一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的工藝。通過(guò)辛酸結(jié)合PEG生成沉淀，過(guò)濾后經(jīng)離子交換，再進(jìn)一步納米膜過(guò)濾使純化的狂犬免疫球蛋白收率大幅度提高。與傳統(tǒng)的低pH孵化比，大大縮短了時(shí)間。該工藝不但能滅活脂包膜病毒，而且對(duì)非脂包病毒也有非常好的去除效果。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，屬于生物制藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]狂犬人免疫球蛋白屬于血液制品，隨著在臨床上的廣泛應(yīng)用，如何保證血液制品的安全性、預(yù)防和控制經(jīng)血液途徑傳播的疾病，已成為世界醫(yī)藥衛(wèi)生界乃至整個(gè)社會(huì)普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，常用的血液制品滅活法多采用S/D處理和低pH孵化法。然而，S/D處理對(duì)非酯包膜病毒無(wú)效，還會(huì)引起部分蛋白質(zhì)的變性；低PH孵化法對(duì)大多數(shù)非脂包膜病毒滅活能力有限。上述方法均不能滿足目前對(duì)血液制品日益提高的安全標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。目前也有利用辛酸鈉除病毒的報(bào)道，當(dāng)加入的辛酸鈉濃度較高時(shí)，對(duì)滅活病毒有非常好的效果，但是過(guò)高的辛酸鈉濃度會(huì)導(dǎo)致部分免疫球蛋白的變性以及多聚體的產(chǎn)生，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量帶來(lái)很大的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種可降低病毒活性并且保證蛋白高活性、安全可靠的雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法。
[0004]一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征是制備工藝包括以下步驟:
(O將原料血漿消毒后0.3倍稀釋?zhuān)肞H4緩沖液調(diào)pH為7.15^7.25，控制血漿溫度1.5^2.5°C后噴入95%乙醇，乙醇的終濃度按照體積計(jì)為8%，噴入速度小于等于50L/h，再次調(diào)pH至7.2，并攪拌2小時(shí)后離心分離出組分I，離心轉(zhuǎn)速為800(T10000r/min，離心后得到的組分I上清液；
(2)上述步驟得到的組分I上清液調(diào)pH為6.85飛.95，加95%乙醇，乙醇的終濃度按照體積記為20%，噴入速度小于等于50L/h，再次調(diào)pH為6.85~6.95，并攪拌兩小時(shí)后靜置2小時(shí),加入硅藻土,加入量為每1000ml反應(yīng)液加入20kg硅藻土，并攪拌20分鐘，壓力分離出組分II和組分III的沉淀；
(3)上述步驟得到的組分II和組分III沉淀以氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH為5.05飛.15，調(diào)溫度為-0.5、°C，加入95%乙醇至乙醇終濃度按照照體積記為17%，而后攪拌2小時(shí)，靜置6^12小時(shí)，得到充分混合液，將組分混合液壓濾得到組分混合液上清；
(4)上述步驟得到的組分混合液上清液加入辛酸和PEG4000，攪拌2小時(shí)，離心，收集上清液；
(5)上述步驟得到的上清液脫鹽脫醇后超濾濃縮，得到組分混合濃縮液；
(6)上述步驟得到的組分混合濃縮液以凝膠柱進(jìn)行層析提純，得到層析蛋白液；
(7)上述步驟得到的層析蛋白液進(jìn)行透析后，再超濾濃縮，得到層析蛋白濃縮液；
(8)上述步驟得到的層析蛋白濃縮液中加入麥芽糖，調(diào)pH3.8^4.0后加水至最終蛋白質(zhì)量百分含量為5.05%~5.2%，經(jīng)0.2um除菌濾芯過(guò)濾得到免疫球蛋白一級(jí)制品；
(9)上述步驟得到的免疫球蛋白二級(jí)制品再次以水進(jìn)行透析并超濾濃縮得到免疫球蛋白二級(jí)制品濃縮液；
(10)上述步驟得到的免疫球蛋白二級(jí)制品濃縮液按每升l(T30g加入甘氨酸，并調(diào)pH
4. 4.8，得到免疫球蛋白三級(jí)制品；
(11)上述步驟得到的免疫球蛋白三級(jí)制品在無(wú)菌條件下用35~50nm孔徑膜進(jìn)行納米膜過(guò)濾，得到濾過(guò)液；
(12)上述步驟得到的濾過(guò)液調(diào)節(jié)pH6.Ο.4，分裝，得到狂犬人免疫球蛋白。
[0005]所述的一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于上述步驟
(3)中，氯化鈉溶液的使用量為每千克組分II和組分III的沉淀以9L 0.01mol/L氯化鈉溶液溶解，調(diào)PH所用溶液是pH 4的醋酸溶液。
[0006]所述的一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步驟(4)中辛酸的加入量為l(T20mmol，PEG4000的加入量為1%~2%，離心轉(zhuǎn)速為800(T10000r/min。
[0007]所述的一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步驟(5)中脫鹽脫醇超濾濃縮的具體方法為，用5倍體積的2l°C的注射用水透析。
[0008]所述的一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步驟(6)中所用凝膠柱為DEAE-Sepharose-FF凝膠柱。
[0009]所述的一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步驟(11)中，納米膜除病毒的的具體條件為:制品pH為4.4.8，甘氨酸含量為l(T30g/L，蛋白濃度為ll(Tl50g/L，過(guò)濾溫度為18~20°C，過(guò)濾量為230L/1.63 m2，過(guò)濾速度小于等于5L/min，納米膜完整性測(cè)定，濾膜前后起泡點(diǎn)壓力為> 4.5bar/cm2。
[0010]本發(fā)明的有效結(jié)果為:目前狂犬人免疫球白在生產(chǎn)過(guò)程中均采用一種病毒滅活的方式去除殘留病毒，有潛在經(jīng)血液傳播的風(fēng)險(xiǎn)，本發(fā)明提供的雙重病毒滅活制備的狂犬人免疫球蛋白大大降低經(jīng)血液傳播的疾病，制品質(zhì)量完全符合《中和人名共和國(guó)藥典》要求，經(jīng)用偽狂犬病毒、HIV病毒進(jìn)行驗(yàn)證，確實(shí)能夠使其病毒滴度5個(gè)Log以上，完全保障制品更加安全可靠。利用該工藝生產(chǎn)的狂犬人免疫球白相比目前通用的方法來(lái)說(shuō)擁有較高的得率，并且該產(chǎn)品中多聚體含量相對(duì)偏低，能夠保證較高的產(chǎn)品質(zhì)量。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1。
[0012]本品系由含高效價(jià)的狂犬抗體的健康人血漿組分，經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法分離純化，并采用辛酸結(jié)合PEG生成沉淀和納米膜除病毒雙重病毒滅活生產(chǎn)工藝，主要用于預(yù)防和治療狂犬病，尤其適用于對(duì)狂犬抗毒素過(guò)敏者。
[0013]1、血漿合并領(lǐng)出100人份以上合格原料血漿，經(jīng)清潔消毒后融化，融化后的血漿合并于反應(yīng)罐中，并對(duì)反應(yīng)罐中血漿進(jìn)行計(jì)量，反應(yīng)罐中血漿經(jīng)均勻攪拌后取樣，供測(cè)總蛋白含量，白蛋白純度及狂犬抗體。
[0014]2、組分(I + II + III) F I + II + III的制作。
[0015]2.1組分I的制作:血漿用0.14mol/L NaCl稀釋液，稀釋混勻后。用pH4.0醋酸緩沖液調(diào)血漿PH7.2±0.05,降溫至0°C開(kāi)始噴入-15°C以下95%乙醇，使最終乙醇濃度達(dá)到8%，噴入乙醇速度≤50L/h。在噴入乙醇過(guò)程中不得高于0°C，但也不得低于乙醇與制品混合的冰點(diǎn)。制品最終溫度控制在-2.5±0.5°C，復(fù)測(cè)pH并用醋酸緩沖液調(diào)整至pH7.2±0.05.繼續(xù)攪拌2小時(shí)后，分離F I或繼續(xù)進(jìn)行F II+III的沉淀及分離，F(xiàn) I上清用于分離F II + III，F(xiàn) I沉淀用于研發(fā)新產(chǎn)品或高壓滅菌銷(xiāo)毀；
0.14mol/LNaCl 加量(L) = (0.25±0.05) X V 血漿(L)
95% 乙醇加入量(L) =0.095±0.003X (V 血漿 +VNaC1+V 緩沖液)L 醋酸緩沖液加入量為(L)= (2.6±0.5) XV血漿(L)/1000
制品PH測(cè)定:為20°C、生理鹽水稀釋至8%乙醇含量條件下，復(fù)合電極測(cè)點(diǎn)結(jié)果。以下各血漿分級(jí)步驟PH值測(cè)定與此相同。
[0016]2.2組分II +III的制作:F I上清用ρΗ4.0醋酸緩沖液調(diào)pH至6.90±0.05，噴入-15°C以下95%乙醇，使最終乙醇濃度達(dá)到20% (v/v)，噴入乙醇速度< 50L/h，在噴入乙醇過(guò)程中制品溫度始終不得高于_1°C，制品最終溫度控制在-0.5°C ±0.5°C，復(fù)測(cè)pH并用醋酸緩沖液調(diào)整至PH6.9±0.05，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，靜置2小時(shí)后，加入硅藻土，繼續(xù)攪拌30分鐘，壓濾分離出F II +III沉淀和上清，出液出液溫度控制在-4.5土1°C，壓濾壓力控制在(0.1MPa, F II + III上清用于分離F IV -1 ；F II + III沉淀用于生產(chǎn)人免疫球蛋白或_30°C以下保存；
95% 乙醇加入量(升)=0.165±0.005X V 反應(yīng)液(L) +0.27±0.01XV 緩沖液(L)
醋酸緩沖液加入量(L)= (1.0±0.4) XV反應(yīng)液(L)/1000 硅藻土加量(Kg) =25XV反應(yīng)液(L) /1000。
[0017]3、組分III(FIII)的分離:每Kg F I + II +III沉淀以 9L 0.01mol/L NaCl(0~0.5°C)溶解后，計(jì)量體積，加PH4.0醋酸鈉溶液，調(diào)pH5.10±0.05，調(diào)反應(yīng)液溫度(H).5°C，加預(yù)冷至-15°C以下的乙醇至乙醇最終濃度為17%，注意加乙醇速度由慢漸快，控制最終反應(yīng)液溫度為-4.5°C '5.5°C。乙醇滴加完畢，攪拌2小時(shí)，靜置6小時(shí)以上或過(guò)夜，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行壓濾分離，注意控制進(jìn)液速度，先循環(huán)至出液溫度在-4.5± 1.(TC，收集過(guò)濾液，要求濾液清亮’過(guò)濾完后吹干，至17%乙醇沖洗液過(guò)濾,合并濾液收集到過(guò)濾液中,過(guò)濾完后吹干沉淀。沉淀收集、稱(chēng)重后置_30°C冷庫(kù)內(nèi)保存或高壓滅菌后銷(xiāo)毀；收集壓濾后反應(yīng)液，及時(shí)抽入反應(yīng)罐，冷卻后置-3'5°C，制作組分II ；
0.01mol/L氯化鈉溶液加量(L) =組分II +III(Kg) X9 PH4.0醋酸緩沖液(L)= (1.1±0.3) X反應(yīng)液量/1000 95%乙醇加量(L) = (0.218±0.005) X反應(yīng)液量 17%乙醇洗液配置量(L) =F II +III(Kg) X3。
[0018]4、組分混合液上清液加入辛酸和PEG4000，辛酸的加入量為l(T20mmol，PEG4000的加入量為1%~2%，離心轉(zhuǎn)速為800(T10000r/min，加入攪拌2小時(shí)，離心，收集上清液。
[0019]5、脫鹽脫醇濃縮:對(duì)收集的上清液攪拌緩慢加入0.5mol/L鹽酸液，調(diào)節(jié)pH至
3.8^4.0，用5倍體積的2~8°C注射用水透析，透析至乙醇含量< 1%，將蛋白液濃縮至3%以上濃度，抽入不銹鋼制品桶。取樣檢測(cè)蛋白含量。
[0020]6、DEAE-Sepharose-FF 凝膠柱層析提純。
[0021]6.1用0.5mol/L NaOH溶液，調(diào)蛋白液pH=6.4~6.8，用lmol/L PB溶液，調(diào)蛋白液電導(dǎo) 2.1±0.2X IO3 us/cm。[0022]6.2用磷酸鹽緩沖液平衡凝膠柱。
[0023]6.3上樣蛋白液,待IgG蛋白峰剛出現(xiàn)收集芽透蛋白液。
[0024]6.4上樣完成后用磷酸鹽緩沖液沖洗，待IgG峰下降至最高峰的約2/3處，用醋酸鹽緩沖液沖洗層析柱。
[0025]7、透析脫鹽，濃縮:收集層析蛋白液，邊攪拌邊緩慢加入0.5mol/L鹽酸液，調(diào)節(jié)pH至3.8^4.0，用5倍體積的2~8°C注射用水透析，透析至乙醇含量〈0.025%，將蛋白液濃縮至6%以上濃度，抽入不銹鋼制品桶。取樣檢測(cè)蛋白含量。
[0026]8、制作免疫球蛋白一級(jí)制品:將超濾濃縮后的蛋白液加入麥芽糖、調(diào)整pH、補(bǔ)加水使最終制品蛋白含量5.05%~5.2%，麥芽糖10± 1%，pH為3.8~4.0。接著經(jīng)0.2um除菌濾芯過(guò)濾得到免疫球蛋白一級(jí)制品。
[0027]9、制作免疫球蛋白二級(jí)制品:將免疫球蛋白一級(jí)制品再次以5倍體積的2 8 C注射用水透析并超濾濃縮。
[0028]10、制作免疫球蛋白三級(jí)制品:得到的免疫球蛋白二級(jí)制品濃縮液按每升l(T30g加入甘氨酸，并調(diào)PH 4.4^4.8。
[0029]11、35~50nm納米膜過(guò)濾:將配制結(jié)束的制品，轉(zhuǎn)移至百級(jí)除菌間，進(jìn)行納米膜過(guò)濾。過(guò)濾溫度為18~20°C，過(guò)濾量為230L/1.63 m2，過(guò)濾速度小于等于5L/min，納米膜完整性測(cè)定，濾膜前后起泡點(diǎn)壓力為> 4.5bar/cm2。
[0030]12、調(diào)節(jié)pH 6.0.4，然后分裝。
[0031]實(shí)施例2:病毒滅活效果比較。
[0032]通過(guò)下表所示用偽狂犬病毒、HIV病毒、Sindbis病毒、犬細(xì)小病毒進(jìn)行工藝驗(yàn)證可以發(fā)現(xiàn):本發(fā)明的病毒去除效果高于常規(guī)的S/D+DV50納米膜和低pH孵放+DV50納米膜
生產(chǎn)工藝。
【權(quán)利要求】
1.一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征是制備工藝包括以下步驟: (O將原料血漿消毒后0.3倍稀釋?zhuān)肞H4緩沖液調(diào)pH為7.15^7.25，控制血漿溫度1.5^2.5°C后噴入95%乙醇，乙醇的終濃度按照體積計(jì)為8%，噴入速度小于等于50L/h，再次調(diào)pH至7.2，并攪拌2小時(shí)后離心分離出組分I，離心轉(zhuǎn)速為800(T10000r/min，離心后得到的組分I上清液； (2)上述步驟得到的組分1上清液調(diào)pH為6.85飛.95，加95%乙醇，乙醇的終濃度按照體積記為20%，噴入速度小于等于50L/h，再次調(diào)pH為6.85~6.95，并攪拌兩小時(shí)后靜置2小時(shí),加入硅藻土,加入量為每1000ml反應(yīng)液加入20kg硅藻土，并攪拌20分鐘，壓力分離出組分II和組分III的沉淀； (3)上述步驟得到的組分II和組分III沉淀以氯化鈉溶液溶解，調(diào)pH為5.05飛.15，調(diào)溫度為-0.5、°C，加入95%乙醇至乙醇終濃度按照照體積記為17%，而后攪拌2小時(shí)，靜置6^12小時(shí)，得到充分混合液，將組分混合液壓濾得到組分混合液上清； (4)上述步驟得到的組分混合液上清液加入辛酸和PEG4000，攪拌2小時(shí)，離心，收集上清液； (5)得到的上清液脫鹽脫醇后超濾濃縮，得到組分混合液縮液； (6)上述步驟得到的組分混合液縮液以凝膠柱進(jìn)行層析提純，得到層析蛋白液； (7)上述步驟得到的層析蛋白液進(jìn)行透析后，再超濾濃縮，得到層析蛋白濃縮液； (8)上述步驟得到的層析蛋白濃縮液中加入麥芽糖，調(diào)pH3.8^4.0后加水至最終蛋白質(zhì)量百分含量為5.05%~5.2%，經(jīng)0.2um除菌濾芯過(guò)濾得到免疫球蛋白一級(jí)制品； (9)上述步驟得到的免疫球蛋白二級(jí)制品再次以水進(jìn)行透析并超濾濃縮得到免疫球蛋白二級(jí)制品濃縮液； (10)上述步驟得到的免疫球蛋白二級(jí)制品濃縮液按每升l(T30g加入甘氨酸，并調(diào)pH4.4~4.8，得到免疫球蛋白三級(jí)制品； (11)上述步驟得到的免疫球蛋白三級(jí)制品在無(wú)菌條件下用35~50nm孔徑膜進(jìn)行納米膜過(guò)濾，得到濾過(guò)液； (12)上述步驟得到的濾過(guò)液調(diào)節(jié)pH6.Ο.4，分裝，得到狂犬人免疫球蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于上述步驟(3)中，氯化鈉溶液的使用量為每千克組分II和組分III的沉淀以9L 0.01mol/L氯化鈉溶液溶解，調(diào)PH所用溶液是pH為4的醋酸溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步驟(4)中辛酸的加入量為l(T20mmol，PEG4000的加入量為1%~2%，離心轉(zhuǎn)速為8000~10000r/min。
4.如權(quán)利要求1所述的一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步驟(5)中脫鹽脫醇超濾濃縮的具體方法為，用5倍體積的2l°C的注射用水透析。
5.如權(quán)利要求1所述的一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步驟(6)中所用凝膠柱為DEAE-Sepharose-FF凝膠柱。
6.如權(quán)利要求1所述的一種雙重病毒滅活制備狂犬人免疫球蛋白的方法，其特征在于步驟(11)中，納米膜除病毒的的具體條件為:制品pH為4.4^4.8，甘氨酸含量為l(T30g/L，蛋白濃度為ll(Tl50g/L，過(guò)濾溫度為18~20°C，過(guò)濾量為230L/1.63 m2，過(guò)濾速度小于等于5L/min，納米膜完整 性測(cè)定，濾膜前后起泡點(diǎn)壓力為≥4.5bar/cm2。
【文檔編號(hào)】C07K1/16GK103864926SQ201410077239
【公開(kāi)日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月5日
【發(fā)明者】呂獻(xiàn)忠, 蘇峰 申請(qǐng)人:新疆德源生物工程有限公司