專利名稱：用于在動物乳腺內(nèi)表達(dá)干擾素的重組dna的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在動物乳汁中獲得干擾素的方法。
干擾素是生物體內(nèi)體的一種細(xì)胞因子，具有抗病毒、抗增殖、誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分化及免疫調(diào)節(jié)等功能，因此臨床上廣泛用于治療病毒感染性、免疫功能失調(diào)性等疾病，如普通感冒，流行性感冒，病毒性腸炎、肝炎，腫瘤等，并常用于其它疾病的輔助治療用藥。干擾素的生產(chǎn)目前主要從組織細(xì)胞中提取、或用DNA工程及細(xì)菌工程的方法在細(xì)菌中或其上清中提取，不論那種方法，其設(shè)備條件及技術(shù)的要求都很高，因此成本高，并且產(chǎn)品中常夾帶一些細(xì)菌或細(xì)胞的分解產(chǎn)物，注入體內(nèi)可引起發(fā)熱等副反應(yīng)。
本方法的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種有助于快速、簡單、有效地從動物乳汁中上獲得干擾素的方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明之目的，首先按本發(fā)明所述的用于在動物乳腺內(nèi)表達(dá)干擾素的重組DNA的構(gòu)建方法，利用分子生物學(xué)的方法獲得包含有動物乳蛋白基因啟動子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與干擾素DNA的完整或不完整片段，通過兩者的直接或間接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成一個或數(shù)個重組DNA，將此重組DNA適當(dāng)處理后與一些化學(xué)物質(zhì)混合注入動物的乳腺導(dǎo)管內(nèi)，通過乳腺導(dǎo)管進(jìn)入乳腺分泌細(xì)胞?；蛲ㄟ^其它建立生物反應(yīng)器的方法導(dǎo)入動物生殖細(xì)胞以建立乳腺定位表達(dá)生物反應(yīng)器，在乳腺分泌細(xì)胞分泌乳汁的同時，也較大量地分泌干擾素，因此可在動物的乳汁中獲得干擾素。
具體點(diǎn)說是首先通過分子生物學(xué)的方法獲得動物干擾素DNA完整或不完整片段和包含有動物乳蛋白基因的啟動子和/或增強(qiáng)子的DNA片段，將干擾素DNA完整或不完整片段連接在包含有動物乳蛋白基因啟動子和/或增強(qiáng)子的DNA片段的下游，再做些必要的DNA修飾后，裝入適當(dāng)?shù)妮d體上，構(gòu)成重組DNA?；蛘邔袆游锶榈鞍谆虻膯幼雍?或增強(qiáng)子的DNA片段與T7RNA聚合酶DNA相連，T7啟動子與干擾素DNA完整或不完整片段相連，將以上兩個連接片段做些必要的DNA修飾，裝入適當(dāng)?shù)囊粋€載體或一個以上的載體上，構(gòu)成重組DNA。通過常規(guī)的分子克隆的方法，大量擴(kuò)增并純化此重組DNA，將此重組DNA做(或者不做)一定的酶切處理，與某些化學(xué)物質(zhì)(如脂質(zhì)體等)混合后，借助注射器等一類器具吸取此混合物，通過動物乳頭管注入乳腺導(dǎo)管內(nèi)，使外源DNA沿乳腺管進(jìn)入乳腺分泌細(xì)胞，當(dāng)動物泌乳時用常規(guī)方法擠出乳汁，在乳汁中即可獲得較大量的干擾素?；?qū)⒅亟MDNA通過其它建立生物反應(yīng)器的方法導(dǎo)入動物生殖細(xì)胞以建立乳腺定位表達(dá)的生物反應(yīng)器。
實(shí)施例1取長600bp的人α-干擾素cDNA與含有啟動子的、長約800bp的牛β-caseincDNA連接，裝入pCDA3載體建成重組DNA，經(jīng)克隆篩選、擴(kuò)增、提取及純化后，與脂質(zhì)體相互作用，用生理鹽水配制成濃度為0.1mg/ml的液體，取200ml，注入空奶期的乳牛乳腺導(dǎo)管內(nèi)，經(jīng)適當(dāng)擠壓后，液體將通過乳腺導(dǎo)管進(jìn)入乳腺分泌細(xì)胞，當(dāng)乳牛產(chǎn)后泌乳，即可在乳汁中獲得較大量的干擾素。
實(shí)施例2將含有啟動子的、長約800bp的牛β-casein cDNA與T7RNA聚合酶DNA連接，另將T7啟動子與長600bp的人α-干擾素cDNA相連，經(jīng)過必要的DNA修飾后分裝入兩個pCDNA3的載體，經(jīng)克隆篩選、擴(kuò)增、提取及純化后，與脂質(zhì)體相互作用，用生理鹽水配制成濃度為0.1mg/ml的液體，取200ml，注入空奶期的乳牛乳腺導(dǎo)管內(nèi)，經(jīng)適當(dāng)擠壓后，液體將通過乳腺導(dǎo)管進(jìn)入乳腺分泌細(xì)胞，當(dāng)動物進(jìn)入泌乳期，含有啟動子的、長約800bp的牛β-casein cDNA′將誘導(dǎo)T7RNA聚合酶的合成，后者將通過作用于T7啟動子誘導(dǎo)α-干擾素的合成，因此可從乳汁中獲得活性α-干擾素。
使用本方法所述的用于在動物乳腺內(nèi)表達(dá)干擾素的重組DNA的構(gòu)建方法，并配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它的建立生物反應(yīng)器的方法，克服了以往生產(chǎn)干擾素所存在的的設(shè)備條件要求高、技術(shù)難度大、成本高、產(chǎn)量低等缺點(diǎn)，使干擾素的生產(chǎn)在純天然狀態(tài)下進(jìn)行，大批量生產(chǎn)，成本較低，因此具有一定的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價值。
權(quán)利要求
1.一種用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在動物乳汁中獲得干擾素的方法，其特征是將包含有動物乳蛋白基因啟動子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與干擾素DNA的完整或不完整片段直接或間接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它建立生物反應(yīng)器的方法，在乳汁中獲得活性干擾素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在乳汁中獲得干擾素的方法，其特征是將包含有動物乳蛋白基因啟動子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與干擾素DNA的完整或不完整片段直接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它建立生物反應(yīng)器的方法，在乳汁中獲得活性干擾素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在動物乳汁中獲得干擾素的方法，其特征是將包含有動物乳蛋白基因啟動子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與干擾素DNA的完整或不完整片段通過T7RNA聚合酶與T7啟動子偶連系統(tǒng)間接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它建立生物反應(yīng)器的方法，在乳汁中獲得活性干擾素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在乳汁中獲得干擾素的方法，其特征是將包含有牛β-casein DNA啟動于和/或增強(qiáng)子的DNA片段與α-干擾素DNA的完整或不完整片段間接或直接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它建立生物反應(yīng)器的方法，在乳汁中獲得活性α-干擾素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在乳汁中獲得干擾素的方法，其特征是將包含有牛α-S1-casein DNA啟動子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與α-干擾素DNA的完整或不完整片段間接或直接相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它建立生物反應(yīng)器的方法，在乳汁中獲得活性α-干擾素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建重組DNA以在乳汁中獲得干擾素的方法，其特征是將包含有牛lactoglobulin DNA啟動子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與α-干擾素DNA的完整或不完整片段相連，經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體，構(gòu)成重組DNA，以此重組DNA配合乳腺導(dǎo)管內(nèi)注射或其它建立生物反應(yīng)器的方法，在乳汁中獲得活性α-干擾素。
全文摘要
干擾素是生物體內(nèi)體的一種細(xì)胞因子,具有抗病毒、抗增殖、誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分化及免疫調(diào)節(jié)等功能,因此臨床上廣泛用于治療病毒感染性、免疫功能失調(diào)性等疾病,如普通感冒。本發(fā)明涉及一種用分子生物學(xué)技術(shù)在乳汁中獲得干擾素的方法,克服了用現(xiàn)有技術(shù)提取或人工生產(chǎn)干擾素之技術(shù)難度大、成本高、產(chǎn)量低等不足,將包含有動物乳蛋白基因啟動子和/或增強(qiáng)子的DNA片段與干擾素DNA的完整或不完整片段直接或通過T7RNA聚合酶與T7啟動子偶連系統(tǒng)等方法間接相連,經(jīng)過一些必要的修飾后裝入適當(dāng)?shù)腄NA載體,構(gòu)成重組DNA,經(jīng)過克隆篩選、擴(kuò)增、純化之后,與脂質(zhì)體等物質(zhì)混合,然后直接注入動物的乳腺導(dǎo)管內(nèi),讓重組DNA進(jìn)入乳腺分泌細(xì)胞,在分泌細(xì)胞分泌乳汁時,重組DNA得以表達(dá),用常規(guī)的方法擠得乳汁,可從乳汁中獲重組DNA的表達(dá)產(chǎn)物—干擾素,本方法具有方法簡單、成本低、干擾素活性高、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C07K14/555GK1247899SQ9811334
公開日2000年3月22日 申請日期1998年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月14日
發(fā)明者黃偉民 申請人:黃偉民