專利名稱：從植物葉片直接提取1，5-二磷酸核酮糖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于提取1.5-二磷酸核酮糖(RuBP)方法，RuBP是羧化酶/加氫酶(Rubisco)的底物，Rubisco是植物進(jìn)行RuBP光合作用的關(guān)鍵性酶，該酶具有雙重催化功能催化RuBP與CO2結(jié)合進(jìn)行羧化反應(yīng)，開啟光合碳還原循環(huán)(即進(jìn)行光合同化作用);同時也催化RuBP與O2結(jié)合，進(jìn)行加氧反應(yīng)，從而啟動光合碳氧循環(huán)(即進(jìn)行光呼吸)。因此，RuBP是光合碳化代謝的必備生化試劑，RuBP屬高能化合物，其含量88-98%，這種產(chǎn)品目前靠進(jìn)口，價格昂貴。
目前RuBP的制備均采用酶促合成法，此法需添加生化劑和酶制劑、成本高、手續(xù)繁冗、得率低。
本發(fā)明根據(jù)葉片中的RuBP含量隨光強(qiáng)上升而顯著增加和RuBP鋇鹽的溶度積常數(shù)很小等特性，提供一種從植物葉片直接提取1.5-二磷酸核酮糖(RuBP)的方法，在制備過程中不需添加生化劑和酶制劑，可獲RuBP鋇鹽或鈉鹽，含量在90%以上，符合生化試劑要求，其工藝簡單、成本低、產(chǎn)量高。
本方法首先采用以強(qiáng)光照處理新鮮植物葉片并迅速低溫冷凍固定，將處理后的葉片破碎、酸浸取、鋇鹽沉淀、陰離子交換層析純化等步驟。
具體提取方法可這樣進(jìn)行一、照光處理取新鮮植物葉片，胡羅卜葉片較理想，裝入透明袋里，排除袋里內(nèi)空氣，充入高純氮氣，將袋口扎緊，置于50lx以上強(qiáng)光下照光約5-10分鐘，使各葉片均能雙面受到光照，隨即于-40℃以下低溫冷凍固定。
二、將冰凍固定的植物葉片破碎，加入約兩倍葉重的預(yù)冷至1℃左右的含8%三氯乙酸及5%甲酸的提取液，高速勻漿，雙層尼龍布過濾，濾液于3000×g離心15分鐘，棄去沉淀，每升上清液中加入150g用1mol HCl/L處理過的活性碳，攪拌均勻后于3000×g離心10分鐘，棄去沉淀，每升上清液中加入飽和Ba(OH)2溶液，用飽和NaOH調(diào)至pH值為6.5，然后每升提取液中加入乙酸鋇10g，無水乙醇300ml，均勻后低溫靜置約30分鐘，3000×g離心15分鐘，可獲RuBP鋇鹽沉淀，整個過程應(yīng)在4℃下進(jìn)行。
三、RuBP純化用0.5mol HCl/L溶解含RuBP的鋇鹽沉淀，用5000×g離心沉降，收集上清液，調(diào)至pH值為3.5，過DEAE-纖維素柱或20×7(717)型陰離子交換樹脂柱(10mmol NaCl/L+1mmol HCl/L溶液平衡)，用3倍柱體積的平衡液洗柱后，再用0.1mmol HCl/L+0.01-0.2mol NaCl/L進(jìn)行梯度洗脫，用磷試劑(4%鉬酸銨∶1mol HCl/L∶70%HClO4∶水為5∶2∶1∶12，V/V)顯色檢測洗脫液，收集含RuBP的洗脫液(與磷試劑反應(yīng)顯淡黃色，然后再用酶法進(jìn)一步鑒定，進(jìn)行酶反應(yīng)時，需將洗脫液用NaOH調(diào)至pH值為7.6左右)，用飽和Ba(OH)2調(diào)至pH值為6.5，每升收集液中加入乙酸鋇10g，無水乙醇300ml，于冰箱中靜置2小時，以5000×g離心使其沉淀完全，收集沉淀，用80%乙醇洗滌3-4次，冰凍干燥即獲RuBP二鋇鹽，整個純化過程都在4℃下進(jìn)行。RuBP二鋇鹽與等當(dāng)量的Na2SO4在冷水中充分?jǐn)嚢杌旌希?500×g離心沉淀，將上清液冰凍干燥真空干燥，然后用無水甲醇∶丙酮為1∶4體積比的混合液洗滌，再用冰凍丙酮洗滌多次，冰凍真空干燥獲得RuBP四鈉鹽。
本方法所獲得的產(chǎn)品RuBP四鈉鹽，經(jīng)酶法分析，不穩(wěn)定磷測定，波譜分析、紙層析分析，結(jié)果表明有效含量在90%以上，符合生化試劑要求，不含無機(jī)磷及共軛雙鍵的任何雜質(zhì)，也不含R5P及Ru5P等糖磷酸酯。
權(quán)利要求
1.從植物葉片直接提取1.5-二磷酸核酮糖(RuBP)方法以新鮮植物葉片為原料，經(jīng)酸提取、鋇鹽沉淀、陰離子交換層析純化等步驟，其特征在于新鮮植物葉片先進(jìn)行強(qiáng)光照并隨即于-40℃以下速凍，破碎后加酸直接提取RuBP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的方法，其特征在于所說的浸提液為含8%三氯乙酸和5%甲酸混合液，加入量約兩倍于葉重。
全文摘要
本方法以新鮮植物葉片為原料，最宜是胡蘿卜葉片，經(jīng)強(qiáng)光照處理并隨即低溫冷凍固定，破碎后用酸浸提，鋇鹽沉淀、陰離子交換層析純化等步驟而獲得，產(chǎn)品有效含量在90％以上，符合生化試劑要求，不含無機(jī)磷及共軛雙鍵的任何雜質(zhì)，也不含R
文檔編號C07H1/08GK1043718SQ8910791
公開日1990年7月11日 申請日期1989年10月11日 優(yōu)先權(quán)日1989年10月11日
發(fā)明者寧正祥, 李明啟 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)