自然連接方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及制造多肽的方法，包括至少一個使用用硒基團官能化的肽的自然連接步驟。本發(fā)明進一步涉及硒肽和化合物。
【專利說明】自然連接方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于制造多肽的方法，其包括至少一個使用通過含硒基團官能化的肽 的自然連接（native ligation)的步驟。本發(fā)明還涉及肽和基于硒的化合物。本發(fā)明還涉 及用于肽的合成的合成試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 通過常規(guī)固相方法即逐個氨基酸的多肽合成在所合成的多肽大時受低產(chǎn)率的限 制。為了克服該限制，已知將兩個多肽通過化學連接而組裝以產(chǎn)生更長的多肽。
[0003] 對于制備具有嚴格定義的結(jié)構(gòu)或者帶有天然（natural)修飾例如轉(zhuǎn)譯后修飾或 非天然修飾的蛋白質(zhì)而言，全（total)多肽合成越來越有用。化學連接方法響應(yīng)該需要；但 是在它們的用途和它們的工業(yè)應(yīng)用方面它們證明是有限制的。
[0004] 通常，在這些方法中，期望通過連接而組裝的多肽之間的鏈接（link)是自然的， 即與多肽的天然結(jié)構(gòu)對應(yīng)。
[0005] 目前存在的主要的自然連接方法是Kent和Dawson的例如在國際申請WO 96/34878和WO 98/28434中描述的自然連接方法。該方法基于（C端）肽硫酯和半胱氨 酰-肽之間的化學選擇性反應(yīng)。不過，該方法的主要缺點是需要復(fù)雜化學方法的肽硫酯的 制造?，F(xiàn)有技術(shù)的這些方法不令人滿意，因為它們不可避免地導致可難以分離的混合物，從 而影響所獲得的最終產(chǎn)物的純度，和導致產(chǎn)率不可避免的損失。
[0006] 一種替代方法是國際申請WO 01/68565和WO 01/87920中所描述的被稱作 Staudinger反應(yīng)的連接。這包括膦基硫酯與疊氮化物的反應(yīng)和所組合的反應(yīng)物的水解以形 成酰胺鍵。然而，該方法難以在工業(yè)規(guī)模上應(yīng)用。
[0007] 描述于國際申請WO 2007/037812中的另一方法基于α -酮酸與N-烷氧基胺按照 脫羧縮合反應(yīng)的反應(yīng)。然而，所述酮酸是難以制造和結(jié)合到肽中的分子。而且，該第三種方 法在不具有用于實施復(fù)雜有機合成的手段的肽合成實驗室中難以應(yīng)用。
[0008] 文獻WO 2011/051906描述了涉及硫醇化合物的自然連接方法。雖然該方法是高 度令人滿意的，但是該硫醇化合物的反應(yīng)動力學有時是緩慢的，特別是當兩個肽之間的鍵 周圍的氨基酸受阻時。
[0009] 因此仍然需要這樣的自然連接方法，其具有快速的反應(yīng)動力學以促進通過兩個受 阻氨基酸之間成鍵而進行的肽連接。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明基于如下連接方法的開發(fā)：所述連接方法基于使用特定的酰胺肽即SeEA 肽和半胱氨酰肽。當使這兩種肽在水溶液中接觸時，自然的肽鍵在這兩個片段之間形成。該 連接非常有效并且以優(yōu)異的產(chǎn)率進行。其在寬的PH范圍內(nèi)起作用。
[0011] 該連接與申請FR 09 57 639中描述的SEA連接具有相似性，不過在這兩種連接的 性質(zhì)以及SeEA和SEA鏈段的性質(zhì)方面存在顯著差異。
[0012] 實際上，SeEA連接的動力學非常顯著地優(yōu)于：用含硫類似物SEA獲得的SEA連接 的動力學，或者基于使用肽硫酯的自然化學連接（NCL)的動力學。
[0013] SeEA的動力學優(yōu)越性絕對沒有降低SEA連接的有用性。相反，其通過如下而對它 進行補充：容許形成通過所述其它技術(shù)即SEA連接或NCL(硫酯化學）難以產(chǎn)生的接合物 (junction)〇
[0014] 在本申請中，SEA基團表示-N(CH2-CH2-S-G 4)2基團，其中G4表示H或者硫保護基 團或者二硫鍵。
[0015] 本發(fā)明的第一主題涉及選自如下的經(jīng)官能化的肽：
[0016] a)式（I) =X1-N(CH2CH2SeH)2 的肽；或者
[0017] b)式（Γ ):

【權(quán)利要求】
λ
1. 經(jīng)官能化的肽，其選自：a) 式（I) =X1-N(CH2CH2SeH)2 的肽；或者
b) 式（I'） 1 勺肽； 其中X1表示肽片段且-N(CH2CH2SeH)2基團或者
基團與該肽片段X1的處 于C端位置的氨基酸殘基的C = O末端形成酰胺鍵。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的經(jīng)官能化的肽，其中X1包括2-300個氨基酸殘基、優(yōu)選5-100個 氨基酸殘基、更特別地優(yōu)選8-50個氨基酸殘基。
3. 用于獲得根據(jù)權(quán)利要求1或根據(jù)權(quán)利要求2的經(jīng)官能化的肽的方法，包括以下步驟 al 和 bl : al)用于提供式（II)的多肽的肽合成： (II)X1-OH 式（II)的多肽優(yōu)選地在其胺官能團和除了其C端羧酸官能團之外的羧酸官能團上包 括保護基團， bl)步驟a)中獲得的多肽的官能化，包括： -式（II)的多肽與選自如下的胺化合物在液相中反應(yīng)以形成式（Ia)或（I'）的多 肽： (Ilia) NH(CH2-CH2-Se-G1)2
其中G1表示硒保護基團或氫原子，所述式（Ia)為： (Ia)X1-N(CH2CH2-Se-G1) 2 ； -任選地，將式（Ia)的多肽脫保護以產(chǎn)生式（I)的化合物， 或者所述方法包括以下步驟a2和b2 a2)使用 -式（IV)或（IV"）的化合物： (IV) X1 -N(CH2CH2-S-H)2 ；
或者 -通過帶有硫酯官能團的基團官能化的肽（IV'）=X1-SR,且R表示任選地被取代的 芳基或烷基， b2)式αν)或αν"）的化合物或式αν'）的化合物與式απ'）或απ"）的胺化合 物之間在液相中反應(yīng)以形成式（I)或a'）的肽：
4. 能夠在根據(jù)權(quán)利要求3的方法中使用的化合物，其選自： a) 式（III'）
的化合物 b) 式（ΙΙΙ"）：
?的化合物。
5. 用于制造根據(jù)權(quán)利要求4的式（III'）和（III"）的化合物的方法，包括：以下用金 屬氫化物NaBH4、LiBH 4或LiAlH4的處理反應(yīng)
和隨后的以下反應(yīng)：
6. 用于獲得根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽的方法，包括以下步驟： a)提供經(jīng)官能化的聚合物樹脂，其具有結(jié)構(gòu)（V)或結(jié)構(gòu)（V'）： 其中，
□表不固體載體， Trt表示任選地被一個或多個取代基取代的三苯基甲基，所述取代基特別地選自取代 基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基， b) 將氨基酸接枝到步驟a)中獲得的經(jīng)官能化的聚合物樹脂上以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)（VI)或結(jié)構(gòu) (VI'）的化合物： 其中，
□和Trt具有與化合物（V)或（V'）中相同的含義， AA表示任選地包括一個或多個保護基團的氨基酸殘基； G3表示AA的N端胺官能團的保護基團或者氫原子， c) 從氨基酸AA開始肽合成以產(chǎn)生化合物（VII)或（VII'）：
其中，
□表不固體載體， Trt表示任選地被一個或多個取代基取代的三苯基甲基，所述取代基特別地選自取代 基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基， X1表示肽片段， d)將Trt和Se之間的鍵切斷以產(chǎn)生化合物⑴或（I'）。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中將氨基酸接枝到所述聚合物樹脂上包括使經(jīng)官能化的 樹脂（V)或（V'）與氨基酸的酰鹵或者與氨基酸以及活化劑接觸，所述活化劑優(yōu)選地選自 HATU、PyBOP、BOP、PyBROP，更特別優(yōu)選 HATU。
8. 能夠在根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法中使用的經(jīng)官能化的聚合物樹脂，其具有結(jié)構(gòu) (V)或結(jié)構(gòu)（V'）：
其中， □表不固體載L, Trt表示任選地被一個或多個取代基取代的三苯基甲基，所述取代基特別地選自取代 基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基。
9. 對應(yīng)于式（VTT)成Γνττ，、的句
厶物ιΜ脂· 其中， □表不固體載體， Trt表示任選地被一個或多個取代基取代的三苯基甲基，所述取代基特別地選自取代 基氯、甲氧基、甲基、氟和氰基， X1表示肽片段。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9的聚合物樹脂，其中所述固體載體□選自聚苯乙烯、聚丙烯酰 胺、聚乙二醇、纖維素、聚乙烯、聚酯、乳膠、聚酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚苯乙 烯共聚物、聚乙二醇-聚丙烯酰胺共聚物以及其衍生物。
11. 用于制造根據(jù)權(quán)利要求8-10之一的聚合物樹脂的方法，包括： a) 提供通過-Trt或-NH-CO-Trt基團官能化的固體載體； b) 所述固體載體的Trt官能團與式（III) =NH(CH2-CH2-Se-H)2的胺化合物反應(yīng)， Trt具有與權(quán)利要求8-10中相同的含義。
12. 用于制造式（VIII)的多肽的方法： (VIII)X1-C1-X2-C2-. ·· -C^1-Xi-. ·· -Clri-Xn 其中， X1, X2，…，Xi,…，Xn為肽片段， C1, C2，…，Cp1，…，Clri為帶有硫醇或硒醇官能團的氨基酸殘基， η為大于或等于2的整數(shù)， i為1到η的任意整數(shù)， 該方法包括一個或多個如下步驟：式（IXi)的化合物與式（ΧΛ)的化合物之間反應(yīng)以 形成式（Xi)的化合物： (IXi)X，i -N(CH2CH2-Se-H)2 其中， X' i表示X1 對于i>l，x' i表示CH-Xi (Xi+1) Ci-Xw-----Clri-Xn (Xi)Xj i-Ci-Xi+1 Cn-Xn。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中化合物（IXi)是從化合物（IX' i)開始，通過與至少 一種使二硒鍵還原的化合物接觸而形成的：
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中化合物（IX'J是通過式（XIi)、(XFi)或（XI')的 化合物與根據(jù)權(quán)利要求4的式（III'）或式（III"）的化合物之間的反應(yīng)獲得的： (XIi)X，i - S-R1
(XI" i)X，i - N(CH2-CH2-S-H)2 其中對于i>l，X' i為C^1-Xi形式的肽片段，且X' i表示X1, R1表示任選地被取代的芳 基或燒基。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，對于由式（XII)表示的多肽的制造： (XII)X1 -C1-X2-C2-X3 所述方法包括步驟： a) 式（XIII)或（XIII'）的化合物與式（XIV)或（XIV'）的化合物之間反應(yīng)以形成式 (XV)或（XV'）的化合物：
b) 式（XV)或（XV'）的化合物與式（XVI)的多肽之間反應(yīng)以形成式（XII)的化合物： (XVI) H-C2-X3 其中，R2表示X1的N端官能團的保護基團或者H ;Xp X2、X3彼此獨立地表示肽片段；Ci 和C2彼此獨立地表示帶有硫醇或硒醇官能團的氨基酸殘基。
16. 用于制造式（XVII)的環(huán)狀多肽的方法：
X2表示肽片段，和C1表示包括硫醇或硒醇官能團的氨基酸殘基， 所述方法包括至少一個如下的反應(yīng)步驟：式（XVIII)的多肽與自身連接： (XVII) H-C1-X2-N (CH2-CH2-Se-H) 2 〇
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述連接反應(yīng)是通過使式（XVIII'）的多肽與至少 一種使二硒鍵還原的化合物接觸而實施的：
18. 多肽合成試劑盒，包括一種或多種能夠在根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法中使用的式 (IXi)或（IX' i)的肽、或者至少一種根據(jù)權(quán)利要求4的化合物。
【文檔編號】C07K7/06GK104271589SQ201380022748
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月21日
【發(fā)明者】O.梅爾尼克, L.雷鮑特, N.奧利維爾 申請人:國家科學研究中心, 里爾巴斯德研究院, 里爾法律與醫(yī)療衛(wèi)生第二大學