一種甲基化egcg的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用超臨界流體色譜與反相高效液相色譜相結(jié)合的方法分離制備化學(xué)合成的甲基化EGCG粗產(chǎn)物，其是以EGCG為底物，硫酸二甲酯為甲基化試劑，采用化學(xué)方法合成甲基化EGCG，利用反相高效制備液相色譜與超臨界流體色譜對化學(xué)合成粗產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分離制備，得到EGCG4″Me、3′,4″-di-O-methyl-EGCG和4′,4″-di-O-methyl-EGCG三種甲基化EGCG單體，產(chǎn)品的純度達(dá)到97%以上。
【專利說明】一種甲基化EGCG的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化合物制備領(lǐng)域，具體地說，涉及一種甲基化EGCG的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]二十世紀(jì)90年代末期，日本研究者最早成功從臺灣凍頂烏龍中分離鑒定出兩種具有抗過敏功能的新型兒茶素衍生物，其分子結(jié)構(gòu)為(-)_表沒食子兒茶素-3-0(4-0-甲基)沒食子酸酯(EGCG4" Me)和(_)_表沒食子兒茶素-3-0(3-0-甲基)沒食子酸酯(EGCG3" Me)。隨著這兩種甲基化EGCG的出現(xiàn)，人們對甲基化EGCG的化學(xué)合成、酶法合成以及EGCG在老鼠和人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了更深入的研究，發(fā)現(xiàn)了更多的甲基化EGCGJM目前對于甲基化EGCG藥理功效的研究主要集中在EGCG4" Me和EGCG3" Me。
[0003]過敏性疾病是發(fā)病率較高的一種常見病，可嚴(yán)重地影響到患者的生活質(zhì)量、工作、學(xué)習(xí)效果，也會(huì)因此造成經(jīng)濟(jì)損失。日本約有三分之一以上的人對花粉過敏。隨著人們飲食習(xí)慣的改變，生活和工作壓力的增大，環(huán)境污染，過敏性疾病在全界范圍內(nèi)呈逐年增加的趨勢，已成為全世界各國政府部門高度關(guān)注的全球健康問題之一。世界變態(tài)反應(yīng)組織(WorldAllergy Organization, WA0)在世界首個(gè)過敏性疾病日(2005年7月8日)公布了對30個(gè)國家進(jìn)行過敏性疾病病學(xué)的調(diào)查結(jié)果表明:在這些國家12億人口中，22%(2.5億人)患有免疫球蛋白E (IgE)介導(dǎo)的過敏性疾病，如花粉過敏、過敏性鼻炎、結(jié)膜炎、哮喘、濕疹、藥物過敏、食物過敏等，世界衛(wèi)生組織(WHO)將過敏性疾病列為“21世紀(jì)重點(diǎn)研究和預(yù)防的疾病”。
[0004]目前治療過敏性疾病的藥物多為化學(xué)合成藥，如變態(tài)反應(yīng)介質(zhì)阻釋劑、抗組胺藥、激素類藥等，這些化學(xué)合成藥副作用大，價(jià)格高。由于生活環(huán)境的改變，過敏患者數(shù)量劇增，然而過敏性疾病的治療需要長期堅(jiān)持，希望開發(fā)對人體沒有副作用的食品或保健品使過敏癥狀減輕，因此迫切需要研究從天然植物中開發(fā)高效、低毒、副作用小的天然抗過敏藥物或保健品，此舉措已成為世界開發(fā)天然抗過敏新藥劑和保健食品的重要研究方向，避免了西藥復(fù)發(fā)率高、不去根、作用環(huán)節(jié)單一、`有不良反應(yīng)等缺點(diǎn)。然而，EGCG3" Me和EGCG4" Me對抗過敏，尤其是花粉過敏具有非常顯著地效果。
[0005]自從日本研究者發(fā)現(xiàn)Benifuuki綠茶和臺灣凍頂烏龍茶中含有EGCG4" Me和EGCG3" Me以來，Benifuuki茶葉在日本市場上的售價(jià)是其他茶葉的2~3倍且供不應(yīng)求，EGCG4" Me和EGCG3〃Me純品售價(jià)高達(dá)每毫克1800元人民幣。國際醫(yī)藥與保健品行業(yè)均認(rèn)為甲基化EGCG非常有可能發(fā)展為一個(gè)獨(dú)立茶樹品種，成為新的兒茶素經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)而為社會(huì)帶來巨額財(cái)富。但富含EGCG4〃Me和EGCG3〃Me的茶樹品種甚少，含量也非常低，特別是EGCG4" Me在多個(gè)茶樹品種中未檢出，面對這種形式，為了開展更多有關(guān)甲基化EGCG功效研究，亟需一種高效制備甲基化EGCG的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種甲基化EGCG的制備方法。[0007]技術(shù)方案如下:
[0008]一種甲基化EGCG的制備方法，包括如下步驟:
[0009]S1.將EGCG:硫酸二甲酯=K2CO3按摩爾比為1:2.5:10的比例加入到錐形瓶中，加入丙酮溶液，氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣體，超聲波超聲2~5小時(shí)，過濾，真空濃縮，乙酸乙酯萃取，濃縮冷凍干燥，得到甲基化EGCG粗產(chǎn)物，采用分析型高效液相色譜對粗產(chǎn)物進(jìn)行分析，超聲5小時(shí)粗產(chǎn)物的色譜圖如圖1所示；
[0010]S2.利用反相高效制備液相色譜與超臨界流體色譜對甲基化EGCG粗產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分離制備，得到EGCG4 " Me、3 '，4 " -d1-One thy 1-EGCG、4'，4" -d1-O-methy1-EGCG 三種甲基化 EGCG 單體。
[0011]進(jìn)一步地,所述步驟S2包括:
[0012]S21.將步驟SI得到的甲基化EGCG粗產(chǎn)物用甲醇溶解，0.45 μ m濾膜過濾，利用反相高效制備液相色譜進(jìn)行分離制備，分別收集各個(gè)色譜峰，參考標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰，真空濃縮干燥，得到 EGCG4 " Me 單體與 3'，4 " -d1-0-methyl-EGCG 和 4'，4 " -d1-0-methyl-EGCG的混合物；
[0013]S22.將混合物溶解后采用超臨界流體色譜進(jìn)行分離精制，收集2個(gè)色譜峰，濃縮干燥，得到 3'，4" -d1-O-methyl-EGCG 單體和 4'，4" -d1-O-methyl-EGCG 單體。
[0014]更進(jìn)一步地，所述步驟S21反相高效制備液相色譜進(jìn)行分離制備的色譜條件為:流動(dòng)相為乙腈-水溶液，梯度洗脫程序?yàn)?0~2 Imin，B泵乙腈維持15%，21~23min，15%B線性升至20%B，保持7min后于2min內(nèi)降至15%B ;流速15-100mL/min ;檢測波長265nm ;柱溫 30°C ;進(jìn)樣量 500-2000 μ L0
[0015]之后，收集反相高效制備液相色譜各個(gè)色譜峰，色譜圖見圖2，以分析型高效液相色譜進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間(保留時(shí)間)進(jìn)行比對，確定I號峰為EGCG (化合物Α)、2號峰為EGCG4" Me(化合物B)，3號峰為未知混合物，是甲基化EGCG粗產(chǎn)物的化合物C和化合物D。將收集的各個(gè)色譜峰進(jìn)行真空濃縮干燥與HPLC分析，HPLC的色譜條件如下:
[0016]色譜柱:WelchromC18 (250mmX 4.6mm5 μ m)；
[0017]色譜條件:流動(dòng)相為KH2PO4磷酸緩沖液(0.02mol/L, pH=2.5)-乙腈溶液，梯度洗脫程序:0~15min，B泵乙腈維持13%，15~25min，13%B線性升至20%B，保持15min后于2min內(nèi)降至13%B ;流速:1.0mL/min ;進(jìn)樣量10 μ L ;波長265nm ;柱溫30。。。
[0018]作為優(yōu)選，所述步驟S21反相高效制備液相色譜進(jìn)行分離制備的色譜柱為:Shimadzu PRC-ODS C18反相色譜柱，內(nèi)徑20_50臟，長度250臟。
[0019]更進(jìn)一步地，所述步驟S22超臨界流體色譜進(jìn)行分離精制的色譜條件為:柱溫350C ;檢測波長214nm ;流動(dòng)相:二氧化碳/乙醇=50/50 ;循環(huán)時(shí)間:13.6min ;流速:120mL/min ;背壓:IOOBar ;單針進(jìn)樣量:60mg。
[0020]之后，收集2個(gè)色譜峰，濃縮干燥，其色譜圖如圖3所示，采用UV、HPLC-MS,NMR對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定與分析，鑒定其分別為3 '，4 " -d1-0-methyl-EGCG、4'，4 " -d1-0-methyl-EGCG,純度達(dá)到97%以上，分別對應(yīng)于圖1中的化合物C和化合物D0
[0021]作為優(yōu)選，所述步驟S22超臨界流體色譜進(jìn)行分離精制的色譜柱為:CHIRALPAKAD-H 制備型手性異構(gòu)柱:Daicel, 250mmX 50mm, 5 μ m。[0022]本發(fā)明的有益效果在于:
[0023]1、本發(fā)明首次采用超臨界流體色譜分離制備甲基化EGCG ；
[0024]2、產(chǎn)品的純度達(dá)到97%以上；
[0025]3、本發(fā)明采用化學(xué)方法合成甲基化EGCG，利用反相高效制備液相色譜和超臨界流體色譜相結(jié)合的方法對合成的粗產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到高含量的甲基化EGCG。工藝穩(wěn)定性好，不需采用其他中間步驟。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發(fā)明化學(xué)合成甲基化EGCG粗產(chǎn)物的HPLC圖譜；其中:峰A為EGCG、峰B為 EGCG4" Me、峰 C 為 3'，4" -d1-0-methyl-EGCG、峰 D 為 4'，4" -d1-0-methyl-EGCG0
[0027]圖2為本發(fā)明粗產(chǎn)物的高效制備液相色譜圖；其中:峰I為EGCG (化合物A)、峰 2 為 EGCG4 " Me (化合物 B)、峰 3 為峰 3 '，4 " -d1-0-methyl-EGCG (化合物 C)和4'，4" -d1-0-methyl-EGCG (化合物 D)混合物。
[0028]圖3為本發(fā)明超臨界流體色譜分離的化合物C和化合物D的色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0030]實(shí)施例1
[0031]稱取95%的EGCG7.33g、K2C0322.Hg,分別加入丙酮溶液800mL和硫酸二甲酯4mL(密度為1.333g/ mL)，沖入氮?dú)猓暡ǔ?小時(shí)，過濾，真空濃縮，加入350mL乙酸乙酯萃取2次，濃縮冷凍干燥，得到合成的甲基化EGCG粗產(chǎn)物4.94g。
[0032]將粗產(chǎn)物用甲醇溶解，0.45 μ m濾膜過濾，上制備型高效液相色譜，采用如下制備色譜條件:Shimadzu PRC-ODS C18反相色譜柱，內(nèi)徑20mm,長度250mm ;流動(dòng)相為乙腈-水溶液，梯度洗脫程序?yàn)?0~21min，B泵乙腈維持15%，21~23min，15%B線性升至20%B，保持7min后于2min內(nèi)降至15%B ;流速15mL/min ;檢測波長265nm ;柱溫30°C;進(jìn)樣量500 μ L。分別收集各個(gè)色譜峰并與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行比對，峰I為EGCG (化合物A)0.38g，純度為98.8%、峰2為EGCG4" Me (化合物B) 1.53g，純度為98.2%，峰3為未知物化合物C和化合物D的混合物0.24g，利用超臨界流體色譜進(jìn)一步進(jìn)行分離制備。
[0033]采用如下超臨界流體色譜條件:CHIRALPAK AD-H制備型手性異構(gòu)柱(Daicel，250mmX50mm,5ym);流動(dòng)相:二氧化碳/乙醇=50/50 ;柱溫35 °C ;檢測波長214nm ;循環(huán)時(shí)間:13.6min ；流速:120mL/min ；背壓:IOOBar ;單針進(jìn)樣量:60mg。分別收集2個(gè)色譜峰，濃縮干燥，采用UV、HPLC-MS, NMR對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定與分析，鑒定其分別為3'，4" -di_0-methyl-EGCG(化合物C)0.057g，純度為 97.6%、4'，4" -d1-0-methyl-EGCG(化合物D) 0.164g，純度為98.1%。
[0034]實(shí)施例2
[0035]稱取95%的EGCG13.75g、K2C0341.45g，分別加入丙酮溶液1500mL和硫酸二甲酯
7.5mL(密度為1.333g/mL)，沖入氮?dú)猓暡ǔ?小時(shí)，過濾，真空濃縮，加入500mL乙酸乙酯萃取2次，濃縮冷凍干燥，得到合成的甲基化EGCG粗產(chǎn)物9.31g。
[0036]將粗產(chǎn)物用甲醇溶解，0.45 μ m濾膜過濾，上制備型高效液相色譜，采用如下制備色譜條件:Shimadzu PRC-ODS C18反相色譜柱，內(nèi)徑30mm,長度250mm ;流動(dòng)相為乙腈-水溶液，梯度洗脫程序?yàn)?0~21min，B泵乙腈維持15%，21~23min，15%B線性升至20%B，保持7min后于2min內(nèi)降至15%B ;流速40mL/min ;檢測波長265nm ;柱溫30°C;進(jìn)樣量1000 μ L。分別收集各個(gè)色譜峰采用分析型高效液相色譜對其進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行比對，峰I為EGCG (化合物Α) 0.64g，純度為97.5%、峰2為EGCG4" Me (化合物B)
2.61g，純度為98.8%，峰3為未知物化合物C和化合物D的混合物0.58g，利用超臨界流體色譜進(jìn)一步進(jìn)行分離制備。
[0037]采用如下超臨界流體色譜條件:CHIRALPAK AD-H制備型手性異構(gòu)柱(Daicel，250mmX50mm,5ym);流動(dòng)相:二氧化碳/乙醇=50/50 ;柱溫35 °C ;檢測波長214nm ;循環(huán)時(shí)間:13.6min ；流速:120mL/min ；背壓:IOOBar ;單針進(jìn)樣量:60mg。分別收集2個(gè)色譜峰，濃縮干燥，采用UV、HPLC-MS, NMR對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定與分析，鑒定其分別為3'，4" -di_0-methyl-EGCG(化合物C)0.15g，純度為 98.32%、4'，4" -d1-0-methyl-EGCG(化合物D) 0.38g，純度為98.56%。
[0038]實(shí)施例3
[0039]稱取95%的EGCG22.92g、K2C0369.lg，分別加入丙酮溶液3000mL和硫酸二甲酯
12.5mL (密度為1.333g/mL)，沖入氮?dú)?，超聲波超?小時(shí)，過濾，真空濃縮，加入800mL乙酸乙酯萃取2次，濃縮冷凍干燥，得到合成的甲基化EGCG粗產(chǎn)物15.41g。
[0040]將粗產(chǎn)物用甲醇溶解，0.45 μ m濾膜過濾，上制備型高效液相色譜，采用如下制備色譜條件:Shimadzu PRC-ODS C18反相色譜柱，內(nèi)徑50mm,長度250mm ;流動(dòng)相為乙腈-水溶液，梯度洗脫程序?yàn)?0~21min，B泵乙腈維持15%，21~23min，15%B線性升至20%B，保持7min后于2min內(nèi)降至15%B ;流速100mL/min ;檢測波長265nm ;柱溫30°C;進(jìn)樣量2000 μ L。分別收集各個(gè)色譜峰采用分析型高效液相色譜對其進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行比對，峰I為EGCG (化合物Α) 0.84g，純`度為97.9%、峰2為EGCG4 " Me (化合物B)
3.56g，純度為98.6%，峰3為未知物化合物C和化合物D的混合物2.6g，利用超臨界流體色譜進(jìn)一步進(jìn)行分離制備。
[0041]采用如下超臨界流體色譜條件:CHIRALPAK AD-H制備型手性異構(gòu)柱(Daicel，250mmX50mm,5ym);流動(dòng)相:二氧化碳/乙醇=50/50 ;柱溫35 °C ;檢測波長214nm ;循環(huán)時(shí)間:13.6min ；流速:120mL/min ；背壓:IOOBar ;單針進(jìn)樣量:60mg。分別收集2個(gè)色譜峰，濃縮干燥，采用UV、HPLC-MS, NMR對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定與分析，鑒定其分別為3'，4" -di_0-methyl-EGCG(化合物 C)0.78g，純度為 98.1%、4'，4" -d1-0-methyl-EGCG(化合物D) 1.65g，純度為99.1%。
[0042]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種甲基化EGCG的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.將EGCG:硫酸二甲酯:K2C03按摩爾比為1:2.5:10的比例加入到錐形瓶中，加入丙酮溶液，氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣體，超聲波超聲2~5小時(shí)，過濾，真空濃縮，乙酸乙酯萃取，濃縮冷凍干燥，得到甲基化EGCG粗產(chǎn)物； 52.利用反相高效制備液相色譜與超臨界流體色譜對甲基化EGCG粗產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的分離制備，得到 EGCG4" Me、3'，4" -d1-0-methyl_EGCG、4'，4" -d1-O-methyl-EGCG三種甲基化EGCG單體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S2包括: 521.將步驟SI得到的甲基化EGCG粗產(chǎn)物用甲醇溶解，0.45 μ m濾膜過濾，利用反相高效制備液相色譜進(jìn)行分離制備，分別收集各個(gè)色譜峰，參考標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰，真空濃縮干燥，得到 EGCG4" Me 單體與 3'，4" -d1-O-me thy 1-EGCG 和 4'，4" -d1-0-me thy 1-EGCG 的混合物； 522.將混合物溶解后采用超臨界流體色譜進(jìn)行分離精制，收集2個(gè)色譜峰，濃縮干燥，得到 3'，4" -d1-O-methyl-EGCG 單體和 4'，4" -d1-0-methyl-EGCG 單體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟S21反相高效制備液相色譜進(jìn)行分離制備的色譜條件為:流動(dòng)相為乙腈-水溶液，梯度洗脫程序?yàn)?0~21min，B泵乙腈維持15%，21~23min，15%B線性升至20%B，保持7min后于2min內(nèi)降至15%B ;流速15_100mL/min ;檢測波長265nm ;柱溫30°C ;進(jìn)樣量500-2000 μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟S21反相高效制備液相色譜進(jìn)行分離制備的色譜柱為:Shimadzu PRC-ODS C18反相色譜柱，內(nèi)徑20-50mm,長度250mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在`于，所述步驟S22超臨界流體色譜進(jìn)行分離精制的色譜條件為:柱溫35°C ;檢測波長214nm ;流動(dòng)相:二氧化碳/乙醇=50/50 ;循環(huán)時(shí)間:13.6min ;流速:120mL/min ;背壓:IOOBar ;單針進(jìn)樣量:60mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟S22超臨界流體色譜進(jìn)行分離精制的色譜柱為:CHIRALPAK AD-H制備型手性異構(gòu)柱:Daicel，250mmX 50mm，5 μ m。
【文檔編號】C07D311/62GK103864745SQ201410078516
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月5日
【發(fā)明者】李銀花, 劉仲華, 李娟 , 黃建安, 李適, 王英姿 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)