專利名稱：在植株內(nèi)表現(xiàn)出抗病毒和/或抗真菌活性的pap突變蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，具體涉及賦予植株對真菌和/或病毒的抗性的方法和遺傳材料。
背景技術(shù)：
保護植株免受病原體的侵害一直是農(nóng)業(yè)上最重要的研究課題。許多商業(yè)上有價值的農(nóng)作物易受植物病毒和真菌的感染，這些病毒和真菌能夠在特定的季節(jié)對作物造成嚴重的侵害，由此極大地降低了其經(jīng)濟價值。對農(nóng)民造成的經(jīng)濟價值的降低繼而造成購買者商品消費的增高。已公開了一些研究，為了賦予植株抗病毒性，對植物病毒衣殼蛋白在植株內(nèi)的表達進行了研究。例如參見Abel等，《科學(xué)》(Science)232738-43(1986)；Guozzo等，《生物技術(shù)》(Bio/Technology)6549-57(1988)；Hemenway等，《歐洲分子生物學(xué)協(xié)會雜志》(EMBO J.)71273-80(1988)；Stark等，《生物技術(shù)》71257-62(1989)和Lawson等，《生物技術(shù)》8127-34(1990)。但是，轉(zhuǎn)基因植株只表現(xiàn)出對同源病毒和相關(guān)病毒的抗性，而沒有對非相關(guān)病毒的抗性。Kawchuk等在《分子和植物微生物相互作用》(Mol.Plant-Microbe Interactions)3(5)301-07(1990)中描述了野生型馬鈴薯卷葉病病毒(PLRV)外被蛋白基因在馬鈴薯植株內(nèi)的表達。雖然被感染的植株表現(xiàn)出對PLRV抗性，但是用PLRV接種的全部轉(zhuǎn)基因植株都被病毒感染，這樣就十分不利地允許了病毒的繼續(xù)傳播，因而不可能獲得高水平的抗性。參見美國專利No.5,304,730。
Lodge等，《美國科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)907089-93(1993)報道了用編碼野生型商陸抗病毒蛋白(PAP)的cDNA經(jīng)根瘤土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草，以及轉(zhuǎn)基因煙草植株對非相關(guān)病毒的抗性。PAP，存在于美洲商陸細胞壁內(nèi)的一種I型核糖體抑制蛋白(RIP)是一單條多肽鏈，催化性去除真核核糖體的28SrRNA內(nèi)高度保守的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)中一特定的腺嘌呤殘基，干擾延長因子2的結(jié)合，由此抑制細胞的蛋白質(zhì)合成。參見例如Irvin等，Pharmac.Ther.55279-302(1992)；Endo等，《生物物理學(xué)研究通訊》(Biophys.Res.Comm.)1501032-36(1988)和Hartley等，F(xiàn)EBS Lett.29065-68(1991)。Lodge的結(jié)果與過去的研究截然相反，即前文所述表達病毒基因的轉(zhuǎn)基因植株只對該病毒和與之密切相關(guān)的病毒具有抗性。參見Beachy等，《植物病理學(xué)年鑒》(Ann.Rev.Phytophathol.)28451-74(1990)和Golemboski等，《美國科學(xué)院院報》876311-15(1990)。但是，Lodge還報道，表達PAP的煙草植株(即表達蛋白超過10ng/mg)傾向于矮化、帶斑點的表型，而其它積聚了最高水平PAP的轉(zhuǎn)基因煙草植株是無繁殖能力的。已經(jīng)證明了RIP在諸如靶特異性等其它方面的性能是不可預(yù)測的。與上文Lodge所證明的PAP(上文Lodge所述)不同，自蓖麻籽中分離得到的蓖麻毒蛋白對哺乳動物核糖體的作用比對植物核糖體強1000倍。參見Harley等，《美國科學(xué)院院報》795935-5938(1982)。大麥胚乳RIP對植物核糖體的活性也很低。參見例如Endo等，《生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報》(Biochem.Biophys.Acta)994224-226(1988)和Taylor等，《植物雜志》(Plant J.)5827-835(1984)。
真菌病原體是植株中病原體嚴重爆發(fā)的重要原因。植物已經(jīng)發(fā)展出了自然防御系統(tǒng)，其中包括細胞壁的形態(tài)修飾和各種抗病原化合物的合成。參見，Boller等，《植物生理學(xué)》(Plant Physiol)74442-444(1984)；Bowles，《生物化學(xué)年鑒》59873-907(1990)；Joosten等，《植物生理學(xué)》89945-951(1989)；Legrand等，《美國科學(xué)院院報》846750-6754(1987)和Roby等，《植物細胞》(PlantCell)2999-1007(1990)。幾種病理相關(guān)性(PR)蛋白已被證明具有抗真菌性能，并可在被病原體感染后被誘導(dǎo)產(chǎn)生。這些是不同形式的水解酶，例如在體外通過破壞真菌細胞壁來抑制真菌生長的幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶。參見Boller等，同上；Grenier等，《植物生理學(xué)》1031277-123(1993)；Leah等，《生物化學(xué)雜志》2661464-1573(1991)；Mauch等，《植物生理學(xué)》87325-333(1988)和Sela-Buurlage Buurlage等，《植物生理學(xué)》101857-863(1993)。
人們已經(jīng)進行了一些努力，試圖用編碼對真菌細胞壁具有顯著裂解活性的病理相關(guān)蛋白(例如幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶)的基因通過重組法來加強植株的抗病性。參見例如Broglie等，《科學(xué)》2541194-1197(1991)；Vierheilig等，《分子和植物微生物相互作用》6261-264(1993)和Zhu等，《生物技術(shù)》12807-812(1994)。最近，發(fā)現(xiàn)了另外兩類基因具有在植株內(nèi)產(chǎn)生抗病性的潛力。Wu等在《植物細胞》71357-1368(1995)中報道，表達黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對胡蘿卜歐文氏桿菌(Erwinia carotovora)和蔓延疫霉的抗性加強。對此的假設(shè)是，由葡萄糖氧化酶催化的葡萄糖的氧化產(chǎn)生了過氧化氫，當它在植株內(nèi)積聚時導(dǎo)致活性氧類物質(zhì)的積累，繼而引發(fā)產(chǎn)生各種抗病原和抗真菌機制，例如植物抗毒素(參見Apostol等，《植物生理學(xué)》90109-116(1989)和Degousee，《植物生理學(xué)》104945-952(1994))，病理相關(guān)蛋白(Klessig等，《植物分子生物學(xué)》(Plant Mol.Biol.)261439-1458(1994))，植物細胞壁的加強(Brisson等，《植物細胞》61703-1712(1994))，水楊酸誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性(Chen等，《科學(xué)》1621883-1886(1993))和超敏防御反應(yīng)(Levine等，《細胞》(Cell)79583-593(1994))。
除了對植株內(nèi)抗病毒性的研究之外，還結(jié)合抗真菌性對RIP進行了研究。例如，Logeman等在《生物技術(shù)》10305-308(1992)中報道，分離自大麥胚乳的一種RIP能夠保護轉(zhuǎn)基因煙草植株免受真菌的感染。大麥胚乳RIP和大麥II類幾丁質(zhì)酶的重組在體外和體內(nèi)都具有對茄屬絲核菌抗性的協(xié)同加強作用。參見Lea等，同上；Mauch等，同上；Zhu等，同上和Jach等，《植物雜志》(The PlantJournal)897-109(1995)。但是，沒有證明PAP具有體外抗真菌活性。參見Chen等，《植物生理學(xué)》40612-620(1991)，其中報道了PAP在體外對真菌蔓延疫霉、Colletotrichum coccodes、腐皮鐮孢、硫色鐮孢、Phoma foreata和茄屬絲核菌沒有作用。
所以，一直以來需要有一種賦予植株廣譜抗病毒和/或真菌的方法，該方法不會導(dǎo)致細胞的死亡或不育、而且只需要很少量的轉(zhuǎn)基因。
本發(fā)明綜述本發(fā)明涉及植物毒性被降低而且在植株內(nèi)表現(xiàn)出PAP生物活性的PAP突變蛋白。“PAP生物活性”指PAP抗病毒活性和/或PAP抗真菌活性。一類較好的PAP突變蛋白其特征在于在成熟PAP的N末端至少有一個氨基酸取代，例如75位的甘氨酸殘基被取代或97位的谷氨酸殘基被取代。另一類PAP突變蛋白的特征在于在成熟PAP的N末端被截短達38個氨基酸。另一類較好的PAP突變蛋白其特征在于具有在成熟PAP的C末端區(qū)域被截短之類的突變。更好的是C末端截短至少約26至約76個成熟PAP氨基酸的PAP突變蛋白(不包括野生型PAP C末端29個氨基酸的延伸)。還有一類PAP突變蛋白是無酶活性的，在體外或植株內(nèi)不表現(xiàn)PAP抗病毒性，但在植株內(nèi)表現(xiàn)PAP抗真菌性。本發(fā)明的PAP突變蛋白還包括22個氨基酸的N末端信號序列和/或野生型PAP的C末端延伸。
本發(fā)明還提供了編碼PAP突變蛋白的DNA分子，這些分子可以同時還編碼或不編碼成熟PAP 22個氨基酸的N末端信號序列和/或野生型PAP 29個氨基酸的C末端延伸。這些DNA可以與在原核細胞(例如大腸桿菌)或真核細胞(例如植物)內(nèi)具有功能的啟動子可操作地連接，然后穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化到在所述細胞內(nèi)具有功能的載體中。本發(fā)明還提供了用編碼突變型PAP的DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主例如原核或真核細胞(例如酵母或植物)，以及用這些DNA轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體。本發(fā)明還提供了含有DNA的轉(zhuǎn)基因植物和種子。以上DNA在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的表達為植株提供了廣譜的抗病毒和/或抗真菌性，但并不象野生型PAP那樣對植物具有植物毒性。本發(fā)明范圍內(nèi)的植物包括單子葉植物例如谷物類和雙子葉植物。
本發(fā)明還提供了鑒定植物毒性降低、而且在植株內(nèi)表現(xiàn)出PAP生物活性的PAP突變蛋白的方法。該方法的步驟包括提供一種經(jīng)轉(zhuǎn)化的真核細胞，例如包含與真核細胞內(nèi)功能性誘導(dǎo)型操縱子可操作性連接的、編碼PAP的DNA分子的酵母。在轉(zhuǎn)化前誘變編碼PAP的DNA，或?qū)D(zhuǎn)化后細胞進行誘變(即在用PAP構(gòu)建物轉(zhuǎn)化細胞后進行誘變)。將如此轉(zhuǎn)化的細胞培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，在規(guī)定的時間后，在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物誘導(dǎo)DNA分子的表達。然后確定培養(yǎng)細胞的存活是否是由于突變型PAP的表達。對宿主基本上沒有毒性的突變PAP型被認為是表現(xiàn)為植物毒性降低的PAP突變蛋白。由此鑒定出的PAP突變蛋白經(jīng)體外(例如使用外源病毒或真菌)或體內(nèi)(例如通過轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的表達)測定表現(xiàn)出廣譜抗病毒和/或抗真菌性的同時被認為是保留了PAP在植物內(nèi)生物活性的PAP突變蛋白。本發(fā)明還提供了用上述方法鑒定的經(jīng)分離和純化的PAP突變蛋白。本發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明表達編碼PAP突變蛋白的DNA的轉(zhuǎn)基因植物與產(chǎn)生成熟、野生型PAP(“PAP”)或變異PAP即PAP-v的轉(zhuǎn)基因植物相比，表現(xiàn)出被降低的植物毒性，但表現(xiàn)出抗病毒性和/或抗真菌性?！敖档偷闹参锒拘浴敝副磉_編碼突變型PAP的DNA的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出正常和有繁殖能力的表型，而不是產(chǎn)生成熟PAP的轉(zhuǎn)基因植物所特有的矮化、帶斑點的表型(例如Lodge在前文文獻中所述)?！耙吧蚉AP”指PAP氨基酸序列1-262，22個氨基酸的N末端信號肽(“野生型PAP的N末端信號序列”)和29個氨基酸的C末端延伸(第263至291位氨基酸)，以上序列均顯示在下表I中作為SEQ ID NO2。對應(yīng)的核苷酸序列為SEQ IDNO1。所以，“野生型、成熟PAP”或“成熟PAP”指表I所示的PAP氨基酸序列1-262。
表I5'CTATGAAGTCGGGTCAAAGCATATACAGGCTATGCATTGTTAGAAACATTGATGCCTCTGATCCCGATAAACAATACAAATTAGACAATAAGATGACATACAAGTACCTAAACTGTGTATGGGGGAGTGAAACCTCAGCTGCTAAAAAAACGTTGTAAGAAAAAAAGAAAGTTGTGAGATTAACTACAGGGCGAAAGTATTGGAACTAGCTAGTAGGAAGGGAAG ATG AAG TCG ATGMet Lys Ser MetCTT GTG GTG ACA ATA TCA ATA TGG CTC ATT CTT GCA CCA ACT TCA ACTLeu Val Val Thr Ile Ser Ile Trp Leu Ile Leu Ala Pro Thr Ser Thr(67) (100)TGG GCT GTG AAT ACA ATC ATC TAC AAT GTT GGA AGT ACC ACC ATT AGCTrp Ala Val Asn Thr Ile Ile Tyr Asn Val Gly Ser Thr Thr Ile Ser(1) (10)GAAA TAC GCC ACT TTT CTG AAT GAT CTT CGT AAT GAA GCG AAA GAT CCALys Tyr Ala Thr Phe Leu Asn Asp Leu Arg Asn Glu Ala Lys Asp Pro(20)(30)AGT TTA AAA TGC TAT GGA ATA CCA ATG CTG CCC AAT ACA AAT ACA AATSer Leu Lys Cys Tyr Gly Ile Pro Met Leu Pro Asn Thr Asn Thr Asn(40)CCCA AAG TAC GTG TTG GTT GAG CTC CAA GGT TCA AAT AAA AAA ACC ATCPro Lys Tyr Val Leu Val Glu Leu Gln Gly Ser Asn Lys Lys Thr Ile(50)(60)ACA CTA ATG CTG AGA CGA AAC AAT TTG TAT GTG ATG GGT TAT TCT GATThr Leu Met Leu Arg Arg Asn Asn Leu Tyr Val Met Gly Tyr Ser Asp(70)CCC TTT GAA ACC AAT AAA TGT CGT TAC CAT ATC TTT AAT GAT ATC TCAPro Phe Glu Thr Asn Lys Cys Arg Tyr His Ile Phe Asn Asp Ile Ser(80) (90)GGT ACT GAA CGC CAA GAT GTA GAG ACT ACT CTT TGC CCA AAT GCC AATGly Thr Glu Arg Gln Asp Val Glu Thr Thr Leu Cys Pro Asn Ala Asn(100)(110)TCT CGT GTT AGT AAA AAC ATA AAC TTT GAT AGT CGA TAT CCA ACA TTGSer Arg Val Ser Lys Asn Ile Asn Phe Asp Ser Arg Tyr Pro Thr Leu(120)GAA TCA AAA GCG GGA GTA AAA TCA AGA AGT CAG GTC CAA CTG GGA ATTGlu Ser Lys Ala Gly Val Lys Ser Arg Ser Gln Val Gln Leu Gly Ile(130) (140)CAA ATA CTC GAC AGT AAT ATT GGA AAG ATT TCT GGA GTG ATG TCA TTCGln Ile Leu Asp Ser Asn Ile Gly Lys Ile Ser Gly Val Met Ser PheACT GAG AAA ACC GAA GCC GAA TTC CTA TTG GTA GCC ATA CAA ATG GTAThr Glu Lys Thr Glu Ala Glu Phe Leu Leu Val Ala Ile Gln Met Val(160) (170)TCA GAG GCA GCA AGA TTC AAG TAC ATA GAG AAT CAG GTG AAA ACT AATSer Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Asn Gln Val Lys Thr Asn(180) (190)TTT AAC AGA GCA TTC AAC CCT AAT CCC AAA GTA CTT AAT TTG CAA GAGPhe Asn Arg Ala Phe Asn Pro Asn Pro Lys Val Leu Asn Leu Gln Glu(200)ACA TGG GGT AAG ATT TCA ACA GCA ATT CAT GAT GCC AAG AAT GGA GTTThr Trp Gly Lys Ile Ser Thr Ala Ile His Asp Ala Lys Asn Gly Val(210) (220)TTA CCC AAA CCT CTC GAG CTA GTG GAT GCC AGT GGT GCC AAG TGG ATALeu Pro Lys Pro Leu Glu Leu Val Asp Ala Ser Gly Ala Lys Trp Ile(230)GTG TTG AGA GTG GAT GAA ATC AAG CCT GAT GTA GCA CTC TTA AAC TACVal Leu Arg Val Asp Glu Ile Lys Pro Asp Val Ala Leu Leu Asn Tyr(240) (250)GTT GGT GGG AGC TGT CAG ACA ACT TAT AAC CAA AAT GCC ATG TTT CCTVal Gly Gly Ser Cys Gln Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Ala Met Phe Pro(260) (262) (270)CAA CTT ATA ATG TCT ACT TAT TAT AAT TAC ATG GTT AAT CTT GGT GATGln Leu Ile Met Ser Thr Tyr Tyr Asn Tyr Met Val Asn Leu Gly Asp(280)CTA TTT GAA GGA TTC TGATCATAAACALeu Phe Glu Gly Phe(290)TAATAAGGAGTATATATATATTACTCCAACTATATTATAAAGCTTAAATAAGAGGCCGTGTTAATTAGTACTTGTTGCCTTTTGCTTTATGGTGTTGTTTATTATGCCTTGTATGCTTGTAATATTATCTAGAGAACAAGATGTACTGTGTAATAGTCTTGTTTGAAATAAAACTTCCAATTATGATGCAAAAAAAAAAAAAAA3'表I還以與野生型PAP對齊的方式顯示了PAP-v氨基酸和對應(yīng)的核苷酸。PAP-v的氨基酸序列與野生型PAP的差別主要在于Leu20Arg(即成熟PAP 20位的精氨酸對亮氨酸)和Tyr49His取代。PAP-v核苷酸序列中的第三處改變對氨基酸序列沒有影響(對應(yīng)于信號序列中第一個Ser的密碼子TCG→TCA)。表I還顯示了 5’端和3’端的非編碼、側(cè)翼序列。在真核細胞內(nèi)表達后，野生型PAP其N末端的22氨基酸序列被共翻譯地切除，生成分子量約32KD的多肽，該多肽經(jīng)進一步加工即切除C末端的29個氨基酸(“野生型PAP的C末端延伸”或“PAP(263-292)”)后生成分子量約29KD的成熟、野生型PAP(后文稱為“PAP(1-262)”)(即分離自美洲商陸的葉中的PAP)。參見Irvin等，Pharmac.Ther.55279-302(1992)；Dore等，《核酸研究》(Nuc.Acids Res.)21(18)4200-05(1993)；Monzingo等，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)233705-15(1993)；Tumer等，《美國科學(xué)院院報》928448-8452(1995)。
“PAP抗病毒活性”指本發(fā)明突變型PAP在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的表達產(chǎn)生了廣譜的抗病毒性，即對大量非相關(guān)病毒引起的感染的抗性或抑制能力，這些病毒包括但不限于RNA病毒例如馬鈴薯X病毒組(PVX，馬鈴薯病毒X)、馬鈴薯Y病毒組(PVY)、黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草花葉病毒(TMV)、大麥黃矮病毒(BYDV)、小麥條斑花葉病毒、馬鈴薯卷葉病病毒(PLRV)、洋李痘病毒、西瓜花葉病毒、南瓜黃色花葉病毒、木瓜環(huán)斑病毒、甜菜西方黃化病毒、大豆矮化病毒、胡蘿卜read葉病毒，和DNA植物病毒例如西紅柿黃葉卷曲病毒。參見Lodge等，同上；Tomlinson等，《普通病毒學(xué)雜志》(J.Gen.Virol.)22225-32(1974)；和Chen等，《植物生理學(xué)》40612-20(1991)。
“PAP抗真菌活性”指本發(fā)明的突變型PAP使植株具有廣譜抗真菌性。本發(fā)明的突變型PAP提高了對植物真菌引起的病害的抗性，這些真菌例如腐霉(爛種、枯苗和根爛的原因之一)、疫霉(造成馬鈴薯的晚疫以及許多其它植物的根爛和疫病)、盤梗霉、霜霉、單軸霉、假霜霉和指梗霉(造成絨毛霉)、禾白粉菌(造成谷類和草類的粉狀霉變)、輪枝孢(造成蔬菜、花卉、農(nóng)作物和樹木維管的枯萎)、絲核菌(造成許多植物的枯萎病和草皮的褐斑病)、鐮孢(造成大豆的根爛、馬鈴薯干枯)、旋孢腔菌(造成根莖腐爛和谷類及草類的疫病)、赤霉(造成苗疫病和玉米以及小谷類的根莖腐爛)、頂囊殼菌(造成谷類的全部頂囊枯黃病)、核盤菌(造成花卉和蔬菜花冠腐爛和枯萎，以及草皮的銀元疹)、柄銹菌(造成小麥和其它小谷類的莖銹)、黑粉菌(造成玉米的黑穗病)、Magnaporthae(造成草皮的夏季斑病)和小核菌(Schlerotium)(造成草皮的北方枯萎病)。其它重要的真菌類病害包括由尾孢、殼針孢、球腔菌、病霉、刺盤孢、長蠕孢、鏈格孢、葡萄孢、枝孢和曲霉引起的病害。
申請人還認為，本發(fā)明的突變型PAP還提高植物對害蟲、細菌和線蟲的抗性。重要的細菌類病害包括由假單孢菌、黃單孢菌、歐文氏菌、Clavibacter和鏈霉菌造成的病害。
本發(fā)明的PAP突變蛋白與野生型PAP的不同主要在于(1)體內(nèi)區(qū)室化改變；(2)C末端突變，包括但不限于缺失或移碼突變；(3)N末端突變；和(4)活性位點突變。第一類PAP突變蛋白可能具有被改變的體內(nèi)區(qū)室化特性；即，它們可能不與野生型定位在相同的亞細胞區(qū)室。雖然不想局限于特定的作用理論，申請人確信在酵母中，這些PAP突變蛋白不能經(jīng)受共翻譯加工(去除22個氨基酸的信號肽)和/或翻譯后加工(去除29個氨基酸的C末端片段)，由此造成細胞毒性完全或基本上被消除。這些突變蛋白同時也是非植物毒性的。有關(guān)這些突變型PAP體內(nèi)功能的尤其令人驚奇或出乎意料的是，突變作用定位于編碼成熟PAP(1-262)的序列內(nèi)，而不在N末端信號肽或29氨基酸的C末端延伸內(nèi)。此外，突變型PAP具有體外抑制翻譯的酶活性，這表明植物毒性不完全是酶活性的作用。較好的PAP突變蛋白包括一個保守性點突變，在野生型PAP的氨基酸殘基75甘氨酸(Gly75)變成纈氨酸、丙氨酸、異亮氨酸或亮氨酸，或者(2)在野生型PAP氨基酸殘基97谷氨酸(Glu97)處的保守性或非保守性點突變。更好的PAP突變蛋白是PAP(1-262，Gly75Val)和PAP(1-262，Glu97Lys)，各自的DNA可以方便地通過將野生型甘氨酸75的密碼子GGT改為GTT(纈氨酸)和將谷氨酸97的密碼子GAA改為AAA(賴氨酸)來制備。其它區(qū)室化特性被改變的PAP突變蛋白可以通過后文的選擇方法來鑒定。Dore等在前文文獻中描述了一種Arg67Gly PAP突變蛋白(在Dore的論文中由于存在一個N末端的甲硫氨酸殘基而編號為Arg68Gly)，但它對真核細胞有毒而對原核細胞例如大腸桿菌無毒。該突變蛋白不包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的第二類PAP突變蛋白在PAP的C末端區(qū)域內(nèi)有缺失或氨基酸取代。申請人意外發(fā)現(xiàn)，這些突變蛋白雖然在體外抑制翻譯但在體內(nèi)是無毒性的(即非植物毒性的)。較好的突變蛋白缺失了成熟PAP的約26至約76個氨基酸，更好的PAP突變蛋白是突變型PAP(1-236)-PAP(1-184)，包括端值。所以，開始于野生型成熟PAP第237位氨基酸殘基的截短形式屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)，其中例如PAP(1-236)，PAP(1-235)，PAP(1-234)，PAP(1-233)，PAP(1-232)，PAP(1-231)，PAP(1-230)，PAP(1-229)，PAP(1-228)，PAP(1-227)，PAP(1-226)，PAP(1-225)，PAP(1-224)，PAP(1-223)，PAP(1-222)，PAP(1-221)，PAP(1-220)，PAP(1-219)，PAP(1-218)，PAP(1-217)，PAP(1-216)，PAP(1-215)，PAP(1-214)，PAP(1-213)，PAP(1-212)，PAP(1-211)，PAP(1-210)，PAP(1-209)，PAP(1-208)，PAP(1-207)，PAP(1-206)，PAP(1-205)，PAP(1-204)，PAP(1-203)，PAP(1-202)，PAP(1-201)，PAP(1-200)，PAP(1-199)，PAP(1-198)，PAP(1-197)，PAP(1-196)，PAP(1-195)，PAP(1-194)，PAP(1-193)，PAP(1-192)，PAP(1-191)，PAP(1-190)，PAP(1-189)，PAP(1-188)，PAP(1-187)，PAP(1-186)，PAP(1-185)和PAP(1-184)。更好的突變蛋白包括PAP(1-184Glu)、PAP(1-188Lys)、PAP(1-206Glu)、PAP(1-209)和PAP(1-236Lys)。只要對植物細胞無毒，這可以用后文的選擇方法進行確定，而且在植物內(nèi)產(chǎn)生抗真菌性和/或抗病毒性，少于26(即1至25個氨基酸，包括端值)或超過76個成熟PAP的氨基酸的缺失也屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。后一種特性可以如下測定，即通過例如在病毒或真菌存在下用PAP突變蛋白體外接種植物器官例如葉，或通過體內(nèi)分別測定，即用真菌或病毒接種用編碼突變型PAP的DNA轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株。一種較好的C末端取代突變蛋白是PAP(1-262，Leu202Phe)。同樣，不想局限于任何特定的作用理論，申請人認為PAP氨基酸序列244Glu至259Cys(表I所示)涉及PAP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜上磷脂的結(jié)合，這種結(jié)合促進PAP向細胞的胞質(zhì)溶膠轉(zhuǎn)移并在此抑制蛋白質(zhì)的合成，所述的氨基酸序列與原核細胞膜脂蛋白的脂結(jié)合位點的共有序列同源(參見Hayashi等，《生物能和生物膜雜志》(J.Bioenerg.Biomem)22451-71(1990))，而且在上述PAP突變蛋白中都缺失。例如因缺失或移碼突變失去了這一功能，使PAP突變蛋白具有本文所述的特性。
Dore等(同上)，同時還公開了一種Phe195Tyr，Lys211Arg PAP突變蛋白(由于在大腸桿菌內(nèi)表達時必需有N末端Met殘基，所以編號與本文所用的編號差相地加1)，它對真核細胞(例如植物)有毒但對原核細胞例如大腸桿菌無毒。所以，Dore的文獻中公開的這種PAP突變蛋白不在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
第三類PAP突變蛋白的特征在于截短了成熟PAP內(nèi)1至至少約38個N末端氨基酸殘基。這些突變蛋白包括PAP(2-262)，PAP(3-262)，PAP(4-262)，PAP(5-262)，PAP(6-262)，PAP(7-262)，PAP(8-262)，PAP(9-262)，PAP(10-262)，PAP(11-262)，PAP(12-262)，PAP(13-262)，PAP(14-262)，PAP(15-262)，PAP(16-262)，PAP(17-262)，PAP(18-262)，PAP(19-262)，PAP(20-262)，PAP(21-262)，PAP(22-262)，PAP(23-262)，PAP(24-262)，PAP(25-262)，PAP(26-262)，PAP(27-262)，PAP(28-262)，PAP(29-262)，PAP(30-262)，PAP(31-262)，PAP(32-262)，PAP(33-262)，PAP(34-262)，PAP(35-262)，PAP(36-262)，PAP(37-262)，PAP(38-262)和PAP(39-262)。如果在體內(nèi)表現(xiàn)出PAP的生物活性和降低的植物毒性，大于38個成熟PAP N末端氨基酸殘基的截短形式也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。這些特性可以通過后文實施例中的方法來測定。
第四類PAP突變蛋白包含使得PAP分子失去酶活性(根據(jù)其在體外和/或真核細胞核糖體內(nèi)抑制翻譯的能力的喪失來確定)的活性位點突變。申請人意外發(fā)現(xiàn)，當這些突變蛋白在植株內(nèi)表達時表現(xiàn)出廣譜抗真菌活性，但是幾乎沒有抗病毒活性。推定的PAP活性位點包括氨基酸殘基Tyr72、Tyr123、Glu176、Arg179和Trp208。所以，失去了酶活性但保留抗真菌活性的PAP活性位點突變蛋白，例如在PAP活性位點內(nèi)包含一個保守或甚至非保守取代，或者至少一個活性位點氨基酸缺失或被其它氨基酸取代的突變蛋白屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。PAP突變蛋白的酶活性和抗真菌活性可以用后文實施例中的測試方法來測定。一種較好的PAP活性位點突變蛋白是PAP(1-262，Glu176Val)。
至于所述的PAP突變蛋白，“與野生型PAP的區(qū)別主要在于…”指除了賦予降低的植物毒性和抗病毒和/或抗真菌活性所必需的氨基酸改變(上述)之外，突變型PAP的氨基酸序列與成熟PAP基本一致?！盎疽恢隆敝钢灰傻腜AP突變蛋白保留上述降低的植物毒性和PAP生物活性，本發(fā)明的PAP突變蛋白還可以通過另外的取代、插入或缺失進一步被修飾。例如，可以通過取代或插入將突變型PAP的N末端變?yōu)榧琢虬彼釟埢?，以便允許編碼突變型PAP的DNA在各種宿主細胞，特別是大腸桿菌中表達。本發(fā)明的PAP突變蛋白還可以包含野生型PAP的N末端的22氨基酸信號肽和/或29氨基酸的C末端延伸，兩者都表示在表I中。
可以利用已知的PAP基因來制備本發(fā)明編碼突變型PAP的DNA。參見Ausubel等編輯，《分子生物學(xué)中的最新方法》(Current Protocols in Molecular Biology)第1卷，第8章，Wiley，NY(1990)。也可以利用PCR技術(shù)來制備DNA。參見《PCR方法》(PCR Protocols)，Innis等編輯，Academic Press，San Diego，CA(1990)。編碼突變型PAP的DNA(例如cDNA)最好以一個表達盒的形式插入在植物轉(zhuǎn)化載體中，該表達盒包含轉(zhuǎn)化植物細胞的全部必需元件。該表達盒按照正確的讀碼框通常包含植物細胞內(nèi)功能性的啟動子，5’端的非翻譯前導(dǎo)序列，突變型PAP DNA，和3’端非翻譯區(qū)，該區(qū)能夠在植物內(nèi)引起RNA序列3’末端的聚腺苷酸化核苷酸的加成。植物細胞內(nèi)功能性的啟動子可以從多種來源獲得，例如植物或植物DNA病毒。表達盒內(nèi)啟動子的選用將決定構(gòu)建物在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的空間和時間表達方式。被選用的啟動子可能具有組成型活性，其中包括CaMV 35S啟動子、肌動蛋白啟動子(McElroy等，《植物細胞》2163-71(1990)；McElroy等，《分子和普通遺傳學(xué)》231150-160(1991)；Chibbar等，《植物細胞報道》12506-509(1993))，和遍在蛋白啟動子(Binet等，《植物科學(xué)》(Plant Science)7987-94(1991)，Christensen等，《植物分子生物學(xué)》12619-6231993)；Taylor等，《植物細胞報道》12491-495(1993))?；蛘?，它們可以經(jīng)創(chuàng)傷誘導(dǎo)(Xu等，《植物分子生物學(xué)》22573-588(1993)；Logemann等，《植物細胞》1151-158(1989)；Rohrmeier&Lehle，《植物分子生物學(xué)》22783-792(1993)；Firek等，《植物分子生物學(xué)》22129-142(1993)；Warener等，《植物雜志》3191-201(1993))，它們由此在創(chuàng)傷或病原感染位置驅(qū)動突變型PAP基因的表達。其它有用的啟動子在特定的細胞(例如葉上皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞)或特定組織或器官(例如根、葉或花)內(nèi)表達。專利申請WO93/07278說明了在髓細胞內(nèi)優(yōu)選表達的玉米trpA基因的分離。Hudspeth&Grula在《植物分子生物學(xué)》12579-589(1989)中說明了一種啟動子，它來自編碼烯醇式丙酮酸磷酸羧酶(PEPC)的玉米基因，并指導(dǎo)葉特異性方式的表達?；蛘撸x用的啟動子可以在光誘導(dǎo)性或其它時序調(diào)控啟動子下驅(qū)動基因的表達。又或者，選用的啟動子是化學(xué)調(diào)控的。DNA還可以編碼野生型PAP的N末端信號序列和/或C末端延伸。
有許多可用在表達盒中的轉(zhuǎn)錄剪切及聚腺苷酸化位點。這些位點負責正確加工(形成)mRNA的3’末端。已知在植物內(nèi)起作用的合適的轉(zhuǎn)錄剪切及聚腺苷酸化位點包括CaMV 35S剪切和聚腺苷酸化位點、tml剪切和聚腺苷酸化位點、胭脂氨酸合成酶剪切和聚腺苷酸化位點、豌豆rbcS E9剪切和聚腺苷酸化位點。這些位點在單子葉及雙子葉植物中均可使用。
許多序列被發(fā)現(xiàn)能夠增強轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)基因的表達，可將這些序列與本發(fā)明的基因結(jié)合使用來提高它們在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的表達。許多內(nèi)含子序列被證明能夠增強表達，尤其在單子葉細胞內(nèi)。例如，已經(jīng)證明在轉(zhuǎn)導(dǎo)入玉米細胞后，在同源啟動子下，玉米Adhl基因的內(nèi)含子顯著增強野生型基因的表達。內(nèi)含子1被發(fā)現(xiàn)特別有效，并以與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因融合的形式增強表達(Callis等，《遺傳學(xué)進展》(Genes Develop)11183-1200(1987))。在相同的實驗系統(tǒng)中，來自玉米bronze-1基因的內(nèi)含子在增強表達方面具有類似的效果(Callis等，同上)。一般總將內(nèi)含子序列結(jié)合到植物轉(zhuǎn)化載體中，通常位于非翻譯前導(dǎo)序列內(nèi)。
已知大量來自病毒的非翻譯前導(dǎo)序列也增強表達，這些序列在雙子葉細胞內(nèi)尤其有效。具體地說，來自煙草花葉病毒的前導(dǎo)序列(TMV，“Ω-序列”)、玉米褪綠斑點病毒(MCMV)、和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導(dǎo)序列已被證明能夠增強表達(Gallie等，《核酸研究》158693-8711(1987)；Skuzeski等，《植物分子生物學(xué)》1565-79(1990))。
許多轉(zhuǎn)化載體可用于植物的轉(zhuǎn)化，而本發(fā)明的基因可以與這些載體中任何一種結(jié)合使用。載體的選用取決于選用的轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)化目標的種類。對于某些目標種類，宜使用不同的抗菌素或除草劑選擇標記。轉(zhuǎn)化中的常用選擇標記包括提供卡那霉素抗性的nptll基因(Messing&Vierra，《基因》19259-268(1982)；Bevan等，《自然》304184-187(1983))，提供對除草劑草胺膦抗性的bar基因(White等，《核酸研究》181062(1990)；Spencer等，《理論及應(yīng)用遺傳學(xué)》79626-631(1990))，提供潮霉素抗性的hph基因(Blochinger&Diggelmann，《分子細胞生物學(xué)》42929-2931)和提供氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Fling&Elwell，1980)。適用于土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體通常帶有至少一個T-DNA邊界序列。這些載體包括例如pBIN19(Bevan，《核酸研究》(1984))和pCIB200(EP 0 332 104)。
不用根瘤土壤桿菌進行的轉(zhuǎn)化不需要在選用的轉(zhuǎn)化載體中含有T-DNA序列，因此除了上述含有T-DNA序列的載體之外，沒有該序列的載體也可以使用。不靠土壤桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過粒子轟擊轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體吸收(例如PEG和電穿孔)和微注射法。載體的選擇很大程度上取決于對被轉(zhuǎn)化種類的選擇。例如，pCIB3064是pUC衍生的載體，適用于直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，并結(jié)合以用除草劑草胺膦進行選擇。WO93/07278和Koziel等，(《生物技術(shù)》11194-200(1993))對此進行了說明。
包含上述各種元件的含有編碼突變型PAP的DNA的表達盒可以利用標準重組DNA技術(shù)插入植物轉(zhuǎn)化載體內(nèi)?；蛘撸d體中可以存在表達盒的部分或全部元件，其余元件則視需要加入載體。
雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的，包括基于土壤桿菌的技術(shù)和不需要土壤桿菌的技術(shù)。非土壤桿菌類技術(shù)包括異源遺傳物質(zhì)直接被原生質(zhì)體或細胞吸收。這可以利用PEG或電穿孔介導(dǎo)的吸收、粒子轟擊介導(dǎo)的傳遞或微注射來進行。這些技術(shù)的實例的說明可參見Paszkowski等，《歐洲分子生物學(xué)協(xié)會雜志》32717-2722(1984)，Potrykis等，《分子和普通遺傳學(xué)》199169-177(1985)，Reich等，《生物技術(shù)》41001-1004(1986)和Klein等，《自然》32770-73(1987)。在所有情況中，都使用標準方法將細胞再生為完整的植株。
轉(zhuǎn)化雙子葉植物，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是一種較好的技術(shù)，因為它轉(zhuǎn)化效率高，而且適用于多個不同的種。通常可用土壤桿菌轉(zhuǎn)化的許多作物種類包括煙草、西紅柿、向日葵、棉花、油籽菜、馬鈴薯、大豆、苜蓿和楊樹(EP0 317 511(棉花)，EP0 249 432(西紅柿)，WO87/07299(芥藍)，美國專利4,795,511(楊樹))。土壤桿菌轉(zhuǎn)化通常包括將攜有目標外源DNA的二元載體(例如pCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)移到合適的土壤桿菌菌株內(nèi)，該菌株依賴于宿主土壤桿菌攜帶在共存質(zhì)?；蛉旧w上的vir基因的互補(例如適合pCIB200的菌株CIB542(Uknes等，《植物細胞》5159-169(1993)))。利用三親本交配法進行重組二元載體向土壤桿菌的轉(zhuǎn)移，即使用帶有重組二元載體的大腸桿菌，帶有能夠使重組二元載體向靶土壤桿菌菌株移動的質(zhì)粒例如pRK2013的輔助大腸桿菌?；蛘?，可以通過DNA轉(zhuǎn)化法將重組二元載體向土壤桿菌轉(zhuǎn)移(Hofgen&Willmitzer，《核酸研究》169877(1988))。
用重組土壤桿菌轉(zhuǎn)化靶植株通常將土壤桿菌與取自植株的外植體共培養(yǎng)，并遵循本領(lǐng)域已知的方法。將帶有位于二元質(zhì)粒T-DNA邊界之間的抗菌素或除草劑抗性標記的轉(zhuǎn)化組織在可選擇培養(yǎng)基上再生。
較好的用于單子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括利用PEG或電穿孔技術(shù)將基因直接轉(zhuǎn)移到原生質(zhì)體中，以及利用粒子轟擊法轉(zhuǎn)移到愈傷組織中。轉(zhuǎn)化可以利用一種DNA或多種DNA(共轉(zhuǎn)化)進行，這兩種方法都適用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化的優(yōu)點在于不需要構(gòu)建復(fù)雜的載體，而且可以產(chǎn)生帶有非連鎖基因座的目的基因和可選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因植物，這樣可以在需要時在后代中去除可選擇標記。但是，共轉(zhuǎn)化的缺點在于各DNA整合到基因組中的機率低于100％(Schocher等，《生物技術(shù)41093-1096(1986))。
已公開的專利申請EP O 292 435、EP O 392 225和WO93/07278描述了制備玉米的愈傷組織和原生質(zhì)體、用PEG或電穿孔法轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體和由轉(zhuǎn)化后原生質(zhì)體再生玉米植株的方法。Gordeon-Kamm等，《植物細胞》2603-618(1990)和Fromm等，《生物技術(shù)》11194-200(1993)描述了利用粒子轟擊術(shù)轉(zhuǎn)化玉米良種近交系的方法。
水稻的轉(zhuǎn)化也可以通過利用原生質(zhì)體或粒子轟擊法的直接基因轉(zhuǎn)移來進行。日本型和印度型的原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化已經(jīng)有所記述(Zhange等，《植物細胞報道》7739-384(1988)；Shimamoto等，《自然》338274-277(1989)；Datta等，《生物技術(shù)》8736-740(1990))。以上兩種植株通常也可用粒子轟擊法轉(zhuǎn)化(Christou等，《生物技術(shù)》9957-962(1991))。
專利申請EP 0 332 581描述了生成、轉(zhuǎn)化和再生早熟禾亞科(Pooidea)原生質(zhì)體的方法。而且，Vasil等(《生物技術(shù)》10667-674(1992))描述了小麥的轉(zhuǎn)化，即用粒子轟擊法轉(zhuǎn)化到C類長期可再生愈傷組織的細胞內(nèi)，以及同樣是Vasil等(《生物技術(shù)》111533-1558(1993))和Weeks等(《植物生理學(xué)》1021077-1084(1993))所述的對未成熟胚和未成熟胚衍生愈傷組織的粒子轟擊法。
轉(zhuǎn)化單子葉植物細胞例如玉米(Zea mays)可以將單子葉植物細胞與許多可能刺穿細胞的針狀體接觸，造成細胞壁破裂，由此允許轉(zhuǎn)化DNA進入細胞。參見美國專利5,302,523。以下美國專利中還公開了對單子葉植物和雙子葉植物都適合的轉(zhuǎn)化技術(shù)美國專利5,240,855(粒子槍)，5,204,253(氣體冷激的加速微粒)、5,179,022(粒子轟擊裝置)、4,743,548和5,114,854(微注射)；5,149,65和5,120,657(加速粒子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；5,066,587(氣體驅(qū)動的微粒加速器)；5,015,580(粒子介導(dǎo)的大豆植株的轉(zhuǎn)化)；5,013,660(激光束介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；和4,849,355和4,663,292。
然后，將如上所述轉(zhuǎn)化的植物細胞或植物組織按照標準方法培養(yǎng)成完整的植株。可以根據(jù)標準方法由轉(zhuǎn)基因的花期植株獲得轉(zhuǎn)基因的種子。同樣，可以利用各種已知技術(shù)來繁殖馬鈴薯和甜菜之類非花期的植物。參見Newell等，《植物細胞報道》1030-34(1991)(其中描述了用莖培養(yǎng)的馬鈴薯轉(zhuǎn)化)。
本發(fā)明編碼突變型PAP的DNA可使任何能夠表達該DNA的植物具有廣譜的抗真菌性和抗病毒性，其中包括單子葉植物(例如谷類)和雙子葉植物。特定的實例包括玉米、西紅柿、草皮、蘆筍、木瓜、向日葵、黑麥、菜豆、生姜、荷花、竹子、馬鈴薯、水稻、花生、大麥、麥芽、小麥、苜蓿、大豆、燕麥、茄子、南瓜、洋蔥、花莖甘藍、甘蔗、甜菜、甜菜根、蘋果、橘子、葡萄柚、梨、李子、桃、菠蘿、葡萄、玫瑰、香石竹、雛菊、郁金香、黃杉、雪松、白松、歐洲赤松、云杉、豌豆、棉花、亞麻和咖啡。
除前文所述之外的PAP突變蛋白可以利用真核細胞內(nèi)的選擇系統(tǒng)來鑒定。在一優(yōu)選實施例中，按照標準技術(shù)，隨機誘變與一真核細胞內(nèi)功能性的啟動子可操作性連接的一編碼PAP的DNA分子。然后用誘變后的PAP構(gòu)建物轉(zhuǎn)化細胞。然后將如此轉(zhuǎn)化的細胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)規(guī)定的時間，例如足夠使細胞進行一定程度生長的時間，然后在此時在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物引起誘變DNA分子的表達。如果培養(yǎng)的細胞能夠在誘導(dǎo)誘變PAP DNA分子的表達后存活，這表明誘變引起了非毒性PAP突變蛋白的表達，然后可以對該PAP突變蛋白進行體外或體內(nèi)實驗以確定它是否保留了PAP的生物活性。較好的體外實驗包括真核細胞翻譯系統(tǒng)，例如測定PAP突變蛋白引起的對蛋白質(zhì)合成的抑制程度的網(wǎng)織紅細胞裂解物系統(tǒng)。較好的宿主細胞是酵母細胞，例如釀酒酵母，在后文實施例1中對此有詳細說明。也可以用許多隨機誘變的編碼PAP的DNA分子實施該方法。然后可按照標準方法將經(jīng)以后的實驗證實植物毒性降低且保留PAP抗病毒性和/或抗真菌活性的PAP突變蛋白分離出來，純化并測序。
在其它實施例中，誘變在轉(zhuǎn)化真核細胞之后進行。轉(zhuǎn)化之后誘變DNA的缺點在于宿主的染色體DNA也會被誘變。為了確定存活細胞中的突變在染色體上還是在質(zhì)粒上，該實施方式需要用誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控下的野生型編碼PAP的DAN取代進行轉(zhuǎn)化的編碼PAP的DNA，并在誘導(dǎo)物存在下培養(yǎng)該細胞。保留生長能力的突變體是染色體突變體，而不能生長的突變體是質(zhì)粒上突變的突變體(即PAP)。
參照以下實施例將進一步說明本發(fā)明。給出這些實施例的目的只是為了說明，而不是為了限定，除非另作說明。
實施例1A.酵母表達載體的構(gòu)建，以及在酵母中的PAP表達分析。將Lodge等所述、表1所示的PAP和PAP-v的相應(yīng)全長cDNA克隆到酵母表達載體中，位于半乳糖誘導(dǎo)型啟動子GAL1的調(diào)控之下。選擇釀酒酵母作為表達系統(tǒng)，因為酵母的優(yōu)點在于可提供真核細胞特異性翻譯后修飾作用。因為酵母的核糖體對PAP敏感，所以使用一個可調(diào)型啟動子驅(qū)動PAP的表達。編碼PAP和PAP-v的cDNA被以在半乳糖誘導(dǎo)型啟動子pGal1調(diào)控下的BgIII/Smal片段形式克隆在酵母表達載體pAC55中，該質(zhì)粒包含可選擇標記URA3。按照Ito等在《細菌學(xué)雜志》153163-68(1983)中所述的方法將包含PAP和PAP-v的載體(NT123和NT124)轉(zhuǎn)化到酵母株W303(Mat a，ade2-1 trp1-1 ura3-1 leu2-3，112his3-11，15can1-100)(Bossie等，《細胞的分子生物學(xué)》3875-93(1992))中，在30℃，在含有葡萄糖的尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化子。
含有NT123(野生型PAP)或NT124(PAP-v)的酵母細胞在含有2％棉籽糖的尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基上在30℃培養(yǎng)48小時，使密度達到5×107細胞/ml。取一半培養(yǎng)物，其中加入2％半乳糖誘導(dǎo)PAP蛋白質(zhì)的表達，另一半用作不誘導(dǎo)的對照。使細胞再生長4小時，然后10,000g離心5分鐘收集細胞。將細胞重懸在含有蛋白酶抑制劑(各0.1μg/ml抗蛋白酶、抑蛋白酶肽、胰凝乳蛋白酶抑制劑、亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制劑)的RIPA緩沖液(9150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，50mM Tris-HCl，pH8)中，并用玻璃微珠(0.5mm)裂解。按照Tomlinson，《普通病毒學(xué)雜志》(J.Gen.Virol.，同上)所述的方法，將提取物上樣在10％SDS-PAGE凝膠上。利用增強的化學(xué)發(fā)光(ECL)法(Amersham)，使用抗純化PAP的抗體進行免疫印跡分析。
在半乳糖誘導(dǎo)后，PAP和PAP-v都在酵母中表達。根據(jù)與PAP蛋白標準物的比較，含有PAP質(zhì)粒(NT123)的酵母細胞同時表達成熟PAP和一種較大形式PAP，而含有PAP-v(NT124)的酵母細胞主要表達較大的PAP和很少的成熟PAP。在培養(yǎng)基中沒有發(fā)現(xiàn)PAP。不限于任何特定的作用理論，申請人認為該結(jié)果表明(1)在酵母中，PAP被表達為前體形式，然后被加工成成熟形式；(2)除了共翻譯地切除N末端信號肽之外，PAP還經(jīng)受其它加工(Lodge等，同上)，因為成熟PAP和酵母中表達的PAP其大小小于預(yù)計的切除信號序列后的大小。
B.PAP和PAP-v的體外翻譯和加工。為了在體外檢查PAP的加工，在35S-甲硫氨酸存在下，用T7偶聯(lián)的帶有或不帶犬微粒體膜(Promega)的網(wǎng)織紅細胞裂解物翻譯系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄和翻譯實施例1A中所述的兩種構(gòu)建物。PAP和PAP-v的cDNA被克隆在pGem3Z載體(Promega)T7啟動子的下游。在35S-甲硫氨酸存在下，用T7偶聯(lián)的帶有或不帶犬胰腺微粒體膜(Promega)的網(wǎng)織紅細胞裂解物翻譯系統(tǒng)(Promega)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯等量的兩種構(gòu)建物(1μg)。在5mM EDTA和125mM蔗糖存在下，翻譯產(chǎn)物與0.2mg/ml蛋白酶K孵育90分鐘。加入4mM PMSF激活蛋白酶K，在室溫下孵育2小時。然后在0.1％SDS和0.1M檸檬酸鈉，pH5.5存在下，在37℃用Endo-H(內(nèi)-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)(1mU/10μl)處理翻譯產(chǎn)物12小時。按照Laemmli等在《自然》(London)227680-5(1970)中所述的方法在10％SDS-PAGE上分析等量的蛋白質(zhì)(3.5μl)。
PAP和PAP-v分別編碼33和34KD的前體蛋白，在與微粒體膜孵育后，兩種前體都被加工成32KD的形式。加工后的蛋白質(zhì)仍然大于成熟形式(29KD)，這表明PAP前體還經(jīng)受了其它翻譯后加工。PAP不包含任何N連接的糖基化位點，所以體外翻譯的蛋白質(zhì)在接受去糖的內(nèi)-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(Endo-H)處理后，大小不變。以上結(jié)果表明PAP前體包含被共翻譯切除的N末端信號序列和另一段翻譯后去除的序列。此外，通過X光結(jié)構(gòu)分析獲得了C末端加工的證據(jù)，這些證據(jù)證明成熟PAP在其C末端比根據(jù)其cDNA預(yù)計的序列短29個氨基酸。參見Monzingo等，《分子生物學(xué)雜志》233705-15(1993)。
C.轉(zhuǎn)化后酵母的生長在2％棉籽糖、與GAL基因表達相關(guān)的非抑制、非誘導(dǎo)碳源存在下，含有NT123或NT124的酵母轉(zhuǎn)化子的生長與含單獨載體的轉(zhuǎn)化子沒有區(qū)別。含NT123的轉(zhuǎn)化酵母的生長在向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物半乳糖后被抑制。含有NT123或NT124的細胞不能在含有半乳糖的平板培養(yǎng)基上生長。但是，在液體培養(yǎng)基中，對NT123的抑制程度大于對NT124的抑制，這可能是因為含NT124的酵母產(chǎn)生較少的成熟PAP。在培養(yǎng)基中加入半乳糖后2小時內(nèi)可檢測到PAP的表達。在6至8小時后達到最高水平。使用抗PAP抗體的免疫印跡分析在NT123轉(zhuǎn)化子內(nèi)檢測到的最高PAP水平為1μg/mg酵母蛋白，在NT124轉(zhuǎn)化子中的為250ng/mg酵母蛋白。這些結(jié)果與酵母中活性PAP的產(chǎn)量一致。
D.PAP質(zhì)粒的誘變。為了分離對酵母無毒性的PAP突變蛋白，按照(5)中所述的方法利用羥基胺誘變含有PAP(NT123)或PAP-v(NT124)的表達質(zhì)粒，將它們轉(zhuǎn)化到酵母中，將細胞平板培養(yǎng)在含有葡萄糖的培養(yǎng)基上，將平行樣品平板培養(yǎng)在含半乳糖的培養(yǎng)板上。將約10μg純化的質(zhì)粒DNA加到500μl新鮮制備的羥基胺溶液(0.35g羥基胺-HCl和0.09g NaOH在5ml水中形成的溶液)中，在37℃溫育20小時。加入10μl 5M NaCl，5μl 1mg/ml BSA和1ml100％乙醇終止誘變，在-70℃溫育10分鐘以沉淀誘變DNA。將DNA重懸在TE中后再次沉淀。然后將DNA轉(zhuǎn)化到酵母中，平板培養(yǎng)在含有2％葡萄糖的尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基上，將平行樣品平板培養(yǎng)在含2％半乳糖的培養(yǎng)基上。利用前文Lodge等所述的ELISA對生長在半乳糖培養(yǎng)基上的集落分析其PAP的表達，并用免疫印跡分析鑒定表達羥基胺產(chǎn)生的突變型PAP的突變體。
E.突變型酵母的生長。經(jīng)NT123衍生的突變體在含半乳糖培養(yǎng)基上的生長與在含棉籽糖培養(yǎng)基上的沒有區(qū)別。利用NT124衍生的突變體也得到了相似的結(jié)果。對酵母內(nèi)蛋白質(zhì)積累的分析顯示，是野生型PAP的表達，而不是羥基胺產(chǎn)生的突變型PAP的表達導(dǎo)致了酵母內(nèi)蛋白質(zhì)積累的降低(數(shù)據(jù)未顯示)。
誘變之后，通過使用PAP抗體的ELISA對生長在尿嘧啶缺陷半乳糖培養(yǎng)基上的集落進行PAP表達的分析，對陽性集落再進行免疫印跡分析。在總共28個來自NT123誘變的突變體中，6個不同的分離體表達與PAP抗體交叉反應(yīng)的蛋白質(zhì)。在總共44個來自NT124誘變的分離突變體中，24個不同的分離體產(chǎn)生與PAP抗體交叉反應(yīng)的蛋白質(zhì)。4個突變體(HMNT123-1、124-6、124-7和124-1)產(chǎn)生比成熟PAP(29KD)大的蛋白質(zhì)，這表明將PAP加工成成熟形式的過程在這些突變體中被抑制。2個突變體(HMNT123-2和123-3)產(chǎn)生與PAP成熟形式共遷移的蛋白質(zhì)，其它幾種突變體(HMNT123-4、123-5、123-6、124-2和124-3)產(chǎn)生較小的蛋白質(zhì)。突變體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達水平在0.005至0.08％總可溶蛋白之間。
F.PAP突變蛋白的核苷酸序列分析。通過對回收自酵母的質(zhì)粒的序列分析鑒定PAP突變蛋白中的氨基酸改變位置。從突變體中分離出質(zhì)粒，按照前文Rose等所述的方法將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，然后用Sequenase 2.0 DNA測序試劑盒(USB)測序。參見Robzyk等，《核酸研究》203790(1992)。對HMNT123-2的測序分析揭示，它包含單個點突變，該突變在推定活性位點將176位的谷氨酸變?yōu)槔i氨酸(E176V)(表II)。HMNT123-2產(chǎn)生與野生型PAP一樣大小的蛋白質(zhì)。176位的谷氨酸(E176)在至今測序過的所有RIP中是高度保守的，并被認為位于PAP的活性位點裂隙中(4)。參見Stevens等，《實驗》(Experientia)37257-9(1981)。HMNT123-6、HMNT124-2和HMNT124-3都有一個靠近C末端的點突變，該突變在237位引入一個終止密碼子取代了色氨酸(W237)(表II)。該突變的結(jié)果是，突變型PAP的C末端缺失了26個氨基酸，由此產(chǎn)生了一個截短的蛋白質(zhì)。HMNT123-5包含一個移碼突變，該突變在大約為Glu184的密碼子(GAG)處缺失了2個核苷酸(GA)，讀碼框由此被改變，Asn190的密碼子因為讀碼框移動了-1個位置而變成了TAA，由此導(dǎo)致截短蛋白質(zhì)的表達。HMNT124-1內(nèi)的一個點突變將97位的谷氨酸變成了賴氨酸(E97K)(表I)。HMNT123-1內(nèi)也含有一個點突變，在75位將甘氨酸變成纈氨酸(G75V)。以上兩種突變體都表達比純化的成熟PAP大的蛋白質(zhì)，這表明PAP的加工在這些突變體中被抑制。
為了證實觀察到的突變體的表型是由經(jīng)鑒定的PAP序列中的突變而不是染色體突變引起的，分離出各種突變型PAP質(zhì)粒并重新轉(zhuǎn)化宿主株W303，然后選擇URA+轉(zhuǎn)化子。這些轉(zhuǎn)化子在半乳糖培養(yǎng)基上的生長速度與野生型相同，這表明轉(zhuǎn)化子經(jīng)PAP表達誘導(dǎo)作用后存活的能力是質(zhì)粒連鎖的。
表II.消除PAP對真核細胞毒性的突變HMNT123-1Gly-75(GGT)→Val(GTT)HMNT123-2Glu-176(GAG)→Val(GTG)HMNT123-4 Trp-208(TGG)→終止子(TAG)HMNT123-5Glu-184(GAG)→Glu(GAA)
HMNT123-6 Trp-237(TGG)→終止子(TAG)HMNT124-1Glu-97(GAA)→Lys(AAA)HMNT124-2 Trp-237(TGG)→終止子(TAG)HMNT124-3 Trp-237(TGG)→終止子(TAG)HMNT124-13 Leu-202(CTT)→Phe(TTT)G.PAP突變蛋白的酶活性使用體外翻譯測定來比較PAP突變蛋白的酶活性。如前文Lodge等所述，在含有不同量PAP的酵母提取物存在下，在兔網(wǎng)織紅細胞裂解物系統(tǒng)(Promega)中翻譯雀麥草花葉病毒(BMV)RNA，利用ELISA定量酵母中的PAP水平(Lodge等，同上)。在0.1至1ng PAP/ml之間，抑制曲線是線性的。表III顯示在0.2ng/ml提取自酵母的PAP存在下進行的蛋白質(zhì)合成抑制實驗的結(jié)果。通過添加野生型酵母提取物或RIPA緩沖液，將總蛋白和PAP分別調(diào)節(jié)至87ng/ml和0.2ng/ml。在過去的實驗中，當在0.2ng/ml BSA存在下進行體外翻譯時，沒有對翻譯的抑制。加入0.2ng/ml提取自非轉(zhuǎn)化酵母(WT)的蛋白質(zhì)時，可以觀察到輕微的翻譯抑制。在存在0.2ng/ml以下物質(zhì)時，翻譯被抑制(1)加入至野生型酵母提取物的純化PAP(WT+PAP)；(2)含有NT123或NT124的酵母的蛋白質(zhì)提取物和(3)含有羥基胺產(chǎn)生的突變蛋白HMNT123-3、HMNT124-1、HMNT124-3和HMNT124-13的酵母的蛋白質(zhì)提取物。相反，提取自HMNT123-2的蛋白質(zhì)在網(wǎng)織紅細胞裂解物系統(tǒng)中不抑制蛋白質(zhì)的合成。在用0.1ng/ml PAP進行體外翻譯實驗時也獲得相似的結(jié)果。
表III.PAP突變蛋白對蛋白質(zhì)合成的抑制加入翻譯培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的合成(摻入的cpm)無RNA2,246+/-204BSA244,956WT 176,723±713PAP+WT 146,660±2474NT123 110,007±445HMNT123-2 213,952±767HMNT123-3 134,202±5522HMNT124 84,959±661HMNT124-1 119,529±2049HMNT124-3 132,955±3739HMNT124-13 145,899±4457
實施例2轉(zhuǎn)基因煙草中PAP突變蛋白的表達將突變型PAP改造成在植物內(nèi)呈組成型表達，用以確定它們是否對植物無毒，以及是否保留PAP的抗病毒特性。
為了將PAP基因插入植物表達載體，如實施例1所述，從酵母中分離編碼突變型PAP的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。從用HindIII消化的大腸桿菌中分離編碼突變型PAP的質(zhì)粒DNA，用Klenow DNA聚合酶補平HindIII位點，用SacI消化質(zhì)粒，分離出編碼突變型PAP的772bp的SacI/HindIII片段。將編碼突變型PAP的SacI/HindIII片段在用SacI和SmaI消化去除野生型PAP的cDNA插入片段后克隆到pMON8443中(Lodge等，美國科學(xué)院院報》907089-7093(1993))。將來自HMNT123-2的SacI/HindIII片段克隆到SacI/SmaI消化的pMON8443中形成NT144，將來自HMNT124-3的SacI/HindIII片段克隆到SacI/SmaI消化的pMON8443中形成NT145。分別用HMNT123-2和HMNT124-3的772bp的SacI/HindIII片段取代pMON8443中772bp野生型PAP cDNA插入片段的SacI/HindIII片段來形成NT146和NT147。
將質(zhì)粒NT144、NT145、NT146和NT147遷移到根瘤土壤桿菌ABI株中用于轉(zhuǎn)化煙草和馬鈴薯(Lodge等，1993)。為了轉(zhuǎn)化紅花煙草(N.tabacum)，用水將1月齡煙草植株的幼葉覆蓋20至30分鐘。待水流干，用10％chlorox和0.04％吐溫20將葉覆蓋15分鐘，然后用水漂洗3次。用蒸汽滅菌的單孔打孔機切取葉盤，將它正面朝下在MS104培養(yǎng)基(4.4g/l MS鹽，30g/l蔗糖，維生素B5，1.0mg/lNAA和0.1mb/l BA)上放置一天，以進行預(yù)培養(yǎng)。將預(yù)培養(yǎng)后的葉盤放在50ml試管內(nèi)，接種按1∶5稀釋的土壤桿菌通宵培養(yǎng)物。將試管顛倒數(shù)次。然后取出葉盤在無菌濾紙上拍干，然后面朝下放在帶有過濾片的MS104培養(yǎng)板上共培養(yǎng)2天。然后將葉盤轉(zhuǎn)移到MS104選擇培養(yǎng)基(含100μg/ml卡那霉素和300μg/mlcefataxime)上，并放置在培養(yǎng)箱中。在約3周后出現(xiàn)愈傷組織和枝條。將枝條轉(zhuǎn)移到帶選擇的MSO培養(yǎng)基(4.4g/l MS鹽，30g/l蔗糖和維生素B5)plantcon上。2周后形成根，生根后的枝條被轉(zhuǎn)移到土壤中并保持在高濕環(huán)境中。然后用ELISA在再生植株中篩選新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)以鑒定表達子。
紅花煙草(N.tabacum cv Samsun)的轉(zhuǎn)化頻率通常在10至12％之間(即由每片葉盤獲得的轉(zhuǎn)基因植株數(shù)量)。如同以前的報道，當轉(zhuǎn)化中使用含野生型PAP或變異PAP的載體(pMON8443或pMON8442)時，紅花煙草轉(zhuǎn)化的頻率顯著下降(Lodge等，1993)。相反，如表IV所示，當轉(zhuǎn)化中使用含有非毒性突變型PAP的載體時，沒有觀察到轉(zhuǎn)化頻率的下降。
表IV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化頻率NT14413％NT14511％NT14712％如同以前的報道，表達野生型PAP或變異PAP的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出生長減少、缺氯癥和葉斑(Lodge等，1993)。相反，表達突變型PAP的轉(zhuǎn)基因植物表型正常。它們的生長速度與野生型植物相同，而且不表現(xiàn)出缺氯癥或葉斑，這表明突變型PAP的表達對轉(zhuǎn)基因植物無毒。突變型PAP在大腸桿菌中也被表達，而且其表達不影響大腸桿菌的生長速度，這表明它們對大腸桿菌無毒。
實施例3轉(zhuǎn)基因煙草中表達的突變型PAP的抗病毒活性用ELISA(Lodge等，1993)測試轉(zhuǎn)基因煙草(N.tabacum cv Samsun)植株以測定突變型PAP的表達水平。在表V中，將轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)表達的突變型PAP的表達水平與變異PAP(pMON8442)(Lodge等，1993)的表達水平進行了比較。
表V轉(zhuǎn)基因煙草中表達的PAP水平植株編號 表達水平NT144-12 1.5μg/mgNT144-13 0.9μg/mgNT145-13 4.4ng/mgpMON8442(26139-11)9.6ng/mg如表V所示，包含C末端缺失突變體的轉(zhuǎn)基因植株(NT145-13)表達突變型PAP的水平與表達變異PAP的植株(pMON8442)相似(Lodge等，1993)。相反，含有活性位點突變體的轉(zhuǎn)基因植物(NT144)表達突變型PAP的水平明顯較高。
為了體外測試PAP突變蛋白(NT144和NT145構(gòu)建物)是否具有抗病毒活性，在取自表達突變型PAP、PAP-v(pMON8442)和非轉(zhuǎn)化(野生型)煙草植株的蛋白質(zhì)提取物存在下，用馬鈴薯X病毒接種野生型煙草。用ELISA定量轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的PAP水平。植株系145-13內(nèi)的PAP表達水平為4.4ng/mg，植株系144-12內(nèi)的PAP表達水平為1.5μg/mg。用每片葉含5ng PAP和1.1mg總蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的提取物接種植株。由非轉(zhuǎn)化煙草(WT)的葉制備蛋白質(zhì)提取物。在6.7μg至1.1mg不等量的來自非轉(zhuǎn)化煙草的蛋白質(zhì)存在下，將50μl 1μg/ml的PVX接種到煙草葉上。20株煙草植株在6.7μg至1.1mg不等量的來自非轉(zhuǎn)化植株的蛋白質(zhì)存在下接種了50μl 1μg/ml的PVX。如表VI所示，全部WT植株都被PVX感染，表現(xiàn)出局部損傷、系統(tǒng)性癥狀和接種葉之上的葉(系統(tǒng)葉)內(nèi)的病毒積累。這些結(jié)果證明，來自非轉(zhuǎn)化煙草的蛋白質(zhì)提取物對PVX感染沒有作用。當在5至10ng純化PAP(WT+PAP)存在下使用來自非轉(zhuǎn)化煙草植株的蛋白質(zhì)提取物時，在接種葉上觀察到數(shù)量較少的PVX損傷，這表明在純化PAP存在下，煙草植株得到免受PVX感染的保護。但是，雖然在這些植株的接種葉上觀察到較少的損傷，但是它們表現(xiàn)出了系統(tǒng)癥狀，而且其PVX抗原的表達水平與在來自非轉(zhuǎn)化煙草植株(WT)的蛋白質(zhì)提取物存在下用PVX接種的植株相似。
表VIPAP突變蛋白對煙草葉的PVX感染的作用1植物提取物a水平 PAP ng/葉平均損傷數(shù)bPVX抗原(ng/mg)cWTd066.6±10.14.4±1.4WT+PAPe59.0±2.0 3.1±1.9101.5±2.0 2.8±2.626139 51.8±2.9 NA145-13 512.5±7.4 0.2±0.3144-12 557.8±7.4 3.2±2.51056.1±4.9 2.5±1.42055.5±13.84.3±1.45053.3±14.92.8±0.310068.0±11.73.0±0.9a從非轉(zhuǎn)化或帶植物表達載體(pMON8442，NT145和NT144)的轉(zhuǎn)化煙草葉制備植物提取物。
b在接種后第9天計數(shù)損傷數(shù)量。
c在接種后第12天，從第1，2和3片系統(tǒng)葉取樣三片葉盤放在一個試管內(nèi)，然后均質(zhì)化在ELISA緩沖液中。用ELISA定量PVX抗原的平均水平。用BCA試劑(Pierce)定量各提取物中的總蛋白。
d從非轉(zhuǎn)化煙草葉中提取蛋白質(zhì)提取物。
e將PAP(Calbiochem)加到取自非轉(zhuǎn)化煙草葉的蛋白質(zhì)提取物中。
1.20株用于野生型(wt)，10株用于wt+PAP，5株用于各種轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)提取物。在不同量的PAP或PAP突變蛋白存在下，用50μl PVX(1μg/ml)接種每株的2片葉。
在5ng表達變異PAP(pMON8442)的轉(zhuǎn)基因植物(26139)的蛋白質(zhì)存在下接種PVX時，在接種葉上可以觀察到明顯較少的損傷，這些植株避免了系統(tǒng)性的感染。同樣，在5ng表達C末端缺失突變蛋白的轉(zhuǎn)基因植物(145-13)的蛋白質(zhì)存在下接種PVX時，損傷數(shù)量明顯較少。這些植株不表現(xiàn)出系統(tǒng)癥狀，而且接種葉上的PVX抗原水平顯著降低。相反，在5至100ng表達活性位點突變蛋白的植株(144-12)的蛋白質(zhì)存在下接種PVX時，接種葉上觀察到的損傷數(shù)與在非轉(zhuǎn)化煙草植株(wt)的蛋白質(zhì)存在下接種的相近。在這些植株上觀察到了系統(tǒng)性癥狀，系統(tǒng)葉中PVX抗原的水平與在非轉(zhuǎn)化煙草植物提取物存在下接種PVX的植株中相當。以上結(jié)果證明，在體外具有酶活性的C末端缺失突變蛋白在體外保留了其抗病毒活性。相反，在體外不具有酶活性的活性位點突變蛋白在體外失去了其抗病毒活性，這表明PAP的酶活性對其體外抗病毒活性來說是決定性的。
實施例4轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中PAP突變蛋白的表達將馬鈴薯的莖切成3mm厚的片，放在無菌水中。將含有NT144，NT145，NT146和NT147的土壤桿菌培養(yǎng)通宵。離心沉淀細胞，然后重懸在10ml水中。將土壤桿菌按1∶10稀釋在水中。去除馬鈴薯莖外植體上的水，加入稀釋過的土壤桿菌。將莖外植體與土壤桿菌一起孵育15分鐘。去除細菌，將外植體放在覆蓋有Whatman#1無菌濾紙的1/10 MSO培養(yǎng)板上。MSO在1L體積中含有4.4g MS鹽，30g蔗糖和1ml維生素B5(500X)，pH5.7。在暗環(huán)境中共培養(yǎng)2天后，將外植體放置在PC培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周，每升該培養(yǎng)基含有MSO加0.5mg/l玉米素核糖核苷(zeatin riboside)(ZR)，5mg/l AgNO3和0.1mg/l NAA(萘乙酸)，100mg卡那霉素和300mg cefataxime。4周后，將外值體置于PS培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基中含有MSO加5mg/l ZR，0.3mg/l赤霉酸，每升100mg卡那霉素和300mgcefataxime。4至8周后開始抽枝。然后將枝條摘取后放在含有PM培養(yǎng)基的plantcons中(每升含4.4g MS鹽，30g蔗糖，0.17g NaH2PO4H2O，1ml鹽酸硫胺素和0.1g肌醇，pH6.0，以及0.2％Gelrite瓊脂)。將植株植入土壤，使其耐寒，并利用NPTII ELISA分析鑒定出轉(zhuǎn)基因植物。然后用ELISA分析轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的PAP表達。利用ELISA鑒定出了表達NT144，NT145和NT146的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。用含有突變型PAP的構(gòu)建物對轉(zhuǎn)化頻率沒有影響，而且表達突變型PAP的轉(zhuǎn)基因植物表型正常，這表明突變型PAP的表達對馬鈴薯沒有毒性。
實施例5轉(zhuǎn)基因草皮中PAP突變蛋白的表達將PAP突變蛋白改造成在單子葉植物中組成型地表達。葦草(Agrostis plustris，Huds.)是一種草皮，用在高爾夫球場、航路、球場和草坪，并被用作用于轉(zhuǎn)化的單子葉植物。為了構(gòu)建單子葉植物的表達載體，將玉米遍在蛋白基因(Toki等，《植物生理學(xué)》1001503-1507(1992))的啟動子和第一個內(nèi)含子克隆到pMON969中構(gòu)建成NT168。pMON969用HindIII和BglII消化去除CaMV 35S啟動子區(qū)。用HindIII和BamHI消化含有遍在蛋白啟動子和第一個內(nèi)含子的質(zhì)粒pAHC20(Toki等，1992)，分離出2016bp的HindIII/BamHI片段，將其與pMON969的HindIII/BglII片段連接成NT168。用BgIII和BamHI消化NT144和NT145，分離出編碼突變型PAP的cDNA片段，將其克隆到NT168的BamHI位置。然后，將含有突變型PAP的cDNA的單子葉表達載體和含有可選擇標記bar基因的pSLI2011(Hartmann等，1994《生物技術(shù)》12919-923)一起用于轉(zhuǎn)化。用兩種不同的方法轉(zhuǎn)化草皮，使用粒子槍的粒子轟擊轉(zhuǎn)化法和前文所述的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。
由7種葦草栽培品種經(jīng)表面滅菌的種子開始成胚發(fā)生愈傷組織培養(yǎng)物“Cobra”、“Emerald”、“PennLinks”、“Providence”、“Putter”、“Southshore”和“SR1020”，按照Hartmann等在《生物技術(shù)》12919-923(1994)中所述將其用于粒子轟擊(biolistic)轉(zhuǎn)化。愈傷組織起始培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基和MS維生素類，其中補充以100mg/L肌-肌醇，3％蔗糖，以及用于MSA2D的150mg/L天冬酰胺和2mg/L 2，4-D或者用于MMS的500mg/L酪蛋白水解物，6.6mg/L麥草畏(dicamba)和0.5mg/L 6-BA。用0.2％PhytagelR(Sigma)固化培養(yǎng)基。在暗環(huán)境中于25℃培養(yǎng)4至6周后，挑選出胚發(fā)生愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上。將1至2g愈傷組織加到含有50ml液體培養(yǎng)基的250ml燒瓶中制備成懸浮液，在暗環(huán)境中于25℃以120rpm的速度振蕩培養(yǎng)，并且每周傳代2次。
將1ml細胞懸浮液放在含加了0.4M甘露醇的MSA2D培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中的5.5cm濾片上，制備成用于粒子轟擊的培養(yǎng)板。在粒子轟擊前20小時制備培養(yǎng)板并保存在暗環(huán)境中。金顆粒(Gold particles)的制備為在100％乙醇中于95℃加熱30分鐘，粗略離心，然后重懸在新鮮乙醇中。顆粒在水浴中經(jīng)超聲波處理10至30分鐘，用無菌蒸餾水洗滌3次，然后重懸在水中。含有50μl(5mg)金顆粒懸浮液，10μg靶DNA、50μl 2.5M CaCl2和20μl 0.1M亞精胺的DNA樣品經(jīng)渦流攪拌、離心并重懸在乙醇中。乙醇洗滌總共重復(fù)3次。最后將沉淀重懸在30μl乙醇中，每次射擊使用5μl DNA溶液。使用Bio-Rad PDS-1000，He Biolistic DeliverySystem，在1100psi進行轟擊。轟擊實驗后的愈傷組織在含有2或4mg/l用于選擇的雙丙氨酰膦(bialaphos)的MSA2D培養(yǎng)板上培養(yǎng)3至4天以進行轟擊后的選擇，然后不轉(zhuǎn)移，繼續(xù)培養(yǎng)8周。8周的平板選擇后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到不含激素的MS培養(yǎng)基上進行再生。在2至8周內(nèi)開始再生。將枝條轉(zhuǎn)移到含有MS培養(yǎng)基的plantcon中，在2至4周后開始生根。
至于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，在傳代4天后分離原生質(zhì)體。與培養(yǎng)基(加有5％甘露醇的MSA2D或MMS)中過濾滅菌的酶溶液，于28℃，以50rpm振蕩培養(yǎng)細胞4小時，酶溶液中含有1％纖維素酶Onozuka RA(Yakult Pharmaceutical Co.LTD)，0.1％溶果膠酶Y-23(Seishin Pharmaceutical Co.LTD)，和0.1％MES(2-[N-嗎啉基]乙烷-磺酸)(Sigma)。約每1g新鮮重量的懸浮培養(yǎng)物用10ml酶溶液處理。使原生質(zhì)體濾過Miracloth并用含有5％甘露醇的培養(yǎng)基洗滌兩次。甘露醇被用作滲透壓穩(wěn)定劑。使用飼養(yǎng)層系統(tǒng)培養(yǎng)原生質(zhì)體(Rhodes等，1988)。洗滌、過濾后的原生質(zhì)體被移液到放置在已分散于5％甘露醇培養(yǎng)基中的一懸浮細胞飼養(yǎng)層上的黑色硝酸纖維素薄膜上(Lee等，1989)。1周后，將有原生質(zhì)體的薄膜轉(zhuǎn)移到3％甘露醇培養(yǎng)板上的新鮮飼養(yǎng)層上。在分離后2周從飼養(yǎng)層取下原生質(zhì)體。將分離后3周時的可見集落數(shù)除以平板培養(yǎng)的原生質(zhì)體的總數(shù)，如此計算出平板培養(yǎng)效率。將愈傷組織衍生的原生質(zhì)體放在不含激素或含有1mg/L 6-BA或細胞分裂素的MS培養(yǎng)基上進行植物的再生。4至5周后，將枝條轉(zhuǎn)移到不含有激素的MS培養(yǎng)基的PlantconR上生根。按照Negrutiu等(1987)所述的方法利用PEG法，或使用Gene-Pulster(Bio-Rad)在170V/cm利用電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。在PEG實驗中，將新鮮分離的原生質(zhì)體以1×107原生質(zhì)體/ml的密度重懸在含有15mM MgCl2和0.1％MES的5％甘露醇溶液中。取約0.3ml原生質(zhì)體與20至40μg質(zhì)粒DNA和13％PEG孵育10至15分鐘，離心后逐步稀釋并重懸在含有5％甘露醇的培養(yǎng)基(pH5.8)中。在電穿孔實驗中，原生質(zhì)體以5×106/ml的密度重懸在冷的過濾滅菌的電穿孔緩沖液中，其中含有5.2g/L KCl，0.835g/L CaCl2，0.976g/L MES和5％甘露醇，pH5.8。將約0.8ml原生質(zhì)體與20μg DNA通過倒轉(zhuǎn)混合，在170V/cm進行電穿孔，并在冰上放置15分鐘，然后用含有5％甘露醇的培養(yǎng)基稀釋至3ml總體積。在分離和轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體16天后，用4mg/L bialaphos進行選擇。在無激素、含6-BA或細胞分裂素的MS培育基上的抗性集落如前文所述。將枝條轉(zhuǎn)移到PlantconR上生根。用商品名為HerbiaceR(Meiji Seika Kaishya，LTD.)的市售bialapho制劑用于暖房內(nèi)的除草劑實驗。HerbiaceR的除草劑比率使用對照植株，并以市售品的0.75磅AI/公頃(1倍于大田比率)為基準確定HerbiaceR的除草劑比率。以每片地塊120ml的比率用畫筆對所有露出地面的分蘗都施以除草劑。地塊的面積為0.1431m2，其上有96或24株植物。
實施例6轉(zhuǎn)基因煙草植株內(nèi)PAP突變蛋白的表達和對病毒感染的抗性A.轉(zhuǎn)基因煙草中PAP突變蛋白的表達為了確定PAP的酶活性是否是其抗病毒活性所必需的，如實施例2所述，將編碼活性位點突變蛋白NT123-2的cDNA克隆到去除了野生型PAP插入片段的pMON8443植物表達載體中，形成NT144。同樣，如實施例2所述，將編碼C末端缺失突變蛋白的NT124-3克隆到pMON8443形成NT145和NT147。突變型PAP的表達由增強的CaMV35S啟動子驅(qū)動。將質(zhì)粒NT144、NT145和NT147遷移到根瘤土壤桿菌中用于轉(zhuǎn)化到煙草中。根據(jù)每片葉盤獲得的轉(zhuǎn)基因植株數(shù)，紅花煙草的轉(zhuǎn)化頻率通常在10至12％之間(Lodge等，1993)。用NT144的轉(zhuǎn)化頻率為13％，使用NT145為11％。表達活性位點突變蛋白或C末端缺失突變蛋白的轉(zhuǎn)基因植株表型正常。它們與野生型的生長速度相同，不表現(xiàn)出缺氯癥或葉斑，這表明突變型PAP的表達對轉(zhuǎn)基因煙草是無毒的。這些結(jié)果與以前的報道(Lodge等，1993)相反，其中報道用含有PAP的載體(pMON8443)時，紅花煙草的轉(zhuǎn)化頻率下降至0.7％，使用含PAP-v的載體(pMON8442)時，下降至3.7％，兩種突變蛋白都具有酶活性(Lodge等，1993)。Lodge等沒有回收到表達高水平PAP的轉(zhuǎn)基因植物，而且，表達高水平PAP-v的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出生長抑制、缺氯癥和葉斑。
先用ELISA對再生的轉(zhuǎn)基因植物進行新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)表達的分析。然后用ELISA和免疫印跡對NPTII陽性植株進行PAP表達的分析。利用ELISA測定，11種不同的轉(zhuǎn)基因植物表達可測水平的活性位點突變蛋白。表達活性位點突變型PAP的植株產(chǎn)生一種與成熟PAP共遷移的29KD蛋白質(zhì)，這表明在轉(zhuǎn)基因植物中，活性位點突變型PAP被完全加工成了成熟形式(數(shù)據(jù)未顯示)。轉(zhuǎn)基因植物表達活性位點突變蛋白的水平明顯高于表達PAP或PAP-v的植株。在野生型煙草或表達β-葡糖醛酸酶的煙草中檢測不到對應(yīng)于PAP的條帶。C末端缺失突變蛋白的表達水平明顯低于活性位點突變蛋白。B.轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)活性位點突變蛋白的抗病毒活性為了確定表達活性位點突變型PAP的轉(zhuǎn)基因系是否抗病毒感染，用PVX接種轉(zhuǎn)化的植株系的后代。用ELISA在自體受精的后代中篩選PAP的存在。轉(zhuǎn)基因植株系后代中PAP水平隨植株年齡和生長條件而不同。PAP水平的差異程度與以前表達PAP或PAP-v的轉(zhuǎn)基因系的有關(guān)報道相近(Lodge等，1993)。各取表達活性位點突變型PAP(144-1和144-7)、PAP-v(26139-19)、PAP(33617-11)的10株轉(zhuǎn)基因系后代和10株非轉(zhuǎn)化煙草植株用1μg/ml PVX接種。在接種后21天內(nèi)每天觀察接種葉和系統(tǒng)葉上癥狀的發(fā)展。此外，為了定量病毒的復(fù)制與傳播，在接種后第12天取樣每棵植株的接種葉和第1，2和3片系統(tǒng)葉的葉盤。
如表VII所示，表達PAP-v或野生型PAP的轉(zhuǎn)基因植物在接種后第9天在接種葉上不形成任何損傷。相反，表達活性位點突變蛋白的轉(zhuǎn)基因植物其接種葉上的損傷與對照植株的一樣多。對系統(tǒng)葉的ELISA顯示，在接種后12天，90％的野生型煙草植株被PVX系統(tǒng)性地感染，但分別只有30％和40％表達PAP或PAP-v的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出系統(tǒng)性PVX感染。相反，表達活性位點突變蛋白的植株100％地表現(xiàn)出PVX感染(表VII)。在接種后21天評價植株時，獲得的結(jié)果相近。
表VII植株系表達的PAP PAP水平損傷數(shù)b表現(xiàn)出系統(tǒng)性(ng/mg)a感染的植株％cWT 077+/-12 9026139-19 PAP-v 5.6+/-2.6 0**30**33617-11 PAP 0.6+/-0.020**40*144-1E176V 43.8+/-4.8 78+/-16100144-7E176V 46.2+/-5.6 72+/-11100a從每系20株植株上各取4片葉盤，用ELISA定量PAP水平。給出平均值+/-標準偏差。b每系10棵植株，每株在2片葉上接種50μl 1μg/ml PVX。在接種后第9天計數(shù)損傷數(shù)。給出平均值+/-標準偏差。c在接種后第12天從第1，2和3系統(tǒng)葉上取樣3片葉盤，利用ELISA定量病毒抗原水平。用BCA試劑盒(Pierce)定量每份提取物中的總蛋白量。**與野生型1％的水平有顯著不同*與野生型5％的水平有顯著不同。
為了確定表達高水平的活性位點突變蛋白的轉(zhuǎn)基因植物是否也易被PVX感染，用0.5μg/ml PVX接種表達高水平活性位點突變型PAP的轉(zhuǎn)基因系144-12的純合后代(R2代)。如以下表VIII所示，產(chǎn)生高水平活性位點突變蛋白的轉(zhuǎn)基因系在其接種葉上的損傷數(shù)與野生型煙草植株的相同，但是表達PAP-v或PAP的轉(zhuǎn)基因植株后代其損傷數(shù)明顯較低。對系統(tǒng)葉的ELISA分析顯示，接種21天后，90％野生型煙草植株和100％表達活性位點突變蛋白的轉(zhuǎn)基因植株被PVX感染。相反，表達PAP-v或PAP的轉(zhuǎn)基因植株在其接種葉上的損傷較少，而且植株中被PVX系統(tǒng)性感染的百分比較低。
在其它實驗中，對7個表達活性位點突變蛋白的不同轉(zhuǎn)基因系的后代分析了其對PVX感染的易感性；其中對PVX都沒有抗性(數(shù)據(jù)未顯示)。
表VIII表達C末端缺失突變蛋白(W237終止子)的轉(zhuǎn)基因煙草植株對PVX感染的易感性植株系表達的PAPPAP水平損傷數(shù)b表現(xiàn)出系統(tǒng)性感(ng/mg)a染的植株％c12天后 21天后WT 024+/-15 90 9026139-19 PAP-v9.6 1+/-2**10**30**33617-11 PAP 1.6 11+/-4**10*40*147-12 E176V1500 23+/-13 100 100145-19 W237終止子 4.5 12+/-10**20**60144-13 W237終止子 4.4 6+/-4**30**60a在原代轉(zhuǎn)基因植株中利用ELISA定量PAP水平b在每8至10棵各轉(zhuǎn)基因系純合后代(R2代)的植株中，每株在兩片葉上接種以0.5μg/ml PVX 50μl。在接種后第12天計數(shù)損傷數(shù)。顯示平均值+/-標準偏差。c在接種后第12天，從各植株的第1和第2系統(tǒng)感染葉上取兩片葉片，并在接種后第21從第3和第4系統(tǒng)感染葉上取兩片葉盤。用ELISA定量病毒抗原的水平。用BCA試劑盒(Pierce)定量每份提取物中的總蛋白量。**與野生型1％的水平有顯著不同*與野生型5％的水平有顯著不同。C.轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)C末端缺失突變蛋白的抗病毒活性為了確定表達C末端缺失突變蛋白的轉(zhuǎn)基因系是否抗病毒感染，用0.5μg/mlPVX接種表達C末端缺失突變蛋白(W237終止子)的轉(zhuǎn)基因系145-13和147-19的純合后代(R2代)，在接種后第12天計數(shù)損傷數(shù)。如以上表VIII所示，來自145-13和147-19轉(zhuǎn)基因系的植株在其接種葉上的損傷數(shù)明顯少于野生型植株。在接種后第12天，分別只有20％和30％來自轉(zhuǎn)基因系147-19和145-13的植株表現(xiàn)出系統(tǒng)性癥狀以及經(jīng)ELISA檢測含有PVX抗原，但是90％對照植株被PVX感染。接種后21天，來自147-19和145-13系的植株中表現(xiàn)出系統(tǒng)性癥狀的百分比有所上升。正如以前實驗中的觀察結(jié)果，表達PAP-v和PAP的轉(zhuǎn)基因系的后代能免受PVX感染。表達C末端缺失突變蛋白(W237終止子)、PAP或PAP-v的被感染植株與被感染的野生型或表達活性位點突變蛋白(E176V)的轉(zhuǎn)基因植株相比，表現(xiàn)出較輕的癥狀。在接種后第21天，使用ELISA來定量轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株中的病毒抗原水平。來自147-19、145-13和33617-11系的植株中的PVX抗原水平低于野生型植株。在接種后4周進行評價時，被感染植株的百分比沒有改變。
在其它實驗中，總共分析了6個不同的表達C末端缺失突變蛋白的轉(zhuǎn)基因系對PVX感染的易感性，其中4個系表現(xiàn)出對PVX感染的抗性(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例7表達PAP和PAP突變蛋白的轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的抗真菌性的分析使用的是表達PAP、PAP突變蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草系的苗和野生型煙草的苗。在出苗4周后，將苗轉(zhuǎn)移到培育室中，于25℃、80％相對濕度和16小時光照周期下種植在無菌土中。利用三親本交配法將含有嵌合PAP基因的重組構(gòu)建物引入根瘤土壤桿菌。含有經(jīng)修飾PAP基因的土壤桿菌被用于轉(zhuǎn)化紅花煙草。使耐卡那霉素的R2代轉(zhuǎn)基因植株自體授粉，并在實驗中使用R3代的苗。使用的是來自33617(表達野生型PAP)、NT144(表達活性位點突變型PAP)、NT145和NT147(都表達C末端缺失突變型PAP)系的轉(zhuǎn)基因植物。
將4周齡的轉(zhuǎn)基因苗和對照苗移植到無菌土中，用由土壤攜帶的真菌病原體茄屬絲核菌接種。對病害癥狀的發(fā)展進行2周的觀察，計算苗死亡的比率。將在真菌感染后存活的植株移植到單個盆中，并組織取樣以進行以后的分析。
在用茄屬絲核菌接種后，對照煙草苗迅速被真菌病原體侵害。病害發(fā)展迅速，在接種后6天中感染了30％以上的對照苗。相反，轉(zhuǎn)基因系1對感染的易感性明顯較低。接種后6天，只有9.5％來自野生型PAP系的苗、約20％來自C末端截短的PAP系的苗和23％來自活性位點突變蛋白系的苗被感染。在以下表IX中列出了在不同時刻的存活苗數(shù)量。全部轉(zhuǎn)基因系均表現(xiàn)出延遲了病癥的出現(xiàn)以及較低的死亡率。
表IX被茄屬絲核菌感染的轉(zhuǎn)基因煙草PAP系內(nèi)的病害進展

在使用不同的另一茄屬絲核菌菌株的實驗中，病害發(fā)展迅速，在5天內(nèi)殺死了大部分幼苗。以下表X列出了在感染土壤中種植2周后存活的苗數(shù)。值得注意的是，雖然對照植物在評價的時候并沒有死亡，但是它們被極度矮化，而且表現(xiàn)出十分嚴重的病癥。相反，表達截短的PAP的轉(zhuǎn)基因系的幼苗表現(xiàn)出的組織損傷少得多。
表X在茄屬絲核菌抗性測試中具有不同的PAP基因的轉(zhuǎn)基因煙草系的存活煙草系(Samsun)種植的苗數(shù)接種14天后接種14天后存活苗的數(shù)量 存活苗的％對照(n) 20 210對照(N) 20 0 033617-11 20 840144-12 20 525145-15 20 1 5147-19 20 525對存活植株的分析進行轉(zhuǎn)基因系的總細胞蛋白分析，即用MiniPROTEAN II電泳槽(Bio-Rad)在10％SDS-PAGE上分離蛋白質(zhì)樣品，按制造商的說明使用Bio-Rad半干電泳轉(zhuǎn)移器將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上。使用PAP IgG或PR1a單克隆抗體進行Western印跡分析。使用DuPont Renaissance試劑盒通過增強化學(xué)發(fā)光進行檢測。
對轉(zhuǎn)基因植株細胞提取物的Western印跡分析顯示，PAP基因在全部經(jīng)真菌感染后存活的植株中都表達。各植株產(chǎn)生的PAP的量不同。此外，由同一植株分離質(zhì)外體液，通過硝酸銀染色非變性凝膠來分析胞外蛋白。在表達商陸抗病毒蛋白基因的植株中檢測到了病理相關(guān)蛋白(PR)的表達。Western印跡分析還顯示，在存活植株內(nèi)，PR1a的表達水平增高。
在表達商陸抗病毒蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草系中觀察到真菌病癥的明顯減少。如表IX和X所示，PAP轉(zhuǎn)基因系在被茄屬絲核菌感染后表現(xiàn)出較高的存活苗百分比。此外，在轉(zhuǎn)基因PAP系中，以幼苗死亡率為代表的病害進程明顯較慢。表達野生型PAP的轉(zhuǎn)基因系33617以及含有PAP突變形式即NT144-12(表達活性位點突變型PAP)、NT145-15和NT147-19(表達缺失了25個C末端氨基酸的PAP截短形式)的轉(zhuǎn)基因煙草系都表現(xiàn)出對真菌感染的抗性。
突變型PAP基因在煙草內(nèi)的表達被證明絕對沒有可測的表型影響，但卻意外可造成了幾種病理相關(guān)蛋白的組成型表達。已知在被誘導(dǎo)的基因中有些具有抗真菌活性?；谶@一發(fā)現(xiàn)，而且不限于任何特定的作用理論，申請人認為表達本發(fā)明突變型PAP基因的煙草系對茄屬絲核菌感染的抗性可以用宿主防御基因的作用來解釋，而表達PAP的植株內(nèi)對真菌感染的抗性可能是由于在轉(zhuǎn)基因煙草中組成型表達的PAP轉(zhuǎn)基因和許多宿主基因的雙重作用。申請人還認為，對這些植物防御基因的誘導(dǎo)還具有保護轉(zhuǎn)基因植株抗其它病原體例如細菌性病原體的作用。
實施例8通過在酵母中的染色體誘變和選擇分離新的PAP突變蛋白A.PAP突變蛋白的分離利用染色體誘變和選擇來分離允許細胞在PAP存在下生長的酵母突變株。釀酒酵母內(nèi)PAP的組成型表達一般是致死性的。所以，將PAP基因置于半乳糖誘導(dǎo)型GAL1啟動子的調(diào)控下。這能夠使得攜帶了含PAP基因的質(zhì)粒的細胞在PAP表達被抑制的葡萄糖上正常生長，但在PAP被表達的半乳糖上殺死已生長的細胞。我們還首次利用誘導(dǎo)型PAP表達系統(tǒng)和PAP對正常酵母細胞的毒性來分離了能夠在PAP存在下生長的突變株。帶有含野生型PAP基因質(zhì)粒(NT123)的酵母細胞被培養(yǎng)到對數(shù)期早期，pH7.0，密度為1×108細胞/ml。取3份1ml的培養(yǎng)物用于誘變。用5μl或25μl乙基甲磺酸(EMS)進行誘變。保留一份不誘變的作為檢測自發(fā)突變頻率的對照。加入EMS后，細胞在30℃培養(yǎng)1小時，加以輕微的振蕩。加入5％硫代硫酸鈉終止誘變。然后在30℃將細胞平板培養(yǎng)在含有2％葡萄糖的尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基上。根據(jù)平板上由誘變細胞生長出的集落數(shù)與非誘變的對照之比，5μl和25μl EMS分別殺死了35％和98％細胞。這些集落被影印到含有2％半乳糖的尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基上平板培養(yǎng)，并篩選出在PAP存在下能夠生長的集落。篩選了約13,500個集落，獲得9個能夠在半乳糖培養(yǎng)基上生長的集落。
對突變株進行了測試，以檢驗突變是染色體連鎖的還是質(zhì)粒連鎖的。在突變株上進行質(zhì)粒的分離，即在非選擇性培養(yǎng)基(YEPD)上將細胞傳代約50代，將它們平板培養(yǎng)在YEPD上，然后影印平板培養(yǎng)這些因丟失了質(zhì)粒而不能再在尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基上生長的細胞。用新鮮的NT123質(zhì)粒轉(zhuǎn)化這些經(jīng)質(zhì)粒分離的細胞，并檢測它們在含有2％半乳糖的尿嘧啶缺陷培養(yǎng)基上生長的能力。保留了在半乳糖培養(yǎng)基上生長能力的突變株是染色體突變株，而不能在半乳糖上生長的突變株帶有質(zhì)粒攜帶的突變。
進一步定性這些質(zhì)粒攜帶的突變體，即對取自表達這些質(zhì)粒的細胞的全部細胞提取物進行免疫印跡分析。該分析揭示，7個質(zhì)粒突變株中有2個表達截短的PAP。另外5個不表達任何PAP蛋白。對表達截短的PAP的2個突變株進行測序，以確定突變的位置。一個突變株，NT185在C末端具有一個點突變，即將Lys210(AAG)變成了終止密碼子(TAG)，造成約3.5KD的缺失。另一突變株，NT187在N末端將Try16(TAC)變成了終止密碼子(TAG)，從而能在Met39處重新起始，由此形成一個24.8KD的蛋白質(zhì)。B.大腸桿菌表達載體的構(gòu)建為了在大腸桿菌細胞內(nèi)表達N末端缺失的成熟PAP，用BstYI和HindIII限制酶消化NT187質(zhì)粒DNA，并用Gene Clean試劑盒(Bio 101)純化該830bp的片段。將純化的片段連接到經(jīng)BamHI和HindIII消化后用堿性磷酸酶處理過的大腸桿菌表達載體pQE31(QIAGEN Inc.)上。形成的質(zhì)粒NT190在大腸桿菌表達載體pQE31內(nèi)含有N末端缺失突變型PAP。C.大腸桿菌內(nèi)PAP突變蛋白的表達從大腸桿菌DH5α細胞中分離NT190，并轉(zhuǎn)化到表達宿主，大腸桿菌M15(pREP4)中。含有NT190的M15細胞在50ml含有2％葡萄糖、100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于35℃通宵劇烈振蕩培養(yǎng)。第二天，接種大量培養(yǎng)物(500ml LB培養(yǎng)基，其中含2％葡萄糖、100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素)，并在37℃劇烈振蕩培養(yǎng)，直至A600達0.9。加入最終濃度為2mM的IPTG，培養(yǎng)物在37℃培養(yǎng)5小時。在4,000Xg離心10分鐘以收集細胞，保存在-70℃。D.N末端缺失的PAP的純化融解1g大腸桿菌細胞重懸在5ml緩沖液A(6M鹽酸胍，0.1M磷酸鈉和0.01MTris-HCl，pH8.0)中，并在室溫下攪拌1小時。大腸桿菌裂解物在4℃以10,000xg離心15分鐘，并收集上清液。加入預(yù)先在緩沖液A中平衡過的50％Ni-瓊脂糖樹脂漿(QIAGEN Inc.)2ml。在室溫下攪拌45分鐘后，將樹脂小心地上樣在poly-prep色譜柱(Bio-Rad)上。柱用20倍柱體積的緩沖液A和10倍柱體積的緩沖液B(8M尿素、0.1M磷酸鈉和0.01M Tris-HCl，pH8.0)洗滌。用20倍柱體積的緩沖液C(8M尿素、0.1M磷酸鈉和0.01M Tris-HCl，pH6.3)洗出不與樹脂結(jié)合的蛋白質(zhì)。最后，用含有250mM咪唑的緩沖液C洗脫結(jié)合蛋白，并用SDS-PAGE和Western印跡分析進行分析。E.N末端缺失的PAP的抗病毒活性為了確定N末端缺失的PAP是否具有抗病毒活性，在有或無純化自大腸桿菌的N末端缺失突變蛋白存在下，用1μg/ml PVX接種野生型煙草植株。利用ELISA和SDS-PAGE測定PAP濃度。在有或無1μg/ml PVX存在下用15ng/μl和1.5ng/μl突變型PAP涂在煙草葉上。如表XI所示，在1.5或15ng/μl N末端缺失的PAP存在下接種PVX的煙草植株與無突變型PAP存在下接種PVX的煙草植株相比，在其接種葉上表現(xiàn)出較少的損傷。而且，如表XII所示，在15ng/μl突變型PAP存在下接種PVX的植株都不表現(xiàn)出PVX系統(tǒng)性癥狀，在1.5ng/μl突變型PAP存在下接種PVX的植株只有13％表現(xiàn)出系統(tǒng)性PVX癥狀，而在單純緩沖液存在下接種PVX的植株100％地表現(xiàn)出系統(tǒng)性PVX癥狀。以上結(jié)果表明，外源性地施用N末端缺失的PAP可保護煙草抗PVX感染，因而是抗病毒的。
表XI外源性施用了N末端缺失的PAP的煙草植株對PVX的易感性施用的蛋白質(zhì)a(ng/μl) PVX(μg/ml)平均損傷數(shù)b無1 20+/-16PAP(1.5) 1 2+/-2PAP(15) 1 2+/-2a在1.5或15ng/μlN末端缺失的PAP存在下用50μl(1μg/ml)PVX接種每棵植株的2片葉。在僅有緩沖液存在下(“無”)用PVX接種12棵植株，在50μl 1.5或15ng/μl突變型PAP存在下用PVX接種8棵植株。b在接種后第7天計數(shù)損傷數(shù)。給出平均值+/-標準偏差。
表XII在外源性施用的N末端缺失的PAP存在下，表現(xiàn)出系統(tǒng)性病癥的植株的百分比施用的蛋白質(zhì)aPVX表現(xiàn)出系統(tǒng)性病癥的植株(ng/μl) (μg/ml) 的百分比b無 1100PAP(1.5) 113PAP(15) 10a在1.5或15ng/μl N末端缺失的PAP存在下用50μl(1μg/ml)PVX接種每棵植株的2片葉。在僅有緩沖液存在下(“無”)用PVX接種12棵植株，在50μl 1.5或15ng/μl突變型PAP存在下用PVX接種8棵植株。b在接種后第11天評價系統(tǒng)性癥狀。
在此將申請人于1995，7，11申請的的未審定的專利申請08/500,611和500,694全文作為參考。
工業(yè)實用性當本發(fā)明的突變型PAP在植物內(nèi)被表達時可提供對病毒和真菌的廣譜抗性。它們只需要很少數(shù)量的轉(zhuǎn)基因就可以有效地提供這種抗性。而且，突變型PAP基本上沒有植物毒性和細胞毒性，因而與使用野生型PAP相比具有突出而且超乎意料的優(yōu)越性。能夠表達本發(fā)明突變型PAP的轉(zhuǎn)基因植物對多種病原體具有明顯更強的抗性，其中包括病毒、真菌、細菌、線蟲和害蟲，所以具有相當高的作物產(chǎn)量。
說明書中提及的所有文獻和專利申請都代表本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的研究水平。所有文獻和專利申請都作了相同程度的引用，都具體、單獨進行了參考性引述。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，本發(fā)明的多種修改形式是顯而易見的。這些修改都在后文權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表(1)一般信息(i)申請人Rutgers，The State UniversityPiscataway，NJ 08855(ii)發(fā)明名稱商陸抗病毒蛋白突變體(iii)序列數(shù)量2(iv)通訊地址(A)地址Lerner，David，Littenberg，Krumholz&Mentlik(B)街道600 South Avenue West(C)城市Westfield(D)州NJ(E)國家USA(F)郵編07090-1497(v)計算機可讀形式(A)記錄介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentln Release#1.0，#1.25版(vi)本申請資料(A)申請?zhí)朠CT(B)申請日11-7-1996(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/500,611(B)申請日11-7-1995(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S 08/500,694
(B)申請日11-7-1995(viii)律師/代理人信息(A)姓名Foley，Shawn P.
(C)參考/卷宗號OCIRS 3.4-034CIP(ix)電訊信息(A)電話908-654-5000(B)傳真908-654-7866(C)電傳139-125(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度1379堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ix)特征(A)名稱/符號CDS(B)位置225..1163(ix)特征(A)名稱/符號突變(B)位置置換(233，″a″)(ix)特征(A)名稱/符號突變(B)位置置換(349，″g″)(ix)特征(A)名稱/符號突變(B)位置置換(435，″c″)
(xi)SEQ ID NO1的序列描述CTATGAAGTC GGGTCAAAGC ATATACAGGC TATGCATTGT TAGAAACATT GATGCCTCTG 60ATCCCGATAA ACAATACAAA TTAGACAATA AGATGACATA CAAGTACCTA AACTGTGTAT 120GGGGGAGTGA AACCTCAGCT GCTAAAAAAA CGTTGTAAGA AAAAAAGAAA GTTGTGAGTT 180AACTACAGGG CGAAAGTATT GGAACTAGCT AGTAGGAAGG GAAG ATG AAG TCG ATG 236Met Lys Ser Met1CTT GTG GTG ACA ATA TCA ATA TGG CTC ATT CTT GCA CCA ACT TCA ACT 284Leu Val Val Thr Ile Ser Ile Trp Leu Ile Leu Ala Pro Thr Ser Thr5 10 15 20TGG GCT GTG AAT ACA ATC ATC TAC AAT GTT GGA AGT ACC ACC ATT AGC 332Trp Ala Val Asn Thr Ile Ile Tyr Asn Val Gly Ser Thr Thr Ile Ser25 30 35AAA TAC GCC ACT TTT CTG AAT GAT CTT CGT AAT GAA GCG AAA GAT CCA 380Lys Tyr Ala Thr Phe Leu Asn Asp Leu Arg Asn Glu Ala Lys Asp Pro40 45 50AGT TTA AAA TGC TAT GGA ATA CCA ATG CTG CCC AAT ACA AAT ACA AAT 428Ser Leu Lys Cys Tyr Gly Ile Pro Met Leu Pro Asn Thr Asn Thr Asn55 60 65CCA AAG TAC GTG TTG GTT GAG CTC CAA GGT TCA AAT AAA AAA ACC ATC 476Pro Lys Tyr Val Leu Val Glu Leu Gln Gly Ser Asn Lys Lys Thr Ile70 75 80ACA CTA ATG CTG AGA CGA AAC AAT TTG TAT GTG ATG GGT TAT TCT GAT 524Thr Leu Met Leu Arg Arg Asn Asn Leu Tyr Val Met Gly Tyr Ser Asp85 90 95 100CCC TTT GAA ACC AAT AAA TGT CGT TAC CAT ATC TTT AAT GAT ATC TCA 572Pro Phe Glu Thr Asn Lys Cys Arg Tyr His Ile Phe Asn Asp Ile Ser105 110 115GGT ACT GAA CGC CAA GAT GTA GAG ACT ACT CTT TGC CCA AAT GCC AAT 620Gly Thr Glu Arg Gln Asp Val Glu Thr Thr Leu Cys Pro Asn Ala Asn120 125 130TCT CGT GTT AGT AAA AAC ATA AAC TTT GAT AGT CGA TAT CCA ACA TTG 668Ser Arg Val Ser Lys Asn Ile Asn Phe Asp Ser Arg Tyr Pro Thr Leu135 140 145GAA TCA AAA GCG GGA GTA AAA TCA AGA AGT CAG GTC CAA CTG GGA ATT 716Glu Ser Lys Ala Gly Val Lys Ser Arg Ser Gln Val Gln Leu Gly Ile150 155 160CAA ATA CTC GAC AGT AAT ATT GGA AAG ATT TCT GGA GTG ATG TCA TTC 764Gln Ile Leu Asp Ser Asn Ile Gly Lys Ile Ser Gly Val Met Ser Phe165 170 175 180ACT GAG AAA ACC GAA GCC GAA TTC CTA TTG GTA GCC ATA CAA ATG GTA 812Thr Glu Lys Thr Glu Ala Glu Phe Leu Leu Val Ala Ile Gln Met Val185 190 195TCA GAG GCA GCA AGA TTC AAG TAC ATA GAG AAT CAG GTG AAA ACT AAT 860Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Asn Gln Val Lys Thr Asn200 205 210TTT AAC AGA GCA TTC AAC CCT AAT CCC AAA GTA CTT AAT TTG CAA GAG 908Phe Asn Arg Ala Phe Asn Pro Asn Pro Lys Val Leu Asn Leu Gln Glu215 220 225ACA TGG GGT AAG ATT TCA ACA GCA ATT CAT GAT GCC AAG AAT GGA GTT 956Thr Trp Gly Lys Ile Ser Thr Ala Ile His Asp Ala Lys Asn Gly Val230 235 240TTA CCC AAA CCT CTC GAG CTA GTG GAT GCC AGT GGT GCC AAG TGG ATA 1004Leu Pro Lys Pro Leu Glu Leu Val Asp Ala Ser Gly Ala Lys Trp Ile245 250 255 260GTG TTG AGA GTG GAT GAA ATC AAG CCT GAT GTA GCA CTC TTA AAC TAC 1052Val Leu Arg Val Asp Glu Ile Lys Pro Asp Val Ala Leu Leu Asn Tyr265 270 275GTT GGT GGG AGC TGT CAG ACA ACT TAT AAC CAA AAT GCC ATG TTT CCT 1100Val Gly Gly Ser Cys Gln Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Ala Met Phe Pro280 285 290CAA CTT ATA ATG TCT ACT TAT TAT AAT TAC ATG GTT AAT CTT GGT GAT 1148Gln Leu Ile Met Ser Thr Tyr Tyr Asn Tyr Met Val Asn Leu Gly Asp295 300 305CTA TTT GAA GGA TTC TGATCATAAA CATAATAAGG AGTATATATA TATTACTCCA 1203Leu Phe Glu Gly Phe310ACTATATTAT AAAGCTTAAA TAAGAGGCCG TGTTAATTAG TACTTGTTGC CTTTTGCTTT 1263ATGGTGTTGT TTATTATGCC TTGTATGCTT GTAATATTAT CTAGAGAACA AGATGTACTG 1323TGTAATAGTC TTGTTTGAAA TAAAACTTCC AATTATGATG CAAAAAAAAA AAAAAA 1379(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度313氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)SEQ ID NO2的序列描述Met Lys Ser Met Leu Val Val Thr Ile Ser Ile Trp Leu Ile Leu Ala1 5 10 15Pro Thr Ser Thr Trp Ala Val Asn Thr Ile Ile Tyr Asn Val Gly Ser20 25 30Thr Thr Ile Ser Lys Tyr Ala Thr Phe Leu Asn Asp Leu Arg Asn Glu35 40 45Ala Lys Asp Pro Ser Leu Lys Cys Tyr Gly Ile Pro Met Leu Pro Asn50 55 60Thr Asn Thr Asn Pro Lys Tyr Val Leu Val Glu Leu Gln Gly Ser Asn65 70 75 80Lys Lys Thr Ile Thr Leu Met Leu Arg Arg Asn Asn Leu Tyr Val Met85 90 95Gly Tyr Ser Asp Pro Phe Glu Thr Asn Lys Cys Arg Tyr His Ile Phe100 105 110Asn Asp Ile Ser Gly Thr Glu Arg Gln Asp Val Glu Thr Thr Leu Cys115 120 125Pro Asn Ala Asn Ser Arg Val Ser Lys Asn Ile Asn Phe Asp Ser Arg130 135 140Tyr Pro Thr Leu Glu Ser Lys Ala Gly Val Lys Ser Arg Ser Gln Val145 150 155 160Gln Leu Gly Ile Gln Ile Leu Asp Ser Asn Ile Gly Lys Ile Ser Gly165 170 175Val Met Ser Phe Thr Glu Lys Thr Glu Ala Glu Phe Leu Leu Val Ala180 185 190Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Asn Gln195 200 205Val Lys Thr Asn Phe Asn Arg Ala Phe Asn Pro Asn Pro Lys Val Leu210 215 220Asn Leu Gln Glu Thr Trp Gly Lys Ile Ser Thr Ala Ile His Asp Ala225 230 235 240Lys Asn Gly Val Leu Pro Lys Pro Leu Glu Leu Val Asp Ala Ser Gly245 250 255Ala Lys Trp Ile Val Leu Arg Val Asp Glu Ile Lys Pro Asp Val Ala260 265 270Leu Leu Asn Tyr Val Gly Gly Ser Cys Gln Thr Thr Tyr Asn Gln Asn275 280 285Ala Met Phe Pro Gln Leu Ile Met Ser Thr Tyr Tyr Asn Tyr Met Val290 295 300Asn Leu Gly Asp Leu Phe Glu Gly Phe305 310
權(quán)利要求
1.一種PAP突變蛋白，它具有降低的植物毒性，而且在植物內(nèi)表現(xiàn)出抗病毒或抗真菌活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PAP突變蛋白，它與野生型PAP的區(qū)別主要在于它在體內(nèi)的區(qū)室化作用被改變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PAP突變蛋白，它在Gly75處具有保守性氨基酸取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的PAP突變蛋白，它包括PAP(1-262，Gly75Val)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的PAP突變蛋白，它在Glu97處具有非保守性氨基酸取代。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的PAP突變蛋白，它是PAP(1-262，Glu97Lys)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PAP突變蛋白，它與野生型PAP的區(qū)別主要在于它在C末端被截短了至少約26至76個成熟PAP的氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的PAP突變蛋白，它選自以下一組PAP突變蛋白PAP(1-236)，PAP(1-235)，PAP(1-234)，PAP(1-233)，PAP(1-232)，PAP(1-231)，PAP(1-230)，PAP(1-229)，PAP(1-228)，PAP(1-227)，PAP(1-226)，PAP(1-225)，PAP(1-224)，PAP(1-223)，PAP(1-222)，PAP(1-221)，PAP(1-220)，PAP(1-219)，PAP(1-218)，PAP(1-217)，PAP(1-216)，PAP(1-215)，PAP(1-214)，PAP(1-213)，PAP(1-212)，PAP(1-211)，PAP(1-210)，PAP(1-209)，PAP(1-208)，PAP(1-207)，PAP(1-206)，PAP(1-205)，PAP(1-204)，PAP(1-203)，PAP(1-202)，PAP(1-201)，PAP(1-200)，PAP(1-199)，PAP(1-198)，PAP(1-197)，PAP(1-196)，PAP(1-195)，PAP(1-194)，PAP(1-193)，PAP(1-192)，PAP(1-191)，PAP(1-190)，PAP(1-189)，PAP(1-188)，PAP(1-187)，PAP(1-186)，PAP(1-185)和PAP(1-184)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PAP突變蛋白，它包括PAP(1-206Glu)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PAP突變蛋白，它包括PAP(1-236Lys)。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PAP突變蛋白，它包括PAP(1-184Glu)。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PAP突變蛋白，它包括PAP(1-188Lys)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PAP突變蛋白，它與野生型PAP的區(qū)別主要在于它在N末端截短了至少約1至38個氨基酸殘基。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的PAP突變蛋白，它選自以下一組PAP突變蛋白PAP(2-262)，PAP(3-262)，PAP(4-262)，PAP(5-262)，PAP(6-262)，PAP(7-262)，PAP(8-262)，PAP(9-262)，PAP(10-262)，PAP(11-262)，PAP(12-262)，PAP(13-262)，PAP(14-262)，PAP(15-262)，PAP(16-262)，PAP(17-262)，PAP(18-262)，PAP(19-262)，PAP(20-262)，PAP(21-262)，PAP(22-262)，PAP(23-262)，PAP(24-262)，PAP(25-262)，PAP(26-262)，PAP(27-262)，PAP(28-262)，PAP(29-262)，PAP(30-262)，PAP(31-262)，PAP(32-262)，PAP(33-262)，PAP(34-262)，PAP(35-262)，PAP(36-262)，PAP(37-262)，PAP(38-262)和PAP(39-262)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PAP突變蛋白，它在植物內(nèi)表現(xiàn)出抗真菌活性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的PAP突變蛋白，它沒有酶活性。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的PAP突變蛋白，其中包括PAP(1-262，Glu176Val)。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PAP突變蛋白，它包含野生型PAP的N末端信號序列。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PAP突變蛋白，它包含野生型PAP的C末端延伸序列。
20.一種DNA分子，它編碼權(quán)利要求1至19中任一項所述的PAP突變蛋白。
21.一種重組DNA分子，它包含與能夠在細胞內(nèi)起作用的啟動子可操作地連接的權(quán)利要求20所述的DNA分子。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的重組DNA分子，所述的啟動子能夠在酵母細胞內(nèi)起作用。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的重組DNA分子，所述的啟動子能夠在植物細胞內(nèi)起作用。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的重組DNA分子，所述的啟動子是誘導(dǎo)型或組成型調(diào)控的。
25.一種載體，它能夠用權(quán)利要求24所述的重組DNA分子進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
26.一種原生質(zhì)體，它能夠被權(quán)利要求24所述的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
27.一種宿主，它能夠被權(quán)利要求24所述的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，而且能夠表達所述的重組DNA分子。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的宿主，它是大腸桿菌細胞。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的宿主，它是酵母細胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的宿主，所述的酵母細胞是釀酒酵母細胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的宿主，所述的重組DNA分子與在所述宿主內(nèi)功能性的誘導(dǎo)型啟動子可操作地連接。
32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的宿主，所述的宿主是植物細胞。
33.一種種子，它包含權(quán)利要求27所述的重組DNA分子，所述的種子能夠生長成其細胞能夠表達所述DNA分子的植物。
34.一種轉(zhuǎn)基因植物，它是由權(quán)利要求33所述的種子生成的。
35.一種轉(zhuǎn)基因植物，它是由權(quán)利要求26所述的原生質(zhì)體生成的。
36.一種轉(zhuǎn)基因植物，它包含權(quán)利要求20所述的DNA分子，而且能夠表達所述的DNA分子。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的轉(zhuǎn)基因植物，它是單子葉植物。
38根據(jù)權(quán)利要求37所述的轉(zhuǎn)基因植物，它是谷類作物。
39.根據(jù)權(quán)利要求36所述的轉(zhuǎn)基因植物，它是雙子葉植物。
40.一種鑒定具有降低的植物毒性的PAP突變蛋白的方法，它包括(a)提供穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的真核細胞，所述的真核細胞用與在真核細胞內(nèi)功能性的誘導(dǎo)型啟動子可操作地連接的、經(jīng)誘變的編碼PAP的DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，或者先用非誘變的編碼PAP的DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化后再誘變轉(zhuǎn)化后的細胞；(b)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化細胞；(c)在培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物引起DNA分子的表達；(d)確定所述的被培養(yǎng)的細胞是否在所述的編碼PAP的DNA分子被表達后存活，由此確定由誘變DNA分子編碼的PAP的生物活性。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，所述的提供步驟包括用隨機誘變的編碼PAP的DNA分子轉(zhuǎn)化大量真核細胞，所述的確定步驟包括確定那些轉(zhuǎn)化的細胞在所述DNA分子的誘導(dǎo)表達后存活，由此確定DNA分子編碼的PAP各自的生物活性。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，它還包括通過分析由DNA分子編碼的PAP來確定它是否保留了PAP的抗真菌或抗病毒活性。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，所述的分析步驟還包括在一定量的由DNA分子編碼的PAP存在下，在真核翻譯系統(tǒng)中翻譯病毒核酸。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，所述的翻譯系統(tǒng)包括網(wǎng)織紅細胞裂解物系統(tǒng)。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，所述的翻譯系統(tǒng)包括兔網(wǎng)織紅細胞裂解物系統(tǒng)。
46.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，所述的真核細胞是酵母細胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，所述的酵母是釀酒酵母。
48.一種經(jīng)分離和純化的PAP突變蛋白，它是用權(quán)利要求40所述的方法鑒定的。
全文摘要
本發(fā)明公開的是具有與野生型PAP相比,植物毒性被降低的PAP突變蛋白,而且它們能夠在植物內(nèi)賦予對病毒和/或真菌的廣譜抗性。一類PAP突變蛋白的特征在于在成熟PAP的N末端至少有一處氨基酸取代,例如75位的甘氨酸殘基或97位的谷氨酸殘基;另兩類PAP突變蛋白的特征分別在于成熟PAP的N末端被截短,和成熟PAP的C末端被截短或有氨基酸取代。另一類沒有酶活性但是仍然保留了抗真菌特性。本發(fā)明同時還公開了編碼PAP突變蛋白的DNA分子、突變型PAP的DNA構(gòu)建物、轉(zhuǎn)基因種子和包含以上DNA的植物。而且,本發(fā)明公開了用于鑒定降低了植物毒性的PAP突變蛋白的方法,以及分離和純化的用以上方法鑒定的PAP突變蛋白。
文檔編號C07K14/415GK1190433SQ96195379
公開日1998年8月12日 申請日期1996年7月11日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月11日
發(fā)明者N·E·蒂默 申請人:拉脫格斯州立大學(xué)