制備比伐盧定的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于通過匯聚五個片段的合成方法制備具有下式的20-mer肽的比伐盧定的方法，以及涉及一些它的肽中間體。H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe--Glu-Glu-Ile15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH--?(I)。
【專利說明】制備比伐盧定的方法
[0001]本申請是申請日為2009年12月17日、中國專利申請?zhí)枮?00980152943.3 (國際申請?zhí)枮镻CT / EP2009 / 009080)、發(fā)明名稱為“制備比伐盧定的方法”的發(fā)明專利申請的
分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及新穎的比伐盧定的匯聚合成方法，比伐盧定是具有下式的20-mer肽
[0003]H-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe-Glu—Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH (I)[0004]本發(fā)明還涉及一些作為比伐盧定合成中的中間體的受保護(hù)的肽。
【背景技術(shù)】
[0005]由凝血酶介導(dǎo)的蛋白酶解處理是控制血液凝固的關(guān)鍵。水蛭素是潛在的臨床凝血酶肽抑制劑，其是由65個氨基酸組成。但是也有更短的肽片段已被證明對血栓形成(危及生命的病征)是有效的。
[0006]US5, 196，404公開了比伐盧定，其是這些更短的多肽中的一種，并且是強(qiáng)效的凝血酶抑制劑。比伐盧定也被稱為水蛭肽-8 (hirulog-8)、BG-8967、Ef Iudan> AngiomaX或
者Hirulogk'并具有在式I中給出的氨基酸序列。
[0007]W098 / 50563描述了用于通過重組技術(shù)制備包括比伐盧定的各種肽的方法。所述方法包括表達(dá)作為融合蛋白一部分的肽，然后通過酰基受體使所述肽從所述融合蛋白釋放。
[0008]Okayama 等.Chem.Pharm.Bull.1996,44,1344-1350,和 Steinmetzer 等.Eur.J.Biochem.1999，265，598-605設(shè)計了在王氏樹脂上采用固相合成各種水蛭肽。所述王氏樹脂需要采用濃的三氟乙酸將所述肽從所述樹脂上裂解下來。在用于制備比伐盧定的類似的固相合成方法中，W091 / 02750公開了以下的連續(xù)方法:將單個Boc-保護(hù)的氨基酸連接至Boc-L-亮氨酸-ο-二乙烯苯樹脂，然后通過采用HF /對甲酚/乙基甲基硫酸鹽同時脫保護(hù)和脫除，并且隨后是冷凍干燥和純化。在兩種情況下，從所述樹脂上裂解所述肽需要強(qiáng)酸條件，而強(qiáng)酸條件可能會引起全部的脫保護(hù)并且可能導(dǎo)致不希望的氨基酸殘基的副反應(yīng)，因此負(fù)面影響了產(chǎn)品的純度。此外，在固相合成中通常由氨基酸的錯誤摻入、單個氨基酸的重復(fù)連接(double-hits)和/或外消旋化作用引起副反應(yīng)，并產(chǎn)生具有與所述目標(biāo)肽的結(jié)構(gòu)非常相似的結(jié)構(gòu)的副產(chǎn)物。因此純化方法變得艱巨并導(dǎo)致產(chǎn)率降低。尤其是更長的多肽在仍與固體載體連接時易于采取不規(guī)則的構(gòu)象，這使其更難于連接其它的氨基酸至所述增長的鏈。因此，該問題隨著所述肽的長度增加而變得更為嚴(yán)重。
[0009]W02007 / 033383公開了基于固相合成或固相合成和溶液法合成的組合(混合方法)的用于制備比伐盧定的方法。在一實施方式中，在超酸不穩(wěn)定的樹脂上制備比伐盧定肽序列。在另一實施方式中，通過使側(cè)鏈保護(hù)的N-末端肽片段與側(cè)鏈保護(hù)的C-末端肽片段偶聯(lián)來制備比伐盧定，并且隨后采用強(qiáng)酸條件脫保護(hù)。在這種情況下，所述N-末端片段和所述C-末端片段的前體(即肽序列減去亮氨酸)均由固相合成制備。該策略的一個缺點是大量形成D-Tyrl9-比伐盧定。該雜質(zhì)難以去除，因此需要額外的勞動、成本以及損失產(chǎn)量來獲得純化的產(chǎn)物。另外，在W02007 / 033383的實施例中得到的純化的比伐盧定的量僅在克的范圍內(nèi)，這表明該方法不適于大規(guī)模制備具有良好的純度的比伐盧定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是提供用于工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)的、可克服線性、固相合成的公知的缺點并且更有效合成比伐盧定的方法。已通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法、權(quán)利要求19所述的肽片段和權(quán)利要求29所述的這些肽片段的用途實現(xiàn)該目的。優(yōu)選的實施方式組成了從屬權(quán)利要求2-18和20-28的主題。
[0011]本發(fā)明涉及遵循匯聚方法(即分別合成各片段然后在溶液相中偶聯(lián)以構(gòu)成目標(biāo)肽)的方法。匯聚合成的急待解決的問題是找到合適的片段以及它們的偶聯(lián)順序以克服匯聚合成的公知的缺點。這些缺點是在偶聯(lián)和分離期間的溶解度問題、與固相合成相比更低的反應(yīng)率以及在偶聯(lián)期間所述C-末端片段的更高的外消旋化風(fēng)險。比伐盧定由20個氨基酸殘基組成，以致于存在大量的可能的片段和偶聯(lián)順序。此外，比伐盧定包含有7個氨基酸殘基，即-Arg3-> -Asn9-> -Asp11-、-Glu13-、-Glu14-、-Glu17-和-Glu18-,所有這些氨基酸殘基都具有需要適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)和脫保護(hù)的反應(yīng)性側(cè)鏈官能團(tuán)。所述相同的問題適用于單個片段的N-末端和C-末端的適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)和脫保護(hù)，因此增加了尋找可實現(xiàn)本發(fā)明的目的的路線艱巨性。
[0012] 申請人:意外的發(fā)現(xiàn)通過采用如下文中所描述的[(1+2)+ (3+{4+5})]策略可方便地構(gòu)建式I的比伐盧定。數(shù)字1、2和5代表式V、VI和X的三個肽片段，數(shù)字3代表式XIII的天冬氨酸衍生物以及數(shù)字4代表式XI的苯丙氨酸衍生物。本發(fā)明涉及用于在溶液相中制備式I的比伐盧定的方法，其包括以下步驟:`[0013](a)使其中Pl為保護(hù)基團(tuán)的式(V)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0014]Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID N04) (V)，
[0015]與其中P2為保護(hù)基團(tuán)的式(VI)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0016]H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID N05) (VI)
[0017]反應(yīng)，以制備其中Pl和P2為如上定義的式(VII)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0018]Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID N02)(VII)，
[0019](b)除去在步驟(a)中制備的肽的P2，以制備其中Pl為如上定義的式(II)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0020]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID N02) (II)，
[0021](c)使其中P3為保護(hù)基團(tuán)的式⑴的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0022]H-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID N08)
[0023](X)，
[0024]與其中P4為保護(hù)基團(tuán)的式(XI)的苯丙氨酸
[0025]p4-Phe12-OH (XI)[0026]反應(yīng)，以制備其中P3和P4為如上定義的式(XII)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0027]P4-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID N09) (XII),
[0028](d)除去在步驟(C)中制備的肽的P4，以制備相應(yīng)的式(XII)的N-末端脫保護(hù)的側(cè)鏈保護(hù)的肽，
[0029](e)使在步驟(d)中制備的式XII的肽與其中P5為保護(hù)基團(tuán)的式(XIII)的側(cè)鏈保護(hù)的天冬氨酸反應(yīng)
[0030]P5-Aspn-OH (XIII),
[0031]以制備其中P3和P5為如上定義的式(XIV)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0032]P5-Asp-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID N03) (XIV),
[0033](f)除去在步驟(e)中制備的肽的P5，以制備其中P3為如上定義的式(III)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0034]H-Asp-Phe-Glu-Glu-1 I e15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3
[0035](SEQ ID N03) (III)，
[0036](g)使在步驟(b)中制備的式II的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽與在步驟(f)中制備的式(III)的側(cè)鏈保護(hù)的肽反應(yīng)，以制備其中Pl和P3為如上定義的式(IV)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0037]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID N01)
[0038](IV)，
[0039](h)除去在步驟(g)中制備的肽的P1、P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，以制備式⑴的比伐盧定。
[0040]本發(fā)明的方法可以通過匯聚片段合成而非常高效地合成比伐盧定，這可容易地適用于工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)。
[0041]所述C-末端保護(hù)基團(tuán)P2(針對肽VI)和P3(針對肽X)可以是與其它保護(hù)基團(tuán)的正交性相一致的任意保護(hù)基團(tuán)。適當(dāng)?shù)膶嵤├强赏ㄟ^皂化作用而除去的C-末端保護(hù)基團(tuán)像甲基(Me)或乙基(Et)，或者可通過催化氫化反應(yīng)而除去的C-末端保護(hù)基團(tuán)。
[0042]在本發(fā)明的方法的實施方式中，在步驟(a)中，保護(hù)基團(tuán)Pl是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)，而保護(hù)基團(tuán)P2是可通過催化氫化反應(yīng)除去并且與可選地側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)；在步驟(c)中，保護(hù)基團(tuán)P3是可通過催化氫化反應(yīng)除去的保護(hù)基團(tuán)，而保護(hù)基團(tuán)P4是與式X的肽的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的且與P3正交的保護(hù)基團(tuán)；以及在步驟(e)中，保護(hù)基團(tuán)P5是與式XII和式XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)或者與P3正交的保護(hù)基團(tuán)，提供包括以下步驟的溶液相方法
[0043](a)使其中Pl為對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)的式(V)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0044]Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID N04) (V)，
[0045]與式(VI)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽反應(yīng)
[0046]H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID N05) (VI)，
[0047]其中P2為可通過催化氫化反應(yīng)而除去的并且與可選的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)，
[0048]以制備其中Pl和P2為如 上所述的式(VII)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0049]Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID N02)(VII)，
[0050](b)除去步驟(a)中制備的肽的P2，以制備其中Pl為如上定義的式(II)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0051]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID N02) (II)，
[0052](c)使其中P3為可通過催化氫化反應(yīng)除去的保護(hù)基團(tuán)的式(X)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0053]H-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID N08)
[0054](X)，
[0055]與其中P4為與式X的肽的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的以及與P3正交的保護(hù)基團(tuán)的式(XI)的苯丙氨酸
[0056]p4-Phe12~0H (XI)
[0057]反應(yīng)，以制備其中P3和P4為如上定義的式(XII)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0058]P4-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID N09) (XII),
[0059](d)除去步驟(c)中制備的肽的P4，以制備相應(yīng)的N-末端脫保護(hù)的式(XII)的側(cè)鏈保護(hù)的妝，
[0060](e)使步驟(d)中制備的式XII的肽與式(XIII)的側(cè)鏈保護(hù)的天冬氨酸反應(yīng)
[0061]P5-Aspn-OH (XIII),
[0062]其中P5為與式XII和式XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的以及與P3正交的保護(hù)基團(tuán)，以制備其中P3和P5為如上定義的式(XIV)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0063]P5-Asp-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID N03) (XIV),
[0064](f)除去步驟(e)中制備的肽的P5，以制備其中P3為如上定義的式(III)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0065]H-Asp-Phe-Glu-Glu-1Ie15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID N03) (III),
[0066](g)使步驟(b)中制備的式II的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽與步驟(f)中制備的式
(III)的側(cè)鏈保護(hù)的肽反應(yīng)，以制備其中Pl和P3為如上定義的式(IV)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0067]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe—Glu-Glu-1 Ie15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID N01)
[0068](IV)，(h)除去步驟(g)中制備的肽的P1、P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，以制備式⑴的比
伐盧定
[0069]H-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH (SEQ ID N01)。
[0070]在這里以及下文中，術(shù)語“正交”作為兩個不同的保護(hù)基團(tuán)的行為的描述特征，應(yīng)被理解為是指一個保護(hù)基團(tuán)可通過不會影響另一保護(hù)基團(tuán)的某種方法裂解。例如，“與側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)”是指可通過不會影響所述側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的某種方法裂解的保護(hù)基團(tuán)。
[0071] 該策略的優(yōu)點是其可在工業(yè)規(guī)模上應(yīng)用，因此可制備具有優(yōu)異純度的比伐盧定且每批的制備得到的比伐盧定的數(shù)量為千克級，并且不會形成像D-Phe12-比伐盧定、D-Tyr19-比伐盧定或者Asp9-比伐盧定的不需要的雜質(zhì)。例如，當(dāng)使保護(hù)的片段Asp-Phe12與式X的保護(hù)的肽片段偶聯(lián)時，可形成5% D-Phe12-比伐盧定，而該形成可意外地通過本發(fā)明的方法而抑制。如在本發(fā)明的方法中所應(yīng)用的催化氫化反應(yīng)具有的優(yōu)點是:不像其它脫保護(hù)方法，該催化氫化反應(yīng)是非常干凈的反應(yīng)方法，其不會誘導(dǎo)碳正離子的形成，因此不會形成不需要的從所述碳正離子和目標(biāo)肽之間的反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物。為了比較，在W02007 /033383中公開的路線中是通過采用叔丁基(tBu ;如叔丁基醚或如叔丁基酯)實現(xiàn)保護(hù)，這是僅可通過酸水解(例如采用鹽酸或三氟乙酸)而裂解的保護(hù)基團(tuán)。所述酸水解誘導(dǎo)副產(chǎn)物(例如叔丁酯化的酪氨酸)的形成，由于所述副產(chǎn)物與最終產(chǎn)物的物理化學(xué)性質(zhì)相似，在最終產(chǎn)物中難以除去所述副產(chǎn)物。酸水解的另一個缺點是處理大量的強(qiáng)酸(例如三氟乙酸)，會引發(fā)生產(chǎn)和環(huán)境的安全問題，尤其是在工業(yè)規(guī)模上的生產(chǎn)和環(huán)境的安全問題。
[0072]為了進(jìn)一步比較，如果可通過皂化反應(yīng)除去的C-末端保護(hù)基團(tuán)(例如Et)被用作為用于式VI和式VII的肽的P2，其在堿性條件下的去除會誘導(dǎo)天冬酰胺殘基(-Asn9-)和精氨酸殘基(-Arg3-)大量裂解。即使皂化反應(yīng)不是采用酸或采用堿來完成的，而是采用更溫和的酶促反應(yīng)的方法(例如采用枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行皂化反應(yīng))來完成，也可觀察到由所述天冬酰胺殘基的裂解而引起Asp9-比伐盧定的大量形成。
[0073]在本發(fā)明的各單個反應(yīng)步驟之前、期間和之后，所有的肽片段以及所有的偶聯(lián)產(chǎn)物可以本身的形式或以適當(dāng)?shù)柠}形式存在，這取決于所述分子的物理化學(xué)性質(zhì)和/或反應(yīng)條件。合適的鹽為例如與三乙胺(TEA)、二環(huán)己胺(DCHA)、鹽酸(HCl)和三氟乙酸(TFA)形成的鹽。
[0074]在步驟(h)中，P1、P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)可在以后或者同時被除去。
[0075]優(yōu)選地，在步驟(h)中，首先同時除去P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，然后除去P1。
[0076]通常，在進(jìn)行下一步驟之前會將步驟(a)至(g)中的每一個步驟之后得到的肽片段進(jìn)行分離。 申請人:意外的發(fā)現(xiàn)在步驟(h)中，在同時除去P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)后得到的肽的分離在除去Pl之前可以被免除，而得到相似的收率并且對純度不產(chǎn)生負(fù)面影響。這是令人驚訝的，因為正常情況下分離步驟是必不可少的以除去副產(chǎn)物，所述副產(chǎn)物可能也在下一步脫保護(hù)步驟反應(yīng)并因此降低目標(biāo)肽的純度。由于分離通常必然伴隨有產(chǎn)品的損失，因此這個發(fā)現(xiàn)對整個方法 的成本和時間具有積極的影響，并且通常產(chǎn)生更高產(chǎn)量的Pl-脫保護(hù)的肽。因此，在本發(fā)明所述的方法的更優(yōu)選的實施方式中，在步驟(h)中，在同時除去P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)后得到的肽在除去Pl之前不進(jìn)行分離。
[0077]任意公知的對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)可用作為P1。合適的實施例為叔丁氧基擬基(Boc)、2-( 二苯基-4-基)丙_2-基氧基擬基(Bpoc)、2-(3, 5- 二甲氧基苯基)丙-2-基氧基擬基(Ddz)、荷-9-基甲氧基擬基(Fmoc)、金剛燒-1-氧基擬基(Adc)、叔-戍基氧基羰基(Aoc)、二苯基氧膦基(Dpp)、2-(甲磺?；?乙氧基羰基(Msc)和鄰苯二甲酰基(Pht)。優(yōu)選地，Pl 為 Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc,更優(yōu)選地 Pl 為 Boc。
[0078]任意分別與式II的片段(針對P4)、式XIII的氨基酸和式XIV的片段(針對P5)的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的以及與P3正交的公知的合適的保護(hù)基團(tuán)可用作為保護(hù)基團(tuán)P4和P5。優(yōu)選地，P4和P5對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定并與側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交以及與P3正交。例如，合適的保護(hù)基團(tuán)是 Boc、Bpoc、Ddz> Fmoc> Adc> Aoc> Dpp> Msc 和 Pht。優(yōu)選地，P4 和 / 或 P5是 Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc ;更優(yōu)選地 P4 和 / 或 P5 是 Boc。
[0079]在本發(fā)明所述的方法的一優(yōu)選實施方式中，P1、P4和P5中的至少一個是Boc、Bpoc、Ddz> Fmoc或Msc ;優(yōu)選P1、P4和P5中的至少一個是Boc。
[0080]任意可通過催化氫化反應(yīng)除去的公知的保護(hù)基團(tuán)可用作為保護(hù)基團(tuán)P3。合適的實施例是芐基(Bzl)、芐基氧基甲基(Bom)、苯甲?；?Pac)、4_硝基芐基(ONbz)、4_吡啶基甲基(Pic)以及4-磺酸基芐基。優(yōu)選地，P3是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基芐基，條件是如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz, P3不是Bom。更優(yōu)選地，P3是Bzl。保護(hù)基團(tuán)Bom是對酸敏感的，而保護(hù)基團(tuán)Boc、Bpoc和Ddz由酸裂解，即Bom與Boc、Bpoc或Ddz是不正交的。在這里和下文中，這個行為排除了同時采用Bom和保護(hù)基團(tuán)Boc、Bpoc或Ddz中之一。
[0081]任意可通過催化氫化反應(yīng)除去的一以及在側(cè)鏈保護(hù)的情況下，同時與側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的——公知的保護(hù)基團(tuán)可用作為保護(hù)基團(tuán)P2。合適的實施例是Bzl、Bom、Pac,ONbz、Pic和4-磺酸基芐基。優(yōu)選地，P2是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基芐基；更優(yōu)選地，P2是Bzl。
[0082]在一優(yōu)選實施方式中，P2和P3中的至少一個是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4_磺酸基芐基，條件是，如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz，P3不是Bom。優(yōu)選地，P2和P3中的至少一個是Bzl。
[0083]在更優(yōu)選的實施方式中，P1、P4和P5中的至少一個是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc ；并且
[0084]P2和P3中的至少一個是Bzl、Bom、Pac、0Nbz、Pic或4-磺酸基芐基，條件是，如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom。優(yōu)選地，PU P4和P5中的至少一個是Boc而P2和P3中的至少一個是Bzl。
[0085]優(yōu)選地，在本發(fā)明所述的方法中，采用選自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基芐基的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)中的至少一種保護(hù)所述式II1、IV、X和XI1-XIV的側(cè)鏈保護(hù)的肽/氨基酸；條件是，如果P4或P5是Boc、Bpoc或Ddz，沒有一個所述側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是Bom。
[0086]具體地，在本發(fā)明所述的方法中，采用至少一個Bzl作為側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)保護(hù)式
II1、IV、X和XI1-XIV的側(cè)鏈保護(hù)的肽/氨基酸。
[0087]通常式V的肽是采用諸如硝基的合適的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)在精氨酸殘基側(cè)鏈保護(hù)的，以避免不需要的副反應(yīng)。通常，式VI的肽是采用合適的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)在天冬酰胺殘基側(cè)鏈保護(hù)的，特別是采用Fomc對N-末端保護(hù)，以避免不需要的副反應(yīng)。合適的實施例是三苯甲基(Trt)，尤其是采用Fomc對N-末端保護(hù)的情況下。
[0088]意外地， 申請人:發(fā)現(xiàn)對于式V和VI的肽，可以免除側(cè)鏈保護(hù)，這使得它們的組裝和它們的偶聯(lián)產(chǎn)物(式VII的肽)的C-末端脫保護(hù)變得更為容易。這個發(fā)現(xiàn)允許不考慮C末端和側(cè)鏈保護(hù)之間的正交，因而使得所述路線更為簡單。另一個優(yōu)點是相應(yīng)的未保護(hù)的起始原料在購買時比保護(hù)的起始原料更便宜，這特別是對于大規(guī)模生產(chǎn)是重要的。
[0089]優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，在步驟(a)中式V和VI的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽中的至少一種是側(cè)鏈未保護(hù)的。假如肽均是側(cè)鏈未保護(hù)的，在步驟(a)和(b)中得到的式VII和II的肽也是側(cè)鏈未保護(hù)的。
[0090]更優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，
[0091 ] 在步驟(a)中，式V和VI的肽都是側(cè)鏈未保護(hù)的；
[0092]在步驟(c)中，采用選自Bzl、Bom、Pac、0Nbz、Pic和4_磺酸基芐基的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)中的至少一 種保護(hù)式X的肽，優(yōu)選是Bzl，條件是，如果P4和P5是B0C、Bp0C或Ddz，沒有一個所述側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是Bom ；以及
[0093]在步驟(e)中，采用選自Bzl、Bom、Pac、0Nbz、Pic和4_磺酸基芐基的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)保護(hù)式XIII的天冬氨酸衍生物，優(yōu)選是Bzl，條件是，如果P4和P5是Boc、Bpoc或Ddz，沒有一個所述側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是Bom。
[0094]甚至更優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，在步驟(a)中，式V和VI的肽均是側(cè)鏈未保護(hù)的；并且在步驟(C)和(e)中，至少一個側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是Bzl。
[0095]在本發(fā)明的方法的最優(yōu)選的實施方式中，在步驟(C)中，采用五個側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)保護(hù)四個谷氨酸的側(cè)鏈和酪氨酸的側(cè)鏈來保護(hù)式X的肽，因此提供式(Xb)的肽
[0096]H-Glu (0P6) -Glu (0P7) -1le15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (PlO) -Leu20—0P3 (SEQID8) (Xb)，[0097]其中P3是可采用催化氫化反應(yīng)除去的保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地P3是Bzl、Bom、Pac、0Nbz、Pic或4-磺酸基芐基；更優(yōu)選地P3是Bzl ;以及
[0098]P6至PlO中的每一個獨立地選自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4_磺酸基芐基；優(yōu)選地P6至PlO中的每一個是Bzl ;以及
[0099]在步驟(e)中式XIII的側(cè)鏈保護(hù)的天冬氨酸是
[0100]P5-Asp (OPIDi1-OH,
[0101]其中P5是與式XII和XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的以及與P3正交的保護(hù)基團(tuán)；優(yōu)選地P5對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定，并且與所述側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交以及與P3正交；更優(yōu)選地P5是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc ;最優(yōu)選地P5是Boc ;以及Pll是選自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基芐基；優(yōu)選地，Pll是Bzl。
[0102]這里以及下文中，對于C-末端和側(cè)鏈，縮寫“0P [編號]”表示酯(在所述側(cè)鏈和C末端的羧酸都反應(yīng)后)，而縮寫“P[編號]”表示醚。例如，“OBzl”表示芐酯(在與側(cè)鏈或C末端的羧基反應(yīng)后)，而縮寫“Bzl ”表示二甲苯醚(在與例如酪氨酸的酚羥基反應(yīng)后)。
[0103]優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，P1、P4和 P5 是 Boc ;P2、P3、P6、P7、P8、P9、P10 和 Pll是 Bzl ;
[0104]更優(yōu)選地，P1、P4和 P5 是 Boc, P2、P3、P6、P7、P8、P9、PlO 和 Pll 是 Bzl，并且式 V和VI的肽是側(cè)鏈未保護(hù)的，提供包括以下步驟的溶液相方法
[0105](a)使
[0106]Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID N04)
[0107]與
[0108]H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID N05)
[0109]反應(yīng)以制備
[0110]Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID N02)
[0111](b)除去步驟(a)中制備的肽的Bzl以制備
[0112]Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID N02),
[0113](c)使
[0114]H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-1le 1 5 -Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)--T yr (Bzl)-Leu20-OBzKSEQ ID8)
[0115]與
[0116]Boc-Phe12-OH
[0117]反應(yīng)以制備[0118]Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) —Tyr (Bzl) -LeU20-OBzl (SEQ ID N09)，
[0119](d)除去步驟(c)中制備的肽的Boc以制備相應(yīng)的N末端脫保護(hù)的肽，
[0120](e)使步驟(d)中制備的肽與
[0121]Boc-Asp (OBzD11-OH
[0122]反應(yīng)以制備
[0123]Boc-Asp (OBzl) n-Phe_Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl)-Tyr (Bzl)-Leu20-OBzKSEQ ID N03)
[0124](f)除去步驟(e)中制備的肽的Boc以制備
[0125]H-Asp (OBzl) n-Phe_Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzl) -Tyr (Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID N03)
[0126](g)使在步驟(b)中制備的肽與步驟(f)中制備的肽反應(yīng)以制備
[0127]Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10—Asp (OBzl) -Phe-Glu (0BzI) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID N01)，以及
[0128](h)除去在步驟(g)中制備的肽的Boc、C末端保護(hù)的Bzl和所有的側(cè)鏈保護(hù)的Bzl，以制備式I的比伐盧定。
[0129]該優(yōu)選的實施方式是非常簡單的并且不需要復(fù)雜的保護(hù)基團(tuán)策略。
[0130]優(yōu)選地，在步驟(h)中，首先同時除去C末端保護(hù)的Bzl和所有側(cè)鏈保護(hù)的Bzl，得到 N 末端 Boc 保護(hù)的比伐盧定 Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1c1-Asp-Phe-Glu—Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(SEQ ID N01)，并且然后去除 Boc。
[0131]優(yōu)選地，在同時除去C末端保護(hù)的Bzl和所有的側(cè)鏈保護(hù)的Bzl之后得到的N末端Boc保護(hù)的比伐盧定在除去Boc之前不需要分離。
[0132]C末端保護(hù)的基團(tuán)P2、P3以及P6至Pll的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，在它們是可通過催化氫化反應(yīng)去除的情況下，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意催化氫化反應(yīng)的方法來去除。氫化反應(yīng)可通過采用氫元素或采用合適的供氫體(例如甲酸、甲酸銨、1，3-環(huán)己二烯、1，4_環(huán)己二烯或硼燒加合物(例如叔-BuNH2.BH3))來完成。合適的氫化反應(yīng)催化劑為例如貴金屬基氫化反應(yīng)催化劑，尤其是被稱為鉬系金屬(即銠、釕、鈀、鋨、銥和鉬)的金屬。方便地，所述氫化反應(yīng)催化劑是位于例如炭的載體上。根據(jù)所需要的活性，可以使所述氫化反應(yīng)催化劑“中毒”特別是硫化以降低其活性。
[0133]可選地，可以添加合適的共催化劑以支持氫化反應(yīng)。所述共催化劑可以是釩或鑰化合物，例如五氧化二釩(V2O5)、偏釩酸銨(NH4VO3)或鑰酸鈉(Na2MoO4)15
[0134]在一優(yōu)選實施方式中，催化劑被回收，這對于生產(chǎn)成本和環(huán)境均具有積極的影響。對于催化劑的回收，可采用任意適于回收催化劑的處理方法。
[0135]優(yōu)選地，所述去除的步驟(b)和(h)中的至少一個是在溶劑中與氫氣和鈀/炭一起實施的。作為溶劑，可采 用任意可溶解反應(yīng)物的惰性液體溶劑。可采用的溶劑包括鹵代芳香烴(例如氯苯和三氟甲苯)；鹵代烴(例如二氯甲烷和二氯乙烯)；醇(例如甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇和苯甲醇)；鹵代醇(例如2，2，2-三氟乙醇)；羧酸(例如乙酸)；羧酸酯和內(nèi)酯(例如乙酸乙酯、乙酸甲酯和戊內(nèi)酯)；以及包含有雜原子的有機(jī)溶劑(例如N-甲基吡咯烷酮(NMP)或N，N-二甲基甲酰胺(DMF))。所述溶劑可以單獨、或者作為溶劑混合物或者作為與水的混合物來使用。根據(jù)肽片段的溶解度，甚至可以僅采用水作為溶劑。因此，在步驟(b)中的去除可以在僅采用水的溶劑中完成。
[0136]優(yōu)選的溶劑選自DMF、丙酮、乙酸、丙酮和水的混合物以及乙酸和水的混合物。
[0137]在一優(yōu)選實施方式中，所述去除的步驟(b)是在選自DMF、丙酮、水、丙酮和水的混合物的溶劑中進(jìn)行；尤其是在DMF中進(jìn)行的。
[0138]更優(yōu)選地，所述去除的步驟(b)是在DMF中進(jìn)行的。意外地，已發(fā)現(xiàn)在去除步驟(b)中采用的溶劑對最終的比伐盧定的雜質(zhì)分布(impurity profile)有影響。已觀察到，與例如丙酮和水的混合物相比較，DMF是有利的，以至于可以抑制在-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10- (SEQ ID N02)的雙摻入之后的雜質(zhì)的形成。[0139]在另一優(yōu)選實施方式中，所述去除步驟(h)在乙酸或乙酸和水的混合物中進(jìn)行；具體在乙酸和水的混合物中進(jìn)行。
[0140]所述去除步驟(b)和(h)的氫化方法可在大氣壓或超大氣壓下進(jìn)行。通常的壓力為I至lOObar。有利地，采用I至70bar ;具體地采用2至lObar。
[0141]所述去除步驟(b)和(h)的氫化反應(yīng)可在低溫或升高的溫度下進(jìn)行。示例性的溫度為-20°C至70°C。優(yōu)選的溫度是(TC至60°C，而更優(yōu)選的溫度是10°C至40°C。
[0142]本發(fā)明的方法的偶聯(lián)步驟(a)、(c)、(e)和(g)在溶液相中進(jìn)行，并且在采用在肽合成領(lǐng)域中公知的反應(yīng)條件下進(jìn)行。各個側(cè)鏈未保護(hù)的或保護(hù)的肽片段/氨基酸衍生物的偶聯(lián)可采用原位偶聯(lián)試劑可選地作為像鹽酸鹽一樣的鹽來完成，所述原位偶聯(lián)試劑例如為磷鐵(phoshonium)偶聯(lián)試劑或脲(uronium)偶聯(lián)試劑,例如苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)磷鎗六氟磷酸鹽(BOP)、苯并三唑-1-基氧基-三(吡咯烷基)磷鎗六氟磷酸鹽(PyBOP)、0-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲六氟硼酸鹽(HBTU)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟硼酸鹽(HCTU)、0-(6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TCTU)、0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲六氟硼酸鹽(HATU)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TATU)、O-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)以及O-[氰基-(乙氧基羰基)甲基氨基]-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TOTU)、或碳二亞胺偶聯(lián)試劑，例如二異丙基碳二亞胺(DIC)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和水溶的碳二亞胺(WS⑶I)例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)。其它的偶聯(lián)方法采用預(yù)先制備的活性酯(N-羥基丁二酰亞胺(HOSu)和對硝基苯酚(HONp)酯)、預(yù)先制備的對稱的酸酐、不對稱的酸酐例如N-羧酸酐(NCAs)和酰氯(例如酰氟或酰氯)。優(yōu)選的偶聯(lián)試劑是碳二亞胺偶聯(lián)試劑，最優(yōu)選的是DIC或EDC，合適的作為EDC鹽例如EDC.HCl。
[0143]所述偶聯(lián)步驟(a)、(c)、(e)和(g)的反應(yīng)混合物可有利地包含有堿，優(yōu)選叔胺堿，其可以將羧基組分去質(zhì)子化并中和氨基組分的平衡離子，從而促進(jìn)了所述原位反應(yīng)。合適的堿是例如三烷基胺(例如N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)) ;N，N-二烷基苯胺(例如N，N-二乙基苯胺)；2，4，6_三烷基吡啶(例如2，4，6_三甲基吡啶)；以及N-烷基嗎啉(例如N-甲基嗎啉)。特別是，所述反應(yīng)混合物有利地包含有作為堿的TEA或DIPEA。
[0144]所述偶聯(lián)步驟(a)、(C)、(e)和(g)的反應(yīng)混合物還可包含有輔助的親和試劑作為添加劑，這是因為所述輔助的親和試劑在抑制不希望的副反應(yīng)方面有積極作用?？刹捎萌我夤妮o助親和試劑。合適的輔助的親和試劑的實施例是1-羥基苯并三唑(HOBt)、N-羥基丁二酰亞胺(HOSu)、N-羥基-3，4-二氫-4-氧代-1，2，3-苯并三唑(HOOBt)和1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)。優(yōu)選地，所述偶聯(lián)步驟的反應(yīng)混合物還包含有HOBt。
[0145]在一優(yōu)選的【具體實施方式】中，所述偶聯(lián)步驟(a)、(c)、(e)和(g)的偶聯(lián)混合物選自 DIC / HOBt / TEA、EDC / HOBt / DIPEA 和 EDC/HOBt/TEA。
[0146]作為偶聯(lián)步驟(a)、(c)、(e)和(g)的溶劑，可采用可溶解反應(yīng)物的任意惰性液體溶劑?？刹捎玫呐悸?lián)溶劑是水溶性溶劑(例如二甲亞砜(DMSO)、二氧六環(huán)、四氫呋喃(THF)、
1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、N, N- 二甲基甲酰胺(DMF)、N, N- 二甲基乙酰胺(DMA)或它們的任意混合物)；非水溶性溶劑(例如二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯或它們的任意混合物)；以及在水溶性溶劑和非水溶性溶劑之間的任意合適的混合物(包括與水的混合物)。優(yōu)選的溶劑是DMF或DMF和水的混合物。
[0147]所述步驟(d)、(f)和(h)的N-末端脫保護(hù)可采用在肽合成領(lǐng)域中公知的反應(yīng)條件下并根據(jù)保護(hù)基團(tuán)P1、P4和P5的性質(zhì)來進(jìn)行。在保護(hù)基團(tuán)為Boc的情況下，脫保護(hù)可適當(dāng)?shù)夭捎盟?優(yōu)選采用三氟乙酸)來完成，所述酸可單獨使用或者作為與惰性溶劑(例如甲苯、THF或者甲苯和THF的混合物)的混合物而使用。在保護(hù)基團(tuán)是Fmoc的情況下，可通過與堿(有利地與二級胺例如哌啶或二乙胺)反應(yīng)而實現(xiàn)N-末端的脫保護(hù)。通常，N-末端脫保護(hù)可在溶劑中進(jìn)行，所述溶劑可以是不干擾反應(yīng)物的任意溶劑，例如氯代烴例如二氯甲烷；烷基化酰胺和內(nèi)酰胺例如二甲基甲酰胺或1-甲基-2-吡咯烷酮；芳香烴例如甲苯；醚例如THF或它們的任意混合物。優(yōu)選地，所述N-末端Boc基團(tuán)的脫保護(hù)在甲苯或在苯酚、甲苯和THF的混合物中進(jìn)行。
[0148]在步驟(h)制備得到的粗品比伐盧定可采用常規(guī)的方法(例如制備級HPLC或反流分布法)來進(jìn)行純化?？芍貜?fù)進(jìn)行純化步驟。
[0149]可對在步驟( a)至(g)之后得到的肽片段采用相同的方法。
[0150]可根據(jù)在肽化學(xué)中公知的分離方法(例如沉淀或冷凍干燥，冷凍干燥又稱為凍干法)分離式I的最終的比伐盧定。
[0151]式V和VI的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽和式X的側(cè)鏈保護(hù)的肽可采用常規(guī)的肽合成方法來制備，所述常規(guī)的肽合成方法為例如溶液相合成(又名:均相肽合成，縮寫為HPPS)、固相肽合成(SPPS)或稱為混合合成的SPPS和HPPS的組合(又名:混合相肽合成，縮寫為MPPS)。
[0152]在本發(fā)明所述的方法的一實施方式中，通過在前述的方法中采用溶液相合成方法制備式V的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽、式VI的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽和式X的側(cè)鏈保護(hù)的肽中的至少一種。優(yōu)選地，這些肽以相應(yīng)的二肽(即序列模式-D-Phe1-Pro^-Arg3-Pro-'-Gly5-Gly-、-Gly7_Gly-、-Asn9_Gly-、-G1u13-G1u_、-1 le15-Pro_、-GIu17-GIu-或-Tyr19-Leu-)為起始進(jìn)行組裝。所述N-末端保護(hù)基團(tuán)、C-末端保護(hù)基團(tuán)和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及反應(yīng)條件可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，優(yōu)選為與上述相同或者相似。
[0153]具體地，用于在溶液相中制備式(V)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽的方法
[0154]Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID N04) (V)，
[0155]優(yōu)選為側(cè) 鏈未保護(hù)的肽Va，
[0156]其中[0157]Pl是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選Pl是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地Pl是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc,最優(yōu)選地 Pl 是 Boc ；
[0158]所述方法包括以下步驟:
[0159](a)除去式(XVI)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的二肽的P12
[0160]P12-Arg-Pro4-0P13 (XVI),
[0161]優(yōu)選為側(cè)鏈未保護(hù)的二肽XVIa，
[0162]其中
[0163]P12是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選P12是與側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的和與P13正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P12是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的并且與側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的和與P13正交的保護(hù)基團(tuán)，甚至更優(yōu)選地P12是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc,最優(yōu)選地P12是Boc ；以及
[0164]P13是例如為Bzl、甲基(Me)或乙基(Et)的保護(hù)基團(tuán)；優(yōu)選地P13是可通過催化氫化反應(yīng)除去的并且與側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P13是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P13是Bzl ;
[0165]條件是如果P12是Boc、Bpoc或Ddz,那P13不是Bom ；
[0166](b)使在步驟(a)中制備的N-末端脫保護(hù)的、可選地側(cè)鏈保護(hù)的二肽，優(yōu)選相應(yīng)的側(cè)鏈未保護(hù)的二肽，與式(XVII)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的二肽反應(yīng)
[0167]Pl-D-Phe1-Pro-Off (XVII),
[0168]優(yōu)選與側(cè)鏈未保護(hù)的二肽XVIIa反應(yīng)，
[0169]其中
[0170]Pl為如上定義，且W是氫或預(yù)活化的基團(tuán)例如五氟苯基(Pfp)，
[0171]以制備式(XV)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0172]Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-0P13(SEQ ID N04) (XV),
[0173]優(yōu)選所述側(cè)鏈未保護(hù)的肽XVa，
[0174]其中
[0175]Pl和P13為如上定義，以及
[0176](c)除去在步驟(b)中制備的式XV的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽的P13，優(yōu)選側(cè)鏈未保護(hù)的肽XVa，以制備式V的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽；優(yōu)選制備側(cè)鏈未保護(hù)的肽Va。
[0177]還具體地，用于在溶液相中制備式(VI)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽優(yōu)選為側(cè)鏈未保護(hù)的肽VIa的方法
[0178]H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-0P2 (SEQ ID N05) (VI),
[0179]其中
[0180]P2是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選P2是可通過催化氫化反應(yīng)除去的并且與可選的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P2是Bz1、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P2是 Bzl ;
[0181]所述方法包括以下步驟:
[0182](a)除去式(XVIII)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的二肽優(yōu)選為側(cè)鏈未保護(hù)的二肽XVIIIa的P14
[0183]P14-Asn-Gly10-0P2 (XVIII),
[0184]其中[0185]P14是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選P14是與側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的和與P2正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P14是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的并且與側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的和與P2正交的保護(hù)基團(tuán)，甚至更優(yōu)選地P14是Boc、Bpoc、Ddz> Fmoc或Msc,最優(yōu)選地P14是Boc ；以及
[0186]P2為如上定義；
[0187]條件是，如果？14是80(3、8口0(:或0(^，那么P2不是Bom ；
[0188](b)使在步驟(a)中制備的N-末端脫保護(hù)的、可選地側(cè)鏈保護(hù)的二肽，優(yōu)選側(cè)鏈未保護(hù)的二肽，與式(IXX)的四甘氨酸反應(yīng)P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH(SEQ ID N010)(IXX)，
[0189]其中
[0190]P15是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地P15是與式XX的肽的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P15是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的并且與式XX的肽的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)，甚至更優(yōu)選地P15是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc,最優(yōu)選地P15是Boc ；
[0191]以制備式(XX)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0192]P15-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID N05) (XX),
[0193]優(yōu)選所述側(cè)鏈未保護(hù)的肽XXa，
[0194]其中
[0195]P2和P15為如上定義，
`[0196]條件是,如果P15是Boc、Bpoc或Ddz,那么P2不是Bom以及
[0197](c)除去在步驟(b)中制備的式XX的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽優(yōu)選側(cè)鏈未保護(hù)的肽XXa的P15，以制備式VI的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽；優(yōu)選制備側(cè)鏈未保護(hù)的肽Via。
[0198]進(jìn)一步具體地，用于在溶液相中制備式(X)的側(cè)鏈保護(hù)的肽的方法
[0199]H-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID N08)
[0200]⑴，
[0201]優(yōu)選為式(Xb)的肽
[0202]H-Glu (0P6) -Glu (0P7) -1le15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (PlO) —Leu20-OP3 (SEQID8) (Xb)，
[0203]其中
[0204]P3是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選P3是可通過催化氫化反應(yīng)除去的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P3是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P3是Bzl，和
[0205]P6至PlO中的每一個獨立地選自Bzl、Bom、Pac、0Nbz、Pic和4-磺酸基芐基，優(yōu)選地P6至PlO的每一個是Bzl，
[0206]所述方法包括以下步驟:
[0207](a)除去式(VIII)的側(cè)鏈保護(hù)的肽的P16
[0208]P16-Glu-Glu-Ty-Leu20-OP3(SEQ ID N06) (VIII),
[0209]優(yōu)選為式(VIIIb)的肽的P16
[0210]P16-Glu(0P8)-Glu (0P9)-Tyr (PlO)-Leu2C1-0P3 (SEQ ID N06)
[0211](VIIIb),
[0212]其中
[0213]P3和P8至PlO為如上定義，以及[0214]P16是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選P16是與側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的和與P3正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P16是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的并且與側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的和與P3正交的保護(hù)基團(tuán)，甚至更優(yōu)選地P16是Boc、Bpoc、Ddz> Fmoc或Msc,最優(yōu)選地P16是Boc ；
[0215]條件是，如果？16是此(:、8?0(3或0(^，那么P3不是Bom ；
[0216](b)使在步驟(a)中制備的式VIII的N-末端脫保護(hù)的、側(cè)鏈保護(hù)的二肽，優(yōu)選相應(yīng)的肽Vlllb，與式(IX)的側(cè)鏈保護(hù)的肽反應(yīng)
[0217]P17-Glu-Glu-1Ie15-Pro-OH(SEQ ID N07) (IX)，
[0218]優(yōu)選為
[0219]P17-Glu(0P6)-Glu (0P7)-1Ie15-Pro-OH(SEQ ID N07) (IXb)，
[0220]其中
[0221]P6和P7為如上定義，以及
[0222]P17是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地P17是與側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P17是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的并且與側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)，甚至更優(yōu)選地P17是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc 或 Msc,最優(yōu)選地 P17 是 Boc ；
[0223]以制備式(XXI)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0224]P17-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID N08)
[0225](XXI)，
[0226]優(yōu)選為式(XXIb)的肽
[0227]P17-Glu (0P6) -Glu (0P7) -1le15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) —Tyr (PlO) -Leu20-OP3 (SEQ ID8) (XXIb)，
[0228]其中
[0229]P3、P6至PlO和P17為如上定義，
[0230]條件是，如果P17是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3或P6至PlO中的任一個不是Bom，以及
[0231](c)除去在步驟(b)中制備的式XXI的側(cè)鏈保護(hù)的肽優(yōu)選為相應(yīng)的肽XXIb的P17，以制備式X的側(cè)鏈保護(hù)的肽；優(yōu)選制備肽Xb。
[0232]在本發(fā)明所述的方法的另一實施方式中，所述肽中的至少一種選自式V的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽、式VI的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽和式X的側(cè)鏈保護(hù)的肽，其是通過在前述的方法中采用溶液相合成方法制備。因此，可采用包括公知的SPPS構(gòu)建塊和SPPS條件的任意公知SPPS方法?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且可用于制備保護(hù)的肽的所有的樹脂。這里，應(yīng)以寬的方式解釋樹脂。因此，術(shù)語“樹脂”應(yīng)理解為是指例如單獨的固體載體或直接連接至連接子的固體載體，可選地在兩者之間選擇。樹脂可以是不可溶解的或可溶解的?？扇芙獾木酆衔锞垡叶?可溶解的PEG聚合物)是可溶解的樹脂固體載體的示例，因此在組裝所述各單個構(gòu)建塊之后形成可溶解的肽-樹脂。優(yōu)選的樹脂是具有三苯甲基或溴二苯甲基的聚苯乙烯基樹脂。三苯甲基樹脂的示例是2-氯三苯甲基氯化物樹脂(CTC樹脂)、三苯甲基氯化物樹脂、4-甲基三苯甲基氯化物樹脂和4-甲氧基三苯甲基氯化物樹脂。優(yōu)選地，所述CTC樹脂用于合成所述肽片段。
[0233]本發(fā)明的另一個目的是提供作為本發(fā)明所述的方法中的中間體的有用的肽。具體地，這些肽中的一種是選自以下的肽[0234](i)式(V)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0235]Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID N04) (V)，
[0236]其中Pl是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地Pl是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地Pl是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc,最優(yōu)選地Pl是Boc ；以及
[0237]所述肽是采用例如硝基的合適的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)在精氨酸殘基上可選地側(cè)鏈保護(hù)的；
[0238](ii)式(VI)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0239]H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID N05) (VI)，
[0240]其中P2是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地P2是可通過催化氫化反應(yīng)除去的并且與可選地側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P2是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P2是Bzl ;以及
[0241]所述肽是采用例如三苯甲基(Trt)的合適的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)在天冬酰胺殘基上可選地側(cè)鏈保護(hù)的；
[0242](iii)式(VII)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0243]Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID N02)(VII)，
[0244]其中P1、P2和可選的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及P1、P2和可選的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選定義為如上定義；
`[0245](iv)式(IIa)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0246]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID N02)(IIa)，
[0247]其中Pl和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及Pl和可選的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選定義為如上定義，
[0248]除了 Boc-D-Phel-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)—Gly10-OH 中Pbf是五甲基二氫苯并呋喃磺?；约癟rt是三苯甲基外。所述肽已在W02007 / 033383中公開作為在CTC樹脂進(jìn)行固相合成的產(chǎn)物。與之相反，本發(fā)明所述的式IIa的側(cè)鏈保護(hù)的肽可通過不同的方法合成，即通過溶液相合成方法合成；
[0249](V)式(IIb)的側(cè)鏈未保護(hù)的肽
[0250]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID N02)(IIb)，
[0251]其中Pl和Pl的優(yōu)選定義為如上定義；
[0252](vi)式⑴的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0253]H-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID N08)
[0254](X)，
[0255]其中P3是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地P3是可通過催化氫化反應(yīng)除去的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P3是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P3是Bzl ;以及
[0256](各)所述側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)是至少一種合適的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地選自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4-磺酸基芐基，更優(yōu)選地為Bzl ；
[0257](vii)式(XII)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0258]P4-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID N09)[0259](XII),
[0260]其中P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及P3和可選地側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選定義為如上所定義；以及
[0261]P4是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地P4是與式X的肽的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的和與P3正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P4是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc,最優(yōu)選地P4是Boc,條件是,如果P4是Boc、Bpoc 或 Ddz,那么 P3 不是 Bom ；
[0262]或
[0263]P4 是氫；[0264](viii)式(XIV)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0265]P5-Asp-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID N03) (XIV),
[0266]其中P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及P3和可選地側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選定義為如上所定義；
[0267]以及
[0268]P5是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地P5是與式XII和式XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的和與P3正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P5是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最優(yōu)選地P5是Boc,條件是,如果P5是Boc、Bpoc或Ddz,那么P3不是Bom,
[0269]除了Fmoc-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -1le15-Pro—Glu (OtBu) -Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Leu2c1-OtBu中tBu是叔丁基以外。所述肽已在W02007 / 033383中公開作為在前體肽(即肽序列減去Leu)和H-Leu-OtBu之間的反應(yīng)的產(chǎn)物。如在W02007 / 033383中公開的所述前體肽已在前述步驟中通過在CTC樹脂上固相合成而形成。在與H-Leu-OtBu反應(yīng)后，所述公開的肽在繼續(xù)進(jìn)行下一步驟之前不進(jìn)行分離。與之相反，本發(fā)明所述的式XIV的側(cè)鏈保護(hù)的肽可通過不同的方法合成，即通過溶液相合成方法合成，并且在其合成之后進(jìn)行對其分離；
[0270](ix)式(III)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0271]H-Asp-Phe-Glu-Glu-1Ie15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID N03) (III),
[0272]其中P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及P3和可選地側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選定義為如上所定義，除了 H-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -1le15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu)-Leu20-OtBu以外。所述肽已在W02007 / 033383中被公開。其是上述的N-末端脫保護(hù)的肽。因此，如上所述，它的合成的方法與本發(fā)明的式III的側(cè)鏈保護(hù)的肽不同；
[0273]以及
[0274](X)式(IV)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0275]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp-Phe—Glu-Glu-1 Ie15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID N01)
[0276](IV)，
[0277]其中P1、P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及P1、P3和可選地側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選定義為如上所定義，
[0278]除了 Boc-D-Phel-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)—Gly10-Asp (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-1le15-Pro—Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu 以外。所述肽已在 W02007 / 033383 中被公開為在 Boc-D-Phel-Pro-Arg(Pbf)-Pro--Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt) -Glyic1-OH和 H-Asp (OtBu) -Phe—Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -1le15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu (它們均已在上文有描述)偶聯(lián)后得到的產(chǎn)物。因此，它的偶聯(lián)產(chǎn)物的合成方法與本發(fā)明的式IV的側(cè)鏈保護(hù)的肽的合成方法不同。
[0279]在一優(yōu)選實施方式中，式V的肽是側(cè)鏈未保護(hù)的并且具有下式
[0280]Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID N04)，其包括比伐盧定的位置 1-4 的氨基酸序列。
[0281]在另一優(yōu)選實施方式中，式VI的肽是側(cè)鏈未保護(hù)的并且具有下式
[0282]H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID N05)，其包括比伐盧定的位置 5-10的氨基酸序列。[0283]在另一優(yōu)選實施方式中，式VII的肽是側(cè)鏈未保護(hù)的并且具有下式
[0284]Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID N02),
[0285]其包括比伐盧定的位置1-10的氨基酸序列。
[0286]在另一優(yōu)選實施方式中，式IIb的側(cè)鏈未保護(hù)的肽是
[0287]Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID N02)，
[0288]其包括比伐盧定的位置1-10的氨基酸序列。
[0289]在另一優(yōu)選實施方式中，式X的側(cè)鏈保護(hù)的肽是
[0290]H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) —Tyr (Bzl) -Leu20-OBzI (SEQ ID N08)，
[0291]其包括比伐盧定的位置13-20的氨基酸序列。
[0292]在另一優(yōu)選實施方式中，式XII的側(cè)鏈保護(hù)的肽是
[0293]Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) —Tyr (Bzl) -LeU20-OBzl (SEQ ID N09)，或
[0294]H-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) —Tyr (Bzl) -Leu20-OBzKSEQ ID N09)，
[0295]其均包括比伐盧定的位置12-20的氨基酸序列。
[0296]在另一優(yōu)選實施方式中，式XIV的側(cè)鏈保護(hù)的肽是
[0297]Boc-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzl) -Tyr (Bzl)-Leu20-OBzKSEQ ID N03),
[0298]其包括比伐盧定的位置11-20的氨基酸序列。
[0299]在另一優(yōu)選實施方式中，式III的側(cè)鏈保護(hù)的肽是
[0300]H-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzl) -Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID N03)，
[0301]其包括比伐盧定的位置11-20的氨基酸序列。
[0302]在另一優(yōu)選實施方式中，式IV的側(cè)鏈保護(hù)的肽是
[0303]Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10—Asp (OBzl) -Phe-Glu (0BzI) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID N01)，
[0304]其包括比伐盧定的位置1-20的氨基酸序列。
[0305]在另一方面，本發(fā)明涉及選自以下組的肽
[0306]⑴式(V)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽[0307]Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID N04) (V),
[0308]其中Pl是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地Pl是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地Pl是Boc、Bpoc、Ddz> Fmoc或Msc ;最優(yōu)選地Pl是Boc ；以及
[0309]所述肽是采用例如硝基的合適的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)在精氨酸殘基上可選地側(cè)鏈保護(hù)的；
[0310]優(yōu)選地，所述肽V是側(cè)鏈未保護(hù)的并且具有下式
[0311]Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID N04)；
[0312](ii)式(VI)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0313]H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID N05) (VI),
[0314]其中P2是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地P2是可通過催化氫化反應(yīng)除去的并且與可選的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P2是Bz1、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P2是Bzl ;以及
[0315]所述肽是采用例如三苯甲基(Trt)的合適的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)在天冬酰胺殘基上可選地側(cè)鏈保護(hù)的；
[0316]優(yōu)選地，所述肽VI是側(cè)鏈未保護(hù)的并且具有下式
[0317]H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID N05)；
[0318](iii)式(VII)的`可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0319]Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2 (SEQ ID N02)(VII)，
[0320]其中P1、P2和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及P1、P2和可選地側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選定義為如上所定義；
[0321]優(yōu)選地，所述肽VII是側(cè)鏈未保護(hù)的并且具有下式
[0322]Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID N02)；
[0323](iv)式(IIa)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0324]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID N02)(IIa)，
[0325]其中Pl和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及Pl和可選地側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選定義為如上所定義，
[0326]除了 Boc-D-Phel-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)—Gly10-OH 以外，其中Pbf是五甲基二氫苯并呋喃磺酰基和Trt是三苯甲基。所述肽已在W02007 /033383中公開作為在CTC樹脂進(jìn)行固相合成的產(chǎn)物。與之相反，本發(fā)明所述的式IIa的側(cè)鏈保護(hù)的肽可通過不同的方法合成，即通過溶液相合成方法合成；
[0327](V)式(IIb)的側(cè)鏈未保護(hù)的肽
[0328]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID N02)(IIb)，
[0329]其中Pl以及Pl的優(yōu)選定義為如上所定義；
[0330]優(yōu)選地，式IIb的側(cè)鏈未保護(hù)的肽是
[0331]Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID N02)；
[0332](vi)式⑴的側(cè)鏈保護(hù)的肽[0333]H-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID N08)
[0334](X)，
[0335]其中P3是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地P3是可通過催化氫化反應(yīng)除去的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P3是Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic或4-磺酸基芐基，最優(yōu)選地P3是Bzl ;以及
[0336]所述(各)側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)優(yōu)選地選自Bzl、Bom、Pac、ONbz、Pic和4_磺酸基芐基，更優(yōu)選地為Bzl ；
[0337]優(yōu)選地，式X的側(cè)鏈保護(hù)的肽是
[0338]H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) —Tyr (Bzl) -Leu20-OBzI (SEQ ID N08)；
[0339](vii)式(XII)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0340]P4-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID N09) (XII),
[0341]其中P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及P3和可選地側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選定義為如上所定義；以及
[0342]P4是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地P4是與式X的肽的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的和與P3正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P4是Boc、Bpoc、Ddz> Fmoc或Msc,最優(yōu)選地P4是Boc,
[0343]條件是，如果P4是Boc、Bpoc或Ddz，那么P3不是Bom ；
[0344]或
[0345]P4 是氫；
[0346]優(yōu)選地，式XII的側(cè)鏈保護(hù)的肽是
[0347]Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) —Tyr (Bzl) -LeU20-OBzl (SEQ ID N09)，或
[0348]H-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) —Tyr (Bzl) -Leu20-OBzKSEQ ID N09)；
[0349](viii)式(XIV)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0350]P5-Asp-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3(SEQ ID N03) (XIV),
[0351]其中P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及P3和可選地側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選定義為如上所定義；
[0352]以及
[0353]P5是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選地P5是與式XII和式XIII的肽/氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的和與P3正交的保護(hù)基團(tuán)，更優(yōu)選地P5是Boc、Bpoc、Ddz、Fmoc或Msc，最優(yōu)選地P5是Boc,條件是,如果P5是Boc、Bpoc或Ddz,那么P3不是Bom,
[0354]除了Fmoc-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -1le15-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Leu2c1-OtBu中tBu是叔丁基以外。所述肽已在W02007 / 033383中公開作為前體肽(即肽序列減去Leu)和H-Leu-OtBu之間的反應(yīng)的產(chǎn)物。如在W02007 / 033383中公開的所述前體肽已在前述步驟中通過在CTC樹脂上固相合成而形成。在與H-Leu-OtBu的反應(yīng)后，所述公開的肽在繼續(xù)進(jìn)行下一步之前不進(jìn)行分離。在與H-Leu-OtBu反應(yīng)后，所述公開的肽在繼續(xù)進(jìn)行下一步驟之前不進(jìn)行分離。與之相反，本發(fā)明所述的式XIV的側(cè)鏈保護(hù)的肽可通過不同的方法合成，即通過溶液相合成方法形成，并且在其形成之后對其進(jìn)行分離；[0355]優(yōu)選地，式XIV的側(cè)鏈保護(hù)的肽是
[0356]Boc-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzl) -Tyr (Bzl)-Leu20-OBzKSEQ ID N03)；
[0357](ix)式(III)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0358]H-Asp-Phe-Glu-Glu-1 Ie15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID N03)
[0359]其中P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及P3和可選地側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選定義為如上所定義，
[0360]除了H-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -1le15-Pro—Glu (OtBu) -Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Leu2c1-OtBu以外。所述肽已在W02007 / 033383中公開。它是上述的N-末端脫保護(hù)的肽。因此，如上所述，它的合成的方法與本發(fā)明的式III的側(cè)鏈保護(hù)的肽不同；[0361 ] 優(yōu)選地，式III的側(cè)鏈保護(hù)的肽是
[0362]H-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzl) -Tyr(Bzl)-Leu20-OBzl (SEQ ID N03)；
[0363]以及
[0364](X)式(IV)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
[0365]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OP3 (SEQ ID N01) (IV)，
[0366]其中P1、P3和側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)以及P1、P3和可選地側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的優(yōu)選定義為如上所定義，
[0367]除了 Boc-D-Phel-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt)—Gly10-Asp (OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-1le15-Pro—Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Leu20-OtBu 以外。所述肽已在 W02007 / 033383 中公開為在 Boc-D-Phe1-Pro-Arg (Pbf)-Pro-Gly5-GIy-Gly-Gly-Asn(Trt)-Gly10-OH 和 H-Asp (OtBu)-Phe—Glu(OtBu)-Glu(OtBu) -1le15-Pro-GIu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (tBu) -Leu20-OtBu (它們均已在上文有描述)偶聯(lián)后得到的產(chǎn)物。因此，它的偶聯(lián)產(chǎn)物的合成方法與本發(fā)明的式IV的側(cè)鏈保護(hù)的肽的合成方法不同；
[0368]優(yōu)選地，式IV的側(cè)鏈保護(hù)的肽是
[0369]Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10—Asp (OBzl) -Phe-Glu (0BzI) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID N01)；
[0370]作為合成式⑴的比伐盧定的中間體的應(yīng)用
[0371]H-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glyi0-Asp-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu20-OH(SEQ ID N01) (I)。
[0372]本發(fā)明還涉及用于制備式I的比伐盧定的方法，所述方法包括以下步驟
[0373](a)使其中Pl為保護(hù)基團(tuán)的式(IIc)的肽
[0374]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID N02)(He)，
[0375]與其中P3和P6至Pll中的每一個是Bzl的式(IIIc)的肽反應(yīng)
[0376]H-Asp (OPll) -Phe-Glu (0P6) -Glu (0P7) -1le15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) -Tyr (PlO)-Leu20-OP3 (SEQ ID N03) (IIIc)，
[0377]以制備得到其中P1、P3和P6至Pll為如上定義的式(IVc)的肽[0378]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp (OPll) -Phe-Glu (0P6)-Glu (0P7) -1le15-Pro-Glu (0P8) —Glu (0P9) -Tyr (PlO) -Leu20-OP3 (SEQ ID N01) (IVc)；(b)除去步驟(a)中制備的肽的側(cè)鏈和C-末端的保護(hù)基團(tuán)P3和P6至Pll ;以及
[0379](c)除去步驟(b)中制備的肽的N-末端保護(hù)基團(tuán)Pl以制備得到式I的比伐盧定。
[0380]本發(fā)明的方法可以通過匯聚片段合成方法高效合成比伐盧定，其易于適用于工業(yè)化生產(chǎn)。而且，該用于制備比伐盧定的路線是非常簡單的并且不需要采用復(fù)雜的保護(hù)基團(tuán)策略。此外，可選擇各種構(gòu)建塊(片段)以避免或減少在組裝期間的外消旋化作用。
[0381]在本發(fā)明的各單個反應(yīng)之前、期間和之后，所有的片段以及所有的偶聯(lián)產(chǎn)物可以本身的形式或以適當(dāng)?shù)柠}形式存在，這取決于所述分子的物理化學(xué)性質(zhì)和/或反應(yīng)條件。合適的平衡離子為例如與三乙胺(TEA)、二環(huán)己胺(DCHA)、鹽酸(HCl)和三氟乙酸(TFA)的鹽形式。
[0382]可采用任意的對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)作為保護(hù)基團(tuán)P1，所述任意的對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)例如為叔丁氧基羰基(Boc)、芴-9-基甲氧基羰基(Fmoc)、
2-(3，5- 二甲氧基苯基)丙烷-2-基氧基擬基(Ddz)、金剛烷基-1-氧基擬基(Adc)(adamantly-1-oxycarbonyl)、叔-戍基氧基羰基(Aoc)、二苯基氧膦基(Dpp)、2_(甲磺?；?乙氧基羰基(Msc)和鄰苯二甲?；?Pht)。優(yōu)選地，保護(hù)基團(tuán)Pl為Boc、Fmoc或Ddz。
[0383]優(yōu)選地，保護(hù)基團(tuán)P3和P6至Pll是芐基(Bzl)。這里以及下文中，縮寫“OBzl”表示芐酯(在與側(cè)鏈或C末端的羧基反應(yīng)后)，而縮寫“Bzl”表示二甲苯醚(在與例如酪氨酸的酚羥基反應(yīng)后)。
[0384]可采用在肽合成領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件進(jìn)行步驟(a)至(C)。
[0385]優(yōu)選在溶液中進(jìn)行偶聯(lián)和脫保護(hù)步驟(a)、(b)和(C)。
[0386]針對偶聯(lián)步驟(a)，優(yōu)選采用DMF作為溶劑。第一個脫保護(hù)步驟(b)優(yōu)選在乙酸和/或水中進(jìn)行，而第二個脫保護(hù)步驟(C)優(yōu)選在甲苯中進(jìn)行。
[0387]在一優(yōu)選實施方式中，采用HOBt、EDC.HCl和TEA的組合完成偶聯(lián)步驟(a)。
[0388]在一優(yōu)選實施方式中，采用氫氣和鈀/炭進(jìn)行所述第一個脫保護(hù)步驟(b)。
[0389]在一優(yōu)選實施方式中，采用TFA進(jìn)行所述第二個脫保護(hù)步驟(C)。
[0390]在步驟(C)后得到的粗制的產(chǎn)物可通過常規(guī)方法(例如制備級HPLC、反流分布法或等效的方法)進(jìn)行純化。如果步驟(a)和(b)后得到的中間體需要純化，可采用相同的方法進(jìn)行純化。
[0391]可采用常規(guī)的肽合成方法(例如溶液相合成法(HPPS)或固相合成法(SPPS))制備保護(hù)的肽片段IIc和IIIc。在SPPS的情況下，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并可用于制備保護(hù)的肽的所有的樹脂。在本文中，應(yīng)以寬的方式解釋樹脂。因此，術(shù)語“樹脂”應(yīng)理解為是指例如單獨的固體載體或直接連接至連接分子的固體載體，可選地在兩者之間進(jìn)行選擇。樹脂可以是不可溶解的或可溶解的。所述可溶解的聚合物聚乙二醇是可溶解的樹脂固體載體的示例。優(yōu)選的樹脂是具有三苯甲基或溴二苯甲基的聚苯乙烯基樹脂。三苯甲基樹脂的示例是2-氯三苯甲基氯化物樹脂(CTC樹脂)、三苯甲基氯化物樹脂、4-甲基三苯甲基氯化物樹脂和4-甲氧基三苯甲基氯化物樹脂。優(yōu)選地，所述CTC樹脂用于合成包含有游離羧基官能團(tuán)的片段。
[0392]在一優(yōu)選實施方式中，采用溶液相合成法制備所述保護(hù)的肽片段IIc和IIIc。[0393]本發(fā)明的另一個目的是提供作為本發(fā)明所述的方法中的中間體的有用的肽。具體地，這些肽中的一種是式IVc的保護(hù)的肽，其中Pl是保護(hù)基團(tuán)；優(yōu)選地Pl是Boc或H ;以及P3 和 P6 至 Pll 是 Bzl。
[0394]作為本發(fā)明的方法中的中間體的特別有用的另一個肽是式IIc的N-末端保護(hù)的肽，其中Pl是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選Pl是Boc。
[0395]在另一方面，本發(fā)明還涉及用于制備其中Pl為Boc的式(IIc)的N-末端保護(hù)的肽的方法
[0396]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID N02)(He)，其包括:
[0397](a)除去式(Vc)的肽的C-末端保護(hù)基團(tuán)
[0398]Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-0P13(SEQ ID N04) (Vc),
[0399]其中Pl是Boc而P13是諸如Bzl、甲基(Me)或乙基(Et)的保護(hù)基團(tuán)；優(yōu)選地P13是 Bzl ;
[0400]以得到其中P13是H的式Vc的N-末端保護(hù)的、C-末端未保護(hù)的肽；
[0401](b)除去其中P15是Boc的式(VIc)的肽的N-末端保護(hù)基團(tuán)P15_Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzKSEQ ID N05) [0402](VIc)，
[0403]得到其中P15為H的式VIc的C-末端保護(hù)的、N-末端未保護(hù)的肽；
[0404](c)使在步驟(a)中制備的其中P13是H的式Vc的肽與在步驟(b)中制備的其中P15是H的式VIc的肽反應(yīng)，得到其中Pl是Boc的式(VIIc)的肽
[0405]Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID N02)(VIIc)；
[0406]以及
[0407](d)除去在步驟(C)中制備的肽的C-末端保護(hù)基團(tuán)，以得到式IIc的N-末端保護(hù)的肽。
[0408]可采用肽合成領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件進(jìn)行步驟(a)至(d)。
[0409]優(yōu)選在溶液中進(jìn)行偶聯(lián)和脫保護(hù)步驟(a)、(b)、(C)和⑷。
[0410]針對偶聯(lián)步驟(C)，優(yōu)選采用DMF作為溶劑。第一個脫保護(hù)步驟(a)優(yōu)選在丙酮中進(jìn)行，而第二個脫保護(hù)步驟(b)優(yōu)選在甲苯和/或THF中進(jìn)行。第三個脫保護(hù)步驟(d)優(yōu)選在選自DMF、丙酮、水、丙酮和水的混合物的溶劑中進(jìn)行。
[0411]在一優(yōu)選實施方式中，采用氫氣和鈀/炭進(jìn)行第一個脫保護(hù)步驟(a)。
[0412]在一優(yōu)選實施方式中，采用TFA進(jìn)行第二個脫保護(hù)步驟(b)。
[0413]在一優(yōu)選實施方式中，采用HOBt、DIC和TEA的組合來完成偶聯(lián)步驟(C)。
[0414]在一優(yōu)選實施方式中，采用氫氣和鈀/炭進(jìn)行第三個脫保護(hù)步驟(d)。
[0415]在步驟(d)后得到的粗制的產(chǎn)物可通過常規(guī)方法(例如制備級HPLC、反流分布法或等效的方法)進(jìn)行純化。如果步驟(a)、(b)和(C)后得到的中間體需要純化，可采用相同的方法進(jìn)行純化。
[0416]可采用常規(guī)的肽合成方法(例如溶液相合成法(HPPS)或固相合成法(SPPS))制備保護(hù)的肽片段Vc和Vic。在SPPS的情況下，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并可用于制備保護(hù)的肽的所有的樹脂。在本文中，應(yīng)以寬的方式解釋樹脂。因此，術(shù)語“樹脂”應(yīng)理解為是指例如單獨的固體載體或直接連接至連接分子的固體載體，可選地在兩者之間進(jìn)行選擇。樹脂可以是不可溶解的或可溶解的。所述可溶解的聚合物聚乙二醇是可溶解的樹脂固體載體的示例，因此生成可溶解的肽-樹脂的結(jié)合物。優(yōu)選的樹脂是具有三苯甲基或溴二苯甲基的聚苯乙烯基樹脂。三苯甲基樹脂的示例是2-氯三苯甲基氯化物樹脂(CTC樹脂)、三苯甲基氯化物樹脂、4-甲基三苯甲基氯化物樹脂和4-甲氧基三苯甲基氯化物樹脂。優(yōu)選地，所述CTC樹脂用于合成包含有游離羧基官能團(tuán)的片段。
[0417]在一優(yōu)選實施方式中，采用溶液相合成法制備所述保護(hù)的肽片段Vc和Vic。
[0418]本發(fā)明的另一個目的是提供作為用于制備式IIc的N-末端保護(hù)的肽的本發(fā)明所述的方法中的中間體的有用的保護(hù)的肽。具體地，這些肽中的一種是式Vc的C-末端和N-末端保護(hù)的肽，其中P13是保護(hù)基團(tuán)，優(yōu)選是Bzl ;這些肽中的另一種是具有游離C-末端的式Vc的N-末端保護(hù)的肽。
[0419]作為本發(fā)明所述的方法中的中間體的特別有用的另一種肽，是式VIc的C-末端保護(hù)的肽，其中P15是Boc ;或？15是H。
[0420]作為用于制備比伐盧定的方法中的中間體的特別有用的另一種肽是式IIIc的保護(hù)的肽，其中P3和P6至Pll是Bzl。
[0421]在另一方面，本發(fā)明還涉及用于制備其中P3和P6至Pll是Bzl的式(IIIc)的保護(hù)的肽
[0422]H-Asp (OPll) -Phe-Glu (0P6) -Glu (0P7) -1le15-Pro-Glu (0P8) —Glu (0P9) -Tyr (P10)-Leu20-OP3 (SEQ ID N03) (IIIc)，其包括:`[0423](a)除去式(VIIIc)的肽的N_末端保護(hù)基團(tuán)
[0424]P16-Glu(0P8)-Glu (0P9)-Tyr (PlO)-Leu2C1-0P3 (SEQ ID N06)
[0425](VIIIc),
[0426]其中P3 和 P8 至 PlO 是 Bzl 且 P16 是 Boc，
[0427]以得到其中P16是H的式VIIIc的C-末端保護(hù)的、N-末端未保護(hù)的肽；
[0428](b)使在步驟(a)中制備的其中P16是H而P3和P8至PlO是Bzl的式VIIIc的肽與其中P17是Boc而P6和P7是Bzl的式(IXc)的肽反應(yīng)
[0429]P17_Glu(0P6)-Glu (0P7)-1Ie15-Pro-OH(SEQ ID N07)
[0430](IXc)，
[0431]以得到其中P17是Boc而P3和P6至PlO是Bzl的式(Xe)的肽
[0432]P17-Glu (0P6) -Glu (0P7) -1le15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) —Tyr (PlO) -Leu20-OP3 (SEQ ID N08) (Xe)；
[0433](c)除去在步驟(b)中制備的式Xe的肽的N-末端保護(hù)基團(tuán)，其中P3和P6至PlO是 Bzl ;而 P17 是 Boc，
[0434]以得到其中P3和P6至PlO是Bzl而P17是H的式Xe的C-末端保護(hù)的、N-末端未保護(hù)的肽；
[0435](d)使在步驟(C)中制備的其中P17是H而P3和P6至PlO是Bzl的式Xe的肽與式(XI)的保護(hù)的氨基酸反應(yīng)
[0436]Boc-Phe12-OH (XI)，[0437]以得到其中P3和P6至PlO是Bzl而P4是Boc的式(XIIc)的肽
[0438]P4-Phe-Glu (0P6) -Glu (0P7) -1le15-Pro-Glu (0P8) -Glu (0P9) —Tyr (PlO) -Leu20-OP3 (SEQ ID N09) (XIIc)，
[0439](e)除去在步驟(d)中制備的式XIIc的肽的N-末端保護(hù)基團(tuán)，其中P3和P6至PlO 是 Bzl 而 P4 是 Boc，
[0440]以得到其中P3和P6至PlO是Bzl而P4是H的式XIIc的C-末端保護(hù)的、N-末端未保護(hù)的肽；
[0441](f)使在步驟(e)中制備的其中P4是H而P3和P6至PlO是Bzl的式XIIc的肽與其中Pll是Bzl的式(XIIIc)的保護(hù)的氨基酸
[0442]Boc-Asp (0Pll)n-OH (XIIIc)，
[0443]反應(yīng)以得到其中P3和P6至Pll是Bzl的式(XIVc)的肽Boc-Asp (OPll)-Phe-Glu (0P6) -Glu (0P7) -1le15-Pro-Glu (0P8) —Glu (0P9) -Tyr (PlO) -Leu20-OP3 (SEQ ID N03)；
[0444]以及
[0445](g)除去在步驟(f)中制備的肽的N-末端保護(hù)基團(tuán)，以得到式IIIc的C-末端保護(hù)的肽。
[0446]采用肽合成領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件進(jìn)行步驟(a)至(g)。
[0447]優(yōu)選在溶液中進(jìn)行偶聯(lián)和脫保護(hù)步驟(a)至(g)。
[0448]針對偶聯(lián)步驟(b)、`(d)和(f)，優(yōu)選采用DMF作為溶劑。優(yōu)選在作為溶劑的甲苯和THF的混合物中進(jìn)行脫保護(hù)步驟(a)、(c)、(e)和(g)。
[0449]在優(yōu)選的實施方式中，采用H0Bt、EDC ^HCl的組合完成偶聯(lián)步驟(b)、(d)和(f)，而步驟(b)采用堿TEA，步驟(d)和(f)分別采用DIPEA。在另一優(yōu)選的實施方式中，采用TFA和苯酚進(jìn)行脫保護(hù)步驟(a)、(c)、(e)和(g)。
[0450]在步驟(g)后得到的粗制的產(chǎn)物可通過常規(guī)方法(例如制備級HPLC、反流分布法或等效的方法)進(jìn)行純化。如果步驟(a)至(f)后得到的中間體需要純化，可采用相同的方法進(jìn)行純化。
[0451]可采用常規(guī)的肽合成方法(例如溶液相合成法(HPPS)或固相合成法(SPPS))制備保護(hù)的肽片段VIIIc、IXc、XI和XIIIc。在SPPS的情況下，可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并可用于制備保護(hù)的肽的所有的樹脂。在本文中，應(yīng)以寬的方式解釋樹脂。因此，術(shù)語“樹脂”應(yīng)理解為是指例如單獨的固體載體或直接連接至連接分子的固體載體，可選地在兩者之間進(jìn)行選擇。樹脂可以是不可溶解的或可溶解的。所述可溶解的聚合物聚乙二醇是可溶解的樹脂固體載體的示例。優(yōu)選的樹脂是具有三苯甲基或溴二苯甲基的聚苯乙烯基樹脂。三苯甲基樹脂的示例是2-氯三苯甲基氯化物樹脂(CTC樹脂)、三苯甲基氯化物樹脂、4-甲基三苯甲基氯化物樹脂和4-甲氧基三苯甲基氯化物樹脂。優(yōu)選地，所述CTC樹脂用于合成包含有游離羧基官能團(tuán)的片段。
[0452]在一優(yōu)選實施方式中，采用溶液相合成法制備所述保護(hù)的肽片段VIIIc、IXc, XI
和 XIIlCo
[0453]本發(fā)明的另一個目的是提供保護(hù)的肽，所述保護(hù)的肽可用作為用于制備式IIIc的C-末端保護(hù)的肽的本發(fā)明所述的方法中的中間體。具體地，這些肽中的一種是式XIVc的保護(hù)的肽，其中P3和P6至Pll是Bzl。[0454]可特別用作為本發(fā)明的方法中的中間體的另一種肽是式XIIc的側(cè)鏈保護(hù)的肽，其中P3和P6至PlO是Bzl，而P4是Boc保護(hù)基團(tuán)，或P4是H。
[0455]可特別用作為本發(fā)明的方法中的中間體的另一種肽是式Xe的保護(hù)的肽，其中P3和P6至PlO是Bzl，而P17是Boc保護(hù)基團(tuán)，或P17是H。
[0456]可特別用作為本發(fā)明的方法中的中間體的另一種肽是式IXc的保護(hù)的肽，其中P6和P7是Bzl，而優(yōu)選P17是Boc。
[0457]可特別用作為本發(fā)明的方法中的中間體的另一種肽是式VIIIc的保護(hù)的肽，其中P3和P8至PlO是Bzl，而P16是Boc保護(hù)基團(tuán)，或P16是H。
[0458]在另一方面，本發(fā)明還涉及任意上述作為合成比伐盧定中的中間體的肽的應(yīng)用?！揪唧w實施方式】
[0459]以下的非限制的實施例將對本發(fā)明的代表性【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0460]縮寫:
[0461]Boc叔丁氧羰基
[0462]Bzl芐基
[0463]DCCI, 3-二環(huán)己基碳二亞胺
[0464]DCHA二環(huán)己胺
[0465]DCU二環(huán)己基脲
[0466]DIC二異丙基碳二亞胺
[0467]DIPEA N，N-二異丙基乙胺
[0468]DMFN，N-二甲基甲酰胺
[0469]EDC.HCl 1-乙基_3_ (3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽
[0470]equiv.當(dāng)量
[0471]HOBt1-羥基苯并三唑
[0472]MTBE甲基叔丁基醚
[0473]NMMN-甲基嗎啉
[0474]HOPfp 五氟苯酚
[0475]OPfp 五氟苯基酯
[0476]HOSu N-羥基丁二酰亞胺
[0477]SuN- 丁二酰亞胺基
[0478]TEA三乙胺
[0479]TFA 三氟乙酸
[0480]THF四氫呋喃
[0481]實施例1 IrfelI^- H-Asn-Glylfl-OBzl.TFA
[0482]在20 °C向TFA (90L)、甲苯(388L)和THF (45L)的混合物中加入Boc-Asn-Gly-O Bzl (90.20kg ；Hexagon Labs Inc.,美國)。在< 22°C 向得到的混合物中緩慢加入TFA(198L)。在20°C使反應(yīng)完成。通過HPLC監(jiān)測所述裂解的完成。
[0483]然后，緩慢加入THF，并在真空蒸發(fā)所述反應(yīng)混合物。采用甲苯和THF的混合物進(jìn)行三共沸蒸餾。得到H-Asn-Glyltl-OBzI *TFA，為油狀殘留物，用乙酸乙酯稀釋。得到的溶液直接用于下一步化學(xué)步驟(參見實施例3)。收率:100%。純度(HPLC):99.3%。
[0484]實施例2:制各 Boc-Gl V5-Gl v-Gl v-Gl V-OH.TEA (SEQ ID NO I O)
[0485]在20 0C 向 Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OEt(SEQ ID N010) [98.1lkg ；Bonora等，Gazzetta Chimica Italiana1980,110,503-510, analogously prepared fromBoc-Gly-Gly-OH(Senn Chemicals,瑞士)和H-Gly-Gly-OEt *HC1 (Senn ChemicalsJ^fi)]在丙酮(78.44L)和處理過的水(processed water) (491L)的混合物中的懸浮液中緩慢加入TEA(73.1L)。在20°C使反應(yīng)完成。通過HPLC監(jiān)測所述皂化反應(yīng)的完成。
[0486]在真空蒸發(fā)所述溶液，并采用處理過的水調(diào)節(jié)所述殘留物的體積至456L。B0c-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH* TEA (SEQ ID NO 10)的溶液直接用于下一步化學(xué)步驟(參見實施例 3)。收率:100%。純度(HPLC):99.6%0
[0487]實施你I 3:吿1|備 Boc—Gly上一Gly-Gly-Gly-Asn-Glym-OBzI (SEQ ID N05)[0488]在(TC采用TEA調(diào)節(jié)H-Asn-Glyic1-OBzl.TFA(573L，參見實施例1)的乙酸乙酯溶液的pH值至6-6.5。按照實施例2制備得到的Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-OH(SEQ ID NO I O)的溶液冷卻至(TC，并加入上述溶液中，然后加入HOBt (28.52kg)和EDC.HCl (69.81kg)。在(TC用TEA(121L)調(diào)節(jié)pH值至6-6.5。使反應(yīng)混合物升溫至室溫。
[0489]在偶聯(lián)反應(yīng)完成后(在約IOh以后；按HPLC指示)，向所述反應(yīng)混合物中加入NaCl。冷卻得到的懸浮液并過濾得到固體殘留物，用NaCl水溶液洗滌多次，然后冷卻。在真空干燥得到的固體,得到 130.15kg(100% )的 Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1c1--OBzl (SEQ ID N05)，純度為 97.9% (HPLC)。
[0490]實施例4 ^lllH-Glv5-Glv-Glv-Glv-Asn-Glv1fl-OBzl.TFA (SEQ ID N05)
[0491]在≤220C向TFA(131L)、甲苯(525L)和THF(105L)的混合物中緩慢加入Boc-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID N05) (131.20kg，參見實施例 3)。在≤ 22°C 向得到的反應(yīng)混合物中緩慢加入TFA(289L)。所述反應(yīng)在20°C在約1.5h內(nèi)反應(yīng)完成(由HPLC監(jiān)測)。
[0492]真空濃縮得到的反應(yīng)混合物，得到的殘留物倒入二異丙醚中。將得到的懸浮液過濾得到固體，用二異丙醚洗滌所述固體多次，然后在真空干燥得到130.99kg H-Gly5-Gly-GIy-Gly-Asn-Gly10-OBzl.TFA(SEQ ID N05)，純度為 97.9% (HPLC)。
[0493]實施例5 ^lIlH-Arg-Pro-OBzl.2HC1
[0494]在<22°C 向 Boc-Arg-Pro-OBzl.HCl (95.0Okg ；Hexagon Labs Inc.，美國)在乙酸(1910L)和THF(19L)中的懸浮液中緩慢加入鹽酸(IM)在乙酸(380L)中的溶液。(在約I小時后)通過HPLC監(jiān)測裂解反應(yīng)的完成。
[0495]真空濃縮得到的反應(yīng)混合物。首先與乙酸一起進(jìn)行共沸蒸餾，然后與DMF —起進(jìn)行共沸蒸餾。得到呈油狀殘留物的H-Arg-PiO-OBzl.2HC1，用DMF稀釋，得到的體積為約380L。得到的溶液直接用于下一步化學(xué)步驟(參見實施例7)。收率:100%。純度(HPLC):96%。
[0496]實施例6:制備 Boc-D-Phe-pro-OPfp
[0497]在≤24°C 向 Boc-D-Phe-Pro-OH(33.33kg ;Bachem AG,瑞士)在乙酸乙酷(183L)的懸浮液中加入HOPfp (17.78kg)在乙酸乙酯(IOL)中的溶液。在_6°C向得到的反應(yīng)混合物中緩慢加入DCC(21.44kg)在乙酸乙酯(83.3L)中的溶液。然后使得到的混合物升溫至室溫。通過HPLC監(jiān)測偶聯(lián)反應(yīng)的完成(約2h)。
[0498]通過過濾除去DCU鹽并用乙酸乙酯洗滌。在真空蒸發(fā)得到的濾液直到殘留體積達(dá)到約80L。與甲苯一起進(jìn)行多次共沸蒸餾。使得到的油狀殘留物在石油醚中沉淀。過濾得到的固體，用石油醚洗滌并在真空干燥以得到26.3kg (54% ) Boc-D-Phe-Pro-OPfp，純度為99.3% (HPLC) ο
[0499]實施例7 ：制備Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OBzl.HCl (SEQ ID N04)
[0500]在20°C用 DMF(360L)稀釋 H-Arg3-Pro-OBzl.2HC1 (103.0Okg ；561L 溶液；參見實施例5)的溶液。在低于55°C真空蒸發(fā)DMF (82L)。然后在20°C向H-Arg3-Pro-OBzl.2HC1的溶液加入Boc-D-Phel-Pro-OPfp (121.54kg ;參見實施例6)。在(TC采用TEA (58L)調(diào)節(jié)得到的混合物的pH值至6.5。根據(jù)HPLC監(jiān)測的指示，在0°C反應(yīng)約20h，使其反應(yīng)完成。
[0501]過濾掉得到的懸浮液的固體部分，并用DMF洗滌所述固體部分。得到的濾液在真空濃縮直到殘留的體積為約385L。加入去離子水、NaCl和乙酸乙酯的混合物。分離各相，依次用NaHCO3水溶液、Na2CO3水溶液、在食鹽水中的HCl溶液以及最后用食鹽水洗滌得到的有機(jī)相。在真空濃縮有機(jī)相，得到油狀殘留物，通過與甲苯一起共沸蒸餾干燥，并在20°C在二異丙醚中沉淀。過濾得到的懸浮液，得到固體，用二異丙醚洗滌多次，并在真空下干燥，得到 106kg 的 Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-OBzI.HCl (SEQ ID N04)，純度為 96% (HPLC)。
[0502]實施例8:制各 Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH (SEQ ID N04)
[0503]在20°C用 TFA / THF(50 / 50, V / V,0.03L)的混合物調(diào)節(jié) Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OBzl.HCl (SEQ ID N04) (33.58kg，參見實施例7)在丙酮(67L)中的溶液的pH值至
4。向鈀/炭(3.36kg)在丙酮(17L)中的懸浮液中加入得到的混合物。在20°C在3bar氫氣壓力進(jìn)行氫化反應(yīng)至少2h。通過HPLC監(jiān)測氫化反應(yīng)的完成。
[0504]將反應(yīng)混合物經(jīng)過纖維素濾芯過濾。得到的濾餅用丙酮洗滌數(shù)次。合并的濾液在真空下濃縮。通過采用丙酮和甲苯的混合物與得到的油狀殘留物共沸蒸餾而使其干燥。采用乙酸乙酯稀釋得到的油狀殘留物，并倒入二異丙醚中。過濾得到的懸浮液，并用二異丙醚洗滌得到的沉淀多次，在真空下干燥，得到31.4kg的Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ IDN04)，純度為 99.4% (HPLC)。
[0505]實施4歹 1丨 9:吿1|備 Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Glya-Gly-Gly-Gly-Asn—GlylQ-QBzl (SEQ ID N02)
[0506]在≤22?采用 TEA(9L)調(diào)節(jié) H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn_Glylcl-OBzl.TFA(SEQ IDN05) (25.20kg，參見實施例4)在DMF(504L)和去離子水(25L)中的溶液的pH值至6.5_7。在≤ 22°C緩慢加入 Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-OH(SEQ ID N04) (25.46kg,參見實施例 8)和H0Bt(L 02kg)。在≤12°C向得到的反應(yīng)混合物中緩慢加入DIC(9.5L)。在≤12°C采用TEA (0.3L)調(diào)節(jié)得到的混合物的pH值至7-7.5。根據(jù)HPLC和TLC監(jiān)測指示，在10°C反應(yīng)10天直至反應(yīng)完成。
[0507]真空濃縮得到的反應(yīng)混合物，得到油狀殘留物，在乙酸乙酯和二異丙醚的混合物中沉淀。多次除去上清液，并用相同體積的二異丙醚代替。過濾所述混合物得到固體，用二異丙醚洗漆三次，在真空干燥，得到30.50kg (76% )的Boc-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl (SEQ ID N02)，純度為 83.4% (HPLC)。
[0508]實施例 10:制備 Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn—Glylfl-OH (SEQID N02)
[0509]將Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1c1-OBzl (SEQ ID N02)(23.43kg凈肽重量，參見實施例9)在丙酮(43L)和去離子水(9L)的混合物中的溶液加入到鈀/炭(0.75kg)在丙酮(3L)的懸浮液中。在20°C在約3bar氫氣壓力進(jìn)行氫化反應(yīng)Ilh0通過HPLC監(jiān)測氫化反應(yīng)的完成。
[0510]向得到的反應(yīng)混合物加入去離子水(36L)，并且將所述反應(yīng)混合物經(jīng)過纖維素濾芯過濾。得到的濾餅用去離子水和丙酮的2:8混合物洗滌數(shù)次。合并的濾液在真空下濃縮。通過采用DMF和甲苯的混合物與得到的殘留物共沸蒸餾而使其干燥，得到21.5kg的Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH (SEQ ID N02)，純度為 80% (HPLC)。
[0511]實施例 11 A^Boc-Tyr(Bzl)-Leu2n-OBzl[0512]將H-Leu-OBzl.對甲苯磺酸鹽(22.2kg ;Bachem AG,瑞士)懸浮在乙酸乙酯(108L)中，然后在室溫加入 TEA(約 7.1L)。將 Boc-Tyr (Bzl)-OH(20kg ;Senn Chemicals,瑞士)和HOBt (7.3kg)以固體形式加入。在_6°C向得到的混合物中加入DCC(12.2kg)在DMF (40L)中的溶液。通過TLC和HPLC監(jiān)測所述反應(yīng)的完成。
[0513]過濾除去產(chǎn)生的D⑶。依次采用KHSO4水溶液和食鹽水的混合物、KHSO4水溶液、NaHCO3水溶液和食鹽水洗滌得到的濾液。真空蒸發(fā)得到的有機(jī)相。得到的殘留物溶于乙酸乙酯中，然后在石油醚中沉淀。過濾固體，用石油醚洗滌并在真空干燥。在母液溶液真空濃縮并在石油醚中沉淀后再次得到產(chǎn)物。過濾固體，用石油醚洗滌并在真空干燥?；旌蟽纱蔚玫降漠a(chǎn)物，得到 25.9kg(84% )的 Boc-Tyr (Bzl)-Leu2c1-OBzl,純度為 97% (HPLC)。
[0514]實施例12 ^lllH-Tvr(Bzl)-Leu2n-OBzl.TFA
[0515]在20O 向 Boc-Tyr (BzI)-Leu2c1-OBzI (25.9kg,參見實施例 11)、苯酚(1.3kg)、甲苯(104L)和THF(21L)的混合物中緩慢加入TFA (83L)。在20°C反應(yīng)完成。通過HPLC監(jiān)測裂解反應(yīng)的完成。
[0516]在真空蒸發(fā)得到的反應(yīng)混合物。采用甲苯和THF的混合物進(jìn)行共沸蒸餾。然后向殘留物中加入乙酸乙酯和石油醚。過濾固體，用乙酸乙酯和石油醚的混合物洗滌，然后用石油醚洗滌，最后在真空下干燥，得到23.7kg (89% )的H-Tyr(BzI)-Leu2tl-OBzI *TFA，純度為98% (HPLC) ο
[0517]實施例13:制各 Boc-Glu (OBzI)-Glu (OBzI)-Tvr(Bzl)-Leu2n-OBzI (SEQ ID N06)
[0518]向H-Tyr(Bzl)-Leu-OBzl.TFA (23.7kg，參見實施例 12)在 DMF (80L)中的溶液中加入 Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -OSu (42.90kg, Senn Chemicals，瑞士)。在(TC用 DIPEA 緩慢調(diào)節(jié)得到的反應(yīng)混合物的PH值至7-7.5。采用HPLC監(jiān)測偶聯(lián)反應(yīng)的完成。
[0519]真空蒸發(fā)得到的反應(yīng)混合物，并將油狀殘留物倒入處理過的水中。過濾固體，用處理過的水洗滌，在乙腈和處理過的水的混合物中再次制成漿料，最后在真空干燥，得到40.3kg 的 Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID N06)，純度為 92 %(HPLC)。
[0520]實施例14:制各 H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tvr (Bzl)-Leu2n-QBzl.TFA(SEQ IDN06)
[0521]在15°C向TFA(117L)、苯酚(5.87kg)、甲苯(470L)和THF(94L)的混合物中緩慢加Λ Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID N06) (117.45kg，參見實施例13)。在≤17°C向得到的混合物中緩慢加入另外的TFA(282L)。在15°C完成所述反應(yīng)。通過HPLC監(jiān)測裂解反應(yīng)的完成(3h)。
[0522]在低于35°C在真空蒸發(fā)得到的反應(yīng)混合物。通過與甲苯/ THF的混合物共沸蒸餾以及然后與甲苯共沸蒸餾而除去殘留的TFA。向得到油狀的殘留物加入MTBE (825L)。然后，向得到的懸浮液加入石油醚。冷卻后，過濾得到的固體，并用石油醚洗滌多次。在石油醚中再次懸浮并過濾后，用石油醚洗滌得到的固體。再次重復(fù)該操作。然后固體在真空干燥，得到 114.86kg(96% )的 H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu2c1-OBzl.TFA(SEQ IDN06)，純度為 96% (HPLC)。
[0523]實施例15 ^illBoc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-1leU-Pro--OH.DCHA(SEQ ID N07)
[0524]向H-1le-Pro-OH.TFA (36kg, Bachem AG,瑞士 )在 DMF (433L)中的溶液緩慢加入Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -OSu (62kg, Senn Chemicals，瑞士)。在(TC用 DIPEA 調(diào)節(jié) pH 值至7-7.5。通過HPLC監(jiān)測反應(yīng)的完成。
[0525]在真空下蒸發(fā)得到的反應(yīng)混合物，并用乙酸乙酯稀釋得到的油狀殘留物。用KHSO4水溶液和食鹽水洗滌得到的混合物。在真空蒸發(fā)得到的有機(jī)相，并通過與甲苯共沸蒸餾來干燥所述油狀殘留物。用甲苯稀釋得到的油狀殘留物，并用DCHA調(diào)節(jié)pH值至7-7.5。然后向得到的混合物中加入石油醚。從而將產(chǎn)生的固體過濾，用石油醚洗滌并在真空干燥，得到 102kg 的 Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-1le15-Pro-OH.DCHA(SEQ ID N07)，純度為 89%(HPLC)。
[0526]實施例16:制各 Boc-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzl) -Tvr (Bzl)-Leu2n-OBzKSEQ ID N08)
[0527]在≤24 O 向 H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr(Bzl)-Leu2c1-OBzl.TFA (SEQ ID N06)(110.39kg，凈肽重量，參見實施例14)在DMF(451L)中的溶液中緩慢加入Boc-Glu(OBzl)-GIu (OBzl)-1le15-Pro-OH.DCHA (SEQ ID N07) (98.88kg，參見實施例 15)和 HOBt (13.82kg)。在_6°C向得到的混合物中分小份加入EDC.HCl (22.99kg)。在_6°C用TEA (12L)調(diào)節(jié)得到的反應(yīng)混合物的pH值至6.5-7。在10°C通過HPLC監(jiān)測偶聯(lián)反應(yīng)的完成。
[0528]過濾除去鹽。在真空蒸發(fā)得到的濾液。得到的油狀殘留物(470L)在NaHCO3溶液中沉淀。過濾固體并用處理過的水洗滌多次。在處理過的水中再次懸浮后，加入乙腈。然后冷卻得到的懸浮液。過濾固體，用水洗滌并在真空干燥，得到160.34kg(88% )的Boc-Glu(OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID N08)，純度為 90% (HPLC)。
[0529]實施例17:制各 H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzl) -Tvr(Bzl)-Leu2n-OBzl.TFA (SEQ ID N08)
[0530]在≤15°C 向 TFA (72L)、甲苯(289L)和 THF (6L)的混合物加入 Boc-GIu(OBzI)-GIu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID N08) (72.24kg，參見實施例16)。在≤22 0C向得到的混合物中緩慢加入另外的TFA(159L)。在20 V反應(yīng)
2.5h使反應(yīng)完成(通過HPLC監(jiān)測)。真空蒸發(fā)反應(yīng)混合物。通過與甲苯和THF的混合物進(jìn)行多次共沸蒸餾而除去殘留的TFA。用甲苯稀釋油狀殘留物并倒入二異丙基醚中。過濾固體，用二異丙基醚洗滌多次。在乙腈和二異丙基醚的混合物中再次懸浮后，然后過濾固體，用二異丙基醚洗滌多次，最后在真空干燥，得到61.7kg (87% )的H-Glu (OBzl) -Glu (OBzl)-Ile15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl)-Leu20-OBzl.TFA(SEQ ID N08)，純度為 88.9%(HPLC)。
[0531]實施例18:制各 Boc-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le--Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzI) -Tvr (Bzl) -Leu2n-OBzl (SEQ ID N09)
[0532]在≤24°C 向 H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-1le15-Pro-Glu(OBzl)—Glu(OBzl)-Tyr (BzD-Leu20-OBzl.TFA(SEQ ID N08) (61.63kg，參見實施例 17)在 DMF(264L)中的溶液緩慢加A Boc-Phe-OH(10.03kg ；Senn Chemicals AG,瑞士)和 HOBt (4.95kg)。在-5°C緩慢加入EDC *HC1 (8.53kg)。在_5°C用DIPEA(47.5L)逐漸調(diào)節(jié)得到的反應(yīng)混合物的pH值至6.5-7。使偶聯(lián)反應(yīng)在10°C反應(yīng)23h至反應(yīng)完成(通過HPLC監(jiān)測)。
[0533]真空蒸發(fā)得到的反應(yīng)混合物。得到的油狀殘留物在NaHCO3溶液中懸浮。過濾固體，用處理過的水洗滌多次，并在真空干燥，得到67.64kg (95% )的Boc-Phe-Glu (OBzl)-Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID N09)，純度為 87.9%(HPLC)。
[0534]實施例19:制各 H-Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tle15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl)-Tvr (Bzl)-Leu2n-OBzl.TFA (SEQ ID N09)
[0535]在15。。向TFA(68L)、苯酚(3.38kg)、甲苯(271L)和THF(54L)的混合物中分小份加入 Boc-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-1le15-Pro—Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr (Bzl)-Leu20-OBzKSEQ ID N09) (67.66kg，參見實施例18)。在15°C向得到的混合物中緩慢加入另外的TFA(149L)。通過HPLC監(jiān)測裂解反應(yīng)的完成(4.3h)。
[0536]得到的反應(yīng)混合物在真空蒸發(fā)。通過與甲苯和THF的混合物進(jìn)行多次共沸蒸餾除去殘留的TFA。用甲苯稀釋油狀殘留物并倒入二異丙基醚中。過濾固體，用二異丙基醚洗滌多次，并在真空干燥,得到 67.25kg(99% )的 H-Phe-Glu (OBzl)-Glu (OBzl)-1le15-Pro--Glu (OBz I)-Glu (OBz I)-Tyr (Bz I)-Leu20-OBz I.TFA (SEQ ID N09)，純度為 86.6% (HPLC)。
[0537]實施例 20:制備 Boc-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1lejj—Pro-Glu (OBzI)-Glu(OBzl)-Tvr(Bzl)-Leu--QBzl (SEQ ID N03)
[0538]在≤20℃ 向 H-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-1le15-Pro-Glu(OBzl)—Glu(OBzl)-Tyr (Bzl)-Leu20-OBzl.TFA(SEQ ID N09) (60.46kg 凈肽重量，參見實施例 19)在 DMF(370L)中的溶液中分小份加入 Boc-Asp (OBzl) η_0Η(20.22kg) (Senn Chemicals AG,瑞士)和HOBt (8.42kg)。在-5°C向得到的反應(yīng)混合物中緩慢加入EDC.HCl (13.38kg)。在_5°C用DIPEA(27L)逐漸調(diào)節(jié)所述得到的反應(yīng)混合物的pH值至6.5_7。然后使偶聯(lián)反應(yīng)在10°C反應(yīng)35h至反應(yīng)完成(通過HPLC監(jiān)測)。
[0539]然后得到的反應(yīng)混合物在真空蒸發(fā)。將所述得到的油狀殘留物緩慢加入到NaHCO3水溶液中。得到的懸浮液過濾并在去離子水中再次懸浮。在過濾并且用去離子水洗滌多次并用乙腈和去離子水洗滌一次以后，在真空干燥所述得到的固體，得到64kg(96% )的Boc-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID N03)，純度為 81.4% (HPLC)。
[0540]實施例21:制各 H-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le--Pro-Glu (OBzl)-Glu(OBzl)-Tvr (Bzl)-Leu--QBzl ? TFA(SEQ ID N03)
[0541]在低于15°C的溫度向TFA(64L)、苯酚(3.2kg)、甲苯(265L)和THF(51L)的混合物中分小份加入 Boc-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzI) -Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID N03) (64.00kg，參見實施例 20)。在≤ 15°C 向得到的反應(yīng)混合物緩慢加入另外的TFA(HlL)。裂解反應(yīng)在15°C進(jìn)行4.8h (由HPLC監(jiān)測)。
[0542]得到的反應(yīng)混合物在真空濃縮。在20°C將所述得到的油狀殘留物加入到二異丙基醚中進(jìn)行沉淀。過濾所述得到的懸浮液，在二異丙基醚中再次懸浮并再次過濾。用二異丙基醚洗滌得到的固體，并在真空干燥，得到61.4kg(凈肽重量)(95% )的H-Asp (OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-1le15-Pro-Glu(OBzl) —Glu(OBzl)-Tyr (Bzl)-Leu20-OBzl.TFA(SEQID N03)，純度為 77.6% (HPLC)。
[0543]實施你丨 22:吿1|備 Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly--Gly-Gly-Gly-Asn-Glylfl-Asp (PBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1lejj-Pro-Glu (OBzl) —Glu (OBzl) -Tyr (Bzl) -Leu2n-QBzl (SEQ ID N01)
[0544]在≤24 O 向 Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1c1-OH (SEQ IDN02) (65.47kg，參見實施例10)在DMF(345L)的溶液中分小份加入H-Asp (OBzl)-Phe-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-1le15-Pro-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Tyr (Bzl)-Leu2c1-OBzl.TFA(SEQ IDN03) (104.40kg，參見實施例 21)和 HOBt (8.42kg)。在 _5°C緩慢加入 EDC.HCl (12.46kg)。在_5°C用TEA(16.5L)逐漸調(diào)節(jié)所述得到的反應(yīng)混合物的pH值至6.5_7。偶聯(lián)反應(yīng)在_5°C進(jìn)行22h直至反應(yīng)完成(由HPLC監(jiān)測)。
[0545]用去離子水緩慢稀釋所述得到的反應(yīng)混合物。過濾所述得到的懸浮液，用去離子水洗漆，并在真空干燥，得到 72kg(50% )的 Boc-D-1Phe-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-Asp (OBzl) —Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -Tyr (Bzl)—Leu20-OBzl(SEQ ID N01)，純度為 81.4% (HPLC)。
[0546]實施4歹 1丨 23:吿1|備 H-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-GIy5~GIy-Gly-Gly—Asn-Glylfl-Asp-Phe-Glu-Glu-1le--Pro-Glu-Glu-Tvr-Leu--OH.2TFA(比伐盧定)(SEQ ID N01)
[0547]將Boc-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1c1-Asp (OBzl) -Phe-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) -1le15-Pro-Glu (OBzl) -Glu (OBzl) —Tyr (Bzl) -Leu20-OBzl (SEQ ID N01)(15.00kg，參見實施例22)在乙酸(53L)中的懸浮液加入到鈀/炭(1.13kg)、去離子水(6L)和乙酸(5L)的混合物中。在< 37°C在3bar氫氣壓力下進(jìn)行氫化反應(yīng)(由HPLC監(jiān)測)。
[0548]在反應(yīng)完成后(5h)，將得到的反應(yīng)混合物冷卻并用去離子水和乙酸稀釋。將反應(yīng)混合物經(jīng)過纖維素濾芯過濾，并用乙酸和處理過的水的混合物將該纖維素濾芯洗脫多次。得到的濾液在真空濃縮。采用卡爾?費歇爾滴定法檢測所述得到的殘留物的含水量(含水量< 5.0% )。
[0549]然后向所述油狀的殘留物中加入甲苯，接著加入TFA。裂解反應(yīng)的完成(一小時以后)采用HPLC進(jìn)行監(jiān)測。
[0550]得到的反應(yīng)混合物在真空濃縮。將所述得到的油狀殘留物加入到二異丙基醚中進(jìn)行沉淀。過濾所述得到的懸浮液以得到固體，并用二異丙基醚洗滌多次，然后在真空干燥，得到 8.41kg (凈肽重量)(78% )的粗制的 H-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Glylcl—Asp-Phe-Glu-Glu-1le15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu2C1-H*2TFA(比伐盧定)(SEQ ID N01)，比伐盧定粗品的純度為65% (HPLC)。通過HPLC檢測發(fā)現(xiàn)該粗品中不含有D-Phe12-比伐盧定，即在位置12沒有發(fā)生外消旋化。
[0551]采用制備級HPLC在C18反相固定相上純化所述粗制的肽。第一步，采用醋酸銨/水/乙腈梯度洗脫純化所述粗制的肽，然后在第二步，采用三氟乙酸/水/乙腈梯度洗脫。對包含有純產(chǎn)物的洗脫的流分進(jìn)行濃縮并凍干，得到白色粉末狀的5.89kg(70%，以粗制的妝中比伐盧定的含量計算)的 H-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly1c1-Asp-Phe-Glu—Glu-1l e15-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu2C1-H*2TFA(比伐盧定)(SEQ ID N01)，純度為99%(HPLC)。沒有檢測到D-Phe12-比伐盧定和D-Tyr19-比伐盧定，并且檢測的彼此雜質(zhì)不超過
0.2% (HPLC)。
【權(quán)利要求】
1.選自以下的組的肽 (ii)式(VI)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽 H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID N05)(VI)， 其中P2是可通過催化氫化反應(yīng)除去的并且與可選的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)正交的保護(hù)基團(tuán)； (iii)式(VII)的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽
Pl-D-Phe1-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OP2(SEQ ID N02) (VII),
其中Pl是對催化氫化反應(yīng)穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)，P2為如上定義； (iv)式(IIa)的側(cè)鏈保護(hù)的肽
Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID N02) (IIa)，其中 Pl 為如上定義，除了 Boc-D-Phe1-Pro-Arg(Pbf)-Pro—Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn(Trt) -Gly10-OH 以外； (v)式(IIb)的側(cè)鏈未保護(hù)的肽
Pl-D-Phel-Pro-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID N02) (IIb)，
其中Pl為如上定義。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中式VI的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽是H-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID N05)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中式VII的可選地側(cè)鏈保護(hù)的肽是Boc-D-Phe1-PiO-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OBzl(SEQ ID N02)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的肽，其中式IIb的側(cè)鏈未保護(hù)的肽是Boc-D-Phe1-PiO-Arg-Pro-Gly5-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly10-OH(SEQ ID N02)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項所述的任意的肽的作為合成比伐盧定的中間體的用途。
【文檔編號】C07K7/06GK103864894SQ201410073688
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2009年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2008年12月29日
【發(fā)明者】杰弗里·蘇門, 盧西亞諾·弗尼 申請人:隆薩布萊納公司