一種虎杖發(fā)酵液中白藜蘆醇的提取方法
【專利摘要】一種虎杖發(fā)酵液中白藜蘆醇的提取方法，包括以下步驟：（1）內(nèi)生真菌L1孢子懸浮液制備；（2）培養(yǎng)基準備；（3）發(fā)酵，得虎杖發(fā)酵液；（4）提?。河靡宜嵋阴シ炙拇屋腿』⒄劝l(fā)酵液，合并乙酸乙酯相，濃縮至干，得白藜蘆醇粗提取物；（5）大孔樹脂－硅膠聯(lián)合層析；（6）精制，得白藜蘆醇產(chǎn)品。本發(fā)明工藝簡單，生產(chǎn)成本低，對環(huán)境污染小，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。利用本發(fā)明對虎杖發(fā)酵液進行提純分離，純化后的白藜蘆醇純度可達92wt％。
【專利說明】一種虎杖發(fā)酵液中白藜蘆醇的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種白藜蘆醇的提取方法，尤其是涉及一種虎杖發(fā)酵液中白藜蘆醇的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]白藜蘆醇是一種植物抗菌素，它主要存在于葡萄的果皮、花生、桑椹、松樹、寥科植物(虎杖)12科、31個屬的72種植物中。白藜蘆醇是生物為抵抗環(huán)境壓力(如氣候惡劣、微生物侵染等)而產(chǎn)生的化學物質(zhì)，具有顯著的藥理和生物學作用，如抗癌、保護神經(jīng)、抗衰老、抗炎癥以及延長壽命等。
[0003]目前，虎杖發(fā)酵液中白藜蘆醇的提取方法一般為大孔樹脂、硅膠或離子交換樹脂單柱層析，這些傳統(tǒng)工藝成本高，純度低。由此可見，尋找一種低成本、純度高的白藜蘆醇提取方法，已成為目前白藜蘆醇生產(chǎn)行業(yè)的當務(wù)之急。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種成本低的虎杖發(fā)酵液中白藜蘆醇的提取方法，所提取出的白藜蘆醇純度高。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是:一種虎杖發(fā)酵液中白藜蘆醇的提取方法，包括以下步驟:
Cl)內(nèi)生真菌LI孢子懸浮液制備:從內(nèi)生真菌LI PDA斜面上挑五環(huán)菌體于IOml生理鹽水中，充分震蕩；
所述內(nèi)生真菌LI保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.4558 (參見申請?zhí)枮?01110130127.1的專利申請文件)；
(2)培養(yǎng)基準備:將新鮮虎杖粉碎至180目，按質(zhì)量比虎杖1.5wt%、無水乙醇2 wt%、CMC-Na 2.5 wt%、NH4NO3 0.2 wt%、Na2HPO40.06 wt%、CaCl20.1 wt% 配制發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)起始PH值為5.5 ;
(3)發(fā)酵:先將步驟(2)中的培養(yǎng)基經(jīng)121°C、30min濕熱滅菌；再將3ml的內(nèi)生真菌LI孢子懸浮液接入250ml三角瓶中，所述三角瓶中裝有30mL起始pH 5.5的培養(yǎng)基，再在培養(yǎng)條件為溫度28°C、轉(zhuǎn)速220r/min下，發(fā)酵60h，得虎杖發(fā)酵液；
(4)提取:用乙酸乙酯分四次萃取虎杖發(fā)酵液，合并乙酸乙酯相，濃縮至干，得白藜蘆醇粗提取物；
(5)大孔樹脂一硅膠聯(lián)合層析:將步驟(4)所得白藜蘆醇粗提取物溶于乙醇與乙酸乙酯的混合液，所述乙醇與乙酸乙酯的混合液中，乙醇與乙酸乙酯的體積比為2:3 ;然后用濾紙過濾，棄去濾渣，得濾液；往大孔樹脂柱加去離子水，當去離子水液面與大孔樹脂柱頂部表面齊平時，將所得濾液加到大孔樹脂柱頂部，當濾液液面沒過大孔樹脂柱頂部時，用乙醇與乙酸乙酯體積比為2:3的混合液作為洗脫液進行洗脫，大孔樹脂層析洗脫速度為Iml /mim，收集洗脫液；再將收集的洗脫液即大孔樹脂層析后的白藜蘆醇混合液，加入到硅膠層析柱中，待白藜蘆醇混合液滲入硅膠中，再用乙醇:乙酸乙酯體積比為4:1的乙醇與乙酸乙酯的混合液作為硅膠柱用洗脫液進行洗脫，硅膠層析洗脫速度為Iml / mim，得洗脫液；
(6)精制:將步驟(5)所得洗脫液，減壓濃縮，至剛好有沉淀出現(xiàn)，溶液變混濁時，停止?jié)饪s，將濃縮液在4°C條件下靜置24h以上析晶，得到黃色晶體，經(jīng)冷凍干燥，得白藜蘆醇產(chǎn)品O
[0006]進一步，步驟(5)中，所述濾紙為精密濾紙。
[0007]本發(fā)明之白藜蘆醇的提取方法，先采用乙酸乙酯分四次萃取虎杖發(fā)酵液，以保障白藜蘆醇的提取率和收率，然后采用大孔樹脂一硅膠聯(lián)合層析將白藜蘆醇精制，確保白藜蘆醇產(chǎn)品的質(zhì)量合格，最后精制，洗脫液中自藜蘆醇部分，減壓濃縮，再將濃縮液靜置析晶，得到黃色晶體，經(jīng)冷凍干燥，得白藜蘆醇產(chǎn)品。
[0008]本發(fā)明工藝簡單，生產(chǎn)成本低，對環(huán)境污染小，適宜工業(yè)化生產(chǎn)。利用本發(fā)明對虎杖發(fā)酵液進行提純分離，純化后的白藜蘆醇可達92wt %，遠遠高于單獨使用大孔樹脂和硅膠單柱層析所得的白藜蘆醇純度。
【具體實施方式】
[0009]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0010]實施例1
本實施例包括以下步驟:
(1)內(nèi)生真菌LI孢子懸浮液制備:從內(nèi)生真菌LIPDA斜面上挑五環(huán)菌體于IOml生理鹽水中，充分震蕩；
所述內(nèi)生真菌LI保藏于中國微生`物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.4558 (參見申請?zhí)枮?01110130127.1的專利申請文件)；
(2)培養(yǎng)基準備:將新鮮虎杖粉碎至180目，取180目新鮮虎杖粉末0.45g(虎杖1.5wt%)、無水乙醇 0.6g (2%)、CMC-Na0.75g (2.5%)、NH4NO30.06g (0.2%)、Na2HPO40.018g(0.06%)、CaCl20.03g (0.1%)配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 值為 5.5 ；
(3)發(fā)酵:先將步驟(2)中的培養(yǎng)基經(jīng)121°C、30min濕熱滅菌；再將3ml的內(nèi)生真菌LI孢子懸浮液接入250ml三角瓶中，所述三角瓶中裝有30mL起始pH 5.5的培養(yǎng)基，再在培養(yǎng)條件為溫度28°C、轉(zhuǎn)速220r/min下，發(fā)酵60h，得虎杖發(fā)酵液；
(4)提取:取200ml虎杖發(fā)酵液，用800ml乙酸乙酯平均分四次萃取，合并乙酸乙酯相，濃縮至干，得白藜蘆醇粗提取物；
(5)大孔樹脂一硅膠聯(lián)合層析:將步驟(4)所得白藜蘆醇粗提取物溶于乙醇與乙酸乙酯的混合液，所述乙醇與乙酸乙酯的混合液中，乙醇與乙酸乙酯的體積比為2:3 ;然后用濾紙過濾，棄去濾渣，得濾液；往大孔樹脂柱加去離子水，當去離子水液面與大孔樹脂柱頂部表面齊平時，將所得濾液加到大孔樹脂柱頂部，當濾液液面沒過大孔樹脂柱頂部時，用乙醇與乙酸乙酯體積比為2:3的混合液作為洗脫液進行洗脫，大孔樹脂層析洗脫速度為Iml /mim，收集洗脫液；再將收集的洗脫液即大孔樹脂層析后的白藜蘆醇混合液，加入到硅膠層析柱中，待白藜蘆醇混合液滲入硅膠中，再用乙醇:乙酸乙酯體積比為4:1的乙醇與乙酸乙酯的混合液作為硅膠柱用洗脫液進行洗脫，硅膠層析洗脫速度為Iml / mim，得洗脫液；
(6)精制:將步驟(5)所得洗脫液，減壓濃縮，至剛好有沉淀出現(xiàn)，溶液變混濁時，停止?jié)饪s，將濃縮液在4°C條件下靜置24h以上析晶，得到黃色晶體，經(jīng)冷凍干燥，得白藜蘆醇產(chǎn)品O
[0011]本實施例所得產(chǎn)品經(jīng)HPLC、以及質(zhì)譜檢測白藜蘆醇純度達到92%。
[0012]實施例2
本實施例包括以下步驟:
Cl)內(nèi)生真菌LI孢子懸浮液制備:從內(nèi)生真菌LI PDA斜面上挑五環(huán)菌體于IOml生理鹽水中，充分震蕩；
所述內(nèi)生真菌LI保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.4558 (參見申請?zhí)枮?01110130127.1的專利申請文件)；
(2)培養(yǎng)基準備:將新鮮虎杖粉碎至180目，取180目新鮮虎杖粉末0.45g(虎杖
1.5wt%)、無水乙醇 0.6g (2%)、CMC-Na0.75g (2.5%)、NH4NO30.06g (0.2%)、Na2HPO40.018g(0.06%)、CaCl20.03g (0.1%)配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 值為 5.5 ；
(3)發(fā)酵:先將步驟(2)中的培養(yǎng)基經(jīng)121°C、30min濕熱滅菌；再將3ml的內(nèi)生真菌LI孢子懸浮液接入250ml三角瓶中，所述三角瓶中裝有30mL起始pH 5.5的培養(yǎng)基，再在培養(yǎng)條件為溫度28°C、轉(zhuǎn)速220r/min下，發(fā)酵60h，得虎杖發(fā)酵液；
(4)提取:取200ml虎杖發(fā)酵液，用800ml乙酸乙酯平均分四次萃取，合并乙酸乙酯相，濃縮至干，得白藜蘆醇粗提取物；
(5)大孔樹脂一硅膠聯(lián)合層析`:將步驟(4)所得白藜蘆醇粗提取物溶于乙醇與乙酸乙酯的混合液，所述乙醇與乙酸乙酯的混合液中，乙醇與乙酸乙酯的體積比為2:3 ;然后用濾紙過濾，棄去濾渣，得濾液；往大孔樹脂柱加去離子水，當去離子水液面與大孔樹脂柱頂部表面齊平時，將所得濾液加到大孔樹脂柱頂部，當濾液液面沒過大孔樹脂柱頂部時，用乙醇與乙酸乙酯體積比為2:3的混合液作為洗脫液進行洗脫，大孔樹脂層析洗脫速度為Iml /mim，收集洗脫液；再將收集的洗脫液即大孔樹脂層析后的白藜蘆醇混合液，加入到硅膠層析柱中，待白藜蘆醇混合液滲入硅膠中，再用乙醇:乙酸乙酯體積比為4:1的乙醇與乙酸乙酯的混合液作為硅膠柱用洗脫液進行洗脫，硅膠層析洗脫速度為Iml / mim，得洗脫液；
(6)精制:將步驟(5)所得洗脫液，減壓濃縮，至剛好有沉淀出現(xiàn)，溶液變混濁時，停止?jié)饪s，將濃縮液在4°C條件下靜置24h以上析晶，得到黃色晶體，經(jīng)冷凍干燥，得白藜蘆醇產(chǎn)品O
[0013]本實施例所得產(chǎn)品經(jīng)HPLC、以及質(zhì)譜檢測白藜蘆醇純度達到30%。
[0014]實施例3
本實施例包括以下步驟:
Cl)內(nèi)生真菌LI孢子懸浮液制備:從內(nèi)生真菌LI PDA斜面上挑五環(huán)菌體于IOml生理鹽水中，充分震蕩；
所述內(nèi)生真菌LI保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.4558 (參見申請?zhí)枮?01110130127.1的專利申請文件)；
(2)培養(yǎng)基準備:將新鮮虎杖粉碎至180目，取180目新鮮虎杖粉末0.45g(虎杖
1.5wt%)、無水乙醇 0.6g (2%)、CMC-Na0.75g (2.5%)、NH4NO30.06g (0.2%)、Na2HPO40.018g(0.06%)、CaCl20.03g (0.1%)配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 值為 5.5 ；
(3)發(fā)酵:先將步驟(2)中的培養(yǎng)基經(jīng)121°C、30min濕熱滅菌；再將3ml的內(nèi)生真菌LI孢子懸浮液接入250ml三角瓶中，所述三角瓶中裝有30mL起始pH 5.5的培養(yǎng)基，再在培養(yǎng)條件為溫度28°C、轉(zhuǎn)速220r/min下，發(fā)酵60h，得虎杖發(fā)酵液；
(4)提取:取200ml虎杖發(fā)酵液，用800ml乙酸乙酯平均分四次萃取，合并乙酸乙酯相，濃縮至干，得白藜蘆醇粗提取物；
(5)大孔樹脂一硅膠聯(lián)合層析:將步驟(4)所得白藜蘆醇粗提取物溶于乙醇與乙酸乙酯的混合液，所述乙醇與乙酸乙酯的混合液中，乙醇與乙酸乙酯的體積比為2:3 ;然后用濾紙過濾，棄去濾渣，得濾液；往大孔樹脂柱加去離子水，當去離子水液面與大孔樹脂柱頂部表面齊平時，將所得濾液加到大孔樹脂柱頂部，當濾液液面沒過大孔樹脂柱頂部時，用乙醇與乙酸乙酯體積比為2:3的混合液作為洗脫液進行洗脫，大孔樹脂層析洗脫速度為Iml /mim，收集洗脫液；再將收集的洗脫液即大孔樹脂層析后的白藜蘆醇混合液，加入到硅膠層析柱中，待白藜蘆醇混合液滲入硅膠中，再用乙醇:乙酸乙酯體積比為4:1的乙醇與乙酸乙酯的混合液作為硅膠柱用洗脫液進行洗脫，硅膠層析洗脫速度為Iml / mim，得洗脫液；
(6)精制:將步驟(5)所得洗脫液，減壓濃縮，至剛好有沉淀出現(xiàn)，溶液變混濁時，停止?jié)饪s，將濃縮液在4°C條件下靜置24h以上析晶，得到黃色晶體，經(jīng)冷凍干燥，得白藜蘆醇產(chǎn)品ο
[0015]本實施例所得產(chǎn)品經(jīng)HPLC、 以及質(zhì)譜檢測白藜蘆醇純度達到87%。
【權(quán)利要求】
1.一種虎杖發(fā)酵液中白藜蘆醇的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)內(nèi)生真菌LI孢子懸浮液制備:從內(nèi)生真菌LIPDA斜面上挑五環(huán)菌體于IOml生理鹽水中，充分震蕩； 所述內(nèi)生真菌LI保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC N0.4558 ； (2)培養(yǎng)基準備:將新鮮虎杖粉碎至180目，按質(zhì)量比虎杖1.5wt%、無水乙醇2 wt%、CMC-Na 2.5 wt%、NH4NO3 0.2 wt%、Na2HPO40.06 wt%、CaCl20.1 wt% 配制發(fā)酵培養(yǎng)基；調(diào)起始pH值為5.5 ; (3)發(fā)酵:先將步驟(2)中的培養(yǎng)基經(jīng)121°C、30min濕熱滅菌；再將3ml的內(nèi)生真菌LI孢子懸浮液接入250ml三角瓶中，所述三角瓶中裝有30mL起始pH 5.5的培養(yǎng)基，再在培養(yǎng)條件為溫度28°C、轉(zhuǎn)速220r/min下，發(fā)酵60h，得虎杖發(fā)酵液； (4)提取:用乙酸乙酯分四次萃取虎杖發(fā)酵液，合并乙酸乙酯相，濃縮至干，得白藜蘆醇粗提取物； (5)大孔樹脂一硅膠聯(lián)合層析:將步驟(4)所得白藜蘆醇粗提取物溶于乙醇與乙酸乙酯的混合液，所述乙醇與乙酸乙酯的混合液中，乙醇與乙酸乙酯的體積比為2:3 ;然后用濾紙過濾，棄去濾渣，得濾液；往大孔樹脂柱加去離子水，當去離子水液面與大孔樹脂柱頂部表面齊平時，將所得濾液加到大孔樹脂柱頂部，當濾液液面沒過大孔樹脂柱頂部時，用乙醇與乙酸乙酯體積比為2:3的混合液作為洗脫液進行洗脫，大孔樹脂層析洗脫速度為Iml /mim，收集洗脫液；再將收集的洗脫液即大孔樹脂層析后的白藜蘆醇混合液，加入到硅膠層析柱中，待白藜蘆醇混合液滲入硅膠中，再用乙醇:乙酸乙酯體積比為4:1的乙醇與乙酸乙酯的混合液作為硅膠柱用洗脫液進行洗脫，硅膠層析洗脫速度為Iml / mim，得洗脫液； (6)精制:將步驟(5)所得洗脫液，減壓濃縮，至剛好有沉淀出現(xiàn)，溶液變混濁時，停止?jié)饪s，將濃縮液在4°C條件下靜置24h以上析晶，得到黃色晶體，經(jīng)冷凍干燥，得白藜蘆醇產(chǎn)品O
【文檔編號】C07C37/82GK103627736SQ201310720626
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】劉杉林 申請人:湖南科源生物制品有限公司