一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法
【專利摘要】本發(fā)明闡述一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案采取酸醇液法破壞胰臟，來提取胰島素，然后根據(jù)等電點沉淀的原理，調(diào)節(jié)pH，堿化、酸化除雜蛋白，減壓濃縮進一步提純并除去乙醇，最后加熱去脂，氯化鈉鹽析制得胰島素。本法每千克胰臟可得4g以上胰島素。
【專利說明】一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，設(shè)計藥用胰島素的生化分離技術(shù)。具體地說是采用酸醇提取減壓濃縮法提取動物胰臟中的胰島素。
【背景技術(shù)】
[0002]胰島素是哺乳動物胰島β細胞分泌的蛋白性激素，分子中含有以二硫鍵相連接的兩條多肽鏈。胰島素可溶于80%以下的稀醇、稀丙醇及酸、堿中，不溶于90%以上的乙醇及其他有機溶劑，在PH值為2~4時較穩(wěn)定，遇蛋白酶、強酸、強堿易被破壞，加熱易變性，其等電點為5.3~5.4。
[0003]胰島素可以調(diào)節(jié)糖代謝，減少糖原異生，促進糖原合成，抑制糖原分解，加速葡萄糖的無氧酵解和有氧氧化，促進組織對葡萄糖的利用，并能促進葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)橹?，因而可降低血糖?br> [0004]糖尿病是世界上最常見的代謝疾病之一，據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟2011年公布的最新數(shù)據(jù)顯示，全球糖尿病患病人數(shù)已達到3.66億。臨床糖尿病患者多使用胰島素療法以維持血糖的正常水平。近年來人胰島素在臨床上也得到了廣泛的應(yīng)用。目前，應(yīng)用基因工程和蛋白水解酶的轉(zhuǎn)肽方法已成功地生產(chǎn)出人胰島素。基因工程方法生產(chǎn)人胰島素投資大，工藝復(fù)雜。
[0005] 傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝從從動物(豬)提純胰島素，采用酸-醇液將其萃取分離，通過鹽析將其析出后進行分離純化。結(jié)果:去除雜質(zhì)蛋白、陰陽離子、熱原性物質(zhì)等，可得到胰島素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是為了提高胰島素的收率，對傳統(tǒng)工藝加以改造，控制好酸-醇萃取液的堿化、酸化PH值，得到了一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法，該方法包括如下步驟:
[0007]1、原料預(yù)處理:胰臟離體后，要立即深凍，先在-20~_40°C下急凍后轉(zhuǎn)入-15~28°C°C保存?zhèn)溆谩?br> [0008]2、酸醇液提取:胰臟凍干粉碎后加入2.0~3.0倍量的酸性乙醇用冰乙酸調(diào)PH2.0~3.2，乙醇含量為60%~75%，在8~15°C攪拌提取3h，離心，取上清液。濾渣再用1.0~2.0倍量酸性乙醇同上述方法提取。合并兩次提取液。
[0009]3、堿化、酸化:提取液在不斷攪拌下加入濃氨水調(diào)ρΗ7.8~8.5 (液溫10~15°C )，立即進行壓濾，除去堿性蛋白，濾液應(yīng)澄清，并及時用硫酸酸化至PH3.5~3.8，降溫至4~5°C，靜置4~8h，使酸性蛋白充分沉淀。
[0010]4、減壓濃縮:吸上層清液至減壓濃縮鍋內(nèi)，下層過濾，沉淀物棄去。濾液并入上清液，在30°C以下減壓蒸去乙醇，濃縮至濃縮液比重為1.04~1.06(約為原體積的I / 10~
I/ 9為止)。
[0011]5、去脂、鹽析:濃縮液轉(zhuǎn)入去脂鍋內(nèi)于5min內(nèi)加熱至48~55°C后,立即用冰鹽水降溫至4~5°C，靜置3~4h，分離出下層清液。用鹽酸調(diào)pH2.3~2.5，于20~25°C在攪拌下加入0.25~0.3倍量固體氯化鈉，保溫靜置3~8h，析出沉淀。
[0012]6、洗滌、干燥:過濾，沉淀用丙酮洗滌三次，10~30°C真空干燥，得胰島素，稱重。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
[0014]采用酸醇提取減壓濃縮法提取動物胰臟中的胰島素，可以提高提取胰島素的效率，并且使其理化性質(zhì)和生物活性保持穩(wěn)定，從而有利于下一步對胰島素進行精制，最終使胰島素的各項指標均符合中國藥典標準。更重要的是，通過工藝的不斷改進和完善，使得胰島素收率提高到0.4%~0.6%，節(jié)約成本，提高了經(jīng)濟效益。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0016]實施例1
[0017](I)原料預(yù)處理:胰臟離體后，要立即深凍，先在_30°C以下急凍后轉(zhuǎn)入_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0018](2)酸醇液提取:取凍干胰塊4kg，用刨胰機刨碎后加入11.2L的酸性乙醇(酸性乙醇控制含量為68%，并用冰乙酸調(diào)pH2.5)，，在12°C攪拌提取3h，離心，取上清液10.1L。濾渣再用10.1L酸性乙醇同上述方法提取lh，離心，取上清液。合并兩次提取液。
[0019](3)堿化、酸化:提取液在不斷攪拌下加入濃氨水調(diào)PH8.0(液溫12°C )，立即進行壓濾，除去堿性蛋白，濾液應(yīng)澄清，并及時用硫酸酸化至PH3.6，降溫至5°C，靜置4h，使酸性蛋白充分沉淀。
[0020](4)減壓濃縮:吸上層清液至減壓濃縮鍋內(nèi)，下層用帆布過濾，沉淀物棄去。濾液并入上清液，在20°C下減壓蒸去乙醇，濃縮至濃縮液比重為1.04(約為原體積的I / 10)。
[0021](5)去脂、鹽析:濃縮液轉(zhuǎn)入去脂鍋內(nèi)與5min內(nèi)加熱至50°C后，立即用冰鹽水降溫至5°C，靜置4h，分離出下層清液。用鹽酸調(diào)pH2.3，于20°C在攪拌下加入0.25倍量固體氯化鈉，保溫靜置4h，析出沉淀。
[0022](6)洗滌、干燥:過濾，沉淀用丙酮洗滌三次，20°C真空干燥，得胰島素，稱重20.4g0
[0023]實施例2
[0024](1)原料預(yù)處理:胰臟離體后，要立即深凍，先在_35°C以下急凍后轉(zhuǎn)入_15°C保存?zhèn)溆谩?br> [0025](2)酸醇液提取:取凍干胰塊4kg，用刨胰機刨碎后加入9.2L的酸性乙醇(酸性乙醇控制含量為75%，并用冰乙酸調(diào)pH2.9)，，在10°C攪拌提取3h，離心，取上清液7.95L。濾渣再用7.95L酸性乙醇同上述方法提取lh，離心，取上清液。合并兩次提取液。
[0026](3)堿化、酸化:提取液在不斷攪拌下加入濃氨水調(diào)PH8.3(液溫10°C )，立即進行壓濾，除去堿性蛋白，濾液應(yīng)澄清，并及時用硫酸酸化至PH3.4，降溫至4°C，靜置6h，使酸性蛋白充分沉淀。
[0027](4)減壓濃縮:吸上層清液至減壓濃縮鍋內(nèi)，下層用帆布過濾，沉淀物棄去。濾液并入上清液，在20°C下減壓蒸去乙醇，濃縮至濃縮液比重為1.06(約為原體積的I / 9)。
[0028](5)去脂、鹽析:濃縮液轉(zhuǎn)入去脂鍋內(nèi)與5min內(nèi)加熱至55°C后，立即用冰鹽水降溫至4°C，靜置6h，分離出下層清液。用鹽酸調(diào)pH2.5，于20°C在攪拌下加入0.28倍量固體氯化鈉，保溫靜置6h，析出沉淀。
[0029](6)洗滌、干燥:過濾，沉淀用丙酮洗滌三次，20°C真空干燥，得胰島素，稱重.19.2g0
[0030]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技 術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)原料預(yù)處理；(2)酸醇液提?。?3)酸化、堿化；(4)減壓濃縮；(5)去脂、鹽析。
2.權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，各步驟具體為: (1)原料預(yù)處理:胰臟離體后，立即深凍。 (2)酸醇液提取:胰臟凍干粉粹后，加入酸性乙醇攪拌提取，離心，取上清液。濾渣再用上述方法提取。合并兩次提取液。 (3)堿化、酸化:提取液加入濃氨水調(diào)pH，壓濾，除去堿性蛋白，濾液用硫酸酸化，降溫，靜置，使酸性蛋白充分沉淀。 (4)減壓濃縮:吸上層清液至減壓濃縮鍋內(nèi)，下層過濾，沉淀物棄去。濾液并入上清液，減壓蒸去乙醇，濃縮。 (5)去脂、鹽析:濃縮液加熱降溫去脂。用鹽酸調(diào)pH，加入0.25~0.3倍量固體氯化鈉，保溫靜置，析出沉淀。 (6)洗滌、干燥:過濾，沉淀用丙酮洗滌，真空干燥，得胰島素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法，其特征在于，所述胰臟為牛胰臟或豬胰臟。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，胰臟采用-20~_40°C速凍法，貯存溫度為-15~28°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法，其特征在于，所述步驟⑵中酸醇液pH為2.0~2.9，乙醇含量為60%~75%，攪拌溫度為8~15°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法，其特征在于，所述步驟(3)中堿化pH為7.8~8.5，酸化pH為3.4~3.8。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法，其特征在于，所述步驟(4)中采用減壓濃縮法蒸去乙醇，溫度為25~35°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法，其特征在于，所述步驟(5)中濃縮液加入去脂鍋內(nèi)迅速加熱降溫去脂，加熱去脂的溫度為:45~52°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法，其特征在于，所述步驟(6)中采用電熱真空干燥箱進行干燥。
【文檔編號】C07K14/625GK103724426SQ201310638708
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】劉乃山, 李靜潔, 劉君, 張曉涵 申請人:青島康原藥業(yè)有限公司