專利名稱：10－羥基－△2－癸烯酸的提取及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于10-羥基-Δ2-癸烯酸的提取，具體涉及10-羥基-Δ2-癸烯酸的物理提取方法及其應(yīng)用。
蜂王漿具有免疫調(diào)節(jié)，抗菌，抗炎，抗癌等作用在國(guó)際國(guó)內(nèi)已被公認(rèn)，科學(xué)實(shí)驗(yàn)證明蜂王漿中起主要作用的物質(zhì)是10-羥基-Δ2-癸烯酸，通用代號(hào)為10-HDA。以下用10-HDA因此如何獲取高純度的10-HDA和對(duì)其的利用，一直是世界各國(guó)科學(xué)工作者研究探索的問題。通過(guò)武漢市醫(yī)學(xué)信息中心的查新檢索與10-HDA提取密切相關(guān)的文獻(xiàn)有3篇，其中有“在XE-60柱上分離及測(cè)定蜂王漿中10-羥基-Δ2癸烯酸”、“(E)-10-羥基-2癸烯酸分離鑒定及其抗輻射作用”、“10-羥基-2-癸烯酸含量測(cè)定方法評(píng)價(jià)”。外文未見相同報(bào)道；中方所檢文獻(xiàn)有與提交課題所述的提取蜂王漿中10-HDA的相似報(bào)道，但未見蜂王漿保持研究及將10-HAD提純后加入其它中藥配制成復(fù)方制劑的相同報(bào)道。
在所檢與10-HDA提取有關(guān)的文獻(xiàn)中，其公開了的提取方法的是化學(xué)方法。但此方法提取的10-HDA的穩(wěn)定性尚待探索，它只適用于實(shí)驗(yàn)室使用。如何使10-HDA形成產(chǎn)品得以充分利用尚未有文獻(xiàn)公開。也未有文獻(xiàn)公開10-HDA的物理提出方法。
本發(fā)明的目的在于提供一種用物理方法從蜂王漿中提取10-羥基-Δ2-癸烯酸的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是應(yīng)用10-羥基-Δ2-癸烯酸與中藥配伍制成復(fù)方制劑。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的，對(duì)蜂王漿進(jìn)行以下處理(1)蜂王漿的消毒處理，殺死其中的耐酸菌；(2)在保溫條件下，使蜂王漿中的10-HDA充分結(jié)晶；(3)將蜂王漿中結(jié)晶的10-HDA分離出，然后進(jìn)行純化，乳化處理；(4)利用冷凍真空干燥設(shè)備進(jìn)行干燥處理，得到10-HDA原粉。
國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者都認(rèn)為10-HDA具有多功能錫免疫調(diào)節(jié)作用，有較強(qiáng)的抗癌抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，擴(kuò)散的作用。具有抑菌和殺菌作用，具有抗炎作用。以此方法提取的10-HDA不受化學(xué)漂劑的污染，保持它的純天然性。但單獨(dú)服用后，容易產(chǎn)生便秘的副作用。所以須與其它物質(zhì)配伍使用。以此方法提取的10-HDA穩(wěn)定性好，可長(zhǎng)期保存。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的另一個(gè)目的，提出對(duì)10-HDA的應(yīng)用是與中藥配伍制成復(fù)方制劑，其中中藥的重量比為0.012～0.09∶4。中藥由當(dāng)歸、黃芪和天花組成，其重量比為0.6∶2.4∶1。
選用的當(dāng)歸有補(bǔ)血，調(diào)經(jīng)、活血止痛、潤(rùn)腸通便的功效(中藥學(xué))。德國(guó)研究人員研究指出當(dāng)歸中AR-1具有重要抗腫瘤作用。AR-1用量在1.6-100mg/kg時(shí)可有效抗S-180腹水瘤，IMC癌并發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸熱水提取物尚有誘導(dǎo)干抗素產(chǎn)生活性(抗癌中藥大辭典)。
黃芪的藥理作用在于補(bǔ)氣升陽(yáng)，固表止汗，托瘡生肌，利水消腫。黃芪有增加要體免疫功能，促進(jìn)抗體生成，還能保護(hù)肝臟，增加血細(xì)胞，提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸甘的含量能抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，甚至使腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)，對(duì)一些致癌性病毒的入侵和復(fù)制亦顯示出阻礙作用，亦可能發(fā)揮抗腫瘤作用(抗癌中藥大辭典)。
天花粉的藥理作用在于利小便，消於血、輕身益氣等作用。
選用當(dāng)歸、黃芪、天花粉等中藥有效地克服了用10-HDA后產(chǎn)生的便秘的副作用，同時(shí)強(qiáng)化了10-HDA的作用。
對(duì)當(dāng)歸、黃花、天花粉的處理可采用精洗浸泡、在生物發(fā)酵設(shè)備中進(jìn)行104℃煮沸保持30分鐘，60℃保持90分鐘，40℃保持6小時(shí)以后來(lái)菌軟化，用膠體磨進(jìn)行乳化處理、提取藥汁、過(guò)濾去渣、濃縮成乳劑、冷凍干燥、粉碎、分裝等工藝。


圖1 10-HDA的提出工藝圖。
圖2中藥處理工藝圖。
圖3沙門氏菌試驗(yàn)流程圖。
圖4霉菌總數(shù)測(cè)定程序圖。
實(shí)施例1、10-HDA的提取(1)采用60鈷消毒工藝將蜂王漿中的耐酸菌殺死。
(2)在溫度25～35℃的條件下、保持48小時(shí)，使蜂王漿中的10-HDA充分結(jié)晶。
(3)以100目過(guò)濾結(jié)晶物后，漂洗并高速離心純化結(jié)晶物，再用膠體磨進(jìn)行乳化處理。
(4)在-40℃條件下對(duì)乳化物進(jìn)行冷凍后升溫至35℃干燥處理；冷凍干燥全過(guò)程為18小時(shí)對(duì)干燥物進(jìn)行粉碎，以每粒70mg含量分裝入膠囊中。
2、與中藥配伍和復(fù)方制劑為克服10-HDA的副作用，以10-HDA70mg與4g中藥配伍混合制成復(fù)方制劑，中藥由當(dāng)歸0.6克，黃芪2.4克，天花粉1克組成。中藥按前述如圖2工藝處理。
按以上方法得到的10-HDA的復(fù)方制劑的技術(shù)要求及檢測(cè)如下衛(wèi)生指標(biāo)按國(guó)家衛(wèi)生部規(guī)定指標(biāo)進(jìn)行生產(chǎn)。
(1)原料要求1、蜂王漿新鮮具有光澤感，無(wú)腐敗變質(zhì)。
2、中藥部份干貨、新鮮、無(wú)霉變、蟲蛀等。
(2)感官要求1、10-HDA為白色細(xì)粉，微酸澀。
2、中藥部份為淡棕色細(xì)粉，氣味純正、味甘微苦。(3)衛(wèi)生要求理化指標(biāo)鉛＜0.5 砷＜0.3水份不超過(guò)5％菌落總數(shù)(Cfu/g)＜1000大腸菌群(cfu/g)＜40致病菌不得檢出霉菌(cfu/g)＜25酵母(cfu/g)＜25(4)衛(wèi)生指標(biāo)的檢測(cè)方法1、對(duì)含鉛的測(cè)定采用無(wú)火焰原子吸收法。2、對(duì)含砷的測(cè)定采用氫化物原子吸收法。3、常見致病菌--沙門氏菌檢驗(yàn)方法。國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)方法包括五個(gè)階段的系統(tǒng)鑒定。1、前增菌用無(wú)選擇性的培養(yǎng)基使于瀕死亡狀態(tài)的沙門氏菌復(fù)活力；2、選擇性增菌，使沙門氏菌得以增殖，而大多數(shù)其他菌受到抑制；3、選擇性平板分離沙門氏菌4、生化試驗(yàn)和A-F多價(jià)D群血清的凝集試驗(yàn)，鑒定到屬；5、血清學(xué)分型鑒定。試驗(yàn)過(guò)程如圖34、對(duì)大腸肝菌檢驗(yàn)方法一般分為三步法第一步初發(fā)酵試驗(yàn)第二步平板分離第三步復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)試驗(yàn)具體方法采用九管法，即選用三個(gè)稀釋度每個(gè)稀釋度接種三管。
判定標(biāo)準(zhǔn)1)初發(fā)酵試驗(yàn)中若所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)生，則可報(bào)告為“大腸肝菌群陰性”2)初發(fā)酵試驗(yàn)中凡產(chǎn)氣者經(jīng)平板分離后，取可疑菌落染色鏡檢，同時(shí)做復(fù)發(fā)酵。
試驗(yàn)一(一)凡乳糖復(fù)了酵管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性，無(wú)芽胞桿菌，即可報(bào)告為“大腸菌群陰性”。(二)如乳糖管不產(chǎn)氣或革蘭氏染色陽(yáng)性，則報(bào)告為“大腸菌群陰性”。
報(bào)告根據(jù)證實(shí)試驗(yàn)(復(fù)發(fā)酵試驗(yàn))確認(rèn)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查大腸菌群最可能數(shù)檢索表，即可報(bào)告每100克檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)。
5、霉菌總數(shù)測(cè)定方法(一)檢樣處理、(二)樣品稀釋及培養(yǎng)、(三)菌落計(jì)數(shù)一、檢驗(yàn)程序如圖4(5)10-HDA復(fù)方制劑的免疫調(diào)節(jié)測(cè)定方法1、樣品處理。樣品為淡棕色粉未，以無(wú)菌蒸餾水按試驗(yàn)所需濃度配制作用。
2、動(dòng)物。昆明種雄小鼠18-22克，200只湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
動(dòng)物批準(zhǔn)號(hào)為鄂動(dòng)醫(yī)字19-0073、分組。劑量分組為低、中、高劑量分別以0.7、1.4、2.8g/kg.bwr 10-HDA復(fù)方制劑灌胃；相當(dāng)于人體的攝入量的5、10、20倍。空白對(duì)照組，灌胃蒸餾水；灌胃一月，然后進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)。
4、實(shí)驗(yàn)方法
4.1試驗(yàn)前后動(dòng)物體重記錄。
4.2對(duì)動(dòng)物淋巴器官/體重比值的影響。
4.3 CONA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法MTT法(步驟同功能實(shí)驗(yàn)程度規(guī)定)4.4二硝基氟笨(DNFB)誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)方法耳腫脹法，用DNFB致敏小鼠后，第5天再用DNFB攻擊右耳，24H后處死動(dòng)物剪下左右耳殼，用打孔器取下下徑8mm的耳片稱重，以左右耳重量之差來(lái)表示DTH的程度。
4.5血清溶血素的測(cè)定方法血凝法按照功能實(shí)驗(yàn)程序操作，根據(jù)血清凝聚程度的級(jí)別計(jì)算出抗體積數(shù)。
4.6腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)方法半體內(nèi)法。制備20％的雞紅細(xì)胞懸胞懸液，每只鼠腹腔注射1ml，該懸液30min后處死動(dòng)物，將其仰位固定于鼠板上，開腹，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2ml，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1ml，平均滴于2片載玻片上，37℃溫育30min；育畢用生理鹽水漂洗，涼干，以1∶1的丙酮甲醇液固定，4％Giemsa--磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗涼干，油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞按下式計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。
4.7小鼠碳廓清試驗(yàn)方法依程序規(guī)定的方法，根據(jù)注入墨汁2min、10min后血中炭濃度(測(cè)吸收光質(zhì))計(jì)算出各組小鼠的吞噬指數(shù)。
10-HDA復(fù)方制劑衛(wèi)生評(píng)價(jià)是按衛(wèi)生部對(duì)保健品特制的衛(wèi)生要求進(jìn)行生產(chǎn)的。本實(shí)施例中，所得到的10-HDA的復(fù)方制劑的衛(wèi)生要指標(biāo)為鉛(mg/kg以As計(jì)) ＜0.5砷(mg/kg以Pb計(jì)) ＜0.3菌落總數(shù)(Cfu/100g)＜10致病菌未檢出大腸菌群(Cfu/100g)＜30霉菌(Cfu/g)＜10酵母(Cfu/g) ＜10對(duì)本實(shí)施例的10-HDA復(fù)方制劑免疫調(diào)功能調(diào)節(jié)測(cè)定結(jié)果如下1、見表1各動(dòng)物間體重?zé)o明顯差異表1試驗(yàn)前后動(dòng)物體重記錄(克X±S)組別劑量 動(dòng)物數(shù) 體重 增重(g/kg.bw)(只) 試驗(yàn)前 試驗(yàn)后 (克)空白組0 1018.7±2.029.0±2.510.4±1.8低劑量組 0.71019.1±1.330.7±1.911.5±1.5中劑量組 1.41019.6±1.630.6±2.011.0±2.1高劑量組 2.81018.4±1.629.7±2.511.1±1.02、見表2各動(dòng)物間胸腺/體重比值和脾臟/體重比值無(wú)明顯差異。表2對(duì)動(dòng)物淋巴器官/體重比值的影響(X±S)組別 劑量 動(dòng)物數(shù) 胸腺/體重比值 脾臟/體重比值(g/kg.bw)(只)(X10-9) (X10-9)空白 0 103.13×0.495.33×0.83低劑量組 0.7103.20×0.385.18×0.68中劑量組 1.4103.22×0.415.24×0.48高劑量組 2.8103.32×0.235.26×0.443、從表3可見與對(duì)照組比較10-HDA復(fù)方制劑低、中、高劑量組顯著性增強(qiáng)ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖能力。表3；10-HDA復(fù)方制劑對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能影響組別 劑量 注ConA誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖 DNFA誘導(dǎo)DTH(g/kg.bw) N OD差值 N左右耳重量差(mg)空白組 010 0.033±0.005 1019.6±2.28低劑量組 0.7 10 0.044±0.008#1023.2±2.70中劑量組 1.4 10 0.056±0.011#1027.6±2.87高劑量組 2.8 10 0.042±0.006#1022.1±2.15注取0.1測(cè)定OD570值對(duì)照組比較*P＜0.05#P＜0.014見表3可以與對(duì)照組比較10-HDA復(fù)方制劑低、中、高劑量顯著性增強(qiáng)小鼠對(duì)DNFB誘發(fā)的DTH反應(yīng)。
5從表4可見與對(duì)照組比較10-HDA復(fù)方制劑低、中、高劑量組可顯著性升高血清溶血素含量。
表4:10-HDA的復(fù)方制劑對(duì)小鼠體液免疫功能的影響組別劑量 動(dòng)物數(shù) 血清溶血素(g/kg.bw) (只)(抗體積數(shù))對(duì)照組0 10 92.6±17.48#低劑量組 0.710150.3±32.69#中劑量組 1.410156.9±35.11#高劑量組 2.810148.7±41.17#與對(duì)照組比較*P＜0.05#P＜0.016從表5可見10-HDA復(fù)方制劑低、中、高劑量組吞噬百分?jǐn)?shù)。
吞噬指數(shù)均明顯高于正常對(duì)照組。表5:10-HDA復(fù)方制劑對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響組別劑量動(dòng)物數(shù)吞噬百分率 吞噬指數(shù)(g/kg.bw) (只) (％)對(duì)照組0 10 42.9±4.060.449±0.041低劑量組 0.710 51.8±4.210.551±0.04#中劑量組 1.410 56.4±3.440.592±0.04#高劑量組 2.810 49.2±3.89# 0.514±0.04#與對(duì)照組比較#P＜0.017從表6可見10-HDA復(fù)方制劑低、中、高劑量組可顯著性提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù)。表6:10-HDA復(fù)方制劑對(duì)小鼠碳廓清功能影響組別劑量(g/kg.bw)動(dòng)物數(shù)(只)吞噬指數(shù)對(duì)照組 010 6.077±0.58低劑量組0.7 10 7.671±0.54#中劑量組1.4 10 7.902±0.78#高劑量組2.8 10 7.567±0.86#與對(duì)照組比較#P＜0.0權(quán)利要求
1.10-羥基-Δ2-癸烯酸的提取，其特征方法是(1)、蜂王漿消毒處理，殺死其中的耐酸菌。(2)、在保溫條件下，使蜂漿中的10-羥基-Δ2-癸烯酸充分結(jié)晶。(3)、將蜂王漿中結(jié)晶的10-羥基-Δ2-癸烯酸分離出，然后進(jìn)行純化，乳化處理。(4)、利用冷凍真空干燥設(shè)備進(jìn)行冷凍干燥處理，后再粉碎得到10-羥基-Δ2-癸烯酸原粉。
2.如權(quán)利要求1所述10-羥基-Δ2-癸烯酸的提取，其特征是工序(2)中的保溫濕度為25～35℃，保持48小時(shí)。
3.如權(quán)利要求1所述10-羥基-Δ2-癸烯酸的提取，其特征是分離采用100目過(guò)濾，純化采用漂洗后高速離心的方法，乳化則采用膠體磨處理。
4．如權(quán)利要求1所述10-羥基-Δ2-癸烯酸的提取，其特征是工序(4)中的冷凍溫度-40℃，其后升溫至35℃干燥，全過(guò)程18小時(shí)。
5．一種10-羥基-Δ2-癸烯酸應(yīng)用，其特征是將10-羥其-Δ2-癸烯酸與中藥配伍制成復(fù)方制劑，10-HDA與中藥的重量比例為0.012～0.09∶4；中藥由當(dāng)歸、黃芪、天花粉組成，其重量比為0.6∶2.4∶1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從蜂王漿中以物理方法提取10－羥基－Δ2－癸烯酸以及10－羥基－Δ2－癸烯酸的應(yīng)用。其物理方法概括為:在保溫條件使蜂王漿中10－HDA充分結(jié)晶,過(guò)濾分離,純化,乳化,再冷卻干燥,并粉碎。為克服10－HDA直接服用后的副作用,將10－HDA與中醫(yī)配伍制成復(fù)方劑,中醫(yī)由當(dāng)歸,黃芪,天花粉組成。10－HDA的提取及應(yīng)用克服了現(xiàn)有化學(xué)方法提取不能實(shí)現(xiàn)的產(chǎn)業(yè)化的不足,同時(shí)克服10－HDA的副作用的影響。
文檔編號(hào)C07C51/43GK1221730SQ98121629
公開日1999年7月7日 申請(qǐng)日期1998年10月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月16日
發(fā)明者許祖逖, 吳潤(rùn)洲, 李冬珍 申請(qǐng)人:武漢天潤(rùn)生物制品有限公司