專利名稱：通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)t細(xì)胞亞群的制作方法
背景技術(shù)：
CD4+T輔助細(xì)胞不是同質(zhì)的群體，但是可以基于細(xì)胞因子分泌劃分為至少二個(gè)稱為T(mén)輔助1型(Th1)和T輔助2型(Th2)的亞群(參見(jiàn)例如Mosmann,T.R.等(1986)J.Immunol.136:2348-2357；Paul,WE和Seder,R.A.(1994)Cell76:241-251；Seder,R.A.和Paul,W.E.(1994)AnnRev.Immunol.12:635-673)。Th1細(xì)胞分泌白介素-2(IL-2)和干擾素-γ(IFN-γ)而Th2細(xì)胞產(chǎn)生白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-10(IL-10)和白介素-13(IL-13)。這二個(gè)亞群均產(chǎn)生諸如腫瘤壞死因子(TNF)和粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的細(xì)胞因子。除了它們細(xì)胞因子表達(dá)的型式不同之外，據(jù)認(rèn)為T(mén)h1和Th2細(xì)胞具有不同的功能活性。例如，Th1細(xì)胞參與誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)應(yīng)答，而Th2細(xì)胞參與對(duì)B淋巴細(xì)胞提供有效的“幫助”并刺激產(chǎn)生IgG1和IgE抗體。
現(xiàn)有足夠的證據(jù)表明，Th1與Th2細(xì)胞的比例與包括自身免疫病、變態(tài)反應(yīng)疾病和傳染病的一大批免疫介導(dǎo)的臨床疾病的結(jié)果高度相關(guān)。例如，在小鼠的實(shí)驗(yàn)性利什曼原蟲(chóng)鼠感染中，對(duì)感染有抗性的動(dòng)物主要增加Th1應(yīng)答，而對(duì)進(jìn)行性感染易感的動(dòng)物則主要增加Th2應(yīng)答(Heinzel,F.P.，等(1989)J.Exp.Med.169:59-72；Locksley,R.M.和Scott,P.(1992)Immunoparasitology Today1:A58-A61)。在鼠血吸蟲(chóng)病中，觀察到Th1向Th2轉(zhuǎn)換與雌寄生蟲(chóng)向組織中排卵同時(shí)發(fā)生，并與該疾病狀況的惡化相關(guān)聯(lián)(Pearce,E.J.等(1991)J.Exp.Med.173:159-166；Grzych,J-M.等，(1991)J.Immunol.141:1322-1327；Kullberg,M.C.,等(1992)J.Immunol.148:3264-3270)。包括慢性感染(例如人免疫缺陷病毒(HIV)和結(jié)核病)和某些轉(zhuǎn)移性癌的許多人類疾病的特征亦為T(mén)hl向Th2轉(zhuǎn)換(參見(jiàn)例如Shearer,G.M.和Clerici,M.(1992)Prog.Chem.Immunol.54:21-43；Clerici,M和Shearer,G.M.(1993)ImmunologyToday 14:107-111；Yamamura,M，等(1993)J.Clin.Invest.91:1005-1010；Pisa,P.，等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7708-7712；Fauci,A.S.(1988)Science239:617-623)。另外，已顯示某些自身免疫病與占優(yōu)勢(shì)的Th1應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者在滑液組織中具有占優(yōu)勢(shì)的Th1細(xì)胞(Simon,AK.，等(1994)proc.Natl.Acad Sci.USA91:8562-8566)，用自體反應(yīng)Th1細(xì)胞可以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自免疫腦脊髓炎(EAE)(Kuchroo,V.K.，等(1993)J.Immunol.151:4371-4381)。
改變或操縱Th1和Th2亞群比例的能力要求了解CD4 T輔助前體細(xì)胞(Thp)分化的機(jī)制，所述前體細(xì)胞僅分泌IL-2，選擇成為T(mén)h1或Th2效應(yīng)物細(xì)胞。很清楚細(xì)胞因子自身是有效的Th細(xì)胞誘導(dǎo)物并形成一自調(diào)節(jié)環(huán)(參見(jiàn)例如Paul,W.E.和Seder,R.A.(1994)Cell76:241-251；Seder,R.A.和Paul,W.E.(1994)Ann.Rev.Immunol.12:635-673)。因此，IL-4促進(jìn)Th2細(xì)胞分化并防止前體分化成為T(mén)h1細(xì)胞，而IL-12和IFN-γ則具有相反的作用。因此一種可能的改變Th1:Th2比例的方法是增加或降低選擇的細(xì)胞因子的水平。已顯示直接給予細(xì)胞因子或細(xì)胞因子的抗體對(duì)某些由或者Th1或者Th2細(xì)胞介導(dǎo)的疾病有效。例如，給予重組IL-4或IL-12抗體改善了Th1驅(qū)動(dòng)的自身免疫病EAE(參見(jiàn)Racke；M.K.等(1994)J.Exp.Med.180:1961-1966；和Leonard,J.P.等(1995)J.Exp.Med.181:381-386)，而抗IL-4抗體則治愈了Th2介導(dǎo)的寄生蟲(chóng)病大型利什曼原蟲(chóng)(Sadick,M.D.等(1990)J.Exp.Med.171:115-127)。然而，做為治療的可選手段，系統(tǒng)給予細(xì)胞因子或抗體可能具有不良副作用，因此，仍然需要操縱Th1/Th2亞群的置換方法。
IL-4在Th2細(xì)胞中的組織特異性表達(dá)或任何T細(xì)胞細(xì)胞因子的分子基礎(chǔ)一直難以理解。一種可能是存在選擇性地使細(xì)胞因子沉默的阻遏蛋白。已有很多文獻(xiàn)描述細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物基因的轉(zhuǎn)錄沉默。實(shí)例包括大腸桿菌熱調(diào)節(jié)基因(Groansson,M.等(1990)Nature344:682-685)、酵母α2交配型基因(Keleher,C.A.等(1988)Cell53:927-936)和哺乳動(dòng)物MHCI型和TcRα基因(Weisman,J.D.和Singer,D.S.(1991)Mol.Cell.Biol.11:4228-4234；Winoto,A.和Blatimore,D.(1989)Cell59:649-655)。確實(shí)，涉及將IL-2基因組DNA注射入非洲爪蟾屬卵母細(xì)胞的早期實(shí)驗(yàn)提示，在與與激活相對(duì)的靜息T細(xì)胞提取物中存在IL-2的阻遏蛋白(Mouzaki,A.等(1991)EMBO J.10:1399-1406)。這些研究提示、在靜息T細(xì)胞中缺乏IL-2產(chǎn)生應(yīng)歸于通過(guò)與該IL-2啟動(dòng)子的負(fù)元件相互作用使IL-2轉(zhuǎn)錄沉默的蛋白。
第二種可能性是存在Th選擇性反式激活蛋白。細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄元件的研究提供了對(duì)這些細(xì)胞因子基因調(diào)節(jié)的了解。例如，對(duì)IL-4細(xì)胞因子啟動(dòng)子的分析揭示了對(duì)包括NF-AT和AP-1家族成員的幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的功能關(guān)鍵位點(diǎn)(Rooney,J.W.等(1995)Immunity2:473-483；Szabo,S.J.等(1993)Mol.Cell.Biol.13:4793-4805)。NF-AT是含有環(huán)孢菌素A敏感性胞質(zhì)磷蛋白和由AP-1家族成員蛋白組成的可誘導(dǎo)核組分的多亞基轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(Flanagan,W.M.等(1991)Nature352:803-807；Jain,J.等(1992)Nature356:801-804)。NF-ATp的純化和克隆揭示了與轉(zhuǎn)錄因子的NFκB家族的Rel同源域(RHD)有限序列相同的區(qū)(McCaffey,P.G.等(1993)Science262:750-754)。三個(gè)相關(guān)基因NF-ATc、NF-AT4/x/c3和NF-AT3/c4的后續(xù)克隆和測(cè)序揭示了類似的結(jié)構(gòu)域。NF-AT家族成員在該域內(nèi)共有約70％序列類似性并與轉(zhuǎn)錄因子的Rel/NFκB家族的RHD有約18％序列類似性。與其在RHD中的非常有限的序列類似性一致，在NFκB和NF-AT蛋白的行為中有顯著的差異，對(duì)介導(dǎo)NF-AT靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的途徑知之甚少。然而，考慮到NF-AT家族成員可以結(jié)合并反式激活包括IL-2和IL-4的多個(gè)細(xì)胞因子基因的啟動(dòng)子(Rooney,J.等(1995)Immunity2:545-553；Szabo,S.J.等(1993)Mol.Cell.Biol.13:4793-4805；Flanagan,W.M.等(1991)Nature352:803-807；Northrop,J.P.等(1994)Nature369:497),NF-AT蛋白不可能直接對(duì)介導(dǎo)Th1或Th2特異性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄負(fù)責(zé)。
細(xì)胞因子啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)的大多數(shù)(即使不是全部)NF-AT結(jié)合位點(diǎn)伴隨有結(jié)合通常為AP-1家族成員的輔助轉(zhuǎn)錄因子的附近位點(diǎn)。已顯示NF-AT和AP-1蛋白協(xié)同和協(xié)作地結(jié)合，并對(duì)IL-2和IL-4啟動(dòng)子的完全活性是必需的。已顯示不同的AP-1蛋白，具體地說(shuō)為c-Jun、c-Fos、Fra-1、Fra-2、Jun B和Jun D，與這些位點(diǎn)結(jié)合(Rao,A等(1994)Immunol.Today15:274-281；Jain,J.等(1993)Nature365:352-355；Boise,L.H.等(1993)Mol.Cell.Biol.13:1911-1919；Rooney,J.等(1995)Immunity 2:545-553；Rooney,J.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:6299-6310)。然而，所有這些AP-1蛋白均未以Th1或Th2特異性方式表達(dá)，并且沒(méi)有AP-1家族成員差異募集至所述IL-2或IL-4復(fù)合位點(diǎn)的證據(jù)(Roorney,J.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:6299-6310)。因此，或者NF-AT蛋白或者AP-1家族成員c-Jun、c-Fos、Fra-1、Fra-2、Jun B和JunD均不可能是IL-4在Th2細(xì)胞中的組織特異性轉(zhuǎn)錄的原因。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及通過(guò)調(diào)節(jié)一種或多種調(diào)節(jié)Th2特異性細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生和調(diào)節(jié)Th1或Th2亞群的方法、涉及可用于這種調(diào)節(jié)的組合物。如本文進(jìn)一步描述的，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Th2細(xì)胞中IL-4的組織特異性表達(dá)不是因?yàn)樽瓒舻鞍锥且驗(yàn)門(mén)h2特異性反式激活?，F(xiàn)已證實(shí)，原癌基因c-Maf對(duì)Th2相關(guān)細(xì)胞因子白介素-4的組織特異性表達(dá)負(fù)責(zé)。另外，c-Maf在非Th2細(xì)胞的細(xì)胞(例如Th1細(xì)胞、B細(xì)胞和非淋巴樣細(xì)胞)中異位表達(dá)，導(dǎo)致該IL-4啟動(dòng)子激活并在適當(dāng)條件下產(chǎn)生內(nèi)源IL-4。另外已發(fā)現(xiàn)c-Maf和NF-AT協(xié)同激活Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)。
另外，現(xiàn)已分離和特征鑒定了稱為NIP45(即NF-AT相互作用蛋白45(NF-AT Interacting Protein45))的與NF-AT蛋白家族成員相互作用的45kDa蛋白?；谒cRel同源域(RHD)相互作用的能力分離NIP45。已顯示NIP45與NF-AT和c-Maf協(xié)同刺激細(xì)胞因子基因表達(dá)。NIP45增強(qiáng)由c-Maf和NF-AT介導(dǎo)的基因表達(dá)，使得當(dāng)這三個(gè)因子(c-Maf、NF-AT和NIP45)在細(xì)胞中均有活性時(shí)，刺激高水平內(nèi)源IL-4產(chǎn)生。另外再發(fā)現(xiàn)缺乏諸如p18的反式激活域的小maf蛋白可以阻遏Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)，例如由c-Maf介導(dǎo)的表達(dá)。
因此，本發(fā)明涉及通過(guò)調(diào)節(jié)一種或多種與NF-AT家族蛋白協(xié)作以調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，與NF-AT家族蛋白協(xié)作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)并因此其表達(dá)或活性受調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子是Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子(例如Th2特異性maf家族蛋白)。在另一實(shí)施方案中，與NF-AT家族蛋白協(xié)作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)并因此其表達(dá)或活性受調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子是maf家族蛋白，例如c-Maf。在再一實(shí)施方案中，與NF-AT家族蛋白協(xié)作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)并因此其表達(dá)或活性受調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子是與NF-AT家族蛋白相互作用的蛋白，例如NIP45。在再一實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)諸如p18的小maf蛋白的表述或活性。本發(fā)明的方法可以涉及調(diào)節(jié)一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(例如c-Maf或p18)或轉(zhuǎn)錄因子的組合(例如c-Maf+NF-AT、或NF-AT+NIP45、或c-Maf+NF-AT+NIP45)的表達(dá)或活性。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法一般涉及用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的藥物接觸細(xì)胞，使得調(diào)節(jié)細(xì)胞的Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。具體地說(shuō)，本發(fā)明的推薦藥物在細(xì)胞內(nèi)作用以調(diào)節(jié)該轉(zhuǎn)錄因子的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法刺激Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。例如，可以在Th1細(xì)胞、B細(xì)胞或非淋巴樣細(xì)胞中刺激Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法抑制Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在該方法中受調(diào)節(jié)的Th2相關(guān)細(xì)胞因子最好為白介素-4。
可以使用各種藥物刺激調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性。例如，本發(fā)明的刺激性藥物可以是編碼導(dǎo)入該細(xì)胞并在其中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的核酸分子?；蛘?，可以使用增強(qiáng)該轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性的化學(xué)藥物做為刺激性藥物。
可以使用各種藥物抑制調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性。適當(dāng)?shù)囊种菩运幬锏膶?shí)例包括與編碼該轉(zhuǎn)錄因子的基因互補(bǔ)的反義核酸分子、結(jié)合該轉(zhuǎn)錄因子(例如在細(xì)胞核內(nèi))的胞內(nèi)抗體、該轉(zhuǎn)錄因子的抑制形式(例如顯性失活形式)和抑制該轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的化學(xué)藥物。
本發(fā)明亦包含涉及調(diào)節(jié)兩種、三種或多種調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性的聯(lián)合方法。因此，在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，用至少一種調(diào)節(jié)至少一種對(duì)調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因起作用的其它轉(zhuǎn)錄因子的活性的藥物接觸細(xì)胞。最好，該至少一種其表達(dá)或活性受調(diào)節(jié)的其它轉(zhuǎn)錄因子選自NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白和AP-1家族蛋白。
可以按照本發(fā)明的方法在體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，用調(diào)節(jié)藥物在體外接觸細(xì)胞，然后將該細(xì)胞給予受治療者以由此調(diào)節(jié)該受治療者中Th1和/或Th2亞群的發(fā)育。因此，在另一方面，本發(fā)明提供在受治療者中調(diào)節(jié)Th1或Th2亞群發(fā)育的方法。除了其中將活體外修飾的細(xì)胞給予該受治療者的實(shí)施方案之外，在另一實(shí)施方案中，這些方法涉及直接給予該受治療者調(diào)節(jié)一種或多種調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子活性的藥物，使得該受治療者中的Th1或Th2細(xì)胞的發(fā)育展受到調(diào)節(jié)。
可以用本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法在各種臨床情況中操縱Th1∶Th2比例。例如，抑制Th2形成可以用于變態(tài)反應(yīng)疾病、惡性腫瘤和傳染病中，而增強(qiáng)Th2形成可以用于自身免疫病和器官移植。
本發(fā)明的再一方面涉及NIP45組合物。本發(fā)明提供NIP45蛋白和分離的編碼NIP45的核酸序列的分離的組合物、與其相關(guān)的其它組合物和其使用方法。已確定NIP45蛋白的氨基酸序列(示于SEQ ID NO:6)，已分離編碼NIP45蛋白的cDNA(其核苷酸序列示于SEQ ID NO；5)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供編碼NIP45的分離核酸分子或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含編碼NIP45蛋白的核苷酸序列的分離核酸分子。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含編碼蛋白的核苷酸序列的分離核酸分子，其中該蛋白包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列同源的氨基酸序列并與NF-AT家族蛋白的Rel同源域相互作用。在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列的核酸分子雜交的分離核酸分子。在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列的分離核酸分子。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供編碼SEQ ID NO:6的氨基酸序列的分離核酸分子。本發(fā)明亦包含編碼NIP45融合蛋白的分離核酸分子和分離反義核酸分子。
本發(fā)明的另一方面涉及含有本發(fā)明的NIP45核酸分子的載體(例如重組表達(dá)載體)和已導(dǎo)入這種載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞，使用這種宿主細(xì)胞產(chǎn)生NIP45蛋白。如果需要，然后可以從該宿主細(xì)胞或該培養(yǎng)基分離NIP45蛋白。
本發(fā)明的再一方面涉及分離的NIP45蛋白或其部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與NF-AT家族蛋白相互作用的分離的NIP45蛋白或其部分。在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列同源的氨基酸序列并與NF-AT家族蛋白相互作用的分離蛋白。本發(fā)明亦包含NIP45融合蛋白。
可以使用本發(fā)明的NIP45蛋白或其片段制備抗NIP45抗體。因此，本發(fā)明還提供特異性結(jié)合NIP45蛋白的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體是單克隆的。在另一實(shí)施方案中，用可檢測(cè)物質(zhì)標(biāo)記該抗體。
可以使用本發(fā)明的NIP45編碼核酸分子制備非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，該動(dòng)物含有攜帶編碼NIP45蛋白或NIP45蛋白部分的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。因此，本發(fā)明亦提供這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，由該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物攜帶的該NIP45轉(zhuǎn)基因改變了編碼內(nèi)源NIP45蛋白的內(nèi)源基因(例如同源重組動(dòng)物)。
本發(fā)明的另一方面涉及檢測(cè)NIP45蛋白或NIPmRNA在生物樣品中存在的方法。為檢測(cè)NIP45蛋白或NIPmRNA，用可以檢測(cè)NIP45蛋白(例如標(biāo)記抗NIP45抗體)或NIP45mRNA(例如可以與NIP45mRNA雜交的標(biāo)記核酸探針)的藥物接觸該生物樣品，使得檢測(cè)到NIP45蛋白或NIPmRNA在該生物樣品中的存在。
本發(fā)明的再一方面涉及鑒別調(diào)節(jié)NIP45的活性或表達(dá)的化合物的方法和鑒別調(diào)節(jié)NIP45與NF-AT家族蛋白之間相互作用的化合物的方法。本發(fā)明亦包含鑒別與NIP45相互作用的蛋白的篩選方法。
本發(fā)明的再一方面涉及為在宿主細(xì)胞中表達(dá)maf蛋白的組合物，該宿主細(xì)胞諸如為免疫細(xì)胞和表達(dá)maf蛋白的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些組合物包括編碼maf家族蛋白的重組表達(dá)載體，其中所述maf編碼序列操作性地連接至指導(dǎo)該maf家族蛋白在特定細(xì)胞類型諸如淋巴樣細(xì)胞(例如T細(xì)胞或B細(xì)胞)或造血干細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。在另一實(shí)施方案中，這些組合物包括宿主細(xì)胞，諸如宿主淋巴樣細(xì)胞(例如宿主T細(xì)胞或宿主B細(xì)胞)或宿主造血干細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞中已導(dǎo)入了編碼maf家族蛋白的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明還提供表達(dá)c-Maf蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一個(gè)最佳實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是小鼠，并且該小鼠在T細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)c-Maf，最好使用包含操作性地連接至c-mafcDNA的CD4啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)基因。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A是所使用的細(xì)胞融合方法的圖解，以證明細(xì)胞因子表達(dá)不是因?yàn)樽瓒粑镆鸬摹?br> 圖1B是逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析由未融合Th1克隆(D1.1)、未融合Th2克隆(D10)、Th1和Th2同核體和Th1-Th2異核體表達(dá)的IL-2和IL-4細(xì)胞因子、對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白、mRNA。
圖2A是Northern印跡分析，描繪在Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞或B淋巴瘤細(xì)胞中分離的cDNA克隆的表達(dá)。使用對(duì)GAPDH特異性的對(duì)照探針以顯示相等RNA上樣量。
圖2B是Northern印跡分析，描繪在體外正常原初脾細(xì)胞分化成為T(mén)h2細(xì)胞期間分離cDNA克隆向上調(diào)節(jié)的表達(dá)。從在標(biāo)明的時(shí)間點(diǎn)收獲的細(xì)胞分離總RNA。通過(guò)ELISA測(cè)定適當(dāng)稀釋度的培養(yǎng)上清液的細(xì)胞因子(IL-10)的產(chǎn)生，以測(cè)定分化為T(mén)h1或Th2譜系。
圖3A是直方圖，描繪在Th1克隆(AE7)中由c-Maf反式激活I(lǐng)L-4啟動(dòng)子。用野生型IL-4 CAT報(bào)道構(gòu)建物和或者對(duì)照質(zhì)粒(pMEX-NeoⅠ)、c-Maf表達(dá)質(zhì)粒(pMEX-Maf)或者c-Fos表達(dá)質(zhì)粒(pMEX-c-Fos)共轉(zhuǎn)染AE7細(xì)胞。于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用抗CD3抗體刺激每個(gè)樣品的一半。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲所有樣品，并測(cè)定相對(duì)CAT活性。
圖3B是薄層層析板的照片，描繪M12B淋巴瘤細(xì)胞中的相對(duì)CAT活性，該細(xì)胞已用野生型IL-4CAT報(bào)道構(gòu)建物和或者兩種對(duì)照質(zhì)粒(pMEX-NeoⅠ和pREP4)、c-Maf表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒(pMEX-Maf和pREP4)、c-Fos表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒(pMEX-c-Fos和pREP4)、c-Jun表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒(pMEX-c-Jun和pREP4)、對(duì)照質(zhì)粒和NF-ATp表達(dá)質(zhì)粒(pMEX-NeoⅠ和pREP-NF-ATp)、c-Maf表達(dá)質(zhì)粒和NF-ATp表達(dá)質(zhì)粒(pMEX-Maf和pREP-NF-ATp)或者c-Fos表達(dá)質(zhì)粒和NF-ATp表達(dá)質(zhì)粒(pMEX-c-Fos和pREP-NF-ATp)共轉(zhuǎn)染。于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用PMA和離子霉素刺激每個(gè)樣品的一半。在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲所有樣品并測(cè)定相對(duì)CAT活性。
圖4是一直方圖，描繪通過(guò)c-Maf和NF-ATp異位表達(dá)在M12細(xì)胞中內(nèi)源產(chǎn)生IL-4。將用標(biāo)明的對(duì)照質(zhì)?；虮磉_(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或者不刺激或者用PMA和離子霉素刺激24小時(shí)。對(duì)每個(gè)樣品的200μl上清液進(jìn)行ELISA以進(jìn)行細(xì)胞因子定量。
圖5A是使用于用抗CD3抗體刺激后的標(biāo)明時(shí)間點(diǎn)收獲的Th2(D10,CDC35)或Th1(AE7,S53)克隆的核提取物進(jìn)行的該IL-4啟動(dòng)子的DNA酶Ⅰ足跡凝膠照片，它描繪在該IL-4啟動(dòng)子內(nèi)緊接著該推測(cè)MARE位點(diǎn)下游的Th2特異性足跡。用*指示在該II-4啟動(dòng)子的非編碼鏈上的二個(gè)Th2特異性超敏殘基。在該DNA酶Ⅰ處理的樣品旁進(jìn)行了五個(gè)泳道的IL-4啟動(dòng)子探針(無(wú)核提取物)和Maxam-Gilbert A/G梯的DNA酶Ⅰ消化物。
圖5B圖解表示鼠IL-4啟動(dòng)子的近端調(diào)節(jié)區(qū)。上部顯示該鼠IL-4啟動(dòng)子的一級(jí)序列。標(biāo)明的數(shù)字是相對(duì)于于+1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)而言的。星號(hào)指示在DNA酶Ⅰ足跡上觀察到的Th2特異性超敏殘基。底部顯示在圖6和7中所示的EMSA和功能檢測(cè)中使用的野生型(-59至-28)寡核苷酸和所述4bp突變體的序列。改變的核苷酸以小寫(xiě)粗體顯示并對(duì)應(yīng)于上部中顯示的編號(hào)系統(tǒng)。
圖6是電泳遷移率變動(dòng)檢測(cè)(EMSA)的照片，證實(shí)是c-Maf而不是c-Jun結(jié)合至近端IL-4啟動(dòng)子并與NF-ATp形成復(fù)合體。用標(biāo)明的蛋白和標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸進(jìn)行EMSA。
圖7A是直方圖(上部)和薄層層析板(底部)的照片，描繪M12細(xì)胞中相對(duì)CAT活性，所述M12細(xì)胞已用c-Maf表達(dá)載體和或者野生型IL-4CAT報(bào)道構(gòu)建物或者示于圖5B中的一種4bp突變體共轉(zhuǎn)染，證明c-Maf對(duì)該IL-4啟動(dòng)子的反式激活反映到該MARE和Th2特異性足跡上。將三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均和一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)分別示于上部和底部。
圖7B是使用重組c-Maf、IL-4啟動(dòng)子(-59至-27)探針和標(biāo)明的未標(biāo)記雙鏈寡核苷酸做為競(jìng)爭(zhēng)物進(jìn)行的EMSA的照片，證明重組c-Maf與IL-4啟動(dòng)子的結(jié)合反映到該MARE和Th2特異性足跡上。
圖8是三份的酵母菌落照片，它們用NIP45質(zhì)粒和或者NF-ATp-RHD做為“餌”或者對(duì)照餌Max、CDK2或pEG202與LacZ報(bào)道質(zhì)粒pSH18轉(zhuǎn)化，表明僅僅那些含有NIP45質(zhì)粒和NF-ATp-RHD餌的菌落表達(dá)LacZ報(bào)道基因。
圖9是免疫沉淀/Western印跡實(shí)驗(yàn)的照片，證明NIP45和NF-ATp在HepG2細(xì)胞中相互作用。
圖10是比較分離自酵母雙雜種篩選的原始NIP45cDNA克隆(上部)和分離自D10.G4λzapⅡ文庫(kù)的最長(zhǎng)的NIP45cDNA克隆(底部)的結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖11描繪原始NIP cDNA克隆分離物的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列。
圖12描繪NIP45cDNA的疏水性標(biāo)繪圖。
圖13是RNA印跡分析在各種組織中NIP45轉(zhuǎn)錄物水平的照片。
圖14A是BHK細(xì)胞的免疫熒光分析的照片，所述細(xì)胞用編碼HA表位標(biāo)記的NIP45蛋白的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染并用HA肽特異性單克隆抗體做為一級(jí)抗體和indocarbocyanine標(biāo)記的山羊抗小鼠二級(jí)試劑檢測(cè)。
圖14B是用DNA染色染料Hoechst33258復(fù)染的圖7A中所述相同細(xì)胞的照片。
圖14C是未刺激的BHK細(xì)胞的免疫熒光分析的照片，所述細(xì)胞用編碼NF-AT4表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染并用抗NF-AT4特異性抗體做為一級(jí)抗體和indocarbocyanine標(biāo)記的山羊抗小鼠二級(jí)試劑檢測(cè)。
圖14D是用DNA染色染料Hoechst33258復(fù)染的圖7C中所述相同細(xì)胞的照片。
圖14E是離子霉素處理的BHK細(xì)胞的免疫熒光分析的照片，所述細(xì)胞用編碼NF-AT4表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染并用抗NF-AT4特異性抗體做為一級(jí)抗體和indocarbocyanine標(biāo)記的山羊抗小鼠二級(jí)試劑檢測(cè)。
圖14F是用DNA染色染料Hoechst33258復(fù)染的圖7D中所述相同細(xì)胞的照片。
圖15是HepG2細(xì)胞中CAT檢測(cè)結(jié)果的照片(左)和定量測(cè)定CAT活性相對(duì)倍數(shù)誘導(dǎo)(fold induction)的直方圖(右)，所述細(xì)胞已用3X NF-AT-CAT報(bào)道基因構(gòu)建物(含有三個(gè)NF-AT結(jié)合位點(diǎn))和或者對(duì)照表達(dá)質(zhì)?；蛘邇HNF-AT家族表達(dá)質(zhì)粒(NF-ATp、NF-ATc、NF-AT3或NF-AT4)本身(-)或者與NIP45表達(dá)質(zhì)粒的組合物(+)轉(zhuǎn)染。
圖16是HepG2細(xì)胞中CAT檢測(cè)結(jié)果的照片(左)和定量測(cè)定CAT活性相對(duì)倍數(shù)誘導(dǎo)的直方圖(右)，所述細(xì)胞已用IL-4-CAT報(bào)道基因構(gòu)建物(延伸至IL-4啟動(dòng)子的-732bp)和NF-ATp、NIP45和/或c-Maf表達(dá)構(gòu)建物的組合物轉(zhuǎn)染，如標(biāo)明那樣。
圖17是直方圖，描繪在M12B淋巴瘤細(xì)胞上清液中IL-4(以pg/ml計(jì))水平，所述細(xì)胞已用NF-ATp、c-Maf的表達(dá)質(zhì)粒和pCI載體對(duì)照(上部條帶)或NF-ATp、c-Maf和NIP45的表達(dá)質(zhì)粒(底部條帶)瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染。
圖18是在體外正常原初脾細(xì)胞分化成為T(mén)h2細(xì)胞期間的第0、1、3、5或7天表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析，描繪c-maf隨時(shí)間向上調(diào)節(jié)表達(dá)和p18隨時(shí)間向下調(diào)節(jié)表達(dá)。
圖19是薄層層析板的照片，描繪M12細(xì)胞中相對(duì)CAT活性，該細(xì)胞已用IL-4啟動(dòng)子報(bào)道基因構(gòu)建物和或者單獨(dú)的c-Maf表達(dá)載體(5μg)、單獨(dú)的p18表達(dá)載體(10μg)或者恒定量的c-Maf表達(dá)載體(5μg)與增加量的p18表達(dá)載體(2.5、5或μg)轉(zhuǎn)染，描繪p18阻遏IL-4啟動(dòng)子活性。
圖20是使用CD4啟動(dòng)子/增強(qiáng)子以調(diào)節(jié)c-maf cDNA表達(dá)的T細(xì)胞中c-maf轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)的示意圖。
圖21是直方圖，描繪或者野生型小鼠或c-maf轉(zhuǎn)基因小鼠的淋巴結(jié)(LN)、脾或胸腺中總細(xì)胞數(shù)(x106)，證實(shí)c-maf轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出在淋巴器官中細(xì)胞數(shù)降低。
圖2是直方圖，描繪野生型小鼠或c-maf轉(zhuǎn)基因小鼠中血清IgE的基礎(chǔ)水平(ng/ml)，證實(shí)c-maf轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出血清IgE基礎(chǔ)水平提高。
發(fā)明詳述在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)和T亞群的方法和組合物。本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)Th2特異性表達(dá)白介素-4基因不是因?yàn)樘囟ㄗ瓒舻鞍椎淖饔?如實(shí)施例1中顯示的)，而是因?yàn)樘囟ǚ词郊せ畹淖饔谩Ｈ绫疚倪M(jìn)一步描述的，現(xiàn)已鑒別出對(duì)Th2特異性表達(dá)白介素-4基因負(fù)責(zé)的反式激活蛋白是c-Maf原癌蛋白，它選擇性地在分化中的和成熟Th2細(xì)胞中表達(dá)，并且不存在于Th1細(xì)胞中(參見(jiàn)實(shí)施例2)。c-Maf在通常不表達(dá)c-Maf的細(xì)胞(例如Th1細(xì)胞和B細(xì)胞)中異位表達(dá)，導(dǎo)致該IL-4啟動(dòng)子反式激活(參見(jiàn)實(shí)施例3)并在適當(dāng)條件下產(chǎn)生內(nèi)源IL-4(參見(jiàn)實(shí)施例4)。另外，在Th2細(xì)胞而不是Th1細(xì)胞的核提取物中存在的一種蛋白印記了maf效應(yīng)元件(MARE)區(qū)的IL-4啟動(dòng)子(參見(jiàn)實(shí)施例5)，并且重組c-Maf于體外結(jié)合至該IL-4啟動(dòng)子上(參見(jiàn)實(shí)施例6)。c-Maf反式激活I(lǐng)L-4的能力反映到該IL-4啟動(dòng)子內(nèi)的MARE和Th2特異性足跡上(參見(jiàn)實(shí)施例7)。
本發(fā)明還至少部分基于發(fā)現(xiàn)與NF-AT相互作用的并增強(qiáng)由c-Maf和NF-AT造成的轉(zhuǎn)錄激活的蛋白?；谒cNF-AT的Rel同源域(RHD)的相互作用鑒別該蛋白NIP45(參見(jiàn)實(shí)施例8)。共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NIP45與NF-AT于體內(nèi)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)相互作用(參見(jiàn)實(shí)施例9)。編碼NIP45的cDNA已被測(cè)序和表征(參見(jiàn)實(shí)施例10)。對(duì)NIP45mRNA的組織表達(dá)型式的檢查揭示，NIP45轉(zhuǎn)錄物優(yōu)先在脾臟、胸腺和睪丸中表達(dá)(參見(jiàn)實(shí)施例11)。亞細(xì)胞定位研究證實(shí)，NIP45蛋白在細(xì)胞核內(nèi)均勻分布(參見(jiàn)實(shí)施例12)。功能研究顯示，NIP45與NF-AT協(xié)同刺激來(lái)自含有NF-AT結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，并且還與NF-AT和c-Maf協(xié)同刺激來(lái)自IL-4啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄(參見(jiàn)實(shí)施例13)。另外，NIP45、NF-AT和c-Maf可以一致作用，在通常不表達(dá)IL-4的細(xì)胞(例如B細(xì)胞)中誘導(dǎo)內(nèi)源IL-4基因表達(dá)(參見(jiàn)實(shí)施例14)。
本發(fā)明再至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)缺乏激活域的小maf蛋白p18可以阻遏由c-Maf介導(dǎo)的細(xì)胞因子基因表達(dá)。體外T輔助細(xì)胞前體的分化與c-maf基因表達(dá)的向上調(diào)節(jié)和p18基因表達(dá)的向下調(diào)節(jié)相聯(lián)系(參見(jiàn)實(shí)施例15)。另外，與在僅存在c-Maf時(shí)的IL-4啟動(dòng)子活性相比，p18與c-Maf共表達(dá)阻遏了IL-4啟動(dòng)子活性(參見(jiàn)實(shí)施例16)。
本發(fā)明再基于在T細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)c-Maf蛋白的c-maf轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的產(chǎn)生(參見(jiàn)實(shí)施例17)。這些動(dòng)物表現(xiàn)出與過(guò)量表達(dá)IL-4的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物非常類似的表現(xiàn)型，即小胸腺和脾臟、CD+/CD8+(雙陽(yáng)性)胸腺細(xì)胞數(shù)量顯著下降、CD4+陽(yáng)性T細(xì)胞下降和血清IgE基礎(chǔ)水平增加。
為使更易理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語(yǔ)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“Th2相關(guān)細(xì)胞因子”指優(yōu)先或僅由Th2細(xì)胞而不是Th1細(xì)胞特產(chǎn)生的細(xì)胞因子。Th2相關(guān)細(xì)胞因子的實(shí)例包括IL4、IL-5、IL-6和IL-13。按照本發(fā)明的方法調(diào)節(jié)其產(chǎn)生的優(yōu)選Th2相關(guān)細(xì)胞因子是白介素-4。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄因子”指于細(xì)胞核內(nèi)起作用以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的因子(例如蛋白)。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄因子”包括直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的因子(例如具有固有(mstrinsic)轉(zhuǎn)錄激活或抑制活性)和間接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的因子(例如通過(guò)與具有固有轉(zhuǎn)錄激活或抑制活性的其它因子相互作用)。
本文使用的“與激活T細(xì)胞核因子家族蛋白協(xié)作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)”的轉(zhuǎn)錄因子指與NF-AT蛋白協(xié)同或一致作用調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。也就是說(shuō)，與單獨(dú)存在時(shí)相比，NF-AT和該協(xié)作性轉(zhuǎn)錄因子均存在時(shí)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因(例如IL-4)表達(dá)較高。該協(xié)作性轉(zhuǎn)錄因子可以與NF-AT有或沒(méi)有物理聯(lián)系。與NF-AT家族蛋白協(xié)作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子包括maf家族蛋白(例如c-Maf)和NF-AT相互作用蛋白(例如NIP45)。
本文使用的“對(duì)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因的調(diào)節(jié)起作用”的轉(zhuǎn)錄因子指參與Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，而不論它是否與NF-AT家族蛋白協(xié)作。與NF-AT協(xié)作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子亦是對(duì)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因的調(diào)節(jié)起作用的因子。然而，其它不與NF-AT協(xié)作的轉(zhuǎn)錄因子亦可對(duì)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因的調(diào)節(jié)起作用。據(jù)認(rèn)為對(duì)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因的調(diào)節(jié)起作用的轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)例包括NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白、AP-1家族蛋白和Stat6(Lederer,J.等(1996)J.Exp.Med.184:397-406)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子”指在Th2細(xì)胞中而不是優(yōu)先或僅在Th1細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“接觸”(即用藥物接觸細(xì)胞)包括于體外將該藥物和所述細(xì)胞共溫育(例如將該藥物加入培養(yǎng)中的細(xì)胞)和給予受治療者該藥物，使得該藥物和該受治療者的細(xì)胞于體內(nèi)接觸。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”的各種形式包括刺激(例如增強(qiáng)或向上調(diào)節(jié)特定應(yīng)答或活性)和抑制(例如降低或向下調(diào)節(jié)特定應(yīng)答或活性)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“maf家族蛋白”指包括v-Maf、c-Maf、mafB、Nrl、mafK、mafF、mafG和p18的AP-1/CREB/ATF亞家族的成員。參見(jiàn)例如Nishizawa,M等(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.USA86:7711-7715；Kataoka,K.等(1993)J.Virol.67:2133-2141；Swaroop,A等(1992)proc.Natl.Acad.Sci.USA89:266-270；Fujiwara,K.T.等(1993)Oncogene8:2371-2380；Igarashi,K.等(1995)J.Biol.Chem.270:7615-7624；Andrews,N.C.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11488-11492；和Kataoka,K.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:2180-2190。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“小maf蛋白”指缺失對(duì)應(yīng)于c-Maf的氨基末端激活域的結(jié)構(gòu)域的maf家族蛋白。小maf蛋白的實(shí)例包括mafK、mafF、mafG和p18。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“NF-AT家族蛋白”(亦可互換稱為簡(jiǎn)單的“NF-AT”)指激活T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的核因子家族的成員，包括NF-ATp、NF-ATc、NF-AT4/x/c3和NF-AT3/c4。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“NF-AT家族蛋白的Rel同源域”(縮寫(xiě)為RHD域)指在NF-AT家族蛋白內(nèi)具有與轉(zhuǎn)錄因子Rel/NFκB家族的RHD內(nèi)約70％序列相似性的域。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“NF-AT相互作用蛋白”(可與“與NF-AT家族蛋白相互作用的蛋白”交互使用)指與NF-AT家族蛋白形成物理聯(lián)系的因子(例如與NF-AT家族蛋白共免疫沉淀)。該NF-AT相互作用蛋白最好與NF-AT家族蛋白的RHD相互作用。NF-AT相互作用蛋白的實(shí)例是NIP45。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“NIP45”包括具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列(或由示于SEQ ID NO:5的核苷酸序列編碼的)的蛋白，以及其哺乳動(dòng)物同源物(例如人類NIP45)或其保留與NF-AT的RHD相互作用能力的修飾形式(例如突變或截短形式)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“AP-1家族蛋白”指是轉(zhuǎn)錄因子AP-1家族成員的蛋白，其實(shí)例包括c-Jun、c-Fos、Fra-1、Fra-2、JunB和JunD。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“核酸分子”包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)。該核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但最好雙鏈DNA。
本文使用的“分離核酸分子”指不含有在該核酸源自的生物體基因組DNA中天然位于該核酸側(cè)翼的基因序列(即，在該核酸源自的生物體基因組DNA中位于該分離核酸分子鄰近的基因序列)的核酸分子。例如，在各種實(shí)施方案中，分離NIP45核酸分子可以含有小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在該核酸源自的細(xì)胞的基因組DNA中天然位于該核酸分子側(cè)翼的核苷酸序列。另外，諸如cDNA分子的“分離”核酸分子可以不含有其它細(xì)胞物質(zhì)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下雜交”描述雜交和清洗條件，在該條件下相互之間至少60％同源的核苷酸序列通常保持相互雜交。該條件最好使得相互同源性至少為至少65％、更優(yōu)選為至少70％、并最優(yōu)選為至少75％的序列通常保持相互雜交。這種嚴(yán)格雜交是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知條件，并載于分子生物學(xué)現(xiàn)行方法，John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。嚴(yán)格雜交條件的推薦的非限制性實(shí)例是于約45℃在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，接著于50-65℃在0.2X SSC、0.1％SDS中清洗一次或多次。
本文使用的“天然存在的”核酸分子指具有在大自然中發(fā)生的核苷酸序列的RNA或DNA(例如編碼天然蛋白)。
本文使用的“反義”核酸包含與編碼蛋白的“有義”核酸互補(bǔ)的核苷酸序列，例如，與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)、與mRNA序列互補(bǔ)或與基因的編碼鏈互補(bǔ)的核苷酸序列。因此，反義核酸可以氫鍵與有義核酸連接。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“編碼區(qū)”指包含翻譯成為氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序列區(qū)，而“非編碼區(qū)”指不翻譯成為氨基酸的核苷酸序列區(qū)(例如5’和3’非翻譯區(qū))。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“載體”指可以運(yùn)輸其連接的另一核酸的核酸分子。一種載體類型是“質(zhì)?！保钙渲锌梢赃B接其它DNA區(qū)段的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。載體的另一類型是病毒載體，其中可以將其它DNA區(qū)段連接入該病毒基因組。某些載體可以在導(dǎo)入其的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)被整合入宿主細(xì)胞的基因組，并因此與宿主基因組一起復(fù)制。另外，某些載體可以指導(dǎo)其可操作連接的基因的表達(dá)。這種載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”或簡(jiǎn)稱“表達(dá)載體”。一般而言，重組DNA技術(shù)中利用的表達(dá)載體常為質(zhì)粒形式。在本說(shuō)明書(shū)中，可以互換使用“質(zhì)?！焙汀拜d體”，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常使用的載體形式。然而，本發(fā)明包括那些起相同作用的其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指已導(dǎo)入諸如本發(fā)明重組表達(dá)載體的本發(fā)明核酸的細(xì)胞。本文互換使用術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”。應(yīng)理解這種術(shù)語(yǔ)不僅指特定受處理細(xì)胞，而且指這種細(xì)胞的子代或潛在子代。因?yàn)橛捎诨蛘咄蛔兓蛘攮h(huán)境影響，在后續(xù)世代中可能發(fā)生某些修飾，這種子代事實(shí)上可能與親代細(xì)胞不同，但仍然屬于本文使用的術(shù)語(yǔ)的范圍。
本文使用的“適于在細(xì)胞中表達(dá)該核酸分子的形式”的核酸分子意味著該核酸分子包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，該核酸分子基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞和所需表達(dá)水平選擇，并操作性地連接至欲表達(dá)的該核酸分子，使得由所述核酸分子編碼的蛋白在該宿主細(xì)胞中表達(dá)。這種核酸分子的實(shí)例包括含有編碼欲在宿主細(xì)胞中表達(dá)的蛋白的核酸序列的重組表達(dá)載體。
本文使用的“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”指非人類動(dòng)物，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為小鼠，其中該動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞包含“轉(zhuǎn)基因”。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”指外源DNA，該外源DNA被整合入由其發(fā)育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞基因組中并且保留在成熟動(dòng)物的基因組中，例如指導(dǎo)在該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞類型或組織中表達(dá)編碼基因產(chǎn)物。
本文使用的“同源重組動(dòng)物”指轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物類型，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為小鼠，其中在該動(dòng)物發(fā)育之前，通過(guò)內(nèi)源基因與導(dǎo)入該動(dòng)物細(xì)胞(例如該動(dòng)物的胚細(xì)胞)的外源DNA之間的同源重組乙腈改變?cè)搩?nèi)源基因。
本文使用的“分離蛋白”指蛋白當(dāng)其從細(xì)胞分離或由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時(shí)大致不含細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基、當(dāng)化學(xué)合成時(shí)不含化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分即諸如Fab和F(ab’)2片段的含有特異性結(jié)合(與之免疫反應(yīng))抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”和“單克隆抗體組合物”指僅含有一種可以與特定抗原表位免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的一群抗體分子。因此單克隆抗體組合物通常對(duì)與其免疫反應(yīng)的特定抗原展示單一結(jié)合親和性。
本文使用的“胞內(nèi)作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性”的藥物指在例如細(xì)胞質(zhì)或核的細(xì)胞胞內(nèi)區(qū)域起作用以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的藥物。因此，術(shù)語(yǔ)“胞內(nèi)作用以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的藥物”不包括諸如抗體的結(jié)合至細(xì)胞表面的藥物。胞內(nèi)作用以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的藥物的實(shí)例包括編碼該轉(zhuǎn)錄因子的核酸分子、反義核酸分子、胞內(nèi)抗體、顯性失活抑制劑和進(jìn)入細(xì)胞并調(diào)節(jié)(即刺激或抑制)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的化學(xué)藥物。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“胞內(nèi)結(jié)合分子”包括通過(guò)結(jié)合至蛋白自身或編碼該蛋白的核酸(例如mRNA分子)于胞內(nèi)起作用抑制目的靶蛋白(例如轉(zhuǎn)錄因子)表達(dá)或活性的藥物。胞內(nèi)結(jié)合分子的實(shí)例包括反義核酸、胞內(nèi)抗體和顯性失活抑制劑。
在以下小節(jié)中更詳細(xì)地描述本發(fā)明的各個(gè)方面。I．Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)已鑒別出對(duì)Th2特異性表達(dá)白介素-4基因負(fù)責(zé)的轉(zhuǎn)錄因子是c-Maf原癌基因。因此，調(diào)節(jié)c-Maf的表達(dá)和/或活性提供了調(diào)節(jié)白介素-4產(chǎn)生的手段。因?yàn)镮L-4自身在Th2細(xì)胞發(fā)育中起自我調(diào)節(jié)作用(參見(jiàn)例如Paul,W.E.和Seder,R.A.(1994)Cell76:241-251；Seder,R.A.和Paul,W.E.(1994)Ann.Rev.Immunol.12:635-673)，并且由此IL-4的產(chǎn)生可以導(dǎo)致通過(guò)進(jìn)一步Th2分化產(chǎn)生諸如IL-5、IL-6、IL-10和IL-13的其它Th2相關(guān)細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)c-Maf表達(dá)和/或活性提供了調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的一般方法。
maf蛋白家族是包括v-Maf、c-Maf、mafB、Nrl、mafK、mafF、mafG和p18的AP-1/CREB/ATF蛋白亞家族。v-maf癌基因最初分離自雞自發(fā)性肌腱膜纖維肉瘤(musculoaponeuroticfibroscarcoma)，并鑒別為鳥(niǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)化基因AS42(Nishizawa,M.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7711-7715)。V-maf編碼與c-fos和c-jun癌基因同源的42kd堿性區(qū)/亮氨酸拉鏈(b-zip)蛋白。其細(xì)胞同源物c-maf原癌基因在v-maf的編碼區(qū)內(nèi)僅有二個(gè)結(jié)構(gòu)變化(Kataoka,K.等(1993)J.Virol.67:2133-2141)。maf家族包括c-Maf、mafB、人類視網(wǎng)膜特異性蛋白Nrl(Swaroop,A.等(1992)Proc.Natl.Acad Sci.USA89:266-270)、mafK、mafF、mafG和p18。后四個(gè)(mafK、mafF、mafG和p18)各編碼缺失含有反式激活域的c-Maf氨基末端三分之二的蛋白(“小maf蛋白”)(Fujiwara,K.T.等(1993)Oncogene8:2371-2380；Igarashi,K.等(1995)J.Biol.Chem270:7615-7624；Andrews,N.C.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11488-11492；Kataoka,K.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:2180-2190)。C-maf和其它maf家族成員相互之間一級(jí)與Fos和Jun形成同二聚體和異二聚體，與AP-1蛋白相互之間配對(duì)的已知能力一致(Kerppola,T.K.和Curran,T.(1994)Oncogene9:675-684；Kataoka,K.等(1994)Mol.Cell.Biol.14:700-712)。命名為c-Maf效應(yīng)元件(MARE)的c-Maf同二聚體結(jié)合的DNA靶序列是分別含有核心TRE(T-MARE)或CRE(C-MARE)回文序列的13或14bp元件。在本發(fā)明之前，對(duì)maf家族成員的功能知之甚少，盡管c-Maf已顯示刺激從浦肯野神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子L7的轉(zhuǎn)錄(Kurscher,C.和Morgan,J.I.(1994)Mol.Cell.Biol.15:246-254)，并且Nrl已顯示驅(qū)動(dòng)QRl視網(wǎng)膜特異性基因表達(dá)(Swaroop,A.等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:266-270)。然而，在本發(fā)明之前，未有任何報(bào)告指c-Maf或其它maf家族成員涉及在淋巴樣細(xì)胞中表達(dá)的基因調(diào)節(jié)或在任何組織中細(xì)胞因子基因的表達(dá)。
已顯示小maf當(dāng)為同二聚體結(jié)合時(shí)做為α和β珠蛋白轉(zhuǎn)錄阻遏物起作用，但當(dāng)做為與紅細(xì)胞類特異性因子p45NF-E2的異二聚體伙伴時(shí)，對(duì)于激活珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄是必需的(Kataoka,K.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:2180-2190；Igarashi,K.等(1994)Nature367:568-572)。已顯示MafK過(guò)量表達(dá)誘導(dǎo)紅白血病細(xì)胞分化(Igarahsi,K.等(1995)proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7445-7449)。本發(fā)明提供小maf蛋白(例如p18)可以調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的證據(jù)。因此，調(diào)節(jié)小maf蛋白的表達(dá)和/或活性亦提供了調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因生產(chǎn)的手段。
本發(fā)明另外提供NF-AT相互作用蛋白NIP45，它與NF-AT結(jié)合并協(xié)同調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)?；谄渑cNF-ATp的Rel同源域的相互作用鑒別NIP45。以下更詳細(xì)描述NIP45。因此調(diào)節(jié)諸如NIP45的NF-AT相互作用蛋白的表達(dá)和/或活性亦提供了調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因生產(chǎn)的手段。
因此，本發(fā)明提供通過(guò)調(diào)節(jié)涉及Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性而調(diào)節(jié)細(xì)胞的Th2相關(guān)細(xì)胞因子生產(chǎn)的方法。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的藥物接觸細(xì)胞，使得細(xì)胞的Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生受調(diào)節(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，被調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子鑒定為與NF-AT家族蛋白協(xié)作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(例如c-Maf或NIP45)。在另一實(shí)施方案中，被調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子是maf家族蛋白(例如c-Maf或諸如p18的小maf蛋白)。在再一實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)錄(transcnption)為NF-AT相互作用蛋白(例如NIP45)。在一最適實(shí)施方案中，本發(fā)明的調(diào)節(jié)藥物的特征為在胞內(nèi)作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)用刺激轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和/或活性的刺激性藥物接觸細(xì)胞，刺激細(xì)胞的Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生。在本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案中，通過(guò)用抑制轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和/或活性的抑制性藥物接觸細(xì)胞，抑制細(xì)胞的Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
如在實(shí)施例中證實(shí)的，盡管c-Maf對(duì)IL-4基因表達(dá)的組織特異性負(fù)責(zé)，但c-Maf與一種或多種其它轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，激活I(lǐng)L-4基因轉(zhuǎn)錄。具體地說(shuō)，c-Maf與NF-AT蛋白協(xié)同作用，刺激IL-4基因表達(dá)。另外，已證實(shí)NF-AT蛋白和轉(zhuǎn)錄因子AP-1/CREB/TF家族的其它成員參與調(diào)節(jié)Th1和Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因的表達(dá)。如實(shí)施例中進(jìn)一步證實(shí)的，與NF-AT相互作用的蛋白NIP45與NF-AT協(xié)同作用，刺激來(lái)自含有NF-AT位點(diǎn)的啟動(dòng)子的表達(dá)。另外，在存在所有三種因子c-Maf、NF-AT和NIP45時(shí)，增強(qiáng)了Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因的表達(dá)。因此，在另一實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)細(xì)胞Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的本發(fā)明的方法可以包含用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的多種藥物接觸細(xì)胞。因此，在用第一種藥物接觸細(xì)胞的本發(fā)明方法中，該方法可以再包含用調(diào)節(jié)對(duì)調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因起作用的一種或多種其它轉(zhuǎn)錄因子活性的一種或多種其它藥物接觸該細(xì)胞。所述調(diào)節(jié)其它轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的其它藥物最好選自NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白和AP-1家族蛋白。
如在實(shí)施例中再證明的，小maf蛋白(例如p18)可以阻遏由正反式激活蛋白(例如c-Maf)介導(dǎo)的Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因的表達(dá)。因此，在再一實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)細(xì)胞Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的本發(fā)明方法包含用調(diào)節(jié)(即，刺激或抑制)小maf蛋白表達(dá)或活性的藥物自身或與調(diào)節(jié)其它轉(zhuǎn)錄因子活性的藥物(例如其它maf家族蛋白、NF-AT家族蛋白或NF-AT相互作用蛋白)聯(lián)合接觸所述細(xì)胞。該小maf蛋白最好為p18。小maf蛋白的其它實(shí)例包括mafK、mafF和mafG。
A．刺激性藥物按照本發(fā)明的方法，為刺激細(xì)胞Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，用刺激調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(例如c-Maf、NIP45、p18)表達(dá)和/或活性的刺激性藥物接觸該細(xì)胞?？梢栽谕ǔ２槐磉_(dá)這種細(xì)胞因子的細(xì)胞類型(例如Th1細(xì)胞、B細(xì)胞或非淋巴樣細(xì)胞)中刺激產(chǎn)生Th2相關(guān)細(xì)胞因子。另外，可以在輔助前體細(xì)胞(Thp)中刺激產(chǎn)生Th2相關(guān)細(xì)胞因子，以促使它們沿Th2途徑分化，而不是沿Th1途徑分化。
推薦的刺激性藥物是編碼調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的核酸分子，其中將該核酸分子以適于在細(xì)胞中表達(dá)該轉(zhuǎn)錄因子的形式導(dǎo)入細(xì)胞。例如，將c-Maf cDNA克隆入重組表達(dá)載體，并將該載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。如在實(shí)施例3中證實(shí)的，c-maf重組表達(dá)載體在Th1細(xì)胞、B細(xì)胞或非淋巴樣細(xì)胞中異位表達(dá)導(dǎo)致IL-4啟動(dòng)子激活。另外，在適當(dāng)條件下(以下更詳細(xì)討論)，刺激內(nèi)源IL-4基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致通常不表達(dá)該細(xì)胞因子的細(xì)胞產(chǎn)生IL-4(參見(jiàn)實(shí)施例4)。
為在細(xì)胞中表達(dá)maf家族蛋白，一般首先用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將maf家族cDNA導(dǎo)入重組表達(dá)載體?？梢酝ㄟ^(guò)例如使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增或通過(guò)篩選適當(dāng)?shù)腸DNA文庫(kù)得到maf家族cDNA。本領(lǐng)域已知maf家族cDNA的核苷酸序列，可以將其用于設(shè)計(jì)PCR引物以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR方法擴(kuò)增cDNA或用于設(shè)計(jì)雜交探針，該探針可以用于用標(biāo)準(zhǔn)雜交方法篩選cDNA文庫(kù)。該maf家族cDNA最好為c-maf原癌基因。Kurscher C.和Morgan,J.I.(1995)Mol.Cell.Biol.15:246-254公開(kāi)了哺乳動(dòng)物(小鼠)c-maf cDNA的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列，并以檢索號(hào)碼S74567儲(chǔ)存于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。這個(gè)哺乳動(dòng)物c-maf與鳥(niǎo)v-maf序列(公開(kāi)于Nishizawa,M.K.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7711-7715和GenBank檢索號(hào)碼D28598和D28596)高度同源，表明c-maf在種間相當(dāng)保守?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(例如PCR或cDNA文庫(kù)篩選)和基于小鼠或鳥(niǎo)序列設(shè)計(jì)的引物或探針，分離包括人類的其它哺乳動(dòng)物種的c-mafcDNA。與小鼠c-mafcDNA同源的人類部分cDNA序列亦以檢索號(hào)碼H24189和N75504儲(chǔ)存于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。本領(lǐng)域亦已知其它maf家族成員的序列，例如MafB(Kataoka,K.等(1994)Mol.Cell Biol.14:7581-91；GenBank檢索號(hào)碼D28600)、MafG(Kataoka等(1994)Mol.Cell Biol.14:7581-91；GenBank檢索號(hào)碼D28601和D28602)、MafF(GenBank檢索號(hào)碼D16184)和MafK(Igarashi,K.等(1995)J.Biol.Chem.270:7615-7624；GenBank檢索號(hào)碼D16187和D42124)。
分離或擴(kuò)增maf家族cDNA后，將該DNA片段導(dǎo)入表達(dá)載體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“載體”指可以運(yùn)輸它連接的另一核酸的核酸分子。一種載體類型是“質(zhì)?！保渲钙渲锌梢赃B接其它DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。載體的另一類型是病毒載體，其中可以將其它DNA區(qū)段連接入該病毒基因組。某些載體可以在導(dǎo)入其的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)被整合入宿主細(xì)胞的基因組，并因此與宿主基因組一起復(fù)制。另外，某些載體可以指導(dǎo)它可操作連接的基因的表達(dá)。這種載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”或簡(jiǎn)稱“表達(dá)載體”。一般而言，重組DNA技術(shù)中利用的表達(dá)載體常為質(zhì)粒形式。在本說(shuō)明書(shū)中，可以互換使用“質(zhì)?！焙汀拜d體”，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常使用的載體形式。然而，本發(fā)明包括那些起相同作用的這種其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸分子的形式的核酸分子，意味著所述重組表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞和所需表達(dá)水平選擇并操作性地連接至欲表達(dá)的該核酸分子。在重組表達(dá)載體內(nèi)，“操作性地連接”意味著目的核苷酸序列以允許表達(dá)該核苷酸序列的方式連接至該調(diào)節(jié)序列(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或當(dāng)該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)在宿主細(xì)胞中)。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如多聚腺苷酸化信號(hào))。這種調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel；Gene Expression Technology: Methods in Enzymology185,AcademicPress,San Diego,CA(1990)。調(diào)節(jié)序列包括那些在許多宿主細(xì)胞類型中指導(dǎo)組成型表達(dá)核苷酸序列的序列、那些僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的序列(例如組織特異性調(diào)節(jié)序列)或那些僅在某些條件下指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的序列(例如誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)序列)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以取決于將要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需的蛋白表達(dá)水平等。當(dāng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，通常由病毒調(diào)節(jié)元件提供所述表達(dá)載體的控制功能。例如，常用的啟動(dòng)子源自多形瘤病毒、腺病毒、細(xì)胞肥大病毒和猿猴病毒40。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的非限制性實(shí)例包括pCDM8(Seed,B.,(1987)Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等(1987),EMBO J.6:187-195)。市售有攜帶不同調(diào)節(jié)序列的各種哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。為在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中組成型表達(dá)所述核酸，推薦的調(diào)節(jié)序列是細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。另外，本領(lǐng)域已知用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)系統(tǒng)，例如其中由重金屬離子調(diào)節(jié)基因表達(dá)的系統(tǒng)(參見(jiàn)例如Mayo等(1982)Cell29:99-108；Brinster等(1982)Nature296:39-42；Searle等(1985)Mol.Cell.Biol.5:1480-1489)、由熱激調(diào)節(jié)的(參見(jiàn)例如Nouer等(1991)載于HeatShock Response，編輯Nouer,L.,CRC,Boca Raton,FL，第167-220頁(yè))、由激素調(diào)節(jié)的(參見(jiàn)例如Lee等(1981)Nature294:228-232；Hynes等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2038-2042；Klock等(1987)Nature329:734-736；Israel&Kaufman(1989)Nucl.Acids Res.17:2589-2604；和PCT公布WO93/23431)、FK506相關(guān)分子調(diào)節(jié)的(參見(jiàn)例如PCT公布WO94/18317)或四環(huán)素調(diào)節(jié)的(Gossen,M.和Bujard,H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551；Gossen,M.等(1995)Science 268:1766-1769；PCT公布WO94/29442；和PCT公布WO96/01313)。再有，本領(lǐng)域已知許多組織特異性調(diào)節(jié)序列，包括白蛋白啟動(dòng)子(肝臟特異性；Pinkert等(1987)Genes Dev.1:268-277)、淋巴特異性啟動(dòng)子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235-275)、特別是T細(xì)胞受體啟動(dòng)子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8:729-733)和免疫蛋白啟動(dòng)子(Banerji等(1983)Cell33:729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell33:741-748)的淋巴特異性啟動(dòng)子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235-277)、神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(例如神經(jīng)絲啟動(dòng)子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477)、胰臟特異性啟動(dòng)子(Edlund等(1985)Science230:912-916)和哺乳動(dòng)物乳腺特異性啟動(dòng)子(例如乳清啟動(dòng)子；美國(guó)專利4,873,316號(hào)和歐洲申請(qǐng)公布號(hào)264,166)。亦包括發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，例如鼠hox啟動(dòng)子(Kessel和Gruss(1990)Science249:374-379)和甲胎蛋白啟動(dòng)子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3:537-546)。
可以通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本文使用的各種形式的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”指本領(lǐng)域認(rèn)可的將外源核酸(例如DNA)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的各種技術(shù)，包括磷酸鈣共沉淀、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染或電穿孔?？稍赟ambrook等(分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，Cold Spnng Harbor Laboratory press(1989))和其它實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中找到轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法。
為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，已知根據(jù)使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅有小部分細(xì)胞可能將外源DNA整合入其基因組。為鑒別和選擇這些整合體，一般將編碼可選擇標(biāo)記(例如對(duì)抗生素抗性)的基因與目的基因一起導(dǎo)入宿主細(xì)胞。推薦的可選擇標(biāo)記包括那些賦予對(duì)藥物(例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤)抗性的標(biāo)記?？梢栽讵?dú)立于編碼maf家族蛋白的載體上將編碼可選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞，或最好在同一載體上導(dǎo)入?？梢酝ㄟ^(guò)藥物選擇鑒別用導(dǎo)入核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如整合了該可選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞死亡)。
使用本領(lǐng)域已知或本文公開(kāi)的核苷酸序列，按照上述可以制備適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的形式的編碼調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的其它轉(zhuǎn)錄因子的核酸分子。該核苷酸序列可以用于設(shè)計(jì)允許通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增cDNA的PCR引物，或用于設(shè)計(jì)使用標(biāo)準(zhǔn)雜交方法用于篩選cDNA文庫(kù)的雜交探針。NIP45的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列分別公開(kāi)于SEQ IDNO:5和6。本領(lǐng)域已知包括p18、mafK、mafF和mafG的小maf蛋白的核苷酸序列和推測(cè)氨基酸序列(參見(jiàn)例如Fujiwara,K.T.等(1993)Oncogene8:2371-2380；Igarashi,K.等(1995)J.Biol.Chem.270:7615-7624；Andrews,N.C.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11488-11492；Kataoka,K.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:2180-2190)。本領(lǐng)域已知包括NF-ATp、NF-ATc、NF-AT4/x/c3和NF-AT3/c4的NF-AT家族蛋白的核苷酸序列和推測(cè)氨基酸序列。已鑒別出四個(gè)NF-AT家族成員(參見(jiàn)例如Emmel,E.A.等(1989)Science246:1617-1620；Flanagan,W.M.等(1991)Nature352:803-807；Jain,J.等(1993)Nature365:352-355；McCaffrey,P.G.等(1993)Science262:750-754；Rao,A.(1994)Immunol.Today15:274-281；Norhrop,J.P.等(1994)Nature369:497)。該NF-AT cDNA最好為NF-ATp的cDNA。哺乳動(dòng)物NF-ATpcDNA的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列公開(kāi)于McCaffrey,P.G.等(1993)Science262:750-754。哺乳動(dòng)物NF-ATc cDNA的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列公開(kāi)于Northrop,J.P.等(1994)Nature369:497，并以檢索號(hào)碼U08015儲(chǔ)存于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。哺乳動(dòng)物NF-AT3 cDNA和NF-AT4cDNA的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列公開(kāi)于Hoey,T.等(1995)Immunity2:461-472。本領(lǐng)域已知AP-1家族蛋白的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列。例如，人類c-fos的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列公開(kāi)于van Straaten,F.等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:3183-3187。人類c-jun的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列公開(kāi)于Bohmann,D.等(1987)Science238:1386-1392。人類jun-B和jun-D的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列公開(kāi)于Nomura,N.等(1990)Nucl.AcidsRes.18:3047-3048。人類fra-1和fra-2的核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列公開(kāi)于Matsui,M.等(1990)Oncogene5:249-255。
刺激Th2相關(guān)細(xì)胞因子在細(xì)胞中表達(dá)的另一形式的刺激藥物是刺激調(diào)節(jié)細(xì)胞中Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子(例如，諸如c-Maf或p18的maf家族蛋白、或者諸如NIP45的與NF-AT相互作用的蛋白)的表達(dá)或活性的化學(xué)化合物。使用選擇刺激該轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的化合物的篩選檢測(cè)鑒別這種化合物。適當(dāng)?shù)暮Y選檢測(cè)的實(shí)例更詳細(xì)地描述于以下V小節(jié)。
除了用刺激調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的第一轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性的第一藥物，本發(fā)明的刺激方法可以包括使用刺激對(duì)調(diào)節(jié)Th1或Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)起作用的一種或多種其它轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性的一種或多種其它藥物。在實(shí)施例4中，顯示在M12B淋巴瘤細(xì)胞中刺激表達(dá)內(nèi)源IL-4需要導(dǎo)入c-Maf表達(dá)載體和NF-AT表達(dá)載體，因此證明c-Maf和NF-AT協(xié)同作用激活I(lǐng)L-4轉(zhuǎn)錄，而c-maf對(duì)表達(dá)的組織特異性負(fù)責(zé)。在實(shí)施例14中，再顯示通過(guò)共表達(dá)c-Maf、NF-AT和NIP45增強(qiáng)刺激M12 B淋巴瘤細(xì)胞中內(nèi)源IL-4的表達(dá)。雖然熟練技術(shù)人員會(huì)理解某些細(xì)胞可以表達(dá)足量的內(nèi)源c-Maf、NF-AT和/或NIP45，使得僅使用單一藥物即可能足以刺激Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因的表達(dá)，但在某些情況下和某些細(xì)胞類型可能需要刺激多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子以得到目的刺激Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生，所述多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子例如為c-Maf和NF-AT一起、c-Maf和NIP45一起、或所有這三種蛋白(c-Maf、NF-AT和NIP45)。
因此，在用刺激第一種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的第一種藥物接觸細(xì)胞的本發(fā)明方法中，該方法可以再包含用至少一種其它藥物接觸該細(xì)胞，所述至少一種其它藥物刺激對(duì)調(diào)節(jié)Th1或Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)起作用的至少一種其它轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性。所述表達(dá)或活性受調(diào)節(jié)的至少一種其它轉(zhuǎn)錄因子最好選自NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白和AP-1家族蛋白。例如，本發(fā)明的刺激方法可以涉及使用第一種藥物刺激c-Maf的表達(dá)或活性，使用第二種藥物刺激或者NF-AT家族蛋白或者與NF-AT家族蛋白相互作用的蛋白(例如NIP45)的表達(dá)或活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的刺激方法涉及使用第一種藥物刺激c-Maf的表達(dá)或活性，使用第二種藥物刺激NF-AT家族蛋白的表達(dá)或活性和使用第三種藥物刺激與NF-AT家族蛋白相互作用的蛋白(例如NIP45)的表達(dá)或活性。在細(xì)胞中刺激NF-AT或NIP45活性的推薦藥物是分別編碼NF-AT或NIP45的重組表達(dá)，其中將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入該細(xì)胞，并在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)NF-AT或NIP45?？梢匀缟鲜鯿-Maf表達(dá)載體那樣制備N(xiāo)F-AT和NIP45的編碼表達(dá)載體并導(dǎo)入細(xì)胞。
用NF-AT或NIP45的cDNA刺激細(xì)胞內(nèi)NF-AT或NIP45活性的置換方法是，可以使用一種或多種刺激細(xì)胞內(nèi)NF-AT或NIP45活性的化學(xué)化合物做為本發(fā)明刺激方法的第二種(或附加)藥物。本領(lǐng)域已知刺激細(xì)胞內(nèi)NF-AT活性的化合物(有關(guān)綜述參見(jiàn)Rao,A.(1994)Immunol.Today15:274-281)。例如，用佛波醇酯佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)和鈣離子載體(例如離子霉素)刺激某些細(xì)胞，導(dǎo)致NF-AT易位至細(xì)胞核(參見(jiàn)例如Flanagan,W.M.等(1991)Nature352:803-807；Jam,J.等(1993)Nature365:352-355)。另外，例如用抗CD3抗體通過(guò)T細(xì)胞受體(TcR)刺激T細(xì)胞導(dǎo)致T細(xì)胞中NF-AT激活。
除了NF-AT蛋白，已顯示包括c-Jun、c-Fos、Fra-1、Fra-2、Jun B和Jun D的AP-1家族成員參與調(diào)節(jié)Th1和Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因(例如IL-2和IL-4)的表達(dá)(參見(jiàn)例如Rao,A.等(1994)Immunol.Today15:274-281；Jam,J.等(1993)Nature365:352-355；Boise,L.H.等(1993)Mol.Cell.Biol.13:1911-1919；Rooney,J.等(1995)Immunity2:545-553；Rooney,J.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:6299-6310)。盡管這些因子不對(duì)所述細(xì)胞因子基因表達(dá)的Th1/Th2特異性負(fù)責(zé)，并且這些因子看來(lái)不與c-Maf協(xié)同調(diào)節(jié)IL-4基因的表達(dá)(參見(jiàn)實(shí)施例)，但已顯示AP-1家族成員增強(qiáng)Th2細(xì)胞內(nèi)IL-4的表達(dá)(參見(jiàn)例如Rooney,J.等(1995)Immunity2:545-553)。因此，在某些情況下，除了刺激c-Maf活性(和可能刺激NF-AT活性)，亦刺激AP-1家族蛋白活性可能是有益的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的刺激方法涉及使用第一種藥物刺激c-Maf表達(dá)或活性，使用第二種藥物刺激AP-1蛋白的表達(dá)或活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用第一種藥物刺激c-Maf的表達(dá)或活性，使用第二種藥物刺激NF-AT蛋白的表達(dá)或活性使用第三種藥物刺激AP-1蛋白的表達(dá)或活性。亦可聯(lián)合用maf、AP-1和/或NF-AT家族蛋白調(diào)節(jié)NIP45活性。
在細(xì)胞中刺激AP-1活性的推薦藥物是編碼AP-1蛋白的重組表達(dá)，其中該重組表達(dá)載體被導(dǎo)入該細(xì)胞，并且在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)AP-1蛋白。可以如上述c-Maf表達(dá)載體那樣制備AP-1編碼表達(dá)載體并導(dǎo)入細(xì)胞。或者，可以使用一種或多種刺激細(xì)胞內(nèi)AP-1活性的化學(xué)化合物做為本發(fā)明刺激方法中的其它藥物。本領(lǐng)域已知刺激細(xì)胞內(nèi)AP-1活性的化合物，包括PMA/鈣離子載體(例如離子霉素)和抗CD3抗體。
B．抑制性藥物按照本發(fā)明的方法，為抑制細(xì)胞Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，用抑制調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(例如c-Maf、NIP45、p18)表達(dá)和/或活性的抑制性藥物接觸該細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，用調(diào)節(jié)與NF-AT家族蛋白合作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和/或活性的藥物接觸該細(xì)胞抑制細(xì)胞Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)用調(diào)節(jié)Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子(最好為c-Mar)的表達(dá)或活性的藥物接觸細(xì)胞，抑制該細(xì)胞的Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)用調(diào)節(jié)余NF-AT家族蛋白相互作用的蛋白(最好為NIP45)的表達(dá)或活性的藥物接觸細(xì)胞，抑制該細(xì)胞的Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生。在再一實(shí)施方案中，通過(guò)用調(diào)節(jié)小maf蛋白表達(dá)或活性的藥物接觸細(xì)胞，抑制該細(xì)胞Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。如上述刺激方法討論的，本發(fā)明的抑制方法可以包含用兩種或更多種調(diào)節(jié)兩種或更多種調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的藥物接觸細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)錄因子包括maf家族蛋白、NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白和AP-1家族蛋白。
可以在例如Th2細(xì)胞或在輔助前體細(xì)胞(Thp)中抑制Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以促使它們沿著Th1途徑而不是Th2途徑分化。本發(fā)明的抑制性藥物可以是例如起作用抑制該轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的胞內(nèi)結(jié)合分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)“胞內(nèi)結(jié)合分子”包括在胞內(nèi)作用通過(guò)結(jié)合至蛋白或編碼蛋白的核酸(例如mRNA分子)抑制該蛋白的表達(dá)或活性。以下更詳細(xì)描述的胞內(nèi)結(jié)合分子的實(shí)例包括反義核酸、胞內(nèi)抗體和顯性失活抑制劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抑制性藥物是與編碼轉(zhuǎn)錄因子(例如，諸如c-Maf或p18的maf家族蛋白、或諸如NIP45的NF-AT相互作用蛋白)的基因或所述基因的部分互補(bǔ)的反義核酸分子、或是編碼所述反義核酸分子的重組表達(dá)載體。使用反義核酸向下調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)特定蛋白的表達(dá)在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知(參見(jiàn)例如Weintraub,H.等，作為遺傳分析分子工具的反義RNA,Reviews-Trends in Genetics，第1(1)卷1986；Askari,F.K.和McDonell,W.M.(1996)N.Eng.J.Med.334:316-318；Bennett,M.R.和Schwartz,S.M.(1995)Circulation92:1981-1993；Mercola,D.和Cohen,J.S.(1995)Cancer Gene Ther.2:47-59；Rossi,J.J.(1995)Br.Med.Bull.51:217-225；Wagner,R.W.(1994)Nature372:333-335)。反義核酸分子包含與另一核酸分子的編碼鏈(例如mRNA序列)互補(bǔ)的核苷酸序列，并且由此可以氫鍵連接至所述另一核酸分子的編碼鏈。與mRNA的序列互補(bǔ)的反義序列可以與該mRNA的編碼區(qū)內(nèi)的、該mRNA的5’或3’非翻譯區(qū)或編碼區(qū)和非翻譯區(qū)之間的連接區(qū)(例如位于5’非翻譯區(qū)和編碼區(qū)的連接)中發(fā)現(xiàn)的序列互補(bǔ)。另外，反義核酸可以與編碼該mRNA的基因的調(diào)節(jié)區(qū)例如轉(zhuǎn)錄起始序列或調(diào)節(jié)元件的序列互補(bǔ)。反義核酸最好設(shè)計(jì)為與該編碼鏈上起始密碼子之前或跨越起始密碼子的區(qū)或mRNA的3’非翻譯區(qū)內(nèi)的區(qū)互補(bǔ)?？梢曰诒疚墓_(kāi)的或本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列設(shè)計(jì)抑制本文討論的轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的反義核酸，并按照沃森和克里克堿基配對(duì)原則進(jìn)行構(gòu)建。
反義核酸可以以各種不同形式存在。例如，該反義核酸可以是僅與maf家族基因的部分互補(bǔ)的寡核苷酸。可以用本領(lǐng)域已知的化學(xué)合成程序構(gòu)建反義寡核苷酸。可以使用天然存在的核苷酸或各種修飾的核苷酸化學(xué)合成反義寡核苷酸，這種修飾是設(shè)計(jì)用以增強(qiáng)該分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或增強(qiáng)該反義核酸和有義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性，例如可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代核苷酸。為抑制培養(yǎng)物中細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，可以將一種或多種反義寡核苷酸加入培養(yǎng)基中的細(xì)胞，典型的濃度為200μg寡核苷酸/ml。
或者，可以使用其中已亞克隆了以反義定位的核酸(即，從插入核酸轉(zhuǎn)錄的核酸將與目的靶核酸反義)的表達(dá)載體，在生物學(xué)上產(chǎn)生反義核酸?？梢赃x擇操作性地連接至反義定位克隆的核酸的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)該反義RNA分子在目的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，例如可以選擇啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子或其它調(diào)節(jié)序列，它們指導(dǎo)反義RNA的組成型、組織特異性或誘導(dǎo)型表達(dá)。如上述重組表達(dá)載體那樣載體反義表達(dá)載體，除了將該cDNA(或其部分)以反義定位克隆入該載體。該反義表達(dá)載體可以是例如重組質(zhì)粒、噬菌粒或減毒病毒的形式。如上述重組表達(dá)載體那樣，使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染技術(shù)將該反義表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。
在另一實(shí)施方案中，用作抑制性藥物的反義核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的可以切割具有與之互補(bǔ)區(qū)的單鏈核酸(例如mRNA)的催化性RNA分子(有關(guān)核酶綜述參見(jiàn)例如Ohkawa,J.等(1995)J.Biochem.118:251-258；Sigurdsson,S.T.和Eckstem,F.(1995)TrendsBiotechnol.13:286-289；Rossi,J.J.(1995)Trends Biotechnol.13:301-306:Kiehmtopf,M.等(1995)J.Mol.Med.73:65-71)。對(duì)編碼本文討論的轉(zhuǎn)錄因子的mRNA有特異性的核酶可以基于該轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列設(shè)計(jì)。例如，可以構(gòu)建四膜蟲(chóng)屬L-19IVS RNA衍生物，其中活性位點(diǎn)的堿基序列與c-mafmRNA或其它轉(zhuǎn)錄因子mRNA中的欲切割的堿基序列互補(bǔ)。參見(jiàn)例如Cech等的美國(guó)專利4,987,071號(hào)和5,116,742號(hào)?；蛘?，可以使用c-maf mRNA(或其它轉(zhuǎn)錄因子mRNA)從RNA分子庫(kù)中選擇具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA。參見(jiàn)例如Bartel,D．和Szostak,J.W.(1993)Science261:1411-1418。
可以用以抑制細(xì)胞內(nèi)Maf蛋白表達(dá)和/或活性的另一類型抑制性藥物是對(duì)本文討論的轉(zhuǎn)錄因子特異性的胞內(nèi)抗體。使用胞內(nèi)抗體抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白功能是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如Carlson,J.R.(1988)Mol.Cell.Biol.8:2638-2646；Biocca,S.等(1990)EMBO J.9:101-108；Werge,T.M.等(1990)FEBS Letters274:193-198；Carlson,J.R.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7427-7428；Marasco,W.A.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7889-7893；Biocca,S.等(1994)Bio/Technology12:396-399；Chen,S-Y等(1994)Human Gene Therapy5:595-601；Duan,L等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:5075-5079；Chen,S-Y.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9l:5932-5936；Beerli,R.R.等(1994)J.Biol.Chem.269:23931-23936；Beerli,R.R.等(1994)Biochem.Biophys.Res.Commun.204:666-672；Mhashilkar,A.M.等(1995)EMBO J.14:1542-1551；Richardson,J.H.等(1995)Proc.Natl Acad.Sci. USA92:3137-3141；Marasco等的PCT公布號(hào)WO94/02610；和Duan等的PCT公布WO95/03832。
為使用胞內(nèi)抗體抑制蛋白活性，制備重組表達(dá)載體，該載體編碼的所述抗體鏈的形式使得在該載體導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，在該細(xì)胞的胞內(nèi)部分做為功能抗體表達(dá)該抗體鏈。為按照本發(fā)明的抑制方法抑制轉(zhuǎn)錄因子活性，最好在該細(xì)胞的核內(nèi)表達(dá)特異性結(jié)合該轉(zhuǎn)錄因子的胞內(nèi)抗體?？梢酝ㄟ^(guò)從該抗體輕鏈和重鏈基因除去編碼N末端疏水性前導(dǎo)序列所那些核苷酸序列，并在所述輕鏈和重鏈基因的或者N末端或者C末端加入編碼核定位信號(hào)的核苷酸序列，來(lái)達(dá)到胞內(nèi)抗體的核表達(dá)(參見(jiàn)例如Biocca,S.等(1990)EMBO J.9:101-108；Mhashilkar,A.M.等(1995)EMBO J.14:1542-1551)。推薦的用于所述胞內(nèi)抗體鏈的核導(dǎo)向的核定位信號(hào)是SV40大T抗原的核定位信號(hào)(參見(jiàn)Biocca,S.等(1990)EMBOJ.9:101-108；Mhashilkar,A.M.等(1995)EMBO J.14:1542-1551)。
為制備胞內(nèi)抗體表達(dá)載體，通常從分泌對(duì)maf蛋白特異性的單克隆抗體的雜交瘤分離編碼對(duì)例如本文討論的Maf家族蛋白或其它轉(zhuǎn)錄因子的目的靶蛋白有特異性的抗體鏈的抗體輕鏈和重鏈的cDNA。本領(lǐng)域已描述抗Maf家族蛋白的抗血清制備(參見(jiàn)例如Fujiwara,K.T.等(1993)Oncogene8:2371-2380；Kataoka,K.等(1993)J.Virol.67:2133-2141；Kerppola,T.K.和Curran,T.(1994)Oncogene9:675-684；Igarashi,K等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci USA92:7445-7449)。可以通過(guò)用Maf蛋白免疫原免疫合適的對(duì)象(例如兔、山羊、小鼠或其它哺乳動(dòng)物),制備抗Maf蛋白抗體。適當(dāng)?shù)拿庖咴苿┛梢院欣缰亟M表達(dá)的Maf蛋白或化學(xué)合成的Maf肽。該制劑還可以包括諸如弗氏完全或不完全佐劑的佐劑或類似的免疫刺激藥物?？梢詮脑搶?duì)象得到產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，并用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備單克隆抗體，所述技術(shù)諸如首先由Kohler和Milstein描述的雜交瘤技術(shù)(1975,Nature256:495-497)(亦參見(jiàn)Brwon等(1981)J.Immunol 127:539-46；Brown等(1980)J Biol Chem255:4980-83；Yeh等(1976)PNAS76:2927-31；和Yeh等(1982)Int.J.Cancer29:269-75)。產(chǎn)生單克隆抗體雜交瘤的技術(shù)是眾所周知的(一般參見(jiàn)R.H.Kenneth，載于Monoclonal Antibodies:A New Dimension In BiologicalAnalyses,Plenum Publishing Corp.New York,New York(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.,54:387-402；M.L.GeRer等(1977)Somatic Cell Genet.,3:231-36)。簡(jiǎn)言之，將無(wú)限增殖細(xì)胞系(通常為骨髓瘤)與來(lái)自用上述maf蛋白免疫原免疫的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞(通常為脾細(xì)胞)融合，并且篩選得到的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，以鑒別產(chǎn)生特異性結(jié)合該Maf蛋白的單克隆抗體的雜交瘤。許多眾所周知的用于融合淋巴細(xì)胞和無(wú)限增殖化細(xì)胞系的方案的任何一種均可應(yīng)用于產(chǎn)生抗Maf蛋白單克隆抗體的目的(參見(jiàn)例如G.Galfre等(1977)Nature266:550-52；Gefter等Somatic Cell Genet.,見(jiàn)上述引用；Lerner,Yale J.Biol.Med.，見(jiàn)上述引用；Kenneth,Monoclonal Antibodies，見(jiàn)上述引用)。另外，一般技術(shù)人員會(huì)理解有許多這種方法的變化亦有用處。通常，該無(wú)限增殖細(xì)胞系(例如骨髓瘤細(xì)胞系)源自與該淋巴細(xì)胞相同的哺乳動(dòng)物物種。例如，可以將來(lái)自用本發(fā)明的免疫原制劑免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞與無(wú)限增殖化小鼠細(xì)胞系融合，產(chǎn)生鼠雜交瘤。推薦的無(wú)限增殖細(xì)胞系是對(duì)含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基”)敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。任何多種骨髓瘤細(xì)胞系中的任何一種均可用做按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的融合對(duì)象，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系。這些骨髓瘤系可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Rockville,Md.)獲得。通常使用聚乙二醇(“PEG”)，將HAT敏感型小鼠骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞融合。然后使用HAT培養(yǎng)基篩選從融合得到的雜交瘤細(xì)胞，該培養(yǎng)基殺死未融合和未有效融合(unproductively fused)的骨髓瘤細(xì)胞(未融合脾細(xì)胞由于未轉(zhuǎn)化而將在幾天后死亡)。通過(guò)例如使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA檢測(cè)篩選雜交瘤培養(yǎng)上清液的抗體鑒別產(chǎn)生特異性結(jié)合該maf蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的置換方法是，可以通過(guò)用該蛋白或其肽篩選重組組合免疫球蛋白文庫(kù)(例如抗體噬菌體展示文庫(kù))，由此分離特異性結(jié)合該蛋白的免疫球蛋白文庫(kù)成員，而鑒別和分離結(jié)合本文討論的轉(zhuǎn)錄因子的單克隆抗體。市售有制備和篩選噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒(例如Pharmacia的重組噬菌體抗體系統(tǒng)(Recombinant PhageAntibody System)，目錄號(hào)碼27-9400-01；和Stratagene SurfZAPTM的噬菌體展示試劑盒(Phage Display Ki)t，目錄號(hào)碼240612)。另外，特別適用于制備和篩選抗體顯示文庫(kù)的方法和試劑的實(shí)例可以參見(jiàn)例如Ladener等美國(guó)專利5,223,409號(hào)；Kang等國(guó)際公布號(hào)WO92/18619；Dower等國(guó)際公布WO91/17271；Winter等國(guó)際公布WO92/20791；Markland等國(guó)際公布號(hào)WO92/15679；Breitling等國(guó)際公布WO93/01288；McCafferty等國(guó)際公布號(hào)WO92/01047；Garrard等國(guó)際公布號(hào)WO92/09690；Fuchs等(1991)Bio/Technology9:1370-1372；Hay等(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85；Huses等(1989)Science246:1275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J 12:725-734；Hawkins等(1992)J Mol Biol226:889-896；Clarkson等(1991)Nature 352:624-628；Gram等(1992)PNAS 89:3576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc Acid Res19:4133-4137；Barbas等(1991)PNAS 88:7978-7982；和McCafferty等Nature(1990)348:552-554。
一旦鑒別對(duì)目的轉(zhuǎn)錄因子特異性的單克隆抗體(例如或者雜交瘤衍生的單克隆抗體或者來(lái)自組合文庫(kù)的重組抗體)，則通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)分離編碼該單克隆抗體輕鏈和重鏈的DNA。對(duì)于雜交瘤衍生的抗體，可以通過(guò)例如PCR擴(kuò)增或cDNA文庫(kù)篩選得到輕鏈和重鏈cDNA。對(duì)于諸如來(lái)自噬菌體展示文庫(kù)的重組抗體，可以在文庫(kù)篩選過(guò)程中從分離的展示示包裝(例如噬菌體)回收編碼輕鏈和重鏈的cDNA。本領(lǐng)域已知可以用以制備PCR引物或cDNA文庫(kù)探針的抗體輕鏈和重鏈核苷酸序列。例如，許多這種序列公開(kāi)于Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國(guó)衛(wèi)生和人類服務(wù)部，NIH Publication No.91-3242和“Vbase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(kù)。
一旦得到抗體輕鏈和重鏈序列，則使用標(biāo)準(zhǔn)方法將其克隆入重組表達(dá)載體。如上述討論的，將編碼輕鏈和重鏈的疏水性前導(dǎo)序列的序列除去、將編碼核定位信號(hào)(例如來(lái)自SV40大T抗原)于框架內(nèi)連接至編碼輕鏈和重鏈的或者氨基或者羧基末端。該表達(dá)載體可以編碼幾個(gè)不同形式之一的胞內(nèi)抗體。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，該載體編碼全長(zhǎng)抗體輕鏈和重鏈，使得全長(zhǎng)抗體在胞內(nèi)表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，該載體編碼全長(zhǎng)輕鏈和僅重鏈的VH/CH1區(qū)，使得Fab片段在胞內(nèi)表達(dá)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該載體編碼單鏈抗體(scFv)，其中輕鏈和重鏈的可變區(qū)由柔韌肽接頭(例如(Gly4Ser)3)連接并做為單鏈分子表達(dá)。為抑制細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子活性，將編碼該轉(zhuǎn)錄因子特異性胞內(nèi)抗體的表達(dá)載體通過(guò)諸如上文討論的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入該細(xì)胞。
本發(fā)明抑制性藥物的再一形式是本文討論的轉(zhuǎn)錄因子(例如maf蛋白)的抑制形式，本文亦稱為顯性失活抑制劑。已知maf蛋白家族與其它AP-1家族成員諸如Fos和Jun同二聚體化和異二聚體化(參見(jiàn)例如Kerppola,T.K.和Curran,T.(1994)Oncogene9:675-684；Kataoka,K.等(1994)Mol.Cell.Biol.14:700-712)。抑制形成二聚體的轉(zhuǎn)錄因子活性的一種手段是通過(guò)使用顯性失活抑制劑，它具有與功能性轉(zhuǎn)錄因子二聚體化的能力，但缺乏激活轉(zhuǎn)錄的能力(參見(jiàn)例如Petrak,D.等(1994)J.Immunol.153:2046-2051)。通過(guò)與功能性轉(zhuǎn)錄因子二聚體化，這種顯性失活抑制劑可以抑制它們的功能活性。這個(gè)過(guò)程可以天然存在做為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的手段。例如，有一些諸如mafK、mafF、mafG和p18的“小”maf蛋白，它們?nèi)笔Ш蟹词郊せ钣虻腸-Maf三分之二的氨基末端(Fujiwara,K.T.等(1993)Oncogene8:2371-2380；Igarashi,K.等(1995)J.Biol.Chem.270:7615-7624；Andrews,N.C.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11488-11492；Kataoka,K.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:2180-2190)。小maf蛋白的同二聚體做為負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑起作用(Igarashi,K.等(1994)Nature367:568-572)，并且已顯示小maf蛋白中的三個(gè)(MafK、MafF和MafG)競(jìng)爭(zhēng)性抑制由v-Maf癌蛋白介導(dǎo)的反式激活(Kataoka,K等(1996)Oncogene12:53-62)。另外，已鑒別出MafB是Ets-1的相互作用伙伴，并顯示它制Ets-1介導(dǎo)的運(yùn)鐵蛋白受體的反式激活和抑制紅細(xì)胞類分化(Sieweke,M.H.等(1996)Cell85:49-60)。
因此，本發(fā)明的抑制性藥物可以是具有與c-Maf二聚體化的能力但缺乏激活轉(zhuǎn)錄能力的Maf蛋白的形式。Maf蛋白的這種顯性失活形式可以是例如天然缺乏反式激活域的小Maf蛋白(例如MafK、MafF、MafG)、MafB或其中除去反式激活域的c-Maf突變形式。使用通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入細(xì)胞的編碼Maf蛋白的重組表達(dá)載體，可以在該細(xì)胞中表達(dá)這種顯性失活Maf蛋白。為表達(dá)缺失反式激活域的c-Maf突變形式，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)從c-maf cDNA除去編碼c-Maf氨基末端的反式激活域的核苷酸序列。優(yōu)選除去至少氨基酸1-122。更優(yōu)選除去氨基酸1-187或氨基酸1-257。保留編碼堿性-亮氨酸拉鏈區(qū)的核苷酸序列。將該截短的cDNA插入重組表達(dá)載體，然后將該載體導(dǎo)入細(xì)胞以在該細(xì)胞內(nèi)允許表達(dá)該截短的缺失反式激活域的c-maf。
可以用以抑制細(xì)胞中maf蛋白的表達(dá)和/或活性的再一種類型的抑制性藥物是抑制細(xì)胞中內(nèi)源maf家族蛋白的表達(dá)或活性的化學(xué)化合物。可以使用選擇抑制maf家族蛋白表達(dá)或活性的化合物的篩選檢測(cè)，鑒別這種化合物。在以下V小節(jié)更詳細(xì)地描述合適的篩選檢測(cè)的實(shí)例。
如上述關(guān)于刺激性藥物所討論的，本發(fā)明的抑制方法可以包括使用一種或多種其它抑制性藥物，所述其它抑制性藥物抑制對(duì)調(diào)節(jié)Th1或Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)起作用的一種或多種其它轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抑制方法包含用抑制maf家族蛋白的表達(dá)或活性的第一種藥物和抑制NF-AT家族蛋白或NF-AT相互作用蛋白(例如NIP45)的表達(dá)或活性的第二種藥物接觸細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抑制方法包含用抑制maf家族蛋白的表達(dá)或活性的第一種藥物和抑制AP-1家族蛋白的表達(dá)或活性的第二種藥物接觸細(xì)胞。在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抑制方法包含用抑制maf家族蛋白的表達(dá)或活性的第一種藥物、抑制NF-AT家族蛋白的表達(dá)或活性的第二種藥物和抑制NF-AT相互作用蛋白(例如NIP45)的表達(dá)或活性的第三種藥物接觸細(xì)胞。抑制NF-AT蛋白或NF-AT相互作用蛋白和AP-1蛋白的抑制性藥物類型的實(shí)例包括反義核酸、胞內(nèi)抗體、顯性失活抑制劑和上述抑制內(nèi)源蛋白的化學(xué)化合物。關(guān)于后者，本領(lǐng)域已知NF-ATp的核易位被免疫抑制藥物環(huán)孢菌素A和FK506抑制(參見(jiàn)例如Rao,A.(1994)Immunol.Today15:274-281；Rao,A.(1995)J.Leukoc.Biol.57:536-542)。因此，在抑制方法的一個(gè)實(shí)施方案中，將諸如環(huán)孢菌素A或FK506(或其它抑制鈣調(diào)磷酸酶途徑的相關(guān)藥物)的免疫抑制藥物與抑制c-Maf表達(dá)或活性的藥物聯(lián)合使用。
可以在體外或體內(nèi)(后者在以下小節(jié)中進(jìn)一步討論)進(jìn)行調(diào)節(jié)細(xì)胞Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的本發(fā)明的方法。為在體外進(jìn)行本方法，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法從受治療者得到細(xì)胞，并在體外用本發(fā)明的刺激性或抑制性藥物溫育(即培養(yǎng))以分別刺激或抑制Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。例如，可以從受治療者得到外周血單核細(xì)胞(PBMC)，并通過(guò)例如用Ficoll/Hypaque的密度梯度離心分離。可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法排除或富集特定細(xì)胞群體。例如，可以通過(guò)在槊料上吸附分離單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)陽(yáng)性和/或陰性選擇，利用抗T細(xì)胞或B細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體富集或排除T細(xì)胞或B細(xì)胞，例如通過(guò)用特異性一級(jí)單克隆抗體(mAb)溫育細(xì)胞，然后使用包被了結(jié)合一級(jí)mAb的二級(jí)抗體的磁性珠分離結(jié)合mAb的細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)類似技術(shù)，使用干細(xì)胞特異性mAb(例如抗CD34mAb)分離源自外周血或骨髓的造血干細(xì)胞。亦可以按照標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選分離特定的細(xì)胞群體。本領(lǐng)域已知抗細(xì)胞特異性表面標(biāo)記的單克隆抗體且許多有市售。
當(dāng)于體外使用刺激性藥物導(dǎo)致刺激Th2相關(guān)細(xì)胞因子特別是IL-4產(chǎn)生時(shí)，可以從該培養(yǎng)上清液回收這些細(xì)胞因子做進(jìn)一步使用。例如，可以將該培養(yǎng)上清液或其純化的部分用于培養(yǎng)中的T細(xì)胞以影響體外Th1或Th2細(xì)胞發(fā)育?；蛘?，可以將該培養(yǎng)上清液或其純化的部分給予受治療者以影響，該受治療者中Th1對(duì)Th2應(yīng)答的發(fā)展。
另外，可以將于體外用刺激性或抑制性藥物處理的細(xì)胞給予受治療者，以影響該受治療者中Th1對(duì)Th2應(yīng)答的發(fā)展。因此，在另一實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)細(xì)胞的Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的本發(fā)明方法還包含將該細(xì)胞給予受治療者，以由此調(diào)節(jié)受治療者中Th1或Th2細(xì)胞的發(fā)育。推薦的活體外修飾和再給予的細(xì)胞類型包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和造血干細(xì)胞。為給予受治療者，可能最好在將細(xì)胞給予受治療者之前，首先從細(xì)胞除去培養(yǎng)物中殘留的藥物。這可以例如通過(guò)Ficoll/Hypaque梯度離心細(xì)胞完成。關(guān)于活體外遺傳修飾細(xì)胞并接著再給予受治療者的進(jìn)一步討論，亦可參見(jiàn)W.F.Anderson等的美國(guó)專利5,399,346號(hào)。Ⅱ．調(diào)節(jié)受治療者中Th1或Th2細(xì)胞發(fā)育的方法本發(fā)明的另一方面涉及調(diào)節(jié)受治療者中Th1或Th2細(xì)胞發(fā)育的方法。術(shù)語(yǔ)“受治療者”包括其中可以引出免疫應(yīng)答的活生物體。推薦的受治療者是哺乳動(dòng)物。受治療者的實(shí)例包括人類、猴子、犬、貓、小鼠、大鼠、奶牛、馬、山羊和綿羊。如上述討論，調(diào)節(jié)受治療者中Th1/Th2比例的一種方法師在活體外用本發(fā)明的一種或多種調(diào)節(jié)藥物處理細(xì)胞(例如T細(xì)胞、B細(xì)胞或造血干細(xì)胞)，使得所述細(xì)胞的Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生受到調(diào)節(jié)，接著將所述細(xì)胞給予該受治療者。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)給予該受治療者調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性的藥物，所述轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)，使得該受治療者中Th1或Th2細(xì)胞的發(fā)育受到調(diào)節(jié)，來(lái)調(diào)節(jié)Th1/Th2的比例。在一個(gè)最佳實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)錄因子是maf家族蛋白，最好為c-Maf蛋白或小maf蛋白(例如p18)。在另一最佳實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)錄因子是與NF-AT家族蛋白相互作用的蛋白，最好是NIP45。該Th2相關(guān)細(xì)胞因子最好是IL-4?？梢酝ㄟ^(guò)給予本發(fā)明的一種或多種刺激性藥物促進(jìn)受治療者中Th2應(yīng)答的發(fā)展，而可以通過(guò)給予本發(fā)明的一種或多種抑制性藥物促進(jìn)受治療者中Th1應(yīng)答的發(fā)展。如上討論的，在某些情況下，可能需要附加調(diào)節(jié)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(例如maf家族蛋白、NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白和/或AP-1家族蛋白的組合)的活性。
關(guān)于包含核酸(包括編碼轉(zhuǎn)錄因子、反義RNA、胞內(nèi)抗體或顯性失活抑制劑的重組表達(dá)載體)的刺激性或抑制性藥物，可以使用本領(lǐng)域已知的將核酸(例如DNA)在體內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞的方法，將該藥物導(dǎo)入受治療者的細(xì)胞。這種方法的實(shí)例包括直接注射可以通過(guò)直接將DNA注射入細(xì)胞，而將裸露的DNA導(dǎo)入細(xì)胞(參見(jiàn)例如Acsadi等(1991)Nature332:815-818；Wolff等(1990)Science247:1465-1468)。例如，可以使用將DNA注射入細(xì)胞的傳遞裝置(例如“基因槍”)。這種裝置有市售(例如BioRad)。
受體介導(dǎo)的DNA攝入亦可以通過(guò)將DNA復(fù)合至諸如聚賴氨酸的陽(yáng)離子，而該陽(yáng)離子偶聯(lián)至細(xì)胞表面受體的配體，而于體內(nèi)將裸露DNA導(dǎo)入細(xì)胞(參見(jiàn)例如Wu,G和Wu,C.H.(1988)J.Biol.Chem.263:14621；Wilson等(1992)J.Biol.Chem.267:963-967；和美國(guó)專利5,166,320)。DNA-配體復(fù)合物與受體的結(jié)合有利于通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用攝入DNA?？梢允褂眠B接至腺病毒衣殼的DNA-配體復(fù)合物，所述腺病毒衣殼天然破壞核內(nèi)體而將物質(zhì)釋到入細(xì)胞質(zhì)中，以避免胞內(nèi)溶酶體降解該復(fù)合物(參見(jiàn)例如Curiel等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8850；Cristiano等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2122-2126)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒已很好地特征記述了缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒以用于基因治療目的的基因轉(zhuǎn)移(有關(guān)綜述參見(jiàn)Miller,A.D.(1990)Blood76:271)?？梢詷?gòu)建具有整合入該逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的目的核苷酸序列的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。另外，可以除去該逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的部分，使得該逆轉(zhuǎn)錄病毒為復(fù)制缺陷型。然后將該復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝為可以用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過(guò)使用輔助病毒感染靶細(xì)胞的病毒粒子。產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和用這種病毒于體外或體內(nèi)感染細(xì)胞的方案可以參見(jiàn)分子生物學(xué)現(xiàn)行方法，Ausubel,F.M等(編輯)Greene PublishingAssociates,(1989),9.10-9.14節(jié)和其它標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒的實(shí)例包括pLJ、pZIP、pWE和pEM，它們均是本領(lǐng)域眾所周知的。合適的包裝病毒系的實(shí)例包括ψCrip、ψCre、ψ2和ψAm。已使用逆轉(zhuǎn)錄病毒于體外和/或體內(nèi)將各種基因?qū)朐S多細(xì)胞類型，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨髓細(xì)胞(參見(jiàn)例如Eglitis，等(1985)Science230:1395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:6460-6464；Wilson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:3014-3018；Armentano等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6141-6145；Huber等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8039-8043；Ferry等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8377-8381；Chowdhury等(1991)Science 254:1802-1805；van Beusechem等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7640-7644; Kay等(1992)Human GeneTherapy 3:641-647；Dai等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10892-10895；Hwu等(1993)J.Immunol.150:4104-4115；美國(guó)專利4,868,116號(hào)；美國(guó)專利4,980,286號(hào)；PCT申請(qǐng)WO89/07136；PCT申請(qǐng)WO89/02468；PCT申請(qǐng)WO89/05345；和PCT申請(qǐng)WO92/07573)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體需要靶細(xì)胞分裂，以使該逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組(和插入其中的異源核酸)整合入宿主基因組以穩(wěn)定地將核酸導(dǎo)入該細(xì)胞。因此，有可能必需刺激靶細(xì)胞復(fù)制。
腺病毒可以操作腺病毒的基因組使得它編碼并表達(dá)目的基因產(chǎn)物，但在其正常裂解病毒生命周期中復(fù)制的能力方面是未激活的。參見(jiàn)例如Berkner等(1988)BioTechniques6:616；Rosenfeld等(1991)Science252:431-434；和Resenfeld等(1992)Cell68:143-155。本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知源自腺病毒毒株Ad5型d1324或其它腺病毒毒株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)的合適的腺病毒載體。重組腺病毒的優(yōu)勢(shì)在于，它們不需要分裂的細(xì)胞即可成為有效的基因傳遞載體，并可用于感染廣泛的細(xì)胞類型，包括氣道上皮(Rosenfeld等(1992)，見(jiàn)上述引用)、內(nèi)皮細(xì)胞(Lemarchand等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6482-6486)、肝細(xì)胞(Herz和Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2812-2816)和肌肉細(xì)胞(Quantin等(1992)proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2581-2584)。另外，導(dǎo)入的腺病毒DNA(和其中含有的異源DNA)不整合入宿主細(xì)胞的基因組，而保持為附加型，因此避免因?yàn)楫?dāng)導(dǎo)入的DNA被整合入宿主基因組(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA)時(shí)插入突變而可能發(fā)生的潛在問(wèn)題。另外，腺病毒基因組攜帶異源DNA的能力與其它基因傳遞載體相比較大(多至8千堿基對(duì))(Berkner等，見(jiàn)上述引用；HajAhmand和Graham(1986)J.Virol.57:267)。目前使用的大多數(shù)復(fù)制缺陷型腺病毒都缺失了所有或部分的病毒E1和E3基因，但保留多達(dá)80％的腺病毒遺傳物質(zhì)。
腺相關(guān)病毒腺相關(guān)病毒(AAV)是天然存在的缺陷型病毒，它需要另一病毒例如腺病毒或皰疹病毒做為有效復(fù)制和生產(chǎn)性生活周期的輔助病毒。(有關(guān)綜述參見(jiàn)Muzyczka等Curr.Topics in Micro.AndImmunol.(1992)158:97-129)。它也是可以將其DNA整合入未分裂細(xì)胞的少數(shù)種病毒之一，并展示出高頻率穩(wěn)定整合(參見(jiàn)例如Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356；Samulski等(1989)J.Virol.63:3822-3828；和McLaughlin等(1989)J.Virol.62:1963-1973)。含有小至300堿基對(duì)的AAV的載體可以被包裝并可以整合。外源DNA的空間限制為約4.5kb?？梢允褂肨ratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.5:3251-3260中描述的AAV載體將DNA導(dǎo)入細(xì)胞。已使用AAV載體將各種核酸導(dǎo)入了不同細(xì)胞類型(參見(jiàn)例如Hermonat等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470；Tratschin等(1985)Mol.Cell.Biol.4:2072-2081；Wondisford等(1988)Mol.Endocrinol.2:32-39；Tratschin等(1984)J.Virol.51:611-619；和Flotte等(1993)J.Biol.Chem.268:3781-3790)。
可以通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)方法，評(píng)價(jià)將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的特定表達(dá)載體系統(tǒng)和方法的效力。例如，可以通過(guò)濾膜雜交技術(shù)(例如Southern印跡)檢測(cè)導(dǎo)入細(xì)胞的DNA，并通過(guò)利用Northern印跡、RNA酶保護(hù)或逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)通過(guò)導(dǎo)入的DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA?？梢酝ㄟ^(guò)適當(dāng)?shù)臋z測(cè)檢測(cè)基因產(chǎn)物，例如通過(guò)諸如用特異性抗體的免疫檢測(cè)產(chǎn)生的蛋白、或通過(guò)諸如酶學(xué)檢測(cè)的功能性檢測(cè)檢測(cè)該基因產(chǎn)物的功能活性。
可以將諸如刺激或抑制內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子活性的化學(xué)化合物的調(diào)節(jié)性藥物做為藥用組合物給予受治療者。這種組合物通常包含該調(diào)節(jié)性藥物和藥學(xué)上可接受載體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受載體”包括任何和所有的與藥用給予相適應(yīng)的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。這種介質(zhì)和藥物用于藥用活性物質(zhì)是本領(lǐng)域眾所周知的。除了在任何常規(guī)介質(zhì)或藥物與該活性化合物不相容的情況下，考慮了它在該組合物中的應(yīng)用。亦可以將補(bǔ)充的活性化合物加入所述組合物中。
配制本發(fā)明的藥用組合物使其與計(jì)劃的給藥途徑相適應(yīng)。例如，用于非腸道、皮內(nèi)或皮下使用的溶液或懸浮液可以包括以下組分無(wú)菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗氧化劑，諸如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯(methyl parabens)的抗細(xì)菌劑；諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；調(diào)節(jié)滲透壓的藥物，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽的緩沖液和諸如氯化鈉或葡萄糖?？梢杂弥T如鹽酸或氫氧化鈉的酸或堿調(diào)節(jié)pH。非腸道制劑可以包裝于安瓶、用玻璃或槊料制成的一次性注射器或多劑量西林瓶。
適于注射使用的藥用組合物包括無(wú)菌水溶液(如果是水溶性)或分散體和用于臨時(shí)制備無(wú)菌注射液或分散體的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有的情況下，該組合物必須無(wú)菌并且應(yīng)是流體的以易于注射。它必須在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定并且必須進(jìn)行防腐以對(duì)抗諸如細(xì)菌和真菌的微生物的污染作用。該載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)和它們的適當(dāng)混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？梢岳缤ㄟ^(guò)使用諸如卵磷脂的包衣、通過(guò)在分散體的情況下保持需要的顆粒大小和通過(guò)使用表面活性劑保持適當(dāng)?shù)牧黧w性?？梢酝ㄟ^(guò)各種抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等達(dá)到防止微生物作用。在許多情況下，最好在該組合物中包括等滲劑，例如蔗糖、諸如甘露醇、山梨醇的多元醇、氯化鈉?？梢酝ㄟ^(guò)在該組合物中包括例如單硬脂酸鋁和明膠的延遲吸收的藥物，達(dá)到可注射組合物的延長(zhǎng)吸收。
可以通過(guò)將需要量的該活性化合物與需要的一種上述列舉的成分或其組合加入適當(dāng)?shù)娜軇┲?，接著進(jìn)行過(guò)濾除菌制備無(wú)菌注射液。一般而言，可以將該活性化合物加入含有基本分散介質(zhì)和需要的來(lái)自上述列舉的其它成分的無(wú)菌溶媒中制備分散體。在用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉劑的情況下，推薦的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從先前除菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生該活性成分和任何其它需要成分的粉劑。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或食用載體?？蓪⑺鼈儼诿髂z膠囊或壓制成片劑。為口服治療給藥的目的，可以將該活性化合物與賦形劑一起加入，并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。亦可以使用流體載體制備口服組合物，以做為漱口藥使用，其中該流體載體中的該化合物可口服、涮洗和咳吐或吞咽?？梢詫⑺帉W(xué)上相容的粘合劑和/或輔助材料做為該組合物的部分包括進(jìn)去。片劑、藥丸、膠囊、錠劑等可以含有以下成分或具有類似性質(zhì)的化合物的任何一種粘合劑，諸如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；諸如淀粉或乳糖的賦形劑、諸如藻酸、Primogel或玉米淀粉的崩解劑；潤(rùn)濕劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes的潤(rùn)滑劑；助流劑，諸如膠體二氧化硅；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；調(diào)味劑，諸如薄荷、水楊酸甲酯或橙調(diào)味劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用保護(hù)該化合物免受機(jī)體快速清除的載體制備該活性化合物，所述載體例如包括植入物和微膠囊化的傳遞系統(tǒng)的控釋制劑?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸。制備這種制劑的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。亦可從AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.市售得到該材料。亦可以使用脂質(zhì)體懸浮液(包括用抗病毒抗原的單克隆抗體導(dǎo)向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)做為藥學(xué)上可接受載體。這些可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如，如美國(guó)專利4,522,811號(hào)描述的。
以劑量單位形式配制口服或非腸道組合物特別有利于易于給藥和劑量一致性。本文使用的劑量單位形式指適于做為欲治療對(duì)象的單位劑量的物理分離單位；每個(gè)單位含有計(jì)算以與需要的藥用載體相結(jié)合產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量的活性化合物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格受以下因素支配并直接取決于以下因素(a)該活性化合物的獨(dú)特性質(zhì)和欲達(dá)到的特定治療效果、和(b)本領(lǐng)域固有的配制這種用于治療個(gè)體的活性化合物的限制。Ⅲ．本發(fā)明方法的應(yīng)用鑒別控制IL-4產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子并由此連續(xù)形成Th2細(xì)胞，使得在各種臨床情況下使用本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法選擇性地操縱T細(xì)胞亞群。本發(fā)明的刺激方法(即，使用刺激性藥物的方法)導(dǎo)致產(chǎn)生Th2相關(guān)細(xì)胞因子，伴隨促進(jìn)Th2應(yīng)答和向下調(diào)節(jié)Th1應(yīng)答。與之相反，本發(fā)明的抑制方法(即，使用抑制性藥物的方法)抑制產(chǎn)生Th2相關(guān)細(xì)胞因子，伴隨向下調(diào)節(jié)Th2應(yīng)答和促進(jìn)Th1應(yīng)答。因此，為治療其中Th2應(yīng)答是有利的病況，選擇本發(fā)明的刺激方法使得促進(jìn)Th2應(yīng)答并向下調(diào)節(jié)Th1應(yīng)答?；蛘?，為治療其中Th1應(yīng)答是有利的病況，選擇本發(fā)明的抑制方法使得向下調(diào)節(jié)Th2應(yīng)答并促進(jìn)Th1應(yīng)答。本發(fā)明方法應(yīng)用于治療疾病調(diào)節(jié)可以導(dǎo)致該病況治愈、與該條件相關(guān)的癥狀類型或數(shù)量減少、或者長(zhǎng)期或者短期(即，改善該病況)或者簡(jiǎn)單瞬時(shí)的對(duì)受治療者有益的效果。
已鑒別出許多與占優(yōu)勢(shì)Th1或Th2型應(yīng)答相關(guān)的病況，這些病況可以受益于患有該病況的個(gè)體內(nèi)已建立的應(yīng)答類型的調(diào)節(jié)。以下更詳細(xì)描述將本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)方法應(yīng)用于這類疾病。
A．變態(tài)反應(yīng)變態(tài)反應(yīng)由其產(chǎn)生受Th2細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子的活性調(diào)節(jié)的IgE抗體介導(dǎo)。在變態(tài)反應(yīng)中，由Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，這進(jìn)一步刺激產(chǎn)生IgE抗體和激活介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)的細(xì)胞，即肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞。IL-4亦在嗜曙紅細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用。因此，本發(fā)明的抑制方法可以用于在變態(tài)反應(yīng)患者中做為向下調(diào)節(jié)致病性IgE抗體產(chǎn)生的手段抑制Th2相關(guān)細(xì)胞因子特別是IL-4產(chǎn)生?？梢詫⒁种菩运幬镏苯咏o予該受治療者，或者可以從該受治療者得到細(xì)胞(例如Thp細(xì)胞或Th2細(xì)胞)并在活體外用抑制性藥物接觸該細(xì)胞，再給予該受治療者。另外，在某些情況下，將變應(yīng)原與抑制性藥物或已用抑制性藥物處理的細(xì)胞共給予該受治療者，可以有益于抑制(例如脫敏)該變應(yīng)原特異性應(yīng)答。以通過(guò)將諸如細(xì)胞因子IL-12或抗Th2相關(guān)細(xì)胞因子抗體(例如抗IL-4抗體)的其它Th1促進(jìn)劑以足以進(jìn)一步刺激Th1型應(yīng)答的量給予該變態(tài)反應(yīng)受治療者，進(jìn)一步增強(qiáng)該治療。
B．癌癥據(jù)報(bào)道，在癌癥患者中Th2促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)升高(參見(jiàn)例如Yamamura,M.，等(1993)J.Clin.Invest.91:1005-1010；Pisa,P.，等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7708-7712)，并且惡性疾病隨著疾病病程的惡化常常與從Th1型應(yīng)答轉(zhuǎn)向Th2型應(yīng)答相關(guān)。因此，可以使用本發(fā)明的抑制方法抑制癌癥患者中Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以做為抵抗Th1向Th2轉(zhuǎn)換和由此促進(jìn)患者中進(jìn)行的Th1應(yīng)答以改善疾病進(jìn)程的手段。該抑制方法可以涉及或者直接將抑制性藥物給予患有癌癥的受治療者或者活體外用抑制性藥物處理從該受治療者得到的細(xì)胞(例如Thp或Th2細(xì)胞)，接著將所述細(xì)胞再給予該受治療者?？梢酝ㄟ^(guò)將諸如細(xì)胞因子IL-12或抗Th2相關(guān)細(xì)胞因子抗體(例如抗IL-4抗體)的其它Th1促進(jìn)劑以足以進(jìn)一步刺激Th1型應(yīng)答的量給予該接受者，進(jìn)一步增強(qiáng)該治療。
C．傳染病亦曾報(bào)道Th2促進(jìn)細(xì)胞因子的表達(dá)在各種傳染病中增強(qiáng)，所述傳染病包括HIV感染、結(jié)核、利什曼病、血吸蟲(chóng)病、絲蟲(chóng)線蟲(chóng)感染和腸道線蟲(chóng)感染(參見(jiàn)例如；Shearer,G.M.和Clerici,M.(1992)Prog.Chem.Immunol.54:21-43；Clerici,M和Shearer,G.M.(1993)Immunology Today14:107-111；Fauci,A.S.(1988)Science239:617-623；Locksley,R.M.和Scott,P.(1992)Immunoparasitology Today 1:A58-A61；Pearce,E.J.，等(1991)J.Exp.Med.173:159-166；Grzych,J-M.，等(1991)J.Immunol.141:1322-1327；Kullberg,M.C.，等(1992)J.Immunol.148:3264-3270；Bancroft,A.J.，等(1993)J.Immunol.150:1395-1402；Pearlman,E，等(1993)Infect.Immun.61:1105-1112；Else,K.J.，等(1994)J.Exp.Med.179:347-351)并且這類傳染病亦與免疫應(yīng)答中Th1向Th2轉(zhuǎn)換相關(guān)。因此，可以使用本發(fā)明的抑制方法抑制患有傳染病的受治療者中Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，做為抵抗Th1向Th2轉(zhuǎn)換并由此促進(jìn)該患者中進(jìn)行的Th1應(yīng)答以改善該感染的進(jìn)程的手段。該抑制方法可以包括或者直接將抑制性藥物給予患有傳染病的受治療者，或者活體外用抑制性藥物處理從該受治療者得到的細(xì)胞(例如Thp或Th2細(xì)胞)，接著將所述細(xì)胞再給予該受治療者。可以通過(guò)將諸如細(xì)胞因子IL-12或抗Th2相關(guān)細(xì)胞因子抗體(例如抗IL-4抗體)的其它Th1促進(jìn)劑以足以進(jìn)一步刺激Th1型應(yīng)答的量給予該接受者，進(jìn)一步增強(qiáng)該治療。
D．自身完疫病本發(fā)明的刺激方法可以治療性地用于治療與Th2型功能障礙相關(guān)的自身免疫病。許多自身免疫病是對(duì)自身組織反應(yīng)和促進(jìn)參與所述疾病病理學(xué)的細(xì)胞因子和自抗體產(chǎn)生的T細(xì)胞的不適當(dāng)激活的結(jié)果。調(diào)節(jié)T輔助型應(yīng)答可以對(duì)自身免疫病的進(jìn)程有效應(yīng)。例如，在實(shí)驗(yàn)性腦變應(yīng)性脊髓炎(EAE)中，在該疾病誘導(dǎo)時(shí)通過(guò)給予IL-4刺激Th2型應(yīng)答削弱了該自身免疫病的程度(Paul,W.E.，等(1994)Cell76:241-251)。另外，已顯示動(dòng)物從該疾病恢復(fù)與由Th2相關(guān)細(xì)胞因子增加所證實(shí)的Th2型應(yīng)答增強(qiáng)相關(guān)(Koury,S.J.，等(1992)J.Exp.Med.176:1355-1364)。另外，可以抑制EAE的T細(xì)胞分泌Th2特異性細(xì)胞因子(Chen,C.，等(1994)Immunity 1:147-154)。由于EAE中刺激Th2型應(yīng)答具有對(duì)抗該疾病的保護(hù)效應(yīng)，因此在患有多發(fā)性硬化(EAE是其模型)的受治療者中刺激Th2應(yīng)答可能有治療益處。
類似地，在小鼠I型糖尿病中刺激Th2型應(yīng)答提供對(duì)抗該疾病的保護(hù)效應(yīng)。確實(shí)，用IL-4(它促進(jìn)Th2應(yīng)答)治療NOD小鼠防止或延遲了通常在這些小鼠中發(fā)展的I型糖尿病的發(fā)病(Rapoport,M.J.，等(1993)J.Exp.Med.178:87-99)。因此，在患有或易患糖尿病的受治療者中刺激Th2應(yīng)答可以改善該病的效果或抑制該病發(fā)病。
其中刺激Th2型應(yīng)答可能有益的再一自身免疫病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。研究顯示患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人在滑液組織中具有占優(yōu)勢(shì)的Th1細(xì)胞(Simon，A.K.，等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:8562-8566)。通過(guò)在患RA的受治療者中刺激Th2應(yīng)答，可以伴隨向下調(diào)節(jié)有害的Th1應(yīng)答以由此改善該疾病的影響。
因此，在患有或易患其中Th2型應(yīng)答對(duì)疾病進(jìn)程有益的自身免疫病的受治療者中，可以使用本發(fā)明的刺激方法刺激Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生。該刺激方法可以包括或者直接將刺激性藥物給予受治療者或者活體外用刺激性藥物處理從該受治療者得到的細(xì)胞(例如Thp、Th1細(xì)胞、B細(xì)胞、非淋巴樣細(xì)胞)，接著將所述細(xì)胞再給予該受治療者?？梢酝ㄟ^(guò)將諸如細(xì)胞因子IL-4本身或抗Th1相關(guān)細(xì)胞因子抗體(例如抗IL-4抗體)的其它Th2促進(jìn)劑以足以進(jìn)一步刺激Th2型應(yīng)答的量給予該接受者，進(jìn)一步增強(qiáng)該治療。
與上述其中Th2應(yīng)答是需要的自身免疫病相對(duì)比，可以通過(guò)Th1型應(yīng)答改善其它自身免疫病?？梢允褂帽景l(fā)明的抑制性藥物治療這類疾病(如上述關(guān)于癌癥和傳染病所述)?？梢酝ㄟ^(guò)以足以進(jìn)一步刺激Th1型應(yīng)答的量給予該受治療者Th1促進(jìn)細(xì)胞因子(例如IFN-γ)進(jìn)一步增強(qiáng)該治療。
可以在人類疾病的上述動(dòng)物模型(例如EAS做為多發(fā)性硬化模型，NOD小鼠做為糖尿病模型)或其它很好地特征記述的人類自身免疫病動(dòng)物模型中測(cè)試治療自身免疫病的藥物的效力。這種動(dòng)物模型包括做為紅斑狼瘡模型的mrl/lpr/lpr小鼠、做為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的鼠膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和鼠實(shí)驗(yàn)性重癥肌無(wú)力(參見(jiàn)Paul編輯的Fundamental Immunology,Raven Press,New York,1989，第40-856頁(yè))。將本發(fā)明的調(diào)節(jié)(即，刺激性或抑制性)劑給予測(cè)試動(dòng)物，然后通過(guò)使用的特定模型的標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測(cè)所述測(cè)試動(dòng)物中的該疾病進(jìn)程。與未治療動(dòng)物(或用對(duì)照藥物治療的動(dòng)物)相比，用該藥物治療的動(dòng)物中該病況的改善即證實(shí)了該調(diào)節(jié)劑的效力。
具有可以按照本發(fā)明處理的自身免疫成分的自身免疫病和紊亂的非限制性實(shí)例包括糖尿病、關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎)、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎、皮炎(包括特應(yīng)性皮炎和濕疹性皮炎)、牛皮癬、斯耶格倫綜合癥(包括斯耶格倫綜合癥繼發(fā)的干燥性角結(jié)膜炎)、斑形脫發(fā)、節(jié)肢動(dòng)物叮咬反應(yīng)引起的變態(tài)反應(yīng)應(yīng)答、局限性回腸炎、口瘡性潰瘍、虹膜炎、結(jié)膜炎、角結(jié)膜炎、潰瘍性結(jié)腸炎、哮喘、變應(yīng)性哮喘、皮膚紅斑狼瘡、硬皮病、陰道炎、直腸炎、藥物皮炎、麻風(fēng)可逆反應(yīng)、麻風(fēng)性結(jié)節(jié)性紅斑、自免疫眼色素層炎、變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎、急性壞死性出血性腦病、特發(fā)性兩側(cè)進(jìn)行性感音神經(jīng)性聽(tīng)覺(jué)喪失、再生障礙性貧血、純紅細(xì)胞貧血、特發(fā)性血小板減少癥、多軟骨炎、韋格納肉芽腫病、慢性活動(dòng)性肝炎、史蒂文斯-約翰遜綜合癥、特發(fā)性口炎性腹瀉、扁平苔蘚、局限性回腸炎、格雷夫斯眼病、結(jié)節(jié)病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、后色素層炎和間質(zhì)性肺纖維化。
E．移植雖然移植排斥或移植接受可能不僅僅歸因于移植受體中的特定T細(xì)胞亞群(即，Th1或Th2細(xì)胞)的作用(有關(guān)討論參見(jiàn)Dallman,M.J.(1995)Curr.Opin.Immunol.7:632-638)，許多研究顯示在延長(zhǎng)的移植物存活中占優(yōu)勢(shì)的Th2應(yīng)答或移植排斥中占優(yōu)勢(shì)的Th1應(yīng)答。例如，移植接受已與Th2細(xì)胞因子型式產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)和/或移植排斥已與Th1細(xì)胞因子型式產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)(參見(jiàn)例如Takeuchi,T.等(1992)Transplantation53:1281-1291；Tzakis,A.G.等(1994)J.Pediatr.Surg.29:754-756；Thai,N.L.等(1995)Transplantation59:274-281)。另外，具有Th2細(xì)胞因子表現(xiàn)型的細(xì)胞的繼承性轉(zhuǎn)移延長(zhǎng)了皮膚移植存活(Maeda,H.等(1994)Int.Immunol.6:855-862)并減少移植物對(duì)抗宿主疾病(Fowler,D.H.等(1994)Blood84:3540-3549；Fowler,D.H.等(1994)Prog.Clin.Biol.Res.389:533-540)。再有，給予促進(jìn)Th2分化的IL-4延長(zhǎng)了心臟同種移植物的存活(Levy,A.E.和Alexander,J.W.(1995)Transplantation60:405-406)，而與促進(jìn)Th1分化的抗IL-10抗體聯(lián)合給予IL-12增強(qiáng)了皮膚同種移植排斥(Gorczynski,R.M.等(1995)Transplantation60:1337-1341)。
因此，可以使用本發(fā)明的刺激方法刺激移植受體中產(chǎn)生Th2相關(guān)細(xì)胞因子，以延長(zhǎng)移植物的存活。該刺激方法可以用于實(shí)體(solid)器官移植和骨髓移植(例如抑制移植物對(duì)抗宿主疾病)。該刺激方法可以包括或者直接將刺激性藥物給予該移植受體，或者活體外用刺激性藥物處理從該受治療者得到的細(xì)胞(例如Thp、Th1細(xì)胞、B細(xì)胞、非淋巴樣細(xì)胞)，接著將該細(xì)胞再給予該受治療者。可以通過(guò)將諸如IL-4自身或抗Th1相關(guān)細(xì)胞因子抗體的其它Th2促進(jìn)藥物以足以進(jìn)一步刺激Th2型應(yīng)答的量給予該受體，進(jìn)一步增強(qiáng)該治療。
除了前述病況外，本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法亦可以用于其它目的。例如，本發(fā)明的刺激方法(即，使用刺激性藥物的方法)可以用于體外刺激產(chǎn)生Th2促進(jìn)細(xì)胞因子(例如IL-4)以工業(yè)生產(chǎn)這些細(xì)胞因子(例如可以用刺激性藥物體外接觸細(xì)胞，以衣刺激產(chǎn)生IL-4，并可以從該培養(yǎng)上清液回收IL-4，并根據(jù)需要進(jìn)一步純化和包裝用于商業(yè)用途)。
另外，本發(fā)明的調(diào)節(jié)方法可以應(yīng)用于疫苗接種，以促進(jìn)受治療者中目的抗原的或者Th1應(yīng)答或者Th2應(yīng)答。即本發(fā)明的藥物可以用作輔助劑，以使對(duì)疫苗的應(yīng)答為T(mén)h1應(yīng)答或Th2應(yīng)答。例如，為刺激對(duì)目的抗原的抗體應(yīng)答(例如用于疫苗接種目的)，可以將該抗原和本發(fā)明的刺激性藥物共給予受治療者，以促進(jìn)該受治療者中對(duì)該抗原的Th2應(yīng)答，因?yàn)門(mén)h2應(yīng)答提供有效的B細(xì)胞，幫助并促進(jìn)IgG1產(chǎn)生。或者，為促進(jìn)對(duì)目的抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答，可以將該抗原和本發(fā)明的抑制性藥物共給予受治療者，以促進(jìn)對(duì)受治療者中對(duì)該抗原的Th1應(yīng)答，因?yàn)門(mén)h1應(yīng)答有利于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的發(fā)展(例如延遲超敏反應(yīng)應(yīng)答)?？梢詫⒛康目乖驮撜{(diào)節(jié)性藥物一同配制成為單一藥用組合物或分離的組合物。在最佳實(shí)施方案中，將目的抗原和該調(diào)節(jié)性藥物同時(shí)給予該受治療者?；蛘?，在某些情況下可能需要首先給予該抗原，然后給予該調(diào)節(jié)性藥物或相反(例如在抗原天然引起Th1應(yīng)答的情況下，首先單獨(dú)給予該抗原以刺激Th1應(yīng)答，然后給予該刺激性藥物自身或與抗原加強(qiáng)一起以將免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)換為T(mén)h2應(yīng)答可能是有益的)。Ⅳ．Maf組合物本發(fā)明的另一方面涉及可以用于按照本發(fā)明的方法在受治療者中調(diào)節(jié)細(xì)胞的Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生或Th1/Th2發(fā)育的組合物。本發(fā)明提供包含編碼maf家族蛋白的核苷酸序列的重組表達(dá)載體，所述核苷酸序列操作性地連接至指導(dǎo)在某些細(xì)胞類型中特異性地表達(dá)maf家族蛋白的調(diào)節(jié)序列。在最佳實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)maf家族蛋白在淋巴樣細(xì)胞(例如T細(xì)胞或B細(xì)胞)中特異性表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述淋巴細(xì)胞是T細(xì)胞。本領(lǐng)域已知T細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件，例如T細(xì)胞受體基因的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)(參見(jiàn)例如Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8:729-733；Leiden,J.M.(1994)Annu.Rev.Immunol.11:539-570；Hettman,T.和Cohen,A.(1994)Mol.Immunol.31:315-322；Redondo,J.M.等(1991)Mol.Cell.Biol.11:5671-5680)。T細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件的其它實(shí)例是那些源自下述基因的調(diào)節(jié)元件CD3基因(參見(jiàn)例如Clevers,H.等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8623-8627；Clevers,H.C.等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8156-8160；Georgopoulos,K.等(1988)EMBO J.7:2401-2407)、CD4基因(參見(jiàn)例如Sawada,S.和Littman,D.R.(1991)Mol.Cell.Biol.11:5506-5515；Salmon,P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:7739-7743；Hanna,Z.等(1994)Mol.Cell.Biol.14:1084-1094；亦參見(jiàn)GenBank檢索號(hào)U01066和S68043的人類CD4啟動(dòng)子序列)和CD2基因(參見(jiàn)例如Zhumabekov,T.等(1995)J.Immunol.Methods 185:133-140)?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法得到包含諸如T細(xì)胞受體基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的一個(gè)或多個(gè)T細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件的DNA片段，例如通過(guò)使用對(duì)應(yīng)于所需區(qū)的5’和3’末端的寡核苷酸引物或來(lái)自T細(xì)胞的基因組DNA做為模板，通過(guò)PCR得到。一旦得到包含T細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件的DNA片段，則可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將其操作性地連接至編碼maf蛋白的cDNA(例如可以將這兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)，使得該調(diào)節(jié)元件位于該maf序列的5’)，并導(dǎo)入諸如質(zhì)粒載體的載體。
在另一實(shí)施方案中，該淋巴樣細(xì)胞是B細(xì)胞(即，在該重組表達(dá)載體內(nèi)編碼maf家族蛋白的核苷酸序列操作性地連接至指導(dǎo)在B細(xì)胞中特異性地表達(dá)maf家族蛋白的調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域已知B細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件，例如免疫球蛋白基因的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)(參見(jiàn)例如Banerji等(1983)Cell 33:729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell33:741-748)。B細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件的其它實(shí)例是那些源自CD20(B1)基因的(參見(jiàn)例如Thevenin,C.等(1993)J.Biol.Chem.268:5949-5956；Rieckmann,P.等(1991)J.Immunol.147:3994-3999)、源自FcεRIIa基因的(參見(jiàn)例如Suter,U.等(1989)J.Immunol.143:3087-3092)和源自主要組織相容性Ⅱ類基因的(參見(jiàn)例如Glimcher,L.H.和Kara,C.J.(1992)Annu.Rev.Immunol.10:13-49；Benoist,C.和Mathis,D.(1990)Annu.Rev.Immunol.8:681-715)調(diào)節(jié)元件?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法得到包含諸如免疫球蛋白基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的B細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件的DNA片段，例如通過(guò)使用對(duì)應(yīng)于所需區(qū)的5’和3’末端的寡核苷酸引物或來(lái)自B細(xì)胞的基因組DNA做為模板通過(guò)PCR得到。一旦得到包含B細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件的DNA片段，則可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將其操作性地連接至編碼maf蛋白的cDNA(例如可以將這兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)，使得該調(diào)節(jié)元件位于所述maf序列的5’)，并導(dǎo)入諸如質(zhì)粒載體的載體。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含編碼maf家族蛋白的核苷酸序列的重組表達(dá)載體，所述核苷酸序列操作性地連接至指導(dǎo)在造血干細(xì)胞中特異性地表達(dá)maf家族蛋白的調(diào)節(jié)序列。本領(lǐng)域已知造血干細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)元件。最好使用源自CD34基因的調(diào)節(jié)元件(參見(jiàn)例如Satterthwaite,A.B.等(1992)Genomics 12:788-794；Burn,T.C.等(1992)Blood 80:3051-3059)。
本發(fā)明的另一方面涉及表達(dá)maf家族蛋白的重組宿主細(xì)胞?？梢允褂眠@種宿主細(xì)胞產(chǎn)生Th2相關(guān)細(xì)胞因子(例如IL-4)。亦可將這種宿主細(xì)胞給予受治療者，以在該受治療者中產(chǎn)生Th2相關(guān)細(xì)胞因子做為在該受治療者中操縱Th1∶Th2比例的手段。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在本文中可互換使用，指其中已導(dǎo)入了重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)理解，這種術(shù)語(yǔ)不僅指特定對(duì)象細(xì)胞，也指這種細(xì)胞的子代。因?yàn)橛捎诨蛘咄蛔兓蛘攮h(huán)境影響在后續(xù)世代中可能發(fā)生某些修飾，這種子代事實(shí)上可能與親代細(xì)胞不同，但是只要這些子代細(xì)胞保留該重組表達(dá)載體，這些子代仍然包括于本文使用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”的范圍之內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供已導(dǎo)入編碼maf家族蛋白的重組表達(dá)載體的宿主淋巴樣細(xì)胞。該宿主淋巴樣細(xì)胞可以是T細(xì)胞或B細(xì)胞。本發(fā)明的宿主T細(xì)胞可以是例如體外培養(yǎng)的T細(xì)胞克隆(諸如實(shí)施例中描述的)，或者是從受治療者中分離的正常T細(xì)胞(例如外周血T細(xì)胞或脾T細(xì)胞)。本領(lǐng)域已知體外制備和培養(yǎng)T細(xì)胞克隆或分離T細(xì)胞(例如從外周血)的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過(guò)使用結(jié)合T細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)記(例如CD3)或T細(xì)胞特定亞群的表面標(biāo)記(例如CD4或CD8)的mAb。可以通過(guò)各種已知的將DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法的一種將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入T細(xì)胞，所述方法包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、lipofectin或電穿孔?？梢栽赟ambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，Cold Spring HarborLaboratory出版社(1989)和其它實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主淋巴樣細(xì)胞是宿主B細(xì)胞，其中已導(dǎo)入了編碼maf家族蛋白的重組表達(dá)載體。該B細(xì)胞可以是例如體外培養(yǎng)的B淋巴瘤細(xì)胞(諸如實(shí)施例中描述的M12細(xì)胞)，或者是從受治療者中分離的正常B細(xì)胞(例如外周血B細(xì)胞或脾B細(xì)胞)。本領(lǐng)域可得到各種B淋巴瘤細(xì)胞系并已知體外培養(yǎng)這種細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法。另外，本領(lǐng)域已知分離正常B細(xì)胞(例如從外周血)的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過(guò)使用結(jié)合B細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)記(例如膜免疫球蛋白B7-1、CD20)的mAb?？梢匀缟鲜鯰細(xì)胞那樣通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入該B細(xì)胞。
在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供已導(dǎo)入編碼maf家族蛋白的重組表達(dá)載體的宿主造血干細(xì)胞?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的分離這種干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法從受治療者(例如從該受治療者的外周血或骨髓)分離造血干細(xì)胞，例如通過(guò)使用結(jié)合造血干細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)記(最好為CD34)的mAb(有關(guān)分離干細(xì)胞的進(jìn)一步描述，參見(jiàn)例如Wagner,J.E.等(1995)Blood86:512-523；Murray,L.等(1995)Blood85:368-378；Bemardi,A.C.等(1995)Science 267:104-108；Bemstein,I.D.等(1994)Blood Cells20:15-24；Angelini,A.等(1993)Int.J.Artif.Organs 16增刊5:13-18；Kato,K.和Radburch,A.(1993)Cytometry14:384-392；Lebkowski,J.S.等(1992)Transplantation 53:1011-1019；Lebkowski,J.等(1993)J.Hematother.2:339-342)。。可以如上述T細(xì)胞那樣通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入該造血干細(xì)胞。
熟練技術(shù)人員將會(huì)理解上述有關(guān)maf家族蛋白的組合物可以為各種不同maf家族蛋白諸如c-Maf和小maf(例如p18)制備。
本發(fā)明再提供攜帶編碼maf家族蛋白的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在最佳實(shí)施方案中，該maf家族轉(zhuǎn)基因優(yōu)先或僅在該動(dòng)物的T細(xì)胞中表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)將轉(zhuǎn)基因中的該maf編碼序列連接至指導(dǎo)在特定細(xì)胞類型中表達(dá)該編碼蛋白的調(diào)節(jié)序列，達(dá)到maf家族蛋白的組織特異性表達(dá)。本領(lǐng)域已知這種組織特異性調(diào)節(jié)元件并將在本文中進(jìn)一步描述。推薦的maf家族轉(zhuǎn)基因的T細(xì)胞特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)元件是CD4啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。推薦用于轉(zhuǎn)基因的maf家族蛋白是c-maf。推薦c-maf轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物的示意圖示于圖20中。在這個(gè)構(gòu)建物中，該CD4啟動(dòng)子/增強(qiáng)子操作性地連接至小鼠c-maf基因的第一個(gè)內(nèi)含子，再操作性地連接至小鼠c-mafcDNA，后者又操作性地連接至SV40多聚腺苷酸化序列?？梢园凑毡疚倪M(jìn)一步詳細(xì)描述的制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)程序通過(guò)將c-maf轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物微注射入受精的卵母細(xì)胞制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在T細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)c-Maf蛋白的c-maf轉(zhuǎn)基因小鼠的表現(xiàn)型在實(shí)施例17中進(jìn)一步描述。簡(jiǎn)言之，這些動(dòng)物表現(xiàn)出與IL-4過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠非常類似的表現(xiàn)型，例如小脾臟和胸腺、雙陽(yáng)性胸腺細(xì)胞和單陽(yáng)性CD4+胸腺細(xì)胞數(shù)減少和血清IgE基礎(chǔ)水平增加。表達(dá)maf家族蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以用于例如評(píng)價(jià)測(cè)試化合物調(diào)節(jié)maf家族蛋白活性的能力。例如，可以給予表達(dá)maf家族蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物測(cè)試化合物，該測(cè)試化合物在該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的效果可以通過(guò)比較在存在該測(cè)試化合物的情況下該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表現(xiàn)型和在缺乏該測(cè)試化合物的情況下該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表現(xiàn)型而確定。Ⅴ．NIP45組合物及其使用方法A．分離的核酸分子本發(fā)明的一個(gè)方面涉及編碼NIP45或其片段的分離的核酸分子。在最佳實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子包含示于SEQ ID NO:5的核苷酸序列。SEQ ID NO:5的序列對(duì)應(yīng)于小鼠NIP45 cDNA。該cDNA包含編碼NIP45蛋白的序列(即，“編碼區(qū)”，從核苷酸13至1248)以及5’非翻譯序列(核苷酸1-12)和3’非翻譯序列(核苷酸1249-1946)。或者，該核酸分子可以僅包含SEQ ID NO:5的編碼區(qū)(即，核苷酸13-1248)。
另外，本發(fā)明的核酸分子可以僅包含SEQ ID NO:5的編碼區(qū)的一部分，例如，編碼NIP45的生物學(xué)活性部分的片段。術(shù)語(yǔ)“NIP45的生物學(xué)活性部分”包括保留與NT-AT家族蛋白的RHD相互作用能力的NIP45的部分。NIP45的部分與NF-AT RHD相互作用的能力可以在標(biāo)準(zhǔn)體外相互作用檢測(cè)中確定，例如使用NF-AT RHD融合蛋白?？梢酝ㄟ^(guò)分離SEQ ID NO:5的部分、表達(dá)NIP45蛋白或肽的被編碼部分(例如通過(guò)在宿主細(xì)胞中重組表達(dá))并例如使用谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)-NF-AT-RHD融合蛋白評(píng)價(jià)該部分與NF-AT特別是NF-AT RHD相互作用的能力，制備編碼生物學(xué)活性NIP45部分的核酸片段。
本發(fā)明再包括由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性與SEQ ID NO:5(或其片段)不同并由此編碼與SEQ ID NO:5編碼的相同的NIP45蛋白的核酸分子。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的核酸分子具有編碼具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列。另外，本發(fā)明包括編碼SEQ ID NO:6的部分例如其生物學(xué)活性部分的核酸分子。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息，分離具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列或其部分的核酸分子。例如，使用SEQ IDNO:5的全部或部分做為雜交探針和使用標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(例如如描述于Sambrook,J.等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY,1989)，可以從cDNA文庫(kù)分離NIP45cDNA。另外，可以通過(guò)使用基于SEQ ID NO:5的序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，分離包含所有或部分SEQ ID NO:5的核酸分子。例如，可以從細(xì)胞分離mRNA(例如通過(guò)Chirgwin等(1979Biochemistry18:5294-5299的硫氰酸鈲提取程序)并可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶(例如可以從Gibco/BRL,Bethesda,MD得到的Moloney MLV逆轉(zhuǎn)錄酶；或可以從Seikagaku America,Inc.,St.Petersburg,FL得到的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶)制備cDNA?？梢曰谑居赟EQ ID NO:5的核苷酸序列設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增的合成寡核苷酸引物?？梢允褂胏DNA或者基因組DNA做為模板并使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋铮凑諛?biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。可以將如此擴(kuò)增的核酸克隆入適當(dāng)?shù)妮d體，并通過(guò)DNA序列分析鑒定。另外，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)，例如使用自動(dòng)DNA合成儀，制備對(duì)應(yīng)于NIP45核苷酸序列的寡核苷酸。
除了示于SEQ ID NO:5的NIP45核苷酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解在種群內(nèi)可以存在導(dǎo)致NIP45氨基酸序列改變的DNA序列多態(tài)性。NIP45基因中的這種遺傳多態(tài)性可能由于自然等位變異存在于種群內(nèi)的個(gè)體之中。這種自然等位變異可以通常導(dǎo)致基因的核苷酸序列中1-5％的變異。做為自然等位變異的結(jié)果和不改變NIP45功能活性的NIP45中的任何和所有這種核苷酸變異和導(dǎo)致的氨基酸多態(tài)性均屬于本發(fā)明的范圍。另外，編碼來(lái)自其它物種的NIP45的核酸分子并因此具有不同于SEQ ID NO:5的小鼠序列但卻與該小鼠序列相關(guān)的核苷酸序列屬于本發(fā)明的范圍。對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的小鼠NIP45cDNA的自然等位變異以及人類和其它哺乳動(dòng)物同源物的核酸分子可以基于其與本文公開(kāi)的小鼠NIP45核酸分子的同源性，使用該小鼠cDNA或其片段做為雜交探針，按照標(biāo)準(zhǔn)雜交條件在嚴(yán)格雜交條件下分離。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子在嚴(yán)格條件下與包含SEQ IDNO:5的核苷酸序列的核酸分子雜交。在某些實(shí)施方案中，該核酸的長(zhǎng)度至少為15、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1500個(gè)核苷酸。在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:5序列雜交的本發(fā)明的分離核酸分子最好對(duì)應(yīng)于天然存在的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，該核酸編碼天然人類NIP45蛋白。在另一實(shí)施方案中，該核酸分子編碼諸如小鼠NIP45蛋白的鼠NIP45蛋白。
除了可能存在于種群中的NIP45序列的天然存在的等位變異，熟練技術(shù)人員將會(huì)進(jìn)一步理解，可以通過(guò)突變將變化導(dǎo)入SEQ ID NO:5的核苷酸序列，由此導(dǎo)致被編碼蛋白的氨基酸序列變化，而不改變?cè)揘IP45蛋白的功能活性。例如，可以在SEQ ID NO:5的序列中造成導(dǎo)致于“非必需”氨基酸殘基的氨基酸置換的核苷酸置換?！胺潜匦琛卑被釟埢强梢詮腘IP45野生型序列(例如SEQ ID NO:6的序列)改變而不改變NIP45的功能活性的殘基，這種功能活性諸如它與NF-ATRHD相互作用的能力或它與NF-AT和c-Maf在刺激基因轉(zhuǎn)錄中協(xié)同，而“必需”氨基酸殘基對(duì)于功能活性是需要的。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及的核酸分子，它編碼在對(duì)NIP45活性非必需的氨基酸殘基中含有變化的NIP45蛋白。這種NIP45蛋白與SEQ ID NO:6的氨基酸序列不同，但卻保留NIP45活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，該分離核酸分子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中該蛋白包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列并與NF-AT家族蛋白的RHD相互作用。由該核酸分子編碼的該蛋白優(yōu)選與SEQ ID NO:6至少70％同源、更優(yōu)選與SEQ ID NO:6至少80％同源、甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO:6至少90％同源，最優(yōu)選與SEQ ID NO:6至少95％同源。
為確定二個(gè)氨基酸序列(例如SEQ ID NO:6與其突變形式)的同源百分比，將這些序列對(duì)齊以進(jìn)行最佳比較(例如為與另一蛋白最佳對(duì)比，可以在蛋白序列中導(dǎo)入空隙)。然后比較位于對(duì)應(yīng)氨基酸位置的氨基酸殘基。當(dāng)一個(gè)序列(例如SEQ ID NO:6)中的位置由與另一序列(例如NIP45的突變形式)中對(duì)應(yīng)位置的同一氨基酸殘基占據(jù)，那么在所述分子于此位置是同源的(即，本文使用的氨基酸“同源性”與氨基酸“相等性”相等)。二個(gè)序列之間的同源性百分比是由這些序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，同源性％=相等位置數(shù)/總位置數(shù)×100)。
可以通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、添加或缺失導(dǎo)入SEQ ID NO:5的核苷酸序列，使得一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加或缺失被導(dǎo)入被編碼的蛋白，而制備編碼與SEQ ID NO:6的蛋白同源的NIP45蛋白的分離核酸分子?？梢酝ㄟ^(guò)諸如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)誘變將突變導(dǎo)入SEQ ID NO:5。最好在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基進(jìn)行保守氨基酸置換?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是其中用具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換該氨基酸殘基的置換。本領(lǐng)域已定義具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族，包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，最好用來(lái)自同一側(cè)鏈家族的另一氨基酸殘基替換NIP45蛋白中的氨基酸殘基?；蛘撸诹硪粚?shí)施方案中，可以例如通過(guò)飽和誘變沿著NIP45編碼序列的全部或部分隨機(jī)導(dǎo)入突變，可以就與NF-AT RHD(例如使用GST-NF-AT-RHD融合蛋白)相互作用的能力篩選得到的突變體，以鑒別保留與NF-AT相互作用能力的突變體。在誘變SEQ ID NO:5后，可以在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)該編碼的突變體蛋白，并可以用體外相互作用檢測(cè)測(cè)定該突變體蛋白與NF-AT相互作用的能力。例如，可以放射標(biāo)記重組NIP45蛋白(例如SEQ ID NO:6的突變或截短的形式)并與GST-NF-AT RHD融合蛋白溫育。然后假如形成了這種復(fù)合物，將谷胱甘肽瓊脂糖膠粒加入該混合物，以沉淀NIP45-GST-NF-AT RHD復(fù)合物。在清洗該膠粒以除去非特異性結(jié)合之后，測(cè)定與該膠粒相結(jié)合的放射性蛋白的量并與殘留于洗脫液中的放射性蛋白的量比較，以由此此確定該NIP45蛋白能否有與NF-AT的RHD相互作用。
本發(fā)明的另一方面涉及與NIP45mRNA編碼鏈或基因反義的分離核酸分子。本發(fā)明的反義核酸可以與整個(gè)NIP45編碼鏈或僅其部分互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義核酸分子與編碼NIP45的核苷酸序列的編碼鏈的編碼區(qū)(例如包含核苷酸13-1248的SEQ ID NO:5的整個(gè)編碼區(qū))反義。在另一實(shí)施方案中，該反義核酸分子與編碼NIP45的核苷酸序列的編碼鏈的非編碼區(qū)反義。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸的長(zhǎng)度至少為15、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1500個(gè)核苷酸。
已知本文公開(kāi)的編碼NIP45的編碼鏈序列(例如SEQ ID NO:5)，可以按照沃森和克里克堿基配對(duì)原則設(shè)計(jì)本發(fā)明的反義核酸。該反義核酸分子可以與NIP45mRNA的整個(gè)編碼區(qū)互補(bǔ)，或者可以是僅與NIP45mRNA的編碼區(qū)或非編碼區(qū)的一部分反義的寡核苷酸。例如，該反義寡核苷酸可以與NIP45 mRNA翻譯起始位點(diǎn)周?chē)膮^(qū)互補(bǔ)。反義寡核苷酸的長(zhǎng)度可以是例如約15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸。可以使用本領(lǐng)域已知的方法使用化學(xué)合成和酶連接反應(yīng)構(gòu)建本發(fā)明的反義核酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或設(shè)計(jì)用于增加該分子的生物學(xué)穩(wěn)定性或增加反義和有義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性的各種修飾核苷酸，化學(xué)合成反義核酸(例如反義寡核苷酸)，例如，可以使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸?；蛘?，可以使用其中已以反義定位(即，從該插入的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA將與目的靶核酸反義，在以下小節(jié)中進(jìn)一步描述)亞克隆核酸的表達(dá)載體，在生物學(xué)上產(chǎn)生反義核酸。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它可以酶切與其有互補(bǔ)區(qū)的諸如mRNA的單鏈核酸?？梢曰诒疚墓_(kāi)的NIP45 cDNA核苷酸序列(即，SEQ ID NO:5)，設(shè)計(jì)對(duì)NIP45編碼核酸具有特異性的核酶。例如，可以構(gòu)建四膜蟲(chóng)屬L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位點(diǎn)的堿基序列與NIP45編碼mRNA中欲酶切的堿基序列互補(bǔ)。參見(jiàn)例如Cech等美國(guó)專利4,987,071號(hào)；和Cech等美國(guó)專利5,116,742號(hào)?；蛘?，可以使用NIP45mRNA從RNA分子庫(kù)中選擇具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA。參見(jiàn)例如Bartel,D.和Szostak,J.W.(1993)Science261:1411-1418。
本發(fā)明的再一方面涉及編碼NIP45融合蛋白的分離核酸分子?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，制備這種包含至少操作性地連接至編碼非NIP45蛋白、多肽或肽的第二核苷酸序列的編碼NIP45蛋白、多肽或肽的第一核苷酸序列的核酸分子。在以下C小節(jié)中進(jìn)一步詳細(xì)描述NIP45融合蛋白。
B．重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明的另一方面涉及含有編碼NIP45(或其部分)的核酸的載體，最好是重組表達(dá)載體。本發(fā)明的表達(dá)載體包含適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)該核酸的形式的本發(fā)明的核酸，這意味著該重組表達(dá)載體包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞選擇并操作性地連接至欲表達(dá)的核酸序列。在重組表達(dá)載體內(nèi)，“操作性地連接”指目的核苷酸序列以允許表達(dá)該核苷酸序列的方式(例如在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)或當(dāng)該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)在宿主細(xì)胞中)連接至該調(diào)節(jié)序列。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如多聚腺苷酸化信號(hào))。這種調(diào)節(jié)序列描述于例如Goeddel；GeneExpression Technology: Methods in Enzymology185,Academic Press,SanDiego,CA(1990)。調(diào)節(jié)序列包括那些在許多宿主細(xì)胞類型中指導(dǎo)組成型表達(dá)核苷酸序列的序列和那些僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)該核苷酸序列表達(dá)的序列(例如組織特異性調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可以取決于將要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需蛋白表達(dá)水平等?？梢詫⒈景l(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以由此產(chǎn)生由本文描述的核酸編碼的包括融合蛋白或肽的蛋白或肽(例如NIP45蛋白、NIP45蛋白的突變形式、NIP45融合蛋白等等)。
可以設(shè)計(jì)本發(fā)明的重組表達(dá)載體以在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)NIP45蛋白。例如，可以在諸如大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)NIP45。在Goeddel；Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中進(jìn)一步討論合適的宿主細(xì)胞?；蛘?，可以例如使用T7啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯該重組表達(dá)載體。
最常用含有指導(dǎo)或者融合或者非融合蛋白表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白在原核生物中的表達(dá)。融合載體將一些氨基酸加至其中編碼的蛋白上，一般加至該重組蛋白的氨基末端。這種融合載體通常適合三個(gè)目的1)增加重組蛋白的表達(dá)；2)增強(qiáng)該重組蛋白的溶解度；和3)通過(guò)做為親和純化中的配體起作用幫助純化該重組蛋白。經(jīng)常在融合表達(dá)載體中，在該融合部分和該重組蛋白的連接處導(dǎo)入一個(gè)蛋白酶剪切位點(diǎn)，以在純化該融合蛋白之后能夠從該融合等分分離該重組蛋白。這種酶及其同源識(shí)別序列包括因子X(jué)a、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括pGEX(PharmaciaBiotech Inc；Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，它們分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A融合至靶重組蛋白。
合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例包括pTrc(Amann等，(1988)Gene69:301-315)和pET11d(Studier等，Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,Califormia(1990)60-89)。靶基因從pTrc載體的表達(dá)依賴于宿主RNA聚合酶從雜種trp-lac融合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。靶基因從pET 11d載體的表達(dá)依賴于從由共表達(dá)病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導(dǎo)的T7gn10-1ac融合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。該病毒聚合酶由來(lái)自包含在lacUV5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下的T7gnl基因的存留(resident)λ原噬菌體的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供。
在大腸桿菌中最大表達(dá)重組蛋白的一種策略是在蛋白酶剪切該重組蛋白的能力削弱的宿主細(xì)菌中表達(dá)該蛋白(Gottesman,S.,GeneExpression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,SanDiego,Califomia(1990)119-128)。另一策略是改變欲插入表達(dá)載體的核酸的核酸序列，使得每個(gè)氨基酸的單個(gè)密碼子是那些在大腸桿菌中優(yōu)先使用的(Wada等，(1992)Nuc.Acids Res.20:2111-2118)?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)進(jìn)行本發(fā)明核酸序列的這種改變。
在另一實(shí)施方案中，該NIP45表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。在啤酒酵母中表達(dá)的載體的實(shí)例包括pYepSecl(Baldari等，(1987)EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene54:113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation,San Diego,CA)。
或者，可以使用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)NIP45?？捎糜谠谂囵B(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等，(1983)Mol.Cell Biol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow,V.A.和Summers,M.D.,(1989)Virology 170:31-39)。
在再一實(shí)施方案中，使用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例包括pMex-NeoⅠ、pCDM8(Seed,B.,(1987)Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等(1987),EMBOJ.6:187-195)。當(dāng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，通常由病毒調(diào)節(jié)元件提供表達(dá)載體的控制功能。例如，常用的啟動(dòng)子源自多形瘤、腺病毒2、細(xì)胞肥大病毒和猿猴病毒40。
在另一實(shí)施方案中，該重組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以優(yōu)先在特定細(xì)胞類型中指導(dǎo)表達(dá)該核酸(例如使用組織特異性調(diào)節(jié)元件表達(dá)該核酸)。本領(lǐng)域已知組織特異性調(diào)節(jié)元件。合適的組織特異性啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括淋巴特異性啟動(dòng)子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235-275)、特別是T細(xì)胞受體啟動(dòng)子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8:729-733)和免疫蛋白啟動(dòng)子(Banerji等(1983)Cell33:729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell33:741-748)、白蛋白啟動(dòng)子(肝臟特異性；Pinkert等(1987)Genes Dev.1:268-277)、神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子(例如神經(jīng)絲啟動(dòng)子；Byme和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477)、胰臟特異性啟動(dòng)子(Edlund等(1985)Science230:912-916)和乳腺特異性啟動(dòng)子(例如乳清啟動(dòng)子；美國(guó)專利4,873,316號(hào)和歐洲申請(qǐng)公布號(hào)264,166)。亦包括發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，例如鼠hox啟動(dòng)子(Kessel和Gruss(1990)Science249:374-379)和甲胎蛋白啟動(dòng)子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3:537-546)。
本發(fā)明另外提供包含以反義定位克隆入該表達(dá)載體的本發(fā)明的DNA分子的重組表達(dá)載體。即，將該DNA分子操作性地連接至調(diào)節(jié)序列，其連接方式使得表達(dá)(通過(guò)轉(zhuǎn)錄該DNA分子)與NIP45mRNA反義的RNA分子?？梢赃x擇操作性地連接至以反義定位克隆的核酸的調(diào)節(jié)序列，該序列指導(dǎo)該反義RNA分子在各種細(xì)胞內(nèi)連續(xù)表達(dá)，例如可以選擇病毒啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子或調(diào)節(jié)序列，它們指導(dǎo)反義RNA的組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)。該反義表達(dá)載體可以是例如重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒的形式，其中反義核酸在高效調(diào)節(jié)區(qū)的控制之下產(chǎn)生，該區(qū)的活性由導(dǎo)入該載體的細(xì)胞類型確定。有關(guān)使用反義基因調(diào)節(jié)基因表達(dá)的討論，參見(jiàn)Weintraub,H.等，作為遺傳分析分子工具的反義RNA,Reviews-Trends in Genetics，第1(1)卷1986。
本發(fā)明的另一方面涉及已導(dǎo)入本發(fā)明的載體、最好是重組表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。例如，可以在諸如大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或COS細(xì)胞)中表達(dá)NIP45蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其它合適的宿主細(xì)胞。可以通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞。本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”指各種本領(lǐng)域認(rèn)可的將異源核酸(例如DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、lipofectin或電穿孔?？梢栽赟ambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989))和其它實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中找到轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適方法。
為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，已知根據(jù)使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅有小部分細(xì)胞可能將外源DNA整合入其基因組。為鑒別和選擇這些整合體，一般將編碼可選擇標(biāo)記(例如對(duì)抗生素抗性)的基因與目的基因一起導(dǎo)入宿主細(xì)胞。推薦的可選擇標(biāo)記包括那些賦予對(duì)藥物(例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤)抗性的的選擇性標(biāo)記?？梢栽诰幋aNIP45的同一載體上或在獨(dú)立載體上將編碼可選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)藥物選擇鑒別用導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如整合了該可選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞死亡)。
諸如培養(yǎng)中的原核或真核宿主細(xì)胞的本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以用于生產(chǎn)(即表達(dá))NIP45蛋白。因此，本發(fā)明再提供使用本發(fā)明的宿主細(xì)胞生產(chǎn)NIP45蛋白的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包含在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(其中已導(dǎo)入了編碼NIP45的重組表達(dá)載體)直至產(chǎn)生NIP45。在另一實(shí)施方案中，該方法再包含從該培養(yǎng)基或該宿主細(xì)胞分離NIP45。天然形式的NIP45蛋白是胞內(nèi)蛋白，因此，可以在重組宿主細(xì)胞中胞內(nèi)表達(dá)重組NIP45蛋白，然后例如通過(guò)裂解該宿主細(xì)胞并從該裂解液回收該重組NIP45蛋白，而從該宿主細(xì)胞分離重組NIP45蛋白?；蛘?，可以通過(guò)將異源信號(hào)序列連接至該蛋白的氨基末端，使得該蛋白從該宿主細(xì)胞分泌，而制備做為胞外蛋白的重組NIP45蛋白。在這種情況下，可以從培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中回收重組NIP45蛋白。
亦可以使用本發(fā)明的某些宿主細(xì)胞產(chǎn)生非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明的宿主細(xì)胞是已導(dǎo)入了NIP45編碼序列的受精卵母細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞。然后，可以使用這種宿主細(xì)胞產(chǎn)生其基因組中已導(dǎo)入了外源NIP45序列的非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或其中內(nèi)源NIP45序列已被改變的同源重組動(dòng)物。這種動(dòng)物可以用于研究NIP45的功能和/或活性，和用于鑒別和/或評(píng)價(jià)NIP45活性的調(diào)節(jié)物。因此，本發(fā)明的另一方面涉及含有攜帶編碼NIP45蛋白或NIP45蛋白部分的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞的非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一個(gè)分實(shí)施方案(subembodiment)中，該轉(zhuǎn)基因改變了編碼內(nèi)源NIP45蛋白的內(nèi)源基因(例如同源重組動(dòng)物，其中該內(nèi)源NIP45基因已被功能性破壞或“剔除”，或者該內(nèi)源NIP45基因的核苷酸序列已突變或該內(nèi)源NIP45基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)已被改變)。
可以通過(guò)將NIP45編碼核酸例如通過(guò)微注射導(dǎo)入受精卵母細(xì)胞的雄原核并使該卵母細(xì)胞在假孕雌性代孕(foster)動(dòng)物中發(fā)育，產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。可以將SEQ ID NO:5的小鼠NIP45cDNA序列做為轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨祟悇?dòng)物(例如小鼠)的基因組?；蛘?，可以基于與小鼠NIP45cDNA的雜交，分離諸如人NIP45基因的小鼠NIP45基因的哺乳動(dòng)物類似物，并用將其做轉(zhuǎn)基因。亦可以將內(nèi)含子序列和多聚腺苷酸化信號(hào)包括于該轉(zhuǎn)基因中，以增加該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率?？梢詫⒔M織特異性調(diào)節(jié)序列操作性地連接至該NIP45轉(zhuǎn)基因，以指導(dǎo)特定細(xì)胞的NIP45蛋白表達(dá)。通過(guò)胚胎操作和微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物特別是諸如小鼠的動(dòng)物的方法已成為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，并描述于例如Leder等的美國(guó)專利4,736,866號(hào)和4,870,009號(hào)、Wagner等的美國(guó)專利4,873,191號(hào)和Hogan,B.,Manipulatmg the Mouse Embryo,(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，N.Y.,1986)。使用類似的方法產(chǎn)生其它的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?？梢曰谄浠蚪M中NIP45轉(zhuǎn)基因的存在和/或所述動(dòng)物的組織或細(xì)胞中NIP45mRNA的表達(dá)，鑒別轉(zhuǎn)基因建立動(dòng)物(transgenic founderanimal)。然后可以用轉(zhuǎn)基因建立動(dòng)物繁育更多的攜帶該轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。另外，可以將攜帶編碼NIP45的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)一步繁育為攜帶其它轉(zhuǎn)基因的其它轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
為產(chǎn)生同源重組動(dòng)物，制備一載體，它含有已導(dǎo)入缺失、添加或置換的至少一部分NIP45基因，以由此改變(例如功能性破壞)內(nèi)源NIP45基因。該NIP45基因最好是小鼠NIP45基因。例如，使用SEQ IDNO:5的小鼠NIP45cDNA做為探針，可以從小鼠基因組DNA文庫(kù)分離小鼠NIP45基因。然后可以用該小鼠NIP45基因構(gòu)建適于改變小鼠基因組中內(nèi)源NIP45基因的同源重組載體。在最佳實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)該載體使得在同源重組時(shí)，該內(nèi)源NIP45基因被功能性地破壞(即，不再編碼功能蛋白；亦稱為“剔除”載體)?；蛘撸梢栽O(shè)計(jì)該載體使得在同源重組時(shí)，該內(nèi)源NIP45基因被突變或其它改變，但仍然編碼功能蛋白(例如可以改變上游調(diào)節(jié)區(qū)以由此改變內(nèi)源NIP45蛋白的表達(dá))。在該同源重組載體中，在該NIP45基因改變部分的5’和3’端由NIP45基因的其它核酸位于其二側(cè)翼，以在由該載體攜帶的外源NIP45基因和胚胎干細(xì)胞中的內(nèi)源NIP45基因之間發(fā)生同源重組。該位于二側(cè)的另一NIP45核酸有足夠的長(zhǎng)度以成功地與該內(nèi)源基因進(jìn)行同源重組。通常，將幾千個(gè)堿基對(duì)的側(cè)翼DNA(5’和3’均有)包括于該載體中(參見(jiàn)例如Thomas,K.R.和Capecchi,M.R.(1987)Cell 51:503有關(guān)同源重組載體的描述)。將該載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞系(例如通過(guò)電穿孔)并選擇其中導(dǎo)入的NIP45基因已與內(nèi)源NIP45基因同源重組的細(xì)胞(參見(jiàn)例如Li,E.等(1992)Cell69:915)。然后將選擇的細(xì)胞注射入動(dòng)物(例如小鼠)的胚泡，以形成聚集嵌合體(參見(jiàn)例如Bradley,A.載于Teratocarcmomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,E.J.Robertson編輯(IRL,Oxford,1987)第113-152頁(yè))。然后可以將嵌合胚胎植入合適的假孕雌性代孕動(dòng)物，并使胚胎發(fā)育足月?？梢允褂迷谄渖臣?xì)胞中含有該同源重組DNA的子代通過(guò)該轉(zhuǎn)基因的種系傳遞繁育動(dòng)物，其中該動(dòng)物的所有細(xì)胞均含有該同源重組DNA。構(gòu)建同源重組載體和同源重組動(dòng)物的方法進(jìn)一步描述于Bradley,A.(1991)CurrentOpinion in Biotechnology2:823-829和Le Mouellec等的PCT國(guó)際公布號(hào)WO90/11354；Smithies等的WO91/01140；Zijlstra等的WO92/0968；和Bems等的WO93/04169。
C．分離的NIP45蛋白和抗NIP45抗體本發(fā)明的另一方面涉及分離的NIP45蛋白、諸如其生物學(xué)活性部分的部分以及適于做為免疫原以產(chǎn)生抗NIP45抗體的肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的NIP45蛋白制劑。該NIP45蛋白最好具有示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，該NIP45蛋白基本上與SEQ ID NO:6同源，并保留SEQ ID NO:6蛋白的功能活性，但由于自然等位變異或誘變?cè)诎被嵝蛄猩喜煌蚴荢EQ IDNO:6蛋白的哺乳動(dòng)物同源物(例如人類同源物)，如上述A小節(jié)中詳細(xì)描述的。因此，在另一實(shí)施方案中，該NIP45蛋白是一蛋白，它包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列并與NF-AT家族蛋白的RHD相互作用。該蛋白優(yōu)選與SEQ ID NO:6至少70％同源、更優(yōu)選與SEQ ID NO:6至少80％同源、甚至更優(yōu)選與SEQ ID NO:6至少90％同源，最優(yōu)選與SEQ ID NO:6至少95％同源。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的NIP45蛋白的部分。例如，本發(fā)明還包括與NF-AT相互作用的NIP45蛋白的部分。如在實(shí)施例中證實(shí)的，NIP45蛋白與NF-AT的RHD相互作用。可以使用體外相互作用檢測(cè)(例如在上述A小節(jié)中描述的使用GST-NF-AT RHD融合蛋白)，以測(cè)定NIP45肽片段與NF-AT Rel同源域相互作用的能力，以由此鑒別與NF-AT相互作用的肽片段。
最好通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)NIP45蛋白。例如，將編碼該蛋白的核酸分子克隆入表達(dá)載體(如上述)，將此表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞(如上述)并在該宿主細(xì)胞中表達(dá)該NIP45蛋白。然后可以使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)，通過(guò)適當(dāng)純化流程從該細(xì)胞分離NIP45蛋白。重組表達(dá)的替代方法是可以使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成NIP45多肽。另外，可以從細(xì)胞(例如從T細(xì)胞)例如通過(guò)使用抗NIP45抗體的免疫沉淀，分離天然NIP45蛋白。
本發(fā)明亦提供NIP45融合蛋白。本文使用的NIP45“融合蛋白”包含操作性地連接至非NIP45多肽的NIP45多肽。“NIP45多肽”指具有對(duì)應(yīng)于NIP45蛋白或其肽片段的氨基酸序列的多肽，而“非NIP45多肽”指具有對(duì)應(yīng)于另一蛋白的氨基酸序列的多肽。在該融合蛋白內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“操作性地連接”指該NIP45多肽和該非NIP45多肽在框架內(nèi)互相融合。該非NIP45多肽可以融合至該NIP45多肽的N末端或C末端。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，該融合蛋白是GST-NIP45融合蛋白，其中該NIP45序列融合至該GST序列的C末端。在另一實(shí)施方案中，該融合蛋白是NIP45-HA融合蛋白，其中該NIP45核苷酸序列插入pCEP4-HA載體(Herrscher,R.F.等(1995)Genesd Dev.9:3067-3082)使得該NIP45序列在框架內(nèi)融合至流感血凝素表位標(biāo)記。這種融合蛋白可以便于純化重組NIP45。
本發(fā)明的NIP45融合蛋白最好用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)。例如，按照常規(guī)技術(shù)，將編碼不同多肽序列的DNA片段在框架內(nèi)連接，該常規(guī)技術(shù)，例如使用平端或交錯(cuò)末端進(jìn)行連接、限制性酶消化以提供適當(dāng)?shù)哪┒恕⒑线m時(shí)填補(bǔ)粘性末端、堿性磷酸酶處理以避免不需要的連接和酶連接。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)包括自動(dòng)DNA合成儀的常規(guī)技術(shù)可以合成該融合基因。或者，可以使用錨定引物進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，該引物在二個(gè)相鄰基因片段之間產(chǎn)生形成互補(bǔ)突出端，該懸垂隨后可以被退火并再擴(kuò)增以產(chǎn)生嵌合基因序列(參見(jiàn)，例如，分子生物學(xué)現(xiàn)行方法，編輯Ausubel等John Wiley&Sons:1992)。另外，市售有許多已編碼融合部分(例如GST多肽或HA表位標(biāo)記)的表達(dá)載體。可以將NIP45編碼核酸克隆入這種表達(dá)載體，使得該融合部分在框架內(nèi)連接至該NIP45蛋白。
使用多克隆和單克隆抗體制備的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以使用分離NIP45蛋白或其片段做為免疫原以產(chǎn)生結(jié)合NIP45的抗體?？梢允褂肗IP45蛋白產(chǎn)生抗體，或者可以使用NIP45的抗原性肽片段做為免疫原。NIP45的抗原性肽片段通常包含示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列的至少8個(gè)氨基酸殘基并包括NIP45的表位，使得產(chǎn)生的抗該肽的抗體與NIP45形成特異性免疫復(fù)合物。該抗原肽優(yōu)選包含至少10個(gè)氨基酸殘基、更優(yōu)選包含至少15個(gè)氨基酸殘基、甚至更優(yōu)選包含至少20個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選包含至少30個(gè)氨基酸殘基。該抗原肽包含的優(yōu)選表位是位于該蛋白表面例如親水性區(qū)的NIP45的區(qū)。SEQ ID NO:6的NIP45蛋白序列的疏水性分析示于圖12。
通常使用NIP45免疫原，通過(guò)用該免疫原免疫適當(dāng)?shù)膶?duì)象(例如，兔子、山羊、小鼠或其它哺乳動(dòng)物)制備抗體。適當(dāng)?shù)拿庖咴苿┛梢园ɡ缰亟M表達(dá)的NIP45蛋白或化學(xué)合成的NIP45肽。該制劑可以再包括諸如帶氏完全或不完全佐劑的佐劑或類似的免疫刺激藥物。用免疫原性NIP45制劑免疫合適的對(duì)象，誘導(dǎo)多克隆抗NIP45抗體應(yīng)答。
因此，本發(fā)明的另一方面有關(guān)抗NIP45抗體?？梢匀缟鲜鐾ㄟ^(guò)用NIP45免疫原免疫合適的對(duì)象，制備多克隆抗NIP45抗體。可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如使用固定化NIP45的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)隨時(shí)間檢測(cè)被接種對(duì)象中的抗NIP45抗體的效價(jià)。如果需要，可以從該哺乳動(dòng)物(例如，從血液)分離該導(dǎo)向NIP45的抗體分子，并通過(guò)例如蛋白A層析的眾所周知的技術(shù)進(jìn)一步純化，以得到IgG部分。在免疫后的適當(dāng)時(shí)間，例如當(dāng)抗NIP45抗體效價(jià)最高時(shí)，可以從該對(duì)象得到抗體產(chǎn)生細(xì)胞并用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備單克隆抗體，所述技術(shù)例如為Kohler和Milstein首先描述的雜交瘤技術(shù)(1975,Nature256:495-497)(亦參見(jiàn)Brown等(1981)J.Immunol 127:539-46；Brown等(1980)J Biol Chem255:4980-83；Yeh等(1976)PNAS 76:2927-31；和Yeh等(1982)Int.J.Cancer29:269-75)、近期的人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等(1983)ImmunolToday4:72)、EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等(1985),Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.，第77-96頁(yè))或trioma技術(shù)。產(chǎn)生單克隆抗體雜交瘤的技術(shù)是眾所周知的(一般參見(jiàn)R.H.Kenneth，載于Monoclonal Antibodies:A New Dimension In Biological Analyses,PlenumPublishing Corp.,New YorK,New York(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale J.Biol.Med.,54:387-402；M.L.Gefter等(1977)Somauc Cell Genet.,3:231-36)。簡(jiǎn)言之，將無(wú)限增殖細(xì)胞系(通常為骨髓瘤)與用NIP45免疫原如上述免疫的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞(通常為脾細(xì)胞)融合，篩選得到的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液以鑒別產(chǎn)生結(jié)合NIP45的單克隆抗體的雜交瘤。
任何用于融合淋巴細(xì)胞和無(wú)限增殖化細(xì)胞系的許多眾所周知的方法均可用于產(chǎn)生抗NIP45單克隆抗體的目的(參見(jiàn)，例如，G.Galfre等(1977)Nature266:55052；Gefter等Somatic Cell Genet.，見(jiàn)上述引用；Lerner,Yale J.Biol.Med.，見(jiàn)上述引用；Kenneth,Monoclonal Antibodies,見(jiàn)上述引用)。另外，一般技術(shù)人員將會(huì)理解這種方法的許多變化亦有用處。通常，該無(wú)限增殖細(xì)胞系(例如，骨髓瘤細(xì)胞系)源自與所述淋巴細(xì)胞相同的哺乳動(dòng)物物種。例如，可以將來(lái)自用本發(fā)明的免疫原制劑免疫的小鼠淋巴細(xì)胞與無(wú)限增殖化小鼠細(xì)胞系融合制備鼠雜交瘤。推薦的永生細(xì)胞系是對(duì)含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基”)敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。多種骨髓瘤細(xì)胞系的任何一種均可用做按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)的融合對(duì)象，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系。這些骨髓瘤系可以從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),Rockville,Md.獲得。通常使用聚乙二醇(“PEG”)將HAT敏感小鼠骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞融合。然后使用HAT培養(yǎng)基篩選從融合得到的雜交瘤細(xì)胞，該培養(yǎng)基殺死未融合和未有效融合的骨髓瘤細(xì)胞(未融合脾細(xì)胞由于未被轉(zhuǎn)化將在幾天后死亡)。通過(guò)例如使用標(biāo)準(zhǔn)ELISA，就結(jié)合NIP45的抗體方面篩選雜交瘤培養(yǎng)上清液，以檢測(cè)產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的置換方法是，可以通過(guò)用NIP45篩選重組組合免疫球蛋白文庫(kù)(例如，抗體噬菌體展示文庫(kù))由此分離結(jié)合NIP45的免疫球蛋白文庫(kù)成員，而鑒別和分離單克隆抗NIP45抗體。市售有制備和篩選噬菌體展示文庫(kù)的藥盒(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號(hào)碼27-9400-01；和Stratagene的SurfZAPTM噬菌體展示藥盒t，目錄號(hào)碼240612)。另外，特別適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)的方法和試劑的實(shí)例可以參見(jiàn)例如Ladener等美國(guó)專利5,223,409號(hào)；Kang等國(guó)際公布號(hào)WO92/18619；Dower等國(guó)際公布號(hào)WO91/17271；Winter等國(guó)際公布號(hào)WO92/20791；Markland等國(guó)際公布WO92/15679；Breitling等國(guó)際公布號(hào)WO93/01288；McCafferty等國(guó)際公布號(hào)WO92/01047；Garrard等國(guó)際公布號(hào)WO92/09690；Ladner等國(guó)際公布號(hào)WO90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology9:1370-1372；Hay等(1992)Hum Antibod Hybridomas3:81-85；Huses等(1989)Science246:1275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J12:725-734；Hawkins等(1992)J Mol Biol226:889-896；C1arkson等(1991)Nature352:624-628；Gram等(1992)PNAS89:3576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137；Barbas等(1991)PNAS88:7978-7982；和McCafferty等Nature(1990)348:552-554。
另外，可以用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備的、諸如包含人和非人類部分的嵌合和人化單克隆抗體的重組抗NIP45抗體屬于本發(fā)明的范圍。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)，產(chǎn)生這種嵌合和人化的單克隆抗體，例如使用描述于以下方法的技術(shù)Robinson等國(guó)際專利公告PCT/US86/02269；Akira，等歐洲專利申請(qǐng)184,187；Taniguchi,M.，歐洲專利申請(qǐng)171,496；Morrison等歐洲專利申請(qǐng)173,494；Neuberger等PCT申請(qǐng)WO86/01533；Cabilly等美國(guó)專利4,816,567號(hào)；Cabilly等歐洲專利申請(qǐng)125,023；Better等(1988)Science240:1041-1043；Liu等(1987)PNAS84:3439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.139:3521-3526；Sun等(1987)PNAS84:214-218；Nishimura等(1987)Canc.Res.47:999-1005；Wood等(1985)Nature314:446-449；和Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80:1553-1559)；Morrson,S.L.(1985)Science229:1202-1207；Oi等(1986)BioTechniques4:214；Winter美國(guó)專利5,225,539；Jones等(1986)Nature321:552-525；Verhoeyan等(1988)Science239:1534；和Beidler等(1988)J.Immunol.141:4053-4060。
可以使用抗NIP45抗體(例如，單克隆抗體)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)諸如親和層析或免疫沉淀分離NIP45。抗NIP45抗體可以便于從細(xì)胞純化天然NIP45和純化在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的NIP45。另外，可以使用抗NIP45抗體檢測(cè)NIP45蛋白(例如，在細(xì)胞裂解液或細(xì)胞上清液中)。通過(guò)將該抗體偶聯(lián)(例如，物理連接)至可檢測(cè)物質(zhì)便于檢測(cè)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，用可檢測(cè)物質(zhì)標(biāo)記本發(fā)明的抗NIP45抗體。可檢測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適的酶的實(shí)例包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光物質(zhì)的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的實(shí)例包括魯米諾；合適的放射性物質(zhì)的實(shí)例包括125I、131I、35S或3H。
D．藥用組合物可以將本發(fā)明的NIP45蛋白和抗NIP45抗體加入適于給予的藥用組合物。這種組合物通常包含該蛋白或抗體和藥學(xué)上可接受載體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受載體”包括任何和所有的與藥用給予相適應(yīng)的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。用于藥用活性物質(zhì)的這種介質(zhì)和藥物是本領(lǐng)域眾所周知的。除了在與該活性化合物不匹配的任何常規(guī)介質(zhì)或藥物的情況下，考慮了它在該組合物中的應(yīng)用。亦可以將附加的活性化合物加入該組合物中。
配制本發(fā)明的藥用組合物，使其與計(jì)劃的給藥途徑相適應(yīng)。例如，用于非腸道、皮內(nèi)或皮下使用的溶液或懸浮液可以包括以下組分無(wú)菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗氧化劑，諸如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯(methyl parabens)的抗細(xì)菌劑；諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；調(diào)節(jié)滲透壓的藥物，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽的緩沖液和諸如氯化鈉或葡萄糖?？梢杂弥T如鹽酸或氫氧化鈉的酸或堿調(diào)節(jié)pH。非腸道制劑可以包裝于安瓶、用玻璃或槊料制成的一次性注射器或多劑量西林瓶。
適于注射使用的藥用組合物包括無(wú)菌水溶液(如果是水溶性)或分散體和用于臨時(shí)制備無(wú)菌注射液或分散體的無(wú)菌粉末。對(duì)于靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有的情況下，該組合物必須無(wú)菌并且應(yīng)是流體的以易于注射。它必須在生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定并且必須進(jìn)行防腐以對(duì)抗諸如細(xì)菌和真菌的微生物的污染作用。該載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等等)和它們的適當(dāng)混合物的溶劑或分散介質(zhì)?？梢岳缤ㄟ^(guò)使用諸如卵磷脂的包衣、通過(guò)在分散體的情況下保持需要的顆粒大小和通過(guò)使用表面活性劑保持適當(dāng)?shù)牧黧w性。可以通過(guò)各種抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等達(dá)到防止微生物作用。在許多情況下，最好在該組合物中包括等滲劑，例如蔗糖、諸如甘露醇、山梨醇的多元醇、氯化鈉?？梢酝ㄟ^(guò)在該組合物中包括例如單硬脂酸鋁和明膠的延遲吸收的藥物，達(dá)到可注射組合物的延長(zhǎng)吸收。
可以通過(guò)將需要量的該活性化合物(例如NIP45蛋白或抗NIP45抗體)與需要的一種上述列舉的成分或其組合加入適當(dāng)?shù)娜軇┲?，接著進(jìn)行過(guò)濾除菌制備無(wú)菌注射液。一般而言，可以將該活性化合物加入含有基本分散介質(zhì)和需要的來(lái)自上述列舉的其它成分的無(wú)菌溶媒中制備分散體。在用于制備無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉劑的情況下，推薦的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從先前除菌過(guò)濾的溶液產(chǎn)生該活性成分和任何其它需要成分的粉劑。
口服組合物一般包括惰性稀釋劑或食用載體。可將它們包裹于明膠膠囊或壓制成片劑。為口服治療給藥的目的，可以將該活性化合物與賦形劑一起加入，并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。亦可以使用流體載體制備口服組合物，以做為漱口藥使用，其中該流體載體中的該化合物可口服、涮洗和咳吐或吞咽?？梢詫⑺帉W(xué)上相容的粘合劑和/或輔助材料做為該組合物的部分包括進(jìn)去。片劑、藥丸、膠囊、錠劑等可以含有以下成分或具有類似性質(zhì)的化合物的任何一種粘合劑，諸如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；諸如淀粉或乳糖的賦形劑、諸如藻酸、Primogel或玉米淀粉的崩解劑；潤(rùn)濕劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes的潤(rùn)滑劑；助流劑，諸如膠體二氧化硅；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；調(diào)味劑，諸如薄荷、水楊酸甲酯或橙調(diào)味劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用保護(hù)該化合物免受機(jī)體快速清除的載體制備該活性化合物，所述載體例如包括植入物和微膠囊化的傳遞系統(tǒng)的控釋制劑?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸。制備這種制劑的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。亦可從AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.市售得到該材料。亦可以使用脂質(zhì)體懸浮液(包括用抗病毒抗原的單克隆抗體導(dǎo)向感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)做為藥學(xué)上可接受載體。這些可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如，如美國(guó)專利4,522,811號(hào)描述的。
E．檢測(cè)NIP45活性的方法本發(fā)明的另一方面有關(guān)使用本發(fā)明的各種NIP45組合物的方法。例如，本發(fā)明提供用于檢測(cè)NIP45蛋白或其mRNA在生物樣品中存在的方法。該方法涉及用可以檢測(cè)NIP45蛋白或其mRNA的藥物接觸該生物樣品，使得檢測(cè)NIP45蛋白或其mRNA在該生物樣品中的存在。推薦的檢測(cè)NIP45mRNA的藥物是可以與NIP45mRNA雜交的標(biāo)記核酸探針。該核酸探針可以是例如SEQ ID NO:5的NIP45cDNA或其部分，諸如長(zhǎng)度至少為15、30、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個(gè)核苷酸并足以在嚴(yán)格條件下與NIP45mRNA雜交的寡核苷酸。檢測(cè)NIP45蛋白的推薦藥物是可以與NIP45蛋白結(jié)合的標(biāo)記抗體?？贵w可以是多克隆或更優(yōu)選是單克隆的。可以使用完整抗體或其部分(例如，F(xiàn)ab或F(ab’)2)。與該探針或抗體有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”包含通過(guò)將可檢測(cè)物質(zhì)偶聯(lián)(即，物理連接)至該探針或抗體的探針或抗體的直接標(biāo)記以及包括通過(guò)與另一直接標(biāo)記的試劑的反應(yīng)的探針或抗體的間接標(biāo)記。間接標(biāo)記的實(shí)例包括使用熒光標(biāo)記的二級(jí)抗體和用生物素末端標(biāo)記DNA探針使其可以被熒光標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素檢測(cè)，而檢測(cè)一級(jí)抗體的間接標(biāo)記。術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)樣品”包括組織、細(xì)胞和生物體液。例如，檢測(cè)NIP45 mRNA的技術(shù)包括Northern雜交和原位雜交。檢測(cè)NIP45蛋白的技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)、Western印跡、免疫沉淀和免疫熒光。Ⅵ．聯(lián)合組合物和藥盒本發(fā)明亦提供包含調(diào)節(jié)性藥物組合的組合物。例如，可以將二個(gè)或多個(gè)編碼調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列加入重組表達(dá)載體，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞。例如，本發(fā)明提供重組載體、已導(dǎo)入這種載體的宿主細(xì)胞，包含編碼與NF-AT家族蛋白協(xié)作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的第一轉(zhuǎn)錄因子的第一核苷酸序列和編碼對(duì)調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因起作用的第二轉(zhuǎn)錄因子的第二核苷酸序列。最好是，第一核苷酸序列編碼maf家族蛋白(例如，c-Maf)或NF-AT相互作用蛋白(例如，NIP45)。最好是，第二核苷酸序列編碼選自NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白和AP-1家族蛋白的轉(zhuǎn)錄因子。
本發(fā)明亦包含調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生或Th1/Th2亞群發(fā)育的藥盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥盒包含至少一種與使用該調(diào)節(jié)性藥物調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生或Th1/Th2亞群發(fā)育的說(shuō)明書(shū)一起包裝的本發(fā)明調(diào)節(jié)性藥物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該藥盒包含至少一種用于刺激Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生或向上調(diào)節(jié)Th2亞群發(fā)育(或向下調(diào)節(jié)Th1亞群發(fā)育)的刺激性藥物。在另一實(shí)施方案中，該藥盒包含至少一種用于抑制Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生或向下調(diào)節(jié)Th2亞群發(fā)育(或向上調(diào)節(jié)Th1亞群發(fā)育)的抑制性藥物。亦提供包含二種或多種本發(fā)明調(diào)節(jié)性(例如，刺激或抑制)藥物的聯(lián)合藥盒。Ⅶ．篩選檢測(cè)本發(fā)明的另一方面有關(guān)鑒別調(diào)節(jié)化合物的篩選檢測(cè)，所述調(diào)節(jié)化合物調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子活性。在各種實(shí)施方案中，這些篩選檢測(cè)可以鑒別例如調(diào)節(jié)所述轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或功能活性的化合物、與所述轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白、以及調(diào)節(jié)這些蛋白-蛋白相互作用的化合物、和在Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因內(nèi)調(diào)節(jié)所述轉(zhuǎn)錄因子與順式作用靶位點(diǎn)(例如，MARE)相互作用的化合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒別調(diào)節(jié)與激活的T細(xì)胞核因子(NF-AT)家族蛋白合作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的活性的化合物，包含提供指示組合物，它具有與NFAT家族蛋白協(xié)作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子活性；使該指示組合物與測(cè)試化合物接觸；和確定測(cè)試化合物對(duì)該指示組合物中轉(zhuǎn)錄因子活性的影響，以由此鑒別調(diào)節(jié)與NFAT家族蛋白協(xié)作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子活性的化合物。
該轉(zhuǎn)錄因子可以是例如maf家族蛋白，例如c-Maf或小maf蛋白(例如，p18)。或者，該轉(zhuǎn)錄因子可以是與NF-AT家族蛋白相互作用的因子，例如NIP45。
該指示組合物可以是無(wú)細(xì)胞組合物，或其可以是細(xì)胞組合物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，該指示組合物是淋巴樣細(xì)胞，例如Th2細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，該指示組合物是酵母細(xì)胞。
在推薦實(shí)施方案中，該指示組合物包含指示細(xì)胞，其中所述指示細(xì)胞包含(ⅰ)該轉(zhuǎn)錄因子和(ⅱ)對(duì)該轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答的報(bào)道基因。最好是，該指示細(xì)胞含有ⅰ)編碼該轉(zhuǎn)錄因子的重組表達(dá)載體；和ⅱ)包含可操作地連接報(bào)道基因的Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因的調(diào)節(jié)序列的載體；并且所述方法包含a)用測(cè)試化合物接觸該指示細(xì)胞；b)測(cè)定在存在該測(cè)試化合物時(shí)該指示細(xì)胞中該報(bào)道基因的表達(dá)水平；和c)比較存在該測(cè)試化合物時(shí)指示細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)水平和不存在該測(cè)試化合物時(shí)指示細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)水平，以由此鑒別調(diào)節(jié)該轉(zhuǎn)錄因子活性的化合物。
在另一推薦實(shí)施方案中，該指示組合物包含的制劑有(ⅰ)該轉(zhuǎn)錄因子和(ⅱ)該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA分子，并且所述方法包含a)調(diào)測(cè)試化合物接觸該指示組合物b)測(cè)定在存在該測(cè)試化合物時(shí)該轉(zhuǎn)錄因子與該DNA分子相互作用的程度；和c)比較存在該測(cè)試化合物時(shí)該轉(zhuǎn)錄因子與該DNA分子相互作用的程度和不存在該測(cè)試化合物時(shí)該轉(zhuǎn)錄因子與該DNA分子相互作用的程度，以由此鑒別調(diào)節(jié)該轉(zhuǎn)錄因子活性的化合物。
在前述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)錄因子是maf家族蛋白并且該DNA分子包含maf效應(yīng)元件(MARE)。
在另一推薦實(shí)施方案中，該方法鑒別來(lái)自Th2細(xì)胞的與該轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白。在該實(shí)施方案中，該指示組合物是指示細(xì)胞，該指示細(xì)胞包含ⅰ)可操作地連接至轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的報(bào)道基因；和ⅱ)編碼第一融合蛋白的第一嵌合基因，所述第一融合蛋白包括與NFAT家族蛋白協(xié)同調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子；該測(cè)試化合物包含第二嵌合基因文庫(kù)，該文庫(kù)編碼第二融合蛋白，該第二融合蛋白包括源自Th2細(xì)胞的蛋白；該報(bào)道基因的表達(dá)對(duì)第一融合蛋白、第二融合蛋白和該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列之間的相互作用敏感；并且其中通過(guò)測(cè)定指示細(xì)胞中該報(bào)道基因的表達(dá)水平確定該測(cè)試化合物對(duì)指示組合物中轉(zhuǎn)錄因子的影響以由此鑒別包含與該轉(zhuǎn)錄因子相互作用的源自Th2細(xì)胞的蛋白的化合物。
本發(fā)明再提供鑒別調(diào)節(jié)NIP45和NF-AT家族蛋白之間相互作用的化合物的方法，包含a)混合(ⅰ)和(ⅱ)，其中(ⅰ)NIP45或其N(xiāo)F-AT相互作用部分；和(ⅱ)NF-AT家族蛋白或其N(xiāo)IP45相互作用部分；在存在或不存在測(cè)試化合物的情況下；b)確定在存在或不存在測(cè)試化合物的情況下(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用的程度；和c)鑒別調(diào)節(jié)NIP45和NF-AT家族蛋白之間相互作用的化合物。
NF-AT家族蛋白的NIP45相互作用部分最好包含NF-AT家族蛋白的Rel同源域。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)用可檢測(cè)物質(zhì)標(biāo)記(ⅰ)或(ⅱ)、分離未標(biāo)記(ⅰ)或(ⅱ)并定量與未標(biāo)記(ⅰ)或(ⅱ)結(jié)合的標(biāo)記的(ⅰ)或(ⅱ)，而確定(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用的程度。可以使用該方法鑒別或者增強(qiáng)或者減弱NIP45和NF-AT家族蛋白之間相互作用的化合物。
在本發(fā)明篩選檢測(cè)的推薦實(shí)施方案中，一旦鑒別測(cè)試化合物調(diào)節(jié)目的轉(zhuǎn)錄因子活性，然后就測(cè)試該測(cè)試化合物對(duì)免疫應(yīng)答的影響。因此，本發(fā)明的篩選方法可以再包含確定該化合物對(duì)免疫應(yīng)答的影響以由此鑒別調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定該化合物對(duì)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因(例如，白介素-4基因)表達(dá)的影響，確定該化合物對(duì)免疫應(yīng)答的影響。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定該化合物對(duì)T輔助1型(Th1)或T輔助2型(Th2)細(xì)胞發(fā)育的影響，確定目的化合物對(duì)免疫應(yīng)答的影響。
本領(lǐng)域已知可以用于在指示細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的重組表達(dá)載體(參見(jiàn)上述討論，亦可參見(jiàn)實(shí)施例)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在表達(dá)載體內(nèi)將該轉(zhuǎn)錄因子編碼序列可操作地連接至允許該轉(zhuǎn)錄因子在該指示細(xì)胞中組成型表達(dá)的調(diào)節(jié)序列(例如，可以使用諸如細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的病毒調(diào)節(jié)序列)。最好是將允許在指示細(xì)胞中組成型表達(dá)該轉(zhuǎn)錄因子的重組表達(dá)載體用于鑒別增強(qiáng)或抑制該轉(zhuǎn)錄因子活性的化合物。在一個(gè)置換實(shí)施方案中，在該表達(dá)載體內(nèi)，將轉(zhuǎn)錄因子編碼序列可操作地連接至內(nèi)源相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因的調(diào)節(jié)序列(即，源自該內(nèi)源基因的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū))。推薦將其中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)受內(nèi)源調(diào)節(jié)序列控制的重組表達(dá)載體用于鑒別增強(qiáng)或抑制該轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)的化合物。
在其中使用了Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因的方法中，該Th2相關(guān)細(xì)胞因子最好是白介素-4。先前已顯示Th2特異性誘導(dǎo)型IL-4表達(dá)可以由Th2細(xì)胞中小至157bp的近端IL-4啟動(dòng)子指導(dǎo)(Hodge,M.等(1995)J.Immunol.154:6397-6405)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用含有該近端IL-4啟動(dòng)子的區(qū)、最好是IL-4啟動(dòng)子的核苷酸-157至+58(相對(duì)于位于+1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))的報(bào)道基因構(gòu)建物?；蛘撸梢允褂弥T如約3kb的上游調(diào)節(jié)序列的IL-4上游調(diào)節(jié)區(qū)的較長(zhǎng)部分，達(dá)到較強(qiáng)的報(bào)道基因表達(dá)。合適的報(bào)道基因構(gòu)建物描述于Todd,M.等(1993)J.Exp.Med.177:1663-1674。有關(guān)IL-4報(bào)道基因構(gòu)建物的描述亦可參見(jiàn)實(shí)施例。
各種報(bào)道基因是本領(lǐng)域已知的并且適用于本發(fā)明的篩選檢測(cè)。適合的報(bào)道基因的實(shí)例包括那些編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、β半乳糖苷酶、堿性磷酸酶或熒光素酶的報(bào)道基因。本領(lǐng)域已知測(cè)定這些基因產(chǎn)物活性的標(biāo)準(zhǔn)方法。
有各種細(xì)胞類型適于做為篩選檢測(cè)中的指示細(xì)胞使用。最好使用通常不表達(dá)c-Maf的細(xì)胞系，例如B細(xì)胞(例如，M12B淋巴瘤細(xì)胞系)或Th1細(xì)胞克隆(例如，AE7細(xì)胞)。亦可以使用非淋巴樣細(xì)胞系做為指示細(xì)胞，例如HepG2肝細(xì)胞癌細(xì)胞系。
在一個(gè)實(shí)施方案中，存在測(cè)試化合物時(shí)指示細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)水平高于不存在測(cè)試化合物時(shí)指示細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)水平，則該測(cè)試化合物被鑒別為刺激該轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的化合物。在另一實(shí)施方案中，存在測(cè)試化合物時(shí)指示細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)水平低于不存在測(cè)試化合物時(shí)指示細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)水平，則該測(cè)試化合物被鑒別為抑制該轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的化合物。
使用報(bào)道基因構(gòu)建物的置換方法是，通過(guò)使用其它“讀出”鑒別調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的化合物。例如，可以用轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體轉(zhuǎn)染指示細(xì)胞，在存在或不存在測(cè)試化合物下培養(yǎng)，可以通過(guò)檢測(cè)指示細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA(例如，IL-4mRNA)或分泌到培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子(例如，IL-4分泌)，評(píng)價(jià)Th2相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生。檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法例如為逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，是本領(lǐng)域已知的。檢測(cè)培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子蛋白的標(biāo)準(zhǔn)方法例如為酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)，亦為本領(lǐng)域所知。有關(guān)檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA和/或蛋白方法的進(jìn)一步描述，亦可參見(jiàn)實(shí)施例。
如上所述，本發(fā)明提供鑒別與目的轉(zhuǎn)錄因子(例如c-Maf或NF-AT)或NIP45相互作用的蛋白(例如，Th2細(xì)胞中的蛋白)的篩選方法。可以基于本領(lǐng)域已知的雙雜種檢測(cè)系統(tǒng)(亦稱為相互作用陷阱檢測(cè)(interaction trap assay))(參見(jiàn)例如，F(xiàn)ield美國(guó)專利5,283,173號(hào)；Zervos等(1993)Cell72:223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268:12046-12054；Bartel等(1993)Biotechniques 14:920-924；和Iwabuchi等(1993)Oncogene8:1693-1696)設(shè)計(jì)這些檢測(cè)。雙雜種檢測(cè)一般用于鑒別與特定靶蛋白相互作用的蛋白。該檢測(cè)采用基因融合，以鑒別可以相互作用以重構(gòu)功能轉(zhuǎn)錄激活因子的蛋白。該轉(zhuǎn)錄激活因子由DNA結(jié)合域和反式激活域組成，其中這兩個(gè)域?qū)τ诩せ畎行蛄?例如GAL4的上游激活因子序列(UAS))下游的基因轉(zhuǎn)錄均是必需的。將編碼靶“餌”蛋白的DNA序列融合至這些域之一，并將DNA序列文庫(kù)融合至另一個(gè)域。能夠結(jié)合至該靶-融合蛋白(例如，靶GAL4-融合“餌”)的“魚(yú)”融合蛋白(由該融合文庫(kù)產(chǎn)生)一般將這二個(gè)域(DNA結(jié)合域和反式激活域)帶至足夠近，以激活插入在該靶序列下游的報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。因此，可以通過(guò)其重構(gòu)功能反式激活蛋白子(例如，功能GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子)的能力鑒別“魚(yú)”蛋白。
通過(guò)構(gòu)建靶c-Maf融合蛋白(例如，c-Maf/GAL4結(jié)合域融合物做為“餌”)和“魚(yú)”融合蛋白的cDNA文庫(kù)(例如，cDNA/GAL4激活域文庫(kù))，并將這些構(gòu)建物導(dǎo)入亦含有連接至對(duì)c-Maf應(yīng)答的調(diào)節(jié)序列(例如，MARE序列，例如如上述討論的IL-4啟動(dòng)子的一個(gè)區(qū))的報(bào)道基因的宿主細(xì)胞，可以將這種普通雙雜種系統(tǒng)用于鑒別Th2細(xì)胞中與c-Maf(或者，使用類似方法與其它目的轉(zhuǎn)錄因子)相互作用的蛋白，其中該cDNA文庫(kù)制備自Th2細(xì)胞的mRNA?；谠搱?bào)道基因構(gòu)建物的反式激活可以鑒別編碼與c-Maf相互作用的來(lái)自Th2細(xì)胞的蛋白的cDNA。
或者，可以使用諸如描述于Sieweke,M.H.等(1996)Cell 85:49-60的“單雜種”檢測(cè)，鑒別與c-Maf相互作用的來(lái)自Th2細(xì)胞的蛋白。該檢測(cè)是上述討論的雙雜種系統(tǒng)的修改。在該系統(tǒng)中，所述“餌”是已除去反式激活域的轉(zhuǎn)錄因子(例如，已除去氨基末端反式激活域的c-Maf)，所述“魚(yú)”是非融合cDNA文庫(kù)(例如，制備自Th2細(xì)胞的cDNA文庫(kù))。將這些構(gòu)建物導(dǎo)入亦含有連接至對(duì)該轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答的調(diào)節(jié)序列(例如，MARE序列，例如對(duì)c-Maf應(yīng)答的該IL-4啟動(dòng)子的區(qū))的報(bào)道基因構(gòu)建物的宿主細(xì)胞(例如，酵母細(xì)胞)?；谠搱?bào)道基因構(gòu)建物的反式激活可以鑒別編碼與c-Maf(或其它目的轉(zhuǎn)錄因子)相互作用的來(lái)自Th2細(xì)胞的蛋白的cDNA。
如上所述，本發(fā)明提供篩選檢測(cè)，以鑒別調(diào)節(jié)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子與該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA分子相互作用的化合物，該轉(zhuǎn)錄因子分別結(jié)合IL-4基因調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)的諸如c-Maf和MARE。本領(lǐng)域已知檢測(cè)DNA結(jié)合蛋白與靶DNA序列相互作用的檢測(cè)(例如，電泳遷移率變動(dòng)檢測(cè)、DNA酶I足跡檢測(cè)等等；有關(guān)進(jìn)一步的描述參見(jiàn)實(shí)施例)。通過(guò)在存在或不存在測(cè)試化合物時(shí)進(jìn)行這種檢測(cè)，可以使用這些檢測(cè)鑒別調(diào)節(jié)(例中，抑制或增強(qiáng))DNA結(jié)合蛋白與其靶DNA序列相互作用的化合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，存在該測(cè)試化合物時(shí)與該DNA片段結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的量高于不存在該測(cè)試化合物時(shí)與該DNA片段結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的量，在這種情況下，該測(cè)試化合物被鑒別為增強(qiáng)該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的化合物。在另一實(shí)施方案中，存在該測(cè)試化合物時(shí)與該DNA片段結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的量低于不存在該測(cè)試化合物時(shí)與該DNA片段結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的量，在這種情況下，該測(cè)試化合物被鑒別為抑制該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的化合物。
在本發(fā)明的鑒別調(diào)節(jié)NIP45與NF-AT家族蛋白相互作用的藥物的方法中，可以在該方法中使用分離的NIP45和/或NF-AT家族蛋白，或者可以僅使用NIP45和/或NF-AT家族蛋白的部分。例如，可以將分離的NF-AT Rel司源域(或包括RHD的較大的NF-AT亞區(qū))做為NF-AT的NIP45相互作用部分使用。同樣，可以使用能夠結(jié)合該NF-AT RHD的NIP45部分。在一個(gè)推薦實(shí)施方案中，(ⅰ)和(ⅱ)中的一個(gè)或二個(gè)均是融合蛋白，例如GST融合蛋白(例如，GST-NF-AT RHD可以做為NF-AT的NIP45相互作用部分使用)。通過(guò)用可檢測(cè)物質(zhì)(例如，放射標(biāo)記)標(biāo)記其中一個(gè)蛋白、分離未標(biāo)記蛋白并定量與未標(biāo)記蛋白結(jié)合的可檢測(cè)物質(zhì)的量而確定(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用的程度?？梢允褂迷摲椒ㄨb別或者刺激或者抑制NIP45和NF-AT家族蛋白之間相互作用的藥物?；谒c不存在該藥物時(shí)的相互作用程度相比增強(qiáng)(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用程度的能力，鑒別刺激NIP45和NF-AT家族蛋白相互作用的藥物，而基于其與不存在該藥物時(shí)的相互作用程度相比降低(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用程度的能力，鑒別抑制NIP45和NF-AT家族蛋白相互作用的藥物?？梢圆捎妹枋鲇赑awson的美國(guó)專利5,352,660號(hào)的鑒別調(diào)節(jié)SH2域-配體相互作用的檢測(cè)系統(tǒng)，鑒別調(diào)節(jié)NIP45/NF-AT RHD相互作用的藥物。
由以下不應(yīng)視為限制的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。本中請(qǐng)引用的所有的參考文獻(xiàn)、專利和公開(kāi)的專利申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本文引用的儲(chǔ)存于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的核苷酸序列和氨基酸序列亦通過(guò)引用結(jié)合到本文中。實(shí)施例1細(xì)胞因子特異性是由于正反式激活因子而不是因?yàn)樽瓒舻鞍卓梢酝ㄟ^(guò)阻遏蛋白或沉默蛋白的作用達(dá)到組織特異性。因此可能IL-2和IL-4基因分別在Th2和Th1細(xì)胞中被主動(dòng)阻遏。為檢測(cè)阻遏蛋白的存在，在不同MHCⅠ類單倍型的Th1(D1.1)和Th2(D10)克隆之間進(jìn)行體細(xì)胞融合。按照“懸浮細(xì)胞融合”程序(Lane,R.D.等(1986)MethodsEnzymol.121:183-192)融合Th1克隆D1.1(Kd)和Th2克隆D10(Kk)。融合后，使細(xì)胞恢復(fù)8小時(shí)，然后用PE綴合抗Kk抗體和FITC綴合抗Kd抗體(Phamingen,La Jolla,CA)雙染色。基于大小將細(xì)胞分選，以從異核體和同核體區(qū)分未融合細(xì)胞，并通過(guò)熒光鑒別單陽(yáng)性和雙陽(yáng)性細(xì)胞。如示于圖1A的該方法的圖解，分選三種群體大PE陽(yáng)性細(xì)胞(D1.1×D1.1)、大FITC陽(yáng)性細(xì)胞(D10×D10)、以及大PE和FITC陽(yáng)性細(xì)胞(D1.1×D10)。表達(dá)MHCⅠ類Kb和Kk標(biāo)記的細(xì)胞是異核體，而僅表達(dá)Kb或Kk的細(xì)胞代表同核體并做為對(duì)照。
然后用抗CD3抗體在培養(yǎng)中刺激這三種群體，以激活細(xì)胞因子基因表達(dá)，并制備用于RT-PCR和Northem印跡分析的RNA。從各群體得到約5×105細(xì)胞。通常，5-10％的細(xì)胞已進(jìn)行融合。然后將這三個(gè)群體各分成二半，將-半細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)清洗的抗CD3包被板，將剩下的一半轉(zhuǎn)移至未包被板。4小時(shí)后，收獲細(xì)胞，并使用Micro-Fast TrackTM藥盒(Statagene,La Jolla,CA)分離多腺苷酸化RNA。使用SuperScript藥盒(Gibco/BRL,Bethesda,MD)制備cDNA，并用于按照制造商說(shuō)明書(shū)使用市售的對(duì)鼠IL-2、IL-4和β肌動(dòng)蛋白特異性的引物(Stratagene,La Jolla,CA)的PCR分析。PCR反應(yīng)包括0.5μCiα-32P-dCTP(3000Ci/mmol,NENDupont)。用乙醇沉淀PCR產(chǎn)物，并通過(guò)非變性PAGE分離、干燥并通過(guò)放射自顯影觀察。
細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的RT-PCR分析結(jié)果示于圖1B中。Th1和Th2克隆以及Th同核體分別僅轉(zhuǎn)錄IL-2(Th1)或IL-4(Th2)，而Th1/Th2異核體產(chǎn)生這二種細(xì)胞因子。與之相反，阻遏蛋白的存在本應(yīng)導(dǎo)致在異核體中消除這二種細(xì)胞因子。從這些實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論是在Th1對(duì)Th2細(xì)胞中的細(xì)胞因子特異性是由Th特異性正反式激活因子介導(dǎo)，而不是由選擇性沉默蛋白介導(dǎo)。實(shí)施例2從制備自抗CD3激活的Th2克隆的cDNA文庫(kù)分離Th2特異性c-maf基因在通過(guò)酵母雙雜種系統(tǒng)(有關(guān)該系統(tǒng)描述，參見(jiàn)例如Field美國(guó)專利5,283,173號(hào)；Zervos等(1993)Cell72:223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268:12046-12054；Bartel等(1993)Biotechniques 14:920-924；和Iwabuchi等(1993)Oncogene8:1693-1696)就NF-AT相互作用蛋白方面篩選制備自抗CD3激活的Th2克隆D10的cDNA文庫(kù)的過(guò)程中，分離了多個(gè)cDNA，這些cDNA都是極弱的相互作用因子。然后通過(guò)使用一組Th1和Th2克隆的Northern印跡分析，評(píng)價(jià)在該篩選中得到的所有cDNA的Th特異性表達(dá)。一個(gè)重復(fù)分離的(140中60)這種cDNA僅在從Th2克隆(D10、CDC35)制備的RNA檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄物，而不是從或者Th1克隆(AR5、OS6、D1)或者從B細(xì)胞淋巴瘤M12制備的RNA檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄物，如描繪于圖2A中的Northern印跡分析描述的。另外，在由該T細(xì)胞受體與抗CD3抗體的連接激活時(shí)，在D10Th2細(xì)胞中檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄物水平顯著增加。在抗CD3處理時(shí)，由該cDNA克隆檢測(cè)到的該轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)未在Th1克隆中發(fā)生。對(duì)照探針GAPDH證實(shí)，在所有泳道中RNA上樣量基本相同。因此，該cDNA克隆在該淋巴樣譜系中的表達(dá)看起來(lái)是Th2特異性的，并對(duì)通過(guò)該T細(xì)胞受體傳遞的信號(hào)敏感。對(duì)于這些Northern印跡，按照制造商說(shuō)明書(shū)使用Trizol(GIBCO/BRL)制備總RNA。將每個(gè)樣品的10μg總RNA在甲醛瓊脂糖凝膠上分級(jí)分離并轉(zhuǎn)移至尼龍膜。使用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記藥盒(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，用α-32P-dCTP標(biāo)記得自該分離克隆的3’非翻譯區(qū)的300bp DraⅠ片段。按照制造商說(shuō)明書(shū)使用QuikHyb(Stratagene,La Jolla,CA)進(jìn)行雜交。
為確定該基因的表達(dá)是否為組織特異性并在正常Th細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中受調(diào)節(jié)，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。通過(guò)在存在細(xì)胞因子和抗細(xì)胞因子抗體(對(duì)于Th1用IFNγ和抗IL-4、對(duì)于Th2用IL-4和抗IFNg)的情況下，用抗CD3處理沿Th1或Th2途徑驅(qū)動(dòng)原初脾細(xì)胞(Th前體(Thp)細(xì)胞)。從6-8周齡Balb/c小鼠制備脾細(xì)胞懸液，以106細(xì)胞/ml的密度于補(bǔ)加了10％FCS的RPMI 1640中培養(yǎng)，并在存在5μg/ml抗IL4抗體(11B11)(對(duì)于Th1譜系)或5μg/ml抗IFNγ抗體(XMG-1)(對(duì)于Th2譜系)的情況下用平板結(jié)合抗CD3抗體刺激。刺激之后24小時(shí)，將50 U/ml IL2加入所有的培養(yǎng)物，并將500 U/ml IL4(Genzyme)加入Th2培養(yǎng)物。在初次刺激后7天，收獲所有的細(xì)胞、清洗細(xì)胞并用平板結(jié)合的抗CD3抗體再刺激。使用上述描述的方法，對(duì)在刺激后初次(0-8天)和再次(0-20小時(shí))應(yīng)答中的不同時(shí)間點(diǎn)收獲的分化中細(xì)胞進(jìn)行Northern印跡分析，并通過(guò)ELISA分析培養(yǎng)上清液IL-10和IFNγ，確定鑒別分化為T(mén)h1或Th2的Thp細(xì)胞。如下述進(jìn)行細(xì)胞因子定量的ELISA。所有的抗細(xì)胞因子抗體均購(gòu)自Pharmingen。按照Pharmingen的說(shuō)明進(jìn)行ELISA，除了使用PBS/BSA中1∶500稀釋度的抗生物素蛋白-堿性磷酸酶(Sigrna)代替抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶。使用底物緩沖液(10％二乙醇胺、0.5mM MgCl2、0.02％疊氮化鈉，pH9.8)中4mg/ml的磷酸對(duì)硝基苯(GIBCO BRL)做為底物。
在其代表性結(jié)果示于圖2B的二個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，該分析顯示于第0天時(shí)位于基線的原初脾細(xì)胞中該cDNA的表達(dá)水平低或無(wú)法檢出。在沿著Th2途徑分化的培養(yǎng)物中，在初次刺激的8天和再次刺激的20小時(shí)時(shí)發(fā)生大量的轉(zhuǎn)錄物誘導(dǎo)。與之相反，沿Th1途徑驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞中未發(fā)生誘導(dǎo)。對(duì)照探針(GAPDH)顯示，在所有泳道中RNA上樣量基本相同。沿著Th1途徑驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞中存在的低水平轉(zhuǎn)錄物可能反映出存在殘留Th2細(xì)胞，因?yàn)樵谶@個(gè)體外分化系統(tǒng)中未發(fā)生完全偏斜。
綜合來(lái)看，這些實(shí)驗(yàn)揭示該分離cDNA選擇性地在Th2克隆中表達(dá)，它在T細(xì)胞激活時(shí)被誘導(dǎo)，并且它不存在于Th1克隆和B淋巴瘤。另外，當(dāng)沿著Th2譜系驅(qū)動(dòng)時(shí)該基因在正常Thp中被誘導(dǎo)，而不在Th1發(fā)育中被誘導(dǎo)。
使用從酵母雙雜種篩選中得到的cDNA做為探針從D10Th2細(xì)胞cDNA文庫(kù)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)雜交方法分離全長(zhǎng)cDNA。從該Th2細(xì)胞文庫(kù)分離4.3kb cDNA并用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)序。序列分析揭示，該Th2特異性基因在序列方面對(duì)應(yīng)于c-maf原癌基因。實(shí)施例3c-Maf在Th1和B細(xì)胞中的異位表達(dá)導(dǎo)致IL-4啟動(dòng)子激活描述于實(shí)施例2中的分離cDNA鑒別為AP-1/CREB/ATF基因家族的成員以及其在Th2細(xì)胞中選擇性表達(dá)，提高了c-Maf控制的IL-4基因組織特異性轉(zhuǎn)錄的可能性。另外，Th2細(xì)胞中和檢測(cè)的四個(gè)轉(zhuǎn)化肥大細(xì)胞系中的三個(gè)中，編碼c-maf的轉(zhuǎn)錄物的存在與IL4的表達(dá)很相關(guān)。為測(cè)試是否c-Maf可以反式激活I(lǐng)L-4啟動(dòng)子，進(jìn)行了共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
Thl克隆和B淋巴瘤M12.4.C3(M12)既不表達(dá)c-maf又不轉(zhuǎn)錄IL-4基因。如果c-Maf是對(duì)控制IL-4基因表達(dá)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，那么在這些細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)應(yīng)使得IL-4基因表達(dá)。為檢測(cè)此點(diǎn)，將全長(zhǎng)(4.3kb)c-maf cDNA克隆插入pMex-NeoI哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的SalⅠ位點(diǎn)，該載體利用CMV增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)插入序列的表達(dá)。然后將該c-Maf表達(dá)載體與IL-4啟動(dòng)子報(bào)道構(gòu)建物共轉(zhuǎn)染入Th1克隆AE7和B淋巴瘤M12。在Hodge,M.等(1995)J.hnmunol.154:6397-6405中描述了制備含有可操作地連接至氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的從-157至+68的IL4啟動(dòng)子片段的野生型IL4CAT報(bào)道構(gòu)建物。將該Th1克隆培養(yǎng)于補(bǔ)加了10％FCS和10％Con-A刺激的大鼠脾細(xì)胞上清液的RPMI1640中，并通過(guò)用適當(dāng)?shù)目乖虯PC每二周刺激一次保持。將M12細(xì)胞培養(yǎng)于補(bǔ)加了10％FCS的RPMI1640中。
通過(guò)用20μg(AE7)或5μg(M12)的各種質(zhì)粒于室溫預(yù)溫育0.4ml細(xì)胞10分鐘瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Thl克隆AE7或M12B淋巴瘤細(xì)胞，該0.4ml細(xì)胞含有在無(wú)血清RPMI 1640中的2×107細(xì)胞/ml AE7或3×106細(xì)胞/mlM12細(xì)胞。然后用設(shè)定于975μF、280V的BIO-RAD基因脈沖發(fā)生器(BIO-RAD,Richmond,CA)對(duì)樣品進(jìn)行電穿孔，并立即置于冰上10分鐘。使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中恢復(fù)過(guò)夜，并用平板結(jié)合抗CD3抗體({Pharmningen,San Diego,CA}于1XPBS中的1μ/ml于4℃過(guò)夜)或用50ng/ml PMA(Sigma,St.Louis,MO)和1μM離子霉素(CalbiochemCorp.,La Jolla,Califomia)刺激24小時(shí)。通過(guò)于0.25M Tris-Cl,pH7.8中冷凍-解凍裂解制備細(xì)胞裂解液。將等量的蛋白(5-20μg)用于CAT檢測(cè)。如Todd,M等(1993)J.Exp.Med.177:1663-1674所述進(jìn)行CAT檢測(cè)。
先前已顯示Th2特異性誘導(dǎo)型IL-4表達(dá)可以由Th2細(xì)胞中小至157bp的近端IL-4啟動(dòng)子指導(dǎo)(Hodge,M.等(1995)J.Irmmunol.154:6397-6405)。在結(jié)果概括于圖3A中的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)c-Maf在Th1克隆AE7中異位表達(dá)導(dǎo)致通過(guò)T細(xì)胞受體刺激后該IL-4啟動(dòng)子報(bào)道物的顯著活性。觀察到的倍數(shù)誘導(dǎo)約是僅用空載體觀察到的5倍。盡管先前未觀察到含有近端(-157至+58)IL-4啟動(dòng)子序列的報(bào)道構(gòu)建物在本文使用的AE7細(xì)胞亞克隆中表達(dá)，但已證實(shí)可以通過(guò)RT-PCR在AE7的其它克隆中檢測(cè)到少量的IL-4mRNA。為更嚴(yán)格地測(cè)試c-Maf在非IL-4產(chǎn)生細(xì)胞中反式激活I(lǐng)L-4啟動(dòng)子的能力，在B淋巴瘤細(xì)胞系M12中進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。正常B細(xì)胞和B淋巴瘤細(xì)胞不產(chǎn)生IL-4。共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果描繪于圖3B，三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的概要示于以下表1中。
表1
*在實(shí)驗(yàn)Ⅰ中，將20mg細(xì)胞裂解液溫育2小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ中，僅將5mg細(xì)胞裂解液溫育1小時(shí)，以揭示c-Maf和NF-ATp之間的協(xié)同作用**ND=未做M12B淋巴瘤細(xì)胞中的結(jié)果證實(shí)了在Th1克隆中的發(fā)現(xiàn)。c-Maf的異位表達(dá)導(dǎo)致在或者用或者不用PMA/Ca++離子載體刺激的M12細(xì)胞中IL-4啟動(dòng)子的顯著活性。與對(duì)照載體轉(zhuǎn)染相比，在未刺激M12細(xì)胞中觀察到的倍數(shù)誘導(dǎo)平均約為50。用PMA/Ca++子載體刺激M12細(xì)胞，這種刺激應(yīng)該導(dǎo)致NF-AT易位至核和誘導(dǎo)其它AP-1家族成員(Flanagan,W.M.(1991)Nature352:803-807；Jain,J.等(1993)Nature365:352-355)，增加IL-4啟動(dòng)子的基礎(chǔ)活性，但仍然存在由c-Maf引起的啟動(dòng)子活性的顯著誘導(dǎo)(平均約為25倍)。C-Maf不反式錄激活由NF-AT多體驅(qū)動(dòng)的對(duì)照?qǐng)?bào)道物，證實(shí)反式激活的特異性。
做為與其它AP-1家族成員相反的c-Maf特異性的對(duì)照，利用在哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pMEX-NeoⅠ中編碼c-Fos和JunD的鼠全長(zhǎng)cDNA和IL-4報(bào)道質(zhì)粒的M12細(xì)胞中亦過(guò)量表達(dá)c-Fos和c-Jun蛋白。通過(guò)在M12細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)這二個(gè)AP-1家族成員之一，不能達(dá)到IL-4啟動(dòng)子活性。因此，c-Maf具有獨(dú)特的能力驅(qū)動(dòng)M12B細(xì)胞中IL-4基因的轉(zhuǎn)錄。另外，在肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2中強(qiáng)制表達(dá)c-Maf亦導(dǎo)致IL-4啟動(dòng)子反式激活。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)，供應(yīng)c-Maf給c-Maf陰性Th1或B細(xì)胞或給非淋巴樣細(xì)胞(例如，肝細(xì)胞癌細(xì)胞系)使得該細(xì)胞反式激活I(lǐng)L-4啟動(dòng)子。
已顯示NF-AT蛋白在調(diào)節(jié)IL-4和IL-2細(xì)胞因子中均極其重要。NF-ATp是該家族的第一個(gè)被分離的成員(McCaffrey,P.G.等(1993)Science262:750-754)。AE7和M12細(xì)胞均有內(nèi)源NF-ATp蛋白，但卻不轉(zhuǎn)錄IL-4。盡管NF-ATp因此不是選擇性IL-4基因轉(zhuǎn)錄的原因，但有意義的是測(cè)試是否在未刺激或刺激的M12細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)NF-ATp會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)由c-maf造成的IL-4啟動(dòng)子的反式激活。用IL-4報(bào)道構(gòu)建物和或者NFAPp表達(dá)載體(pREP4-NF-ATp，它亦攜帶潮霉素抗性基因)自身或者NFAPp表達(dá)載體與c-Maf表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染M12細(xì)胞。在M12細(xì)胞中僅過(guò)量表達(dá)NF-ATp導(dǎo)致IL-4啟動(dòng)子的有節(jié)制表達(dá)。該反式激活被c-Maf的異位表達(dá)顯著地增強(qiáng)，該增強(qiáng)不是疊加型的而是協(xié)同的(參見(jiàn)圖3B和表1)。與之對(duì)照，c-Fos過(guò)量表達(dá)不會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)由NF-ATp達(dá)到的有節(jié)制反式激活。這些結(jié)果表明，c-maf和NF-ATp相互作用，以達(dá)到該IL-4啟動(dòng)子的最大表達(dá)，該組織特異性由c-Maf提供。實(shí)施例4c-Maf的異位表達(dá)激活內(nèi)源IL-4基因在B淋巴瘤中的轉(zhuǎn)錄如在實(shí)施例3中證實(shí)的，c-Maf在Th1、B和非淋巴樣細(xì)胞中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染檢測(cè)中反式激活I(lǐng)L-4啟動(dòng)子。為測(cè)試c-maf在非IL-4產(chǎn)生細(xì)胞中表達(dá)是否可以激活內(nèi)源IL-4轉(zhuǎn)錄，用編碼c-maf、NF-ATp或編碼二者、或編碼junD的表達(dá)載體及用或不用NF-ATp做為對(duì)照穩(wěn)定轉(zhuǎn)染B淋巴瘤M12。為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，如上述實(shí)施例3中轉(zhuǎn)染M12細(xì)胞。在加入濃度均為400μg/ml的新霉素(GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD)和潮霉素(Calbiochem,Corp.)之前使轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中恢復(fù)48小時(shí)。每隔一天用新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)加轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的M12細(xì)胞以相同密度鋪平板，并于24小時(shí)后收獲上清液，通過(guò)ELISA測(cè)定細(xì)胞因子。如實(shí)施例2中描述的進(jìn)行ELISA。示于圖4中的結(jié)果證實(shí)，在這些實(shí)驗(yàn)中用c-maf、junD或NF-ATp自身轉(zhuǎn)染的M12細(xì)胞不產(chǎn)生ELISA可測(cè)定的IL-4。然而，用c-maf和NF-ATp一起穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的M12細(xì)胞產(chǎn)生ELISA可檢測(cè)的、但為低水平的IL-4。這些結(jié)果為對(duì)來(lái)自這些轉(zhuǎn)染細(xì)胞的RNA的RT-PCR證實(shí)。相反，這些細(xì)胞不產(chǎn)生可檢測(cè)的IL-2。同時(shí)需要c-maf和NF-ATp與M12細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中注意到的這些因子在反式激活I(lǐng)L-4啟動(dòng)子的協(xié)同效應(yīng)一致。與之對(duì)照，轉(zhuǎn)染可以增強(qiáng)IL-4在Th2細(xì)胞中表達(dá)的AP-1家族成員的junD自身或與NF-ATp一起轉(zhuǎn)染，未導(dǎo)致IL-4產(chǎn)生。這些結(jié)果證實(shí)，c-Maf在指導(dǎo)組織特異性內(nèi)源IL-4產(chǎn)生中的必需的和選擇性作用。實(shí)施例5IL-4啟動(dòng)子中的一個(gè)位點(diǎn)被Th2克隆而不是Th1克隆的提取物足跡覆蓋實(shí)施例3和4描述的實(shí)驗(yàn)證實(shí)c-maf在控制組織特異性IL-4表達(dá)中的清楚的作用。另外，c-maf轉(zhuǎn)錄物在Th2細(xì)胞中而不是在Th1細(xì)胞中表達(dá)。然而，當(dāng)使用制備自Th2細(xì)胞的核提取物時(shí)，通過(guò)電泳遷移率變動(dòng)檢測(cè)(EMSA)未檢測(cè)到DNA-蛋白復(fù)合物。為進(jìn)一步檢測(cè)是否Th2核提取物中的蛋白可以結(jié)合MARE或附近序列，使用了更敏感的DNA酶Ⅰ足跡技術(shù)。通過(guò)將T細(xì)胞受體與平板結(jié)合抗CD3抗體連接，激活二個(gè)Th2克隆(D10、CDC35)和二個(gè)Th1克隆(AE7、S53)，并于0時(shí)(未刺激)、2小時(shí)和6小時(shí)后制備核提取物。然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法，使用克列諾末端標(biāo)記的IL-4啟動(dòng)子片段(-157至+68)進(jìn)行DNA酶Ⅰ足跡分析。結(jié)果示于圖5A。來(lái)自Th1和Th2細(xì)胞的刺激核提取物均足跡覆蓋二個(gè)NF-AT位點(diǎn)和先前描述的遠(yuǎn)側(cè)NF-AT位點(diǎn)上游的AP-1位點(diǎn)(Rooney,J.等(1995)Immunity2:545-553)，與證實(shí)的NF-AT和AP-1蛋白調(diào)節(jié)IL-2和IL-4啟動(dòng)子的功能一致(Rooney,J.等(1995)Immunity2:545-553；Rooney,J.等(1995)Mol.Cell.Biol.15:6299-6310)。另外，檢查該放射自顯影揭示，當(dāng)使用來(lái)自刺激的Th2而不是刺激的Th1細(xì)胞的提取物時(shí)，在非編碼鏈的殘基-28和-29處有超敏區(qū)。未刺激的Th細(xì)胞提取物不足跡覆蓋該區(qū)。觀察到的Th2足跡是不濃的，但在二個(gè)實(shí)驗(yàn)中可重復(fù)，并位于先前證實(shí)對(duì)IL-4啟動(dòng)子在Th2細(xì)胞中激活是關(guān)鍵的位點(diǎn)(Hodge,M.等(1995)J.Immunol.154:6397-6405)。由足跡分析檢測(cè)的在IL-4啟動(dòng)子中占據(jù)的位點(diǎn)的圖解概要示于圖5B中。這些結(jié)果表明先前顯示為功能重要的在近端IL-4啟動(dòng)子中的位點(diǎn)位于激活的Th2細(xì)胞中，而不是位于激活的Th1細(xì)胞中。實(shí)施例6重組c-maf結(jié)合至IL-4啟動(dòng)子中的MARE位點(diǎn)該Th2特異性足跡不含有c-maf效應(yīng)元件(MARE)。但是，檢查該近端IL-4啟動(dòng)子揭示緊靠該近端NF-AT位點(diǎn)(殘基-56至-51)下游的半個(gè)c-maf結(jié)合位點(diǎn)(MARE)(殘基-42至-37)(示于圖5B)。先前已證實(shí)該位點(diǎn)的突變消除了Th2細(xì)胞中該IL-4啟動(dòng)子的活性(Hodge,M.等(1995)J.Immunol.154:6397-6405)。為檢測(cè)c-Maf是否結(jié)合該位點(diǎn)，將含有b-拉鏈域(氨基酸171-371)的截短的c-Maf重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，并在S-標(biāo)記瓊脂糖柱上純化，并用于使用放射標(biāo)記的MARE寡核苷酸的電泳遷移率變動(dòng)檢測(cè)中。
通過(guò)將編碼c-Maf氨基酸殘基171-317的cDNA片段(公開(kāi)于Kurschner C.和Morgan,J.I.(1995)Mol.Cell.Biol.15:246-254)插入pET29(Novagen,Inc.Madison,WI)的NotⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建重組c-Maf的表達(dá)載體。使用T7聚合酶在BL21(DE3)株中表達(dá)該截短的c-Maf蛋白。通過(guò)加入1mM IPTG并于37℃溫育3小時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞。將誘導(dǎo)的細(xì)胞在lX結(jié)合/清洗緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.5、150mM NaCl、0.1％TritonX-100)并接著通過(guò)超聲處理裂解。使用S-標(biāo)記純化藥盒(Novagen)按照制造商的說(shuō)明書(shū)，從可溶性部分純化c-Maf蛋白。二個(gè)其它的蛋白NF-ATp和c-Jun亦用于EMSA檢測(cè)中。使用含有編碼鼠NF-ATp的Rel域的cDNA片段的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯載體TP7-NF-ATp，表達(dá)含有鼠NF-ATp的Rel域的重組NF-ATp。通過(guò)將全長(zhǎng)鼠c-Jun cDNA插入pGEM4的PstⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建c-Jun表達(dá)載體pGEM-c-Jun。從該T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄了1μg的每種質(zhì)粒DNA，并通過(guò)使用TnT偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯藥盒(Promega,Madison,WI)在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液中翻譯。
如下述進(jìn)行電泳遷移率變動(dòng)檢測(cè)(EMSA)。將100ng的雙鏈寡核苷酸用γ-32P-dATP(DuPont NEN Research Product,wilmington,DE)用T4多核苷酸激酶(Pharmacia LKB Biotechnology,Inc.,Piscataway,NJ)末端標(biāo)記。將該標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸在15-20％聚丙烯酰胺凝膠上分級(jí)分離，在1X TE中于37℃洗脫過(guò)夜并在乙醇中沉淀。于室溫進(jìn)行結(jié)合檢測(cè)20分鐘，該檢測(cè)使用了在15μl體積的20mM HEPES(pH7.9)、100mMKCl、5％甘油、1mM EDTA、5mM DTT、0.1％NP-40和0.5mg/ml BSA中的0.5μg重組蛋白或0.4μl體外翻譯產(chǎn)物、500ng多聚(dI-dC)和20,000cpm探針。然后在含有0.5X TBE的4％非變性聚丙烯酰胺凝膠中于室溫將該樣品分級(jí)分離。
用于EMSA中的源自鼠IL4啟動(dòng)子的寡核苷酸是:-59至-27:5’-CTCATTTTCCCTTGGTTTCAGCAACTTTAACTC-3’(SEQ ID NO:1)；-79至-60:5’-ATAAAATTTTCCAATGTAAA-3’(SEQ ID NO:2)；和-88至-61:5’-TGGTGTAATAAAATTTTCCAATGTAAA-3’(SEQ ID NO:3)。用于EMSA中的MARE寡核苷酸的序列是5’-GGAATTGCTGACTCAGCATTACT-3’(SEQ ID NO:4)．將所有的寡核苷酸與其相應(yīng)的反向互補(bǔ)鏈退火，以形成雙鏈寡核苷酸。
使用重組c-Maf的EMSA的結(jié)果示于圖6。該重組c-Maf蛋白與共有MARE寡核苷酸和存在于該IL-4中含有該NF-AT位點(diǎn)和MARE的33bp寡核苷酸均很好地結(jié)合。結(jié)合被未標(biāo)記同源物而不是對(duì)照探針特異性地競(jìng)爭(zhēng)。另外，c-Maf5不與僅含有重組NF-ATp良好結(jié)合的NF-AT靶序列的寡核苷酸結(jié)合。c-Maf與該IL-4啟動(dòng)子探針結(jié)合的能力是特異性的，因?yàn)轶w外翻譯的c-Jun蛋白不與該寡核苷酸結(jié)合。該c-Jun蛋白是功能性的，因?yàn)樗梢耘c含有核心TRE位點(diǎn)的共有MARE結(jié)合。這些結(jié)果表明，c-Maf而不是另一AP-1家族成員(c-Jun)可以與近端IL-4啟動(dòng)子內(nèi)的MARE位點(diǎn)結(jié)合。
NF-AT與AP-1家族成員蛋白協(xié)作地相互作用，在EMSA上形成在IL-2和IL-4啟動(dòng)子DNA上遷移率較高的復(fù)合物(Jain,J.(1993)Nature365:353-355；Rooney,J.等(1995)Immunity2:545-553)。先前實(shí)施例中描述的功能研究提示NF-AT蛋白可能與c-maf相互作用。為確定在存在DNA時(shí)c-Maf是否與NF-AT相互作用，在使用含有該NF-AT位點(diǎn)和鄰近MARE位點(diǎn)的33bp寡核苷酸的EMSA中，獨(dú)立或一起使用重組NF-ATp和c-Maf。結(jié)果示于圖6。單獨(dú)的每種蛋白結(jié)合至IL-4啟動(dòng)子DNA。重組c-Maf加重組NF-ATp蛋白產(chǎn)生這些復(fù)合物，并另外形成遷移率較高的復(fù)合物。當(dāng)使用c-Jun和NF-ATp時(shí)未觀察到較高遷移率的復(fù)合物，與c-Jun不能結(jié)合該位點(diǎn)一致。這些結(jié)果表明，c-Maf可以特異性地體外結(jié)合至位于近端IL-4啟動(dòng)子內(nèi)的序列，該序列先前顯示在Th2細(xì)胞中是功能關(guān)鍵的，并且如其它AP-1蛋白一樣，c-Maf可以體外與NF-AT蛋白相互作用。實(shí)施例7c-Maf轉(zhuǎn)錄激活I(lǐng)L-4啟動(dòng)子的能力反映到MARE和Th-2特異性足跡上通過(guò)高分辨率誘變已特征鑒定了恰好位于TATA元件上游的IL-4啟動(dòng)子的必需區(qū)(Hodge,M.等(1995)J.Immunol.154:6397-6405)。對(duì)該33bp區(qū)(-59至-28)的誘變證實(shí)對(duì)在Th2細(xì)胞中誘導(dǎo)型IL-4轉(zhuǎn)錄所必需的多個(gè)位點(diǎn)。這些位點(diǎn)包括NF-AT靶序列、Th2提取物足跡覆蓋的區(qū)、和現(xiàn)在識(shí)別為MARE的位點(diǎn)。使用了一系列包含跨越該區(qū)產(chǎn)生的四堿基對(duì)接頭掃描突變體的IL-4報(bào)道基因構(gòu)建物，以標(biāo)記被c-Maf在M12細(xì)胞中體內(nèi)利用的靶序列。用該c-maf表達(dá)載體和該系列突變IL-4啟動(dòng)子構(gòu)建物共轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。這些結(jié)果示于圖7A。MARE(mut3和4)或由Th2足跡定義的位點(diǎn)(mut2)的突變?nèi)∠?mut2和4)或部分取消(mut3)了轉(zhuǎn)染的c-maf驅(qū)動(dòng)IL-4轉(zhuǎn)錄的能力。亦在破壞該NF-AT序列的突變體8中觀察到降低c-maf反式激活的溫和效應(yīng)，與M12細(xì)胞中存在內(nèi)源NF-ATp一致并與在先前實(shí)施例中證實(shí)的NF-ATp和c-maf之間的協(xié)同作用一致。突變體6和7沒(méi)有顯著的效應(yīng)，而突變體5具有增強(qiáng)的反式激活能力與先前在Th2細(xì)胞中觀察到的一致(Hodge,M.等(1995)J.Immunol.154:6397-6405)。該反式激活數(shù)據(jù)與用重組c-Maf蛋白和做為探針的含有該33bp區(qū)的寡核苷酸和做為冷競(jìng)爭(zhēng)物的同一系列突變寡核苷酸進(jìn)行的EMSA一致。這些EMSA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖7B。這些實(shí)驗(yàn)表明c-Maf特異性地結(jié)合至并反式激活近端IL-4啟動(dòng)子內(nèi)的MARE，并且該鄰近Th2特異性元件密切參與c-Maf的結(jié)合和功能。實(shí)施例8使用酵母雙雜種相互作用陷阱檢測(cè)分離NIP45cDNA使用酵母雙雜種相互作用陷阱檢測(cè)分離可以直接結(jié)合NF-ATp的RHD的蛋白。通過(guò)將鼠NF-ATp的跨越氨基酸228-520的900bp片段(McCaffrey,P.G.等(1993)Science262:750-754)克隆入載體pEG202(Gyuris,J.等(1993)Cell75:791-803)的BamHⅠ位點(diǎn)，制備N(xiāo)F-ATp(RHD)-Gal4融合蛋白做為酵母雙雜種檢測(cè)中的“餌”。通過(guò)DNA序列分析確認(rèn)了該NF-AT(p)多肽序列與該Gal4序列的框架內(nèi)融合。使用本領(lǐng)域已知的方法(參見(jiàn)Gyuris,J.等(1993)Cell75:791-803)，將該餌用于篩選制備自鼠T細(xì)胞系D10的cDNA文庫(kù)、構(gòu)建于質(zhì)粒pJG4-5中，以選擇編碼與該餌相互作用的多肽的克隆。
分離了一類編碼具有對(duì)NF-ATp(RHD)-Gal4餌明顯高親和性(通過(guò)高水平β-半乳糖苷酶活性和賦予亮氨酸原養(yǎng)型的能力表現(xiàn))的融合蛋白的相互作用因子并命名為NIP45(NF-AT相互作用蛋白45)。圖8顯示酵母菌落的照片(每個(gè)質(zhì)粒組合三個(gè)代表)，該酵母已用NIP45質(zhì)粒和或者該NF-ATp-RHD餌或者對(duì)照餌(Max-Gla4,CDK2-Gal4和對(duì)照載體pEG202，僅表達(dá)表位標(biāo)記Gal4蛋白)以及LacZ報(bào)道質(zhì)粒pSH18共轉(zhuǎn)化。將所述酵母菌落在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上選擇，并點(diǎn)到含有Xgal和非阻遏碳源半乳糖的平板上。用NIP45質(zhì)粒和NF-ATp-RHD餌共轉(zhuǎn)化的酵母菌落為藍(lán)色，證實(shí)該LacZ報(bào)道質(zhì)粒表達(dá)(指示NIP-45/NF-ATp-RHD相互作用)，而用該NIP45質(zhì)粒和該對(duì)照餌轉(zhuǎn)化的酵母菌落為白色，表明NIP45與對(duì)照餌無(wú)相互作用。亦在含有半乳糖缺乏亮氨酸的培養(yǎng)基上測(cè)試轉(zhuǎn)化體，僅那些含有該NIP45質(zhì)粒和該NF-ATp-RHD餌的酵母生長(zhǎng)，進(jìn)一步表明NIP45與NF-ATp-RHD的特異性相互作用。通過(guò)該雙雜種檢測(cè)分離的NIP45cDNA是1.9kb DNA片段。實(shí)施例9NIP45與NF-ATp在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)體內(nèi)相互作用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)了NIP45多肽特異性地與NF-ATp體內(nèi)相互作用的能力。將在酵母雙雜種系統(tǒng)(實(shí)施例8中所述的)中選擇的1.9kb NIP45cDNA插入片段亞克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，該載體將編碼區(qū)融合至來(lái)自流感血凝聚素(HA)肽的表位標(biāo)記、載體pCEP4-HA(Herrshcer,R.F.等(1995)Genes Dev.9:3067-3082)，以產(chǎn)生表達(dá)載體NIP45-HA。然后將該標(biāo)記的構(gòu)建物與NF-ATp表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞(該細(xì)胞表達(dá)低水平的NF-ATp)。做為對(duì)照，亦用NIP45-HA與NF-ATp構(gòu)建物的親代表達(dá)載體(即，沒(méi)有該NF-ATp插入片段的表達(dá)載體)或用該NF-ATp表達(dá)載體與具有該表位標(biāo)記的NIP45框架外融合物共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞制備裂解液，并用抗NF-ATp抗體免疫沉淀。然后使用或者抗NF-ATp抗體或抗HA抗體對(duì)該免疫沉淀物質(zhì)進(jìn)行Westem印跡分析。
該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖9。使用HA特異性單克隆抗體(mAb)對(duì)這些樣品進(jìn)行的western印跡分析證實(shí)，用于免疫沉淀的抗NF-ATp抗體與該HA標(biāo)記的NIP45多肽共免疫沉淀。顯示僅用NIP45-HA轉(zhuǎn)染的泳道(中間泳道)揭示在這些細(xì)胞中存在低內(nèi)源水平的NF-ATp。通過(guò)用NF-ATp表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，進(jìn)一步增加了免疫沉淀的HA標(biāo)記的NIP45蛋白的量，證實(shí)該相互作用的特異性(右邊泳道)。未處理裂解液的Western印跡分析證實(shí)在測(cè)試NIP45-HA抗NF-ATp抗體共免疫沉淀的樣品中表達(dá)了相同水平的NIP45-HA多肽。另外，當(dāng)使用正常兔血清進(jìn)行免疫沉淀時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到對(duì)或者NF-ATp或者該HA標(biāo)記蛋白的免疫反應(yīng)性物質(zhì)。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NF-AT和NIP45在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中體內(nèi)物理結(jié)合。實(shí)施例10NIP45cDNA結(jié)構(gòu)分析將使用雙雜種檢測(cè)分離的克隆的1.9kb NIP45cDNA插入片段(描述于實(shí)施例1)用于篩選D10.G4 T細(xì)胞λzap Ⅱ cDNA文庫(kù)(Stratagene)，以鑒別全長(zhǎng)克隆。篩選含有約8×105克隆的文庫(kù)產(chǎn)生了7個(gè)雜交克隆，它們大都不超過(guò)原始分離物的5’末端。然而，最長(zhǎng)克隆(2.8kb)的序列分析證實(shí)與原始克隆在5’末端的同一性。在圖10中比較了原始1.9kbcDNA分離物和最長(zhǎng)的2.8kb cDNA分離物的結(jié)構(gòu)。該2.8kb cDNA分離物含有位于原始克隆5’末端下游868bp的180bp的另一片段。在該180核苷酸片段末端的連接序列表明它是未剪接內(nèi)含子并且在該區(qū)內(nèi)的核苷酸序列的概念翻譯(conceptual translation)揭示出一個(gè)框架內(nèi)終止密碼子。在該克隆內(nèi)的該另一序列的大部分都位于3’末端并代表后接多腺苷酸化尾的延伸性3’非翻譯區(qū)(參見(jiàn)圖10)。在許多基因內(nèi)都觀察到這種延伸性3’非翻譯區(qū)。如果剪接該小內(nèi)含子并翻譯該單個(gè)可讀框區(qū)，預(yù)期該2.8kb cDNA克隆編碼與原始1.9kb分離物相同的多肽。
該1.9kb cDNA分離物的核苷酸序列和預(yù)期的氨基酸序列示于圖11(并分別示于SEQ ID NO:5和6)。從第一個(gè)起始密碼子至框架內(nèi)的第一個(gè)終止密碼子顯示該編碼區(qū)。將核苷酸和氨基酸位置標(biāo)明于原始序列的右邊。該1.9kb核苷酸序列的概念翻譯揭示了具有45Kd分子量的412個(gè)氨基酸的多肽，并因此將該蛋白命名為NF-AT相互作用蛋白45(NIP45)。檢查NIP45的氨基酸序列揭示在N末端的一個(gè)高度堿性域，其中32個(gè)氨基酸中的13個(gè)是堿性的。在圖11中將該區(qū)標(biāo)下劃線。該堿性區(qū)看起來(lái)是圖12中顯示的疏水性圖中的親水性延伸(stretch)。實(shí)施例11NIP45mRNA的組織表達(dá)進(jìn)行來(lái)自不同鼠組織的RNA的Northem印跡分析以調(diào)查NIP45mRNA的組織表達(dá)。將來(lái)自各種組織的10μg總RNA在變性瓊脂糖凝膠上分離、印跡并與放射標(biāo)記的1.4kb MP45cDNA片段雜交。通過(guò)比較溴化乙錠熒光控制樣品的等量RNA上樣。該Northern印跡分析的結(jié)果示于圖13。該雜交揭示約3.1kb的轉(zhuǎn)錄物，它的大小與最長(zhǎng)的cDNA克隆相當(dāng)。來(lái)自睪丸的RNA懷疑另外的1.4Kb雜交種類。在脾臟、胸腺和睪丸中觀察到最高的NIP45轉(zhuǎn)錄物水平。在淋巴器官中的優(yōu)先表達(dá)可能表明NIP45在免疫系統(tǒng)中的特定功能。在該T細(xì)胞cDNA文庫(kù)中NIP45cDNA克隆的低強(qiáng)度雜交信號(hào)和極少發(fā)生表明NIP45RNA是相對(duì)稀少的信息。實(shí)施例12NIP45的亞細(xì)胞定位通過(guò)間接免疫熒光測(cè)定表位標(biāo)記的NIP45蛋白的亞細(xì)胞定位。使用本領(lǐng)域已知的方法(參見(jiàn)Heald,R.等(1993)Cell74:463-474)，用1μg編碼HA表位標(biāo)記的NIP45(pCEP4-HA)的表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞。如所述將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞過(guò)夜培養(yǎng)、固定、透化(Heald,R.等(1993)見(jiàn)上述)并用抗HA mAb 12CA5(Boehringer Mannheim)和indocarbocyanine標(biāo)記的驢抗鼠抗體(Jackson ImmunoResearch)探測(cè)，然后用染料Hoechst33258復(fù)染。結(jié)果示于圖14A-B。通過(guò)與用DNA染料Hoechst33258復(fù)染的相同細(xì)胞(參見(jiàn)圖14B)比較，用indocarbocyanine標(biāo)記的二級(jí)試劑觀察到了NIP45的核染色(參見(jiàn)圖14A)。熒光型式表明NIP45在核中均勻地分布。另外，該型式符合在用NF-AT4轉(zhuǎn)染并用離子霉素刺激的細(xì)胞中觀察到的情況(Shibasaki,F.等(1996)Nature382:370-373；亦參見(jiàn)以下)。用PMA和/或離子霉素刺激不影響該NIP45的亞細(xì)胞定位。
亦對(duì)用NF-AT4轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，并或者直接固定或者在固定之前首先用1mM離子霉素刺激10分鐘，并接著如上述進(jìn)行。結(jié)果示于圖14C-F。用抗NF-AT4特異性抗體，接著用indocarbocyanine標(biāo)記的二級(jí)試劑和Hoechst33258探測(cè)未刺激的(圖14C和14D)和離子霉素處理的(圖14E和14F)NF-AT4轉(zhuǎn)染子。Indocarbocyanine熒光證實(shí)，在未刺激的轉(zhuǎn)染子(圖14C)中胞質(zhì)定位的NF-AT4和在刺激的細(xì)胞中核定位的NF-AT4(圖14E)的染色型式。鄰近的板(分別為圖14D和14F)顯示了曝光以檢測(cè)通過(guò)用Hoechst33258染色的核的同一區(qū)域。
亦調(diào)查了NIP45對(duì)NF-AT4核易位的影響。用或者NF-AT4或者NF-AT4加上NIP45轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并于次日用1μM離子霉素刺激0、2、4、8或15分鐘。對(duì)于一個(gè)樣品，用離子霉素刺激細(xì)胞15分鐘，然后用新鮮培養(yǎng)基清洗并使之再靜置15分鐘(在表1中以“15分鐘+15分鐘靜置”標(biāo)明)。設(shè)計(jì)該分析以檢測(cè)NIP45做為核保留因子的功能。已顯示15分鐘對(duì)于NF-AT4輸出至細(xì)胞質(zhì)是充足的時(shí)間(Shibasaki,F.等(1996)Nature382:370-373)。然后固定所有的樣品，并如上述通過(guò)免疫熒光分析NF-AT4易位。結(jié)果概括于以下表2。NF-AT4在細(xì)胞質(zhì)中的亞細(xì)胞定位用(-)標(biāo)明，NF-AT4的核易位用(+)標(biāo)明。
表2NF-AT4的核易位
存在NIP45時(shí)沒(méi)有觀察到NF-AT4核輸入或輸出速率的差別，表明對(duì)胞內(nèi)鈣水平變化應(yīng)答的NF-AT4核運(yùn)輸不受外源NIP45過(guò)量表達(dá)的影響。實(shí)施例13NIP45在調(diào)節(jié)基因表達(dá)中的功能活性為檢測(cè)NIP45在NF-AT驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄中的功能作用，以在HepG2細(xì)胞中高水平表達(dá)NIP45。選擇HepG2細(xì)胞是因?yàn)樗鼈兙哂械退降膬?nèi)源NF-AT，并且NF-AT家族成員蛋白的異位表達(dá)已顯示在缺乏外源刺激時(shí)在該細(xì)胞系中反式激活NF-AT驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄(Hoey,T.等(1995)Immunity2:461-472)。用來(lái)自IL-2基因的3X NF-AT-CAT報(bào)道基因(Venkataraman,L.等(1994)Immunity1:189-196)和NIP45和NF-AT家族成員(NF-ATp、NF-ATc、NF-AT3、NF-AT4)的對(duì)照質(zhì)?；虮磉_(dá)載體轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。通過(guò)描述于Hoey,T.等(1995)見(jiàn)上述的DEAE葡聚糖方法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，并按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行CAT檢測(cè)。結(jié)果示于圖15。將每個(gè)組合的一個(gè)代表性檢測(cè)示于代表各組的相對(duì)CAT活性的直方圖鄰近。通過(guò)歸一化用該CAT報(bào)道基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的CAT活性，并將每個(gè)親代表達(dá)載體歸一化至1，計(jì)算倍數(shù)誘導(dǎo)。數(shù)值代表超出該對(duì)照轉(zhuǎn)染的CAT表達(dá)的相對(duì)水平。顯示的每個(gè)代表性放射自顯影都進(jìn)行了至少三次轉(zhuǎn)染。
僅將NIP45轉(zhuǎn)染入具有3X NF-AT-CAT報(bào)道基因的HepG2細(xì)胞未導(dǎo)致CAT表達(dá)的顯著增長(zhǎng)，證實(shí)NIP45不能僅靠自身式激活NF-AT靶序列。單獨(dú)的NF-ATp過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致該NF-AT-CAT報(bào)道基因的大量反式激活(超出對(duì)照載體6倍)，與先前的報(bào)道(Hoey,T.等(1995)見(jiàn)上述)一致。NIP45加NF-ATp的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致相對(duì)于僅用NF-ATp轉(zhuǎn)染的CAT活性增加4-5倍，并超過(guò)僅用載體轉(zhuǎn)染的25-30倍。當(dāng)使用突變3X NF-AT-CAT報(bào)道基因或?qū)φ誐HCⅡ類啟動(dòng)子報(bào)道基因時(shí)未觀察到這種增加，因此證明其靶位點(diǎn)的特異性。為確認(rèn)該NIP45cDNA編碼的該多肽產(chǎn)物對(duì)該增強(qiáng)的反式激活負(fù)責(zé)，通過(guò)于核苷酸50制造二個(gè)堿基缺失將移碼突變導(dǎo)入該編碼區(qū)。該變化導(dǎo)致于氨基酸13導(dǎo)入錯(cuò)義突變和在附加的22個(gè)殘基后該多肽終止。使用該NIP45Δ構(gòu)建物的檢測(cè)證實(shí)它不能在存在或不存在NF-ATp時(shí)反式激活該NF-AT報(bào)道基因，因此確認(rèn)觀察到的增強(qiáng)的反式激活是因?yàn)閺腘IP45cDNA表達(dá)的多肽。亦在B細(xì)胞系M12和T細(xì)胞克隆D10中進(jìn)行反式激活實(shí)驗(yàn)，得到類似但顯著性較低的結(jié)果，可能是因?yàn)樵谶@些以后的細(xì)胞系中高水平的內(nèi)源NIP45或NF-ATp。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NIP45顯著地和特異性地增強(qiáng)由NF-ATp誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，該活性需要與NF-ATp相互作用。
NF-AT蛋白在RHD內(nèi)共享約70％同一性，提高了NIP45亦可以與其它NF-AT家族成員相互作用的可能性。為測(cè)試該可能性，將NIP45與編碼或者NF-ATc、NF-AT3或NF-AT4的表達(dá)構(gòu)建物加上3X NF-AT-CAT報(bào)道質(zhì)粒如上述共轉(zhuǎn)染。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦示于圖8。先前已證實(shí)，當(dāng)在HepG2細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)時(shí)，所有的NF-AT家族成員都可以反式激活含有三份拷貝的NF-AT/AP1位點(diǎn)的報(bào)道基因，盡管水平不同(Hoey,T.等(1995)見(jiàn)上述)。在缺乏NIP45時(shí)，NF-ATp是最有效的NF-AT-CAT報(bào)道基因的反式激活蛋白，其次是NF-ATc和NF-AT3,NFAT4只有微弱的反式激活，與先前的數(shù)據(jù)(McCaffrey,P.G.等(1993)Science262:750-754)一致。當(dāng)NF-ATc、NF-AT3或NF-AT4與NIP45共轉(zhuǎn)染時(shí)，NIP45顯著增強(qiáng)NF-ATc和NF-AT3驅(qū)動(dòng)的反式激活，并微弱地增強(qiáng)NF-AT4介導(dǎo)的反式激活(圖15)。與NF-ATc在HepG2細(xì)胞中協(xié)作同NIP45與NF-ATcRHD餌在酵母細(xì)胞中相互作用的觀察一致。總體上，NIP45過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致NF-ATc引起的反式激活增加4倍，NF-AT3驅(qū)動(dòng)的反式激活增加3倍，NF-AT4驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄增加2倍。已知NF-AT家族成員的RHD的高度序列保守性，NIP45增強(qiáng)所有的NF-AT家族成員的活性的能力是不奇怪的。NF-AT RHD域的序列比較揭示，與羧基末端相比，氨基末端部分的序列同一性較高(Hoey,T.等(1995)見(jiàn)上述)。因此，有可能該NIP45/NF-AT相互作用位點(diǎn)位于該RHD的5’部分。
盡管含有多拷貝NF-AT結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)道構(gòu)建物提供了測(cè)定由NF-AT和NIP45引起的反式激活的敏感方法，但我們尋求確定在天然NF-AT依賴性啟動(dòng)子的情況下NIP45是否有功能。IL-4表達(dá)是高度組織特異性的并局限于T細(xì)胞的Th2亞群和肥大細(xì)胞。該IL-4啟動(dòng)子含有已顯示對(duì)IL-4表達(dá)關(guān)鍵的多個(gè)NF-AT結(jié)合位點(diǎn)(Rooney,J.w.等(1995)Immunity2:473-483)。另外，已顯示原癌基因c-Maf指導(dǎo)IL-4的組織特異性表達(dá)(實(shí)施例3和4)。因此，該IL-4啟動(dòng)子在HepG2細(xì)胞系中不活躍但可以通過(guò)導(dǎo)入NF-ATp和c-Maf被激活。在如上述進(jìn)行的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，用IL-4-CAT報(bào)道構(gòu)建物(延伸至該IL-4啟動(dòng)子的-732bp)和NIP45、NF-ATp和c-Maf的表達(dá)載體或?qū)φ辙D(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。NIP45的對(duì)照是于氨基酸13的移碼突變體。NF-ATp和c-Maf的對(duì)照分別是空表達(dá)載體pREP4和pMEX(Ho,I.C.等(1996)Cell85:973-983)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖16(如在圖15中描繪代表性CAT檢測(cè)和直方圖)。該數(shù)據(jù)表明，與NF-ATp和c-Maf一同導(dǎo)入NIP45導(dǎo)致相對(duì)于僅用NF-ATp和c-Maf觀察到的IL-4啟動(dòng)子活性再增加9倍。NIP45亦增加缺乏轉(zhuǎn)染的NF-ATp時(shí)IL-4啟動(dòng)子活性，該效應(yīng)有可能是因?yàn)榕c內(nèi)源NF-ATp相互作用。實(shí)施例14瞬時(shí)過(guò)量表達(dá)NIP45與NF-ATp和c-Maf導(dǎo)致內(nèi)源IL-4產(chǎn)生為確定NIP45、NF-ATp和c-Maf的組合是否足以誘導(dǎo)正常不產(chǎn)生IL-4的細(xì)胞內(nèi)源IL-4表達(dá)，用NF-ATp和c-Maf的表達(dá)載體與NIP45或pCI載體對(duì)照瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染M12B淋巴瘤細(xì)胞。如先前描述通過(guò)電穿孔瞬時(shí)轉(zhuǎn)染M12細(xì)胞(Ho,I.C.等(1996)Cell85:973-983)，即于975μF、280V電穿孔之前于室溫將0.4ml PBS中的3x106細(xì)胞與5μg的每種質(zhì)粒溫育10分鐘。通過(guò)市售IL-4ELISA(Pharmingen)按照制造商說(shuō)明書(shū)除了所述的修飾(Ho,I.C.等(1996)見(jiàn)上述)測(cè)定72小時(shí)后收獲的細(xì)胞上清液的IL-4水平。進(jìn)行了獨(dú)立的四組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并檢測(cè)該培養(yǎng)上清液中IL-4的分泌。這四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之一的代表實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖17。對(duì)于每組轉(zhuǎn)染，包括NIP45導(dǎo)致顯著增加IL-4產(chǎn)生。用NIP45轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比未接受NIP45的細(xì)胞多產(chǎn)生50-200倍的內(nèi)源IL-4，其中IL-4產(chǎn)生接近檢測(cè)的極限。實(shí)施例15體外T輔助細(xì)胞分化期間p18mRNA表達(dá)被向下調(diào)節(jié)Maf家族蛋白p18是缺失含有反式激活域的c-Maf三分之二的氨基末端的“小”maf蛋白成員之一。為檢測(cè)在正常T輔助細(xì)胞分化成為T(mén)h2表現(xiàn)型期間p18轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，如上述實(shí)施例2中所述進(jìn)行體外分化實(shí)驗(yàn)。通過(guò)在存在細(xì)胞因子和抗細(xì)胞因子抗體(對(duì)于Th1用IFNγ和抗IL-4，對(duì)于Th2用IL-4和抗IFNγ)的情況下用抗CD3處理，沿Th1或Th2途徑驅(qū)動(dòng)原初脾細(xì)胞(Th前體(Thp)細(xì)胞)。對(duì)在刺激后的各時(shí)間點(diǎn)(第0、1、3、5、或7天)收獲的分化細(xì)胞進(jìn)行Northem印跡分析，以分析p18和c-maf轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。體外分化Th2細(xì)胞c-maf和p18表達(dá)的結(jié)果示于圖18。與上述結(jié)果一致，于第0天時(shí)c-maf轉(zhuǎn)錄物表達(dá)是低水平或無(wú)法檢出，但在沿著Th2途徑分化時(shí)其表達(dá)增加。與之相反，p18轉(zhuǎn)錄物表達(dá)于第0天(即未分化T細(xì)胞中)時(shí)是可檢測(cè)的，但在所述該細(xì)胞沿Th2途徑分化時(shí)降至基本不可檢測(cè)的水平。這些結(jié)果表明，在正常T輔助細(xì)胞分化為T(mén)h2表現(xiàn)型期間，p18表達(dá)被向下調(diào)節(jié)。實(shí)施例16p18阻遏IL-4啟動(dòng)子活性為檢測(cè)p18表達(dá)是否影響IL-4啟動(dòng)子活性，在M12B淋巴瘤細(xì)胞中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)使用的方法是上述實(shí)施例3中描述的。將IL-4啟動(dòng)子/CAT報(bào)道基因構(gòu)建物與或者c-Maf表達(dá)載體、p18表達(dá)載體或者c-Maf和p18表達(dá)載體一起轉(zhuǎn)染入M12細(xì)胞。CAT檢測(cè)的代表性結(jié)果示于圖19。僅表達(dá)c-Maf(5μg質(zhì)粒)導(dǎo)致該IL-4啟動(dòng)子構(gòu)建物激活(參見(jiàn)圖19的泳道2)，由該M12細(xì)胞中可檢測(cè)的CAT活性所證實(shí)。共轉(zhuǎn)染p18表達(dá)載體(2.5、5或10μg)與c-Maf導(dǎo)致CAT活性降低(參見(jiàn)圖19的泳道3、4和5),p18量增加導(dǎo)致觀察到的CAT活性更加降低。在M12細(xì)胞中僅表達(dá)p18未導(dǎo)致在細(xì)胞中可檢測(cè)的CAT活性(參見(jiàn)圖19的泳道6)。這些結(jié)果證實(shí)，p18可以阻遏由c-Maf刺激的IL-4啟動(dòng)子活性。實(shí)施例17過(guò)量表達(dá)c-Maf的轉(zhuǎn)基因小鼠本實(shí)施例描述在轉(zhuǎn)基因小鼠的T細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)c-Maf蛋白。該c-maf轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物的示意圖示于圖20。該構(gòu)建物包含4kb小鼠c-mafcDNA和小鼠c-maf基因的第一個(gè)內(nèi)含子。該c-maf cDNA的表達(dá)受CD4啟動(dòng)子/增強(qiáng)子調(diào)節(jié)區(qū)控制，該區(qū)可操作地連接至c-maf第一個(gè)內(nèi)含子的5’末端，由此賦予該構(gòu)建物T細(xì)胞特異性表達(dá)。將一個(gè)SV40多聚腺苷酸化位點(diǎn)連接至該c-mafcDNA的3’末端。將該c-maf轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物微注射入受精的小鼠卵母細(xì)胞，并按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備轉(zhuǎn)基因小鼠。
使用幾種不同的檢測(cè)將該c-maf轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表現(xiàn)型與野生型動(dòng)物的表現(xiàn)型比較。首先，定量測(cè)定淋巴器官(淋巴結(jié)、脾臟和胸腺)中的總細(xì)胞數(shù)，其結(jié)果示于圖21。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)，c-maf轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出在檢測(cè)的所有三個(gè)淋巴器官中與野生型小鼠相比細(xì)胞數(shù)降低。其次，使用流式細(xì)胞儀，比較c-maf轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠中特定胸腺細(xì)胞群體的豐度。定量測(cè)定了雙陽(yáng)性(CD4+CD8+)、雙陰性(CD4-CD8-)和單陽(yáng)性胸腺細(xì)胞(CD4+或CD8+)。亦測(cè)定了CD4與CD8細(xì)胞的比例(CD4/CD8)。結(jié)果概括于以下表3中。
表3c-Maf轉(zhuǎn)基因小鼠中特定胸腺細(xì)胞群體體的豐度
這些結(jié)果證實(shí)與野生型小鼠相比，c-maf轉(zhuǎn)基因小鼠的雙陽(yáng)性胸腺細(xì)胞數(shù)顯著降低。另外，c-maf轉(zhuǎn)基因小鼠的CD4+單陽(yáng)性胸腺細(xì)胞數(shù)顯著降低。最后，定量測(cè)定了c-maf轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠血清中IgE的基礎(chǔ)水平。結(jié)果示于圖22。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)與野生型小鼠相比，c-maf轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出血清IgE基礎(chǔ)水平增加。
上述c-maf轉(zhuǎn)基因小鼠的表現(xiàn)型(即脾臟和胸腺小、雙陽(yáng)性胸腺細(xì)胞和單陽(yáng)性CD4+胸腺細(xì)胞數(shù)降低、血清IgE基礎(chǔ)水平增加)與IL-4過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠描述的表現(xiàn)型(參見(jiàn)Tepper等(1990)Cell62:457；和Lewis等(1991)J.Exp.Med.173:89)非常類似。等價(jià)物本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)識(shí)別或可以確定使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)的本文描述的本發(fā)明的特定實(shí)施方案的許多等價(jià)方案。這種等價(jià)方案包括在以下權(quán)利要求書(shū)內(nèi)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)名稱President and Fellows of Harvard College(B)街道124Mount Auburn Street(C)城市Cambrige(D)州Massachusetts(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編02138(ⅱ)發(fā)明名稱通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群的方法和組合物(ⅲ)序列數(shù)量6(ⅳ)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人LAHIVE&COCKFIELD(B)街道60State Street,suite510(C)城市Boston(D)州Massachusetts(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編02109-1875(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S(B)提交日期(C)分類(ⅵ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/636,602(B)提交日期1996年4月23日(C)分類(ⅵ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/755,592(B)提交日期1996年11月25日(C)分類(ⅵ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/755,584(B)提交日期1996年11月25日(C)分類(ⅷ)代理律師/代理人信息(A)姓名Kara,Catherine J.
(B)注冊(cè)號(hào)P41,106(C)參考/檔案號(hào)HUI-021CPPC(ⅸ)電信信息(A)電話(617)227-7400
(B)傳真(617)227-5941(2)SEQ IDNO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度33個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1CTCATTTTCC CTTGGTTTCA GCAACTTTAA CTC 33(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2ATAAAATTTT CCAATGTAAA20(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3TGGTGTAATA AAATTTTCCA ATGTAAA27(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4GGAATTGCTG ACTCAGCATT ACT23(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1946個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置13...1248(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5ACAGTGTGGG AG ATG GCG GAA CCA CTG AGG GGA CGT GGT CCG AGG TCC 48Met Ala Glu Pro Leu Arg Gly Arg Gly Pro Arg Ser1 5 10CGC GGT GGC CGA GGC GCT CGG AGA GCC CGA GGC GCC CGT GGC CGG TGT 96Arg Gly Gly Arg Gly Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ala Arg Gly Arg Cys15 20 25CCT CGC GCC CGG CAG TCT CCG GCT AGG CTC ATT CCA GAC ACC GTG CTT 144Pro Arg Ala Arg Gln Ser Pro Ala Arg Leu Ile Pro Asp Thr Val Leu30 35 40GTG GAC TTG GTC AGT GAC AGC GAC GAA GAG GTC TTG GAA GTC GCA GAC 192Val Asp Leu Val Ser Asp Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Ala Asp45 50 55 60CCA GTA GAG GTG CCG GTC GCC CGC CTC CCC GCG CCG GCT AAA CCT GAG 240Pro Val Glu Val Pro Val Ala Arg Leu Pro Ala Pro Ala Lys Pro Glu65 70 75CAG GAC AGC GAC AGT GAC AGT GAA GGG GCG GCC GAG GGG CCT GCG GGA 288Gln Asp Ser Asp Ser Asp Ser Glu Gly Ala Ala Glu Gly Pro Ala Gly80 85 90GCC CCG CGT ACA TTG GTG CGA CGG CGG CGG CGG CGG CTG CTG GAT CCC 336Ala Pro Arg Thr Leu Val Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Leu Asp Pro95 100 105GGA GAG GCG CCG GTG GTC CCA GTG TAC TCC GGG AAG GTA CAG AGC AGC 384Gly Glu Ala Pro Val Val Pro Val Tyr Ser GlY Lys Val Gln Ser Ser110 115 120CTC AAC CTC ATT CCA GAT AAT TCA TCC CTC TTG AAA CTG TGC CCT TCA 432Leu Asn Leu Ile Pro Asp Asn Ser Ser Leu Leu Lys Leu Cys Pro Ser125 130 135 140GAG CCT GAA GAT GAG GCA GAT CTG ACA AAT TCT GGC AGT TCT CCC TCT 480Glu Pro Glu Asp Glu Ala Asp Leu Thr Asn Ser Gly Ser Ser Pro Ser145 150 155GAG GAT GAT GCC CTG CCT TCA GGT TCT CCC TGG AGA AAG AAG CTC AGA 528Glu Asp Asp Ala Leu Pro Ser Gly Ser Pro Trp Arg Lys Lys Leu Arg160 165 170AAG AAG TGT GAG AAA GAA GAA AAG AAA ATG GAA GAG TTT CCG GAC CAG 576Lys Lys Cys Glu Lys Glu Glu Lys Lys Met Glu Glu Phe Pro Asp Gln175 180 185GAC ATC TCT CCT TTG CCC CAA CCT TCG TCA AGG AAC AAA AGC AGA AAG 624Asp Ile Ser Pro Leu Pro Gln Pro Ser Ser Arg Asn Lys Ser Arg Lys190 195 200CAT ACG GAG GCG CTC CAG AAG CTA AGG GAA GTG AAC AAG CGT CTC CAA 672His Thr Glu Ala Leu Gln Lys Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Leu Gln205 210 215 220GAT CTC CGC TCC TGC CTG AGC CCC AAG CAG CAC CAG AGT CCA GCC CTT 720Asp Leu Arg Ser Cys Leu Ser Pro Lys Gln His Gln Ser Pro Ala Leu225 230 235CAG AGC ACA GAT GAT GAG GTG GTC CTA GTG GAA GGG CCT GTC TTG CCA 768Gln Ser Thr Asp Asp Glu Val Val Leu Val Glu Gly Pro Val Leu Pro240 245 250CAG AGC TCT CGA CTC TTT ACA CTC AAG ATC CGG TGC CGG GCT GAC CTA 816Gln Ser Ser Arg Leu Phe Thr Leu Lys Ile Arg Cys Arg Ala Asp Leu255 260265GTG AGA CTG CCT GTC AGG ATG TCG GAG CCC CTT CAG AAT GTG GTG GAT 864Val Arg Leu Pro Val Arg Met Ser Glu Pro Leu Gln Asn Val Val Asp270 275 280CAC ATG GCC AAT CAT CTT GGG GTG TCT CCA AAC AGG ATT CTT TTG CTT 912His Met Ala Asn His Leu Gly Val Ser Pro Asn Arg Ile Leu Leu Leu285 290 295 300TTT GGA GAG AGT GAA CTG TCT CCT ACT GCC ACC CCT AGT ACC CTA AAG 960Phe Gly Glu Ser Glu Leu Ser Pro Thr Ala Thr Pro Ser Thr Leu Lys305 310 315CTT GGA GTG GCT GAC ATC ATT GAT TGT GTG GTG CTA GCA AGC TCT TCA 1008Leu Gly Val Ala Asp Ile Ile Asp Cys Val Val Leu Ala Ser Ser Ser320 325 330GAG GCC ACA GAG ACA TCC CAG GAG CTC CGG CTC CGG GTG CAG GGG AAG 1056Glu Ala Thr Glu Thr Ser Gln Glu Leu Arg Leu Arg Val Gln Gly Lys335 340 345GAG AAA CAC CAG ATG TTG GAG ATC TCA CTG TCT CCT GAT TCT CCT CTT 1104Glu Lys His Gln Met Leu Glu Ile Ser Leu Ser Pro Asp Ser Pro Leu350 355 360AAG GTT CTC ATG TCA CAC TAT GAG GAA GCC ATG GGA CTC TCT GGA CAC 1152Lys Val Leu Met Sar His Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Ser Gly His365 370 375 380AAG CTC TCC TTC TTC TTT GAT GGG ACA AAG CTT TCA GGC AAG GAG CTG 1200Lys Leu Ser Phe Phe Phe Asp Gly Thr Lys Leu Ser Gly Lys Glu Leu385 390 395CCA GCT GAT CTG GGC CTG GAA TCC GGA GAT CTC ATC GAA GTC TGG GGC 1248Pro Ala Asp Leu Gly Leu Glu Ser Gly Asp Leu Ile Glu Val Trp Gly400 405 410TGAAGCTCTC ACCCTGTTCG GACGCAAAGC CAAGACATGG AGACAATAGC TCCCAATTTT1308ATTATTGTGA TTTTTCGCCC CATAAGGGCT AACAGAAACT GAATTAGAAC TTGTTTACTT1368ATTTATTTCT GGTGCTGGGG ATTGAACCCC AGACTATGCA CATGCTAAGG ATGTATGAAG1428TGGAGGCAAA ACCAAGGCAT TACCTTTAGC CAGCCTCTAG TAGACTGTAG TGTCAAGCAA1488GTGGCTACTT GGTAGTTGTG TGGCTCTGTG TATGTTTGTG CTGTATTTGG CAGCCCCTGG1548GGCACATAGA AGGGACCTTG GCTTCCCTAC CATTTCACGT TCGCTGGTGC CCTTTCCTTC1608ATCAGATGAC TTCTGTGAAG CTGCCTATGT TGAGTGTGTT GAACTAAATG AGCTCTGCTT1668TGGGTGTCCA GGCCTGGGGT TTGTGCCGCA GTTGGAGCCA GCAGTGACTT CACTCTGACT 1728TGGGACTGAG AATGCATTTC CTGGTGGAGA CACTCGGGTG CAGAAATATA ACAGAAGGTG 1788ACATACATGC TGAAGCTGAG GACTAGGTCG AAAGTTAACG ACGTTGCATT TTCAGCCTTG 1848GGTATCCTCT CTGCCTGCCA GGACTCTAGC CAGTGTCTGG TACACACTTC TTGGCATGGA 1908CACCTAGGTC GACGCGGGCG CGATTCGGCC GACTCGAG 1946(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度412個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Met Ala Glu Pro Leu Arg Gly Arg Gly Pro Arg Ser Arg Gly Gly Arg1 5 10 15Gly Ala Arg Arg Ala Arg Gly Ala Arg Gly Arg Cys Pro Arg Ala Arg20 25 30Gln Ser Pro Ala Arg Leu Ile Pro Asp Thr Val Leu Val Asp Leu Val35 40 45Ser Asp Ser Asp Glu Glu Val Leu Glu Val Ala Asp Pro Val Glu Val50 55 60Pro Val Ala Arg Leu Pro Ala Pro Ala Lys Pro Glu Gln Asp Ser Asp65 70 75 80Ser Asp Ser Glu Gly Ala Ala Glu Gly Pro Ala Gly Ala Pro Arg Thr85 90 95Leu Val Arg Arg Arg Arg Arg Arg Leu Leu Asp Pro Gly Glu Ala Pro100 105 110Val Val Pro val Tyr Ser Gly Lys val Gln Ser Ser Leu Asn Leu Ile115 120 125Pro Asp Asn Ser Ser Leu Leu Lys Leu Cys Pro Ser Glu Pro Glu Asp130 135 140Glu Ala Asp Leu Thr Asn Ser Gly Ser Ser Pro Ser Glu Asp Asp Ala145 150 155 160Leu Pro Ser Gly Ser Pro Trp Arg Lys Lys Leu Arg Lys Lys Cys Glu165 170 175Lys Glu Glu Lys Lys Met Glu Glu Phe Pro Asp Gln Asp Ile Ser Pro180 185 190Leu Pro Gln Pro Ser Ser Arg Asn Lys Ser Arg Lys His Thr Glu Ala195 200 205Leu Gln Lys Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Leu Gln Asp Leu Arg Ser210 215 220Cys Leu Ser Pro Lys Gln His Gln Ser Pro Ala Leu Gln Ser Thr Asp225 230 235 240Asp Glu Val Val Leu Val Glu Gly Pro Val Leu Pro Gln Ser Ser Arg245 250 255Leu Phe Thr Leu Lys Ile Arg Cys Arg Ala Asp Leu Val Arg Leu Pro260 265 270Val Arg Met Ser Glu Pro Leu Gln Asn Val Val Asp His Met Ala Asn275 280 285His Leu Gly Val Ser Pro Asn Arg Ile Leu Leu Leu Phe Gly Glu Ser290 295 300Glu Leu Ser Pro Thr Ala Thr Pro Ser Thr Leu Lys Leu Gly Val Ala305 310 315 320Asp Ile Ile Asp Cys Val Val Leu Ala Ser Sar Ser Glu Ala Thr Glu325 330 335Thr Ser Gln Glu Leu Arg Leu Arg Val Gln Gly Lys Glu Lys His Gln340 345 350Met Leu Glu Ile Ser Leu Ser Pro Asp Ser Pro Leu Lys Val Leu Met355 360 365Ser His Tyr Glu Glu Ala Met Gly Leu Ser Gly His Lys Leu Set Phe370 375 380Phe Phe Asp Gly Thr Lys Leu Ser Gly Lys Glu Leu Pro Ala Asp Leu385 390 395 400Gly Leu Glu Ser Gly Asp Leu Ile Glu Val Trp Gly405 410
權(quán)利要求
1．調(diào)節(jié)細(xì)胞的T輔助2型(Th2)相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的方法，包含用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)或活性的藥物接觸該細(xì)胞，使得調(diào)節(jié)細(xì)胞的Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中該轉(zhuǎn)錄因子與激活的T細(xì)胞核因子(NF-AT)家族蛋白合作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。
2．權(quán)利要求1的方法，其中該轉(zhuǎn)錄因子是Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子。
3．權(quán)利要求1的方法，其中該轉(zhuǎn)錄因子是maf家族蛋白。
4．權(quán)利要求3的方法，其中該maf家族蛋白是c-Maf。
5．權(quán)利要求3的方法，其中該maf家族蛋白是小maf蛋白。
6．權(quán)利要求5的方法，其中該小maf蛋白是p18。
7．權(quán)利要求1的方法，其中該轉(zhuǎn)錄因子與NF-AT家族蛋白相互作用。
8．權(quán)利要求7的方法，其中該轉(zhuǎn)錄因子與NF-AT家族蛋白的Rel同源域相互作用。
9．權(quán)利要求8的方法，其中該轉(zhuǎn)錄因子是NIP45。
10．權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中該藥物在胞內(nèi)起作用調(diào)節(jié)該轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性。
11．權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中該藥物是編碼該轉(zhuǎn)錄因子的核酸分子，其中該核酸分子以適于在該細(xì)胞中表達(dá)該轉(zhuǎn)錄因子的形式被導(dǎo)入該細(xì)胞。
12．權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中該藥物是胞內(nèi)結(jié)合分子。
13．權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中用至少一種其它藥物接觸該細(xì)胞，所述其它藥物調(diào)節(jié)至少一種對(duì)調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因起作用的其它轉(zhuǎn)錄因子的活性。
14．權(quán)利要求13的方法，其中至少一種其它轉(zhuǎn)錄因子選自NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白和AP-1家族蛋白。
15．權(quán)利要求11的方法，其中將至少一種其它核酸分子導(dǎo)入該細(xì)胞，所述至少一種其它核酸分子編碼至少一種對(duì)調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因起作用的其它轉(zhuǎn)錄因子。
16．權(quán)利要求15的方法，其中該至少一種其它轉(zhuǎn)錄因子選自NF-AT家族蛋白、NF-AT相互作用蛋白、maf家族蛋白和AP-1家族蛋白。
17．權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中該細(xì)胞是T輔助1型(Th1)細(xì)胞、B細(xì)胞或非淋巴樣細(xì)胞。
18．權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中刺激該細(xì)胞Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
19．權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中抑制該細(xì)胞Th2相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
20．權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，其中該Th2相關(guān)細(xì)胞因子是白介素-4。
21．權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)的方法，再包含將該細(xì)胞給予受治療者，以由此調(diào)節(jié)受治療者中T輔助1型(Th1)或T輔助2型(Th2)細(xì)胞的發(fā)育。
22．重組表達(dá)載體，它包含編碼maf家族蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列操作性地連接至指導(dǎo)該maf家族蛋白在淋巴樣細(xì)胞中特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。
23．權(quán)利要求22的重組表達(dá)載體，其中該調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)該maf家族蛋白特異性地在T細(xì)胞中表達(dá)。
24．權(quán)利要求22的重組表達(dá)載體，其中該調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)該maf家族蛋白特異性地在B細(xì)胞中表達(dá)。
25．重組表達(dá)載體，它包含編碼maf家族蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列操作性地連接至指導(dǎo)該maf家族蛋白在造血干細(xì)胞中特異性表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。
26．已導(dǎo)入編碼maf家族蛋白的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是淋巴樣細(xì)胞。
27．權(quán)利要求26的宿主細(xì)胞，它是T細(xì)胞。
28．權(quán)利要求26的宿主細(xì)胞，它是B細(xì)胞。
29．已導(dǎo)入編碼maf家族蛋白的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是造血干細(xì)胞。
30．分離的核酸分子，它包含編碼NIP45或其生物學(xué)活性部分的核苷酸序列。
31．分離核酸分子，它包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中該蛋白包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列，并與NF-AT家族蛋白的Rel同源域相互作用。
32．權(quán)利要求31的分離的核酸分子，其中該蛋白包含與SEQ IDNO:6的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列。
33．權(quán)利要求31的分離的核酸分子，其中該蛋白包含與SEQ IDNO:6的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列。
34．權(quán)利要求31的分離的核酸分子，其中該蛋白包含與SEQ IDNO:6的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸序列。
35．長(zhǎng)度至少為15個(gè)核苷酸的分離的核酸分子，它在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列的核酸分子雜交。
36．權(quán)利要求35的分離的核酸分子，它包含天然存在的核苷酸序列。
37．權(quán)利要求36的分離的核酸分子，它編碼小鼠NIP45。
38．權(quán)利要求36的分離核酸分子，它編碼人類NIP45。
39．包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列編碼區(qū)的分離的核酸分子。
40．權(quán)利要求39的分離的核酸分子，包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
41．編碼SEQ ID NO:6的氨基酸序列的分離的核酸分子。
42．編碼NIP45融合蛋白的分離的核酸分子。
43．與權(quán)利要求30的核酸分子反義的分離的核酸分子。
44．分離的核酸分子，它與包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列的核酸分子的編碼鏈反義。
45．權(quán)利要求44的分離的核酸分子，它與SEQ ID NO:5的核苷酸序列編碼鏈的編碼區(qū)反義。
46．權(quán)利要求44的分離的核酸分子，它與SEQ ID NO:5的核苷酸序列編碼鏈的非編碼區(qū)反義。
47．包含權(quán)利要求30-46中任一項(xiàng)的核酸分子的載體。
48．權(quán)利要求47的載體，它是重組表達(dá)載體。
49．含有權(quán)利要求47或48的載體的宿主細(xì)胞。
50．生產(chǎn)NIP45蛋白的方法，包含在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求49的宿主細(xì)胞直至產(chǎn)生NIP45蛋白。
51．權(quán)利要求50的方法，再包含從該培養(yǎng)基或該宿主細(xì)胞分離NIP45蛋白。
52．分離的NIP45蛋白或其生物學(xué)活性部分。
53．分離的蛋白，它包含與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列，并與NF-AT家族蛋白的Rel同源域相互作用。
54．權(quán)利要求53的分離的蛋白，它與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少70％同源。
55．權(quán)利要求53的分離的蛋白，它與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少80％同源。
56．權(quán)利要求53的分離的蛋白，它與SEQ ID NO:6的氨基酸序列至少90％同源。
57．包含操作性地連接至非NIP45多肽的NIP45多肽的融合蛋白。
58．NIP45的抗原肽，它包含示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列的至少8個(gè)氨基酸殘基，該肽包含NIP45表位，使得制備的抗該肽的抗體與NIP45形成特異性免疫復(fù)合體。
59．特異性結(jié)合NIP45蛋白的抗體。
60．權(quán)利要求59的抗體，它是單克隆抗體。
61．權(quán)利要求59的抗體，它被偶聯(lián)至可檢測(cè)物質(zhì)上。
62．藥用組合物，它包含權(quán)利要求59-61中任一項(xiàng)的抗體和藥學(xué)上可接受載體。
63．非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，它含有攜帶編碼NIP45蛋白的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。
64．權(quán)利要求63的非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，它包含具有改變的內(nèi)源NIP45基因的細(xì)胞。
65．非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，含有攜帶編碼maf家族蛋白的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。
66．權(quán)利要求65的非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中該maf家族蛋白優(yōu)先在該動(dòng)物的T細(xì)胞中表達(dá)。
67．鑒別調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性的化合物的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄因子與激活的T細(xì)胞核因子(NF-AT)家族蛋白合作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因的表達(dá)，該方法包括提供指示組合物，它具有與NF-AT家族蛋白合作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的活性；用測(cè)試化合物接觸該指示組合物；和確定該測(cè)試化合物對(duì)該指示組合物中的該轉(zhuǎn)錄因子活性的影響以由此鑒別調(diào)節(jié)與NFAT家族蛋白合作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子活性的化合物。
68．權(quán)利要求67的方法，其中該轉(zhuǎn)錄因子是maf家族蛋白。
69．權(quán)利要求68的方法，其中該maf家族蛋白是c-Maf。
70．權(quán)利要求68的方法，其中該maf家族蛋白是小maf蛋白。
71．權(quán)利要求67的方法，其中該轉(zhuǎn)錄因子與NF-AT家族蛋白相互作用。
72．權(quán)利要求71的方法，其中該轉(zhuǎn)錄因子是NIP45。
73．權(quán)利要求67的方法，其中該指示組合物是淋巴樣細(xì)胞。
74．權(quán)利要求73的方法，其中該淋巴樣細(xì)胞是Th2細(xì)胞。
75．權(quán)利要求67的方法，其中該指示組合物是酵母細(xì)胞。
76．權(quán)利要求67-75中任一項(xiàng)的方法，其中該指示組合物包含指示細(xì)胞，其中所述指示細(xì)胞包含(ⅰ)該轉(zhuǎn)錄因子和(ⅱ)對(duì)該轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答的報(bào)道基因。
77．權(quán)利要求76的方法，其中所述指示細(xì)胞含有ⅰ)編碼該轉(zhuǎn)錄因子的重組表達(dá)載體；和ⅱ)包含操作性地連接報(bào)道基因的Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因調(diào)節(jié)序列的載體；并且所述方法包括a)用測(cè)試化合物接觸該指示細(xì)胞；b)確定在存在該測(cè)試化合物時(shí)該指示細(xì)胞中該報(bào)道基因的表達(dá)水平；和c)比較存在該測(cè)試化合物時(shí)指示細(xì)胞中該報(bào)道基因的表達(dá)水平和不存在該測(cè)試化合物時(shí)指示細(xì)胞中該報(bào)道基因的表達(dá)水平，以由此鑒別調(diào)節(jié)該轉(zhuǎn)錄因子活性的化合物。
78．權(quán)利要求67-72的任一的方法，其中該指示組合物包含下述的制劑(ⅰ)該轉(zhuǎn)錄因子和(ⅱ)該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA分子，并且所述方法包括a)用測(cè)試化合物接觸該指示組合物；b)確定存在該測(cè)試化合物時(shí)該轉(zhuǎn)錄因子與該DNA分子相互作用的程度；和c)比較存在該測(cè)試化合物時(shí)該轉(zhuǎn)錄因子與該DNA分子相互作用的程度和不存在該測(cè)試化合物時(shí)該轉(zhuǎn)錄因子與該DNA分子相互作用的程度，以由此鑒別調(diào)節(jié)該轉(zhuǎn)錄因子活性的化合物。
79．權(quán)利要求78的方法，其中該轉(zhuǎn)錄因子是maf家族蛋白并且該DNA分子包含maf效應(yīng)元件(MARE)。
80．權(quán)利要求67-75中任一項(xiàng)的方法，它鑒別來(lái)自Th2細(xì)胞的與該轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白，其中該指示組合物是指示細(xì)胞，該指示細(xì)胞包含ⅰ)操作性地連接至轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的報(bào)道基因；和ⅱ)編碼第一融合蛋白的第一嵌合基因，所述第一融合蛋白包含與NFAT家族蛋白合作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子；該測(cè)試化合物包含第二嵌合基因的文庫(kù)，該文庫(kù)編碼第二融合蛋白，該第二融合蛋白包括源自Th2細(xì)胞的蛋白。表達(dá)對(duì)第一融合蛋白、第二融合蛋白和該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列之間的相互作用敏感的報(bào)道基因；和其中通過(guò)確定該指示細(xì)胞中該報(bào)道基因的表達(dá)水平，來(lái)確定該測(cè)試化合物對(duì)該指示組合物中的該轉(zhuǎn)錄因子的作用，以由此鑒別包含來(lái)自Th2細(xì)胞的與該轉(zhuǎn)錄因子相互作用的化合物。
81．鑒別調(diào)節(jié)NIP45與NF-AT家族蛋白之間相互作用的化合物的方法，包含a)存在或不存在測(cè)試化合物時(shí)混合(ⅰ)NIP45或其N(xiāo)F-AT相互作用部分；和(ⅱ)NF-AT家族蛋白或其N(xiāo)IP45相互作用部分；b)在存在和不存在該測(cè)試化合物時(shí)，確定(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用的程度；和c)鑒別調(diào)節(jié)NIP45與NF-AT家族蛋白相互作用的化合物。
82．權(quán)利要求81的方法，其中該NF-AT家族蛋白的NIP45相互作用部分包含該NF-AT家族蛋白的Rel同源域。
83．權(quán)利要求81的方法，其中通過(guò)用可檢測(cè)物質(zhì)標(biāo)記(ⅰ)或(ⅱ)、分離未標(biāo)記(ⅰ)或(ⅱ)、并定量測(cè)定與未標(biāo)記(ⅰ)或(ⅱ)結(jié)合的標(biāo)記(ⅰ)或(ⅱ)的量，確定(ⅰ)和(ⅱ)之間相互作用的程度。
84．權(quán)利要求67-75或81-83的任一的方法，再包括確定該化合物對(duì)免疫應(yīng)答的影響，以由此鑒別調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的化合物。
85．權(quán)利要求84的方法，其中通過(guò)測(cè)定該化合物對(duì)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響確定該化合物對(duì)免疫應(yīng)答的影響。
86．權(quán)利要求85的方法，其中該Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因時(shí)白介素-4基因。
87．權(quán)利要求84的方法，其中通過(guò)測(cè)定該化合物對(duì)T輔助類型1(Th1)或T輔助類型2(Th2)細(xì)胞發(fā)育的影響確定目的化合物對(duì)免疫應(yīng)答的影響。
全文摘要
公開(kāi)了通過(guò)調(diào)節(jié)與NF－AT家族蛋白合作調(diào)節(jié)Th2相關(guān)細(xì)胞因子基因表達(dá)的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子的活性,調(diào)節(jié)T輔助2型(Th2)相關(guān)細(xì)胞因子、特別是白介素－4產(chǎn)生的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中,調(diào)節(jié)maf家族蛋白(例如c－Maf或小maf蛋白,諸如p18)的活性。在另一實(shí)施方案中,調(diào)節(jié)與NF－AT家族蛋白相互作用的蛋白(例如NIP45)的活性。本發(fā)明也包括組合方法,例如其中調(diào)節(jié)maf家族蛋白和NF－AT蛋白的活性或調(diào)節(jié)maf蛋白 和NF－AT相互作用蛋白的活性。也公開(kāi)了使用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性的藥物調(diào)節(jié)T輔助1型(Th1)或T輔助2型(Th2)亞群發(fā)育的方法。本發(fā)明也提供NIP45組合物,包括編碼NIP45的分離的核酸分子、反義核酸分子、含有NIP45核酸分子的重組表達(dá)載體,也提供已導(dǎo)入這種表達(dá)載體的宿主細(xì)胞和攜帶NIP45轉(zhuǎn)基因的非人類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明還提供分離的NIP45蛋白和肽、NIP45融合蛋白和抗NIP45抗體。也公開(kāi)了使用本發(fā)明NIP45組合物的方法。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1225682SQ97195740
公開(kāi)日1999年8月11日 申請(qǐng)日期1997年4月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月23日
發(fā)明者L·H·格里姆徹爾, M·R·霍德格, I·C·霍 申請(qǐng)人:哈佛大學(xué)校長(zhǎng)及研究員協(xié)會(huì)