高速逆流色譜從紅花籽粕中制備5-羥色胺衍生物方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及天然藥物的分離制備方法，具體涉及高速逆流色譜法從紅花籽粕中分離制備2個(gè)5-羥色胺衍生物的方法。高速逆流色譜的固定相和流動(dòng)相由氯仿、甲醇和0.1mol/LHCL水混合后分層，下相作為固定相，上相作為流動(dòng)相。本發(fā)明不需要使用固相載體，無不可逆吸附，操作方便，條件固定，易于重復(fù)，樣品無損失、無污染、高效、快速、低成本分離制備5-羥色胺衍生物，獲得的N-(p-香豆酰)5-羥色胺和阿魏酰5-羥色胺單體純度可達(dá)95％以上，可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】高速逆流色譜從紅花籽粕中制備5-羥色胺衍生物方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及天然藥物的分離方法，具體涉及高速逆流色譜法從紅花籽柏中分離制備2個(gè)5-羥色胺衍生物的方法。
【背景技術(shù)】 [0002]^LlACarthamus tinctorius L.)菊科屬植物,是一種藥、油、染料、飼料兼用的經(jīng)濟(jì)作物。紅花籽，中藥習(xí)稱“白平子”，是紅花的種子。紅花籽柏是紅花籽榨取油后的剩下廢棄物，多用作肥料和飼料，對(duì)其中的化學(xué)成分研究較少。近年來，國(guó)外對(duì)紅花籽柏中的一些微量成分進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)紅花籽柏中的5-羥色胺衍生物具有極強(qiáng)的清除自由基和活性抗氧化性,并可以調(diào)節(jié)人體內(nèi)免疫反應(yīng),抑制腫瘤、保護(hù)人體中的NK細(xì)胞免受程序性死亡、強(qiáng)烈抑制黑色素生成等活性。紅花籽柏中的N-阿魏酰5-羥色胺和N-1p-香豆酰)5-羥色胺，具有保護(hù)心臟功能，預(yù)防心肌機(jī)能發(fā)生障礙，可以促進(jìn)心肌運(yùn)動(dòng)。有的研究還表明，N-(P-香豆酰)5-羥色胺可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，并且將會(huì)是一種很好的抗炎藥物，對(duì)人類的健康有重要的意義。
[0003]紅花籽柏中5-羥色胺衍生物傳統(tǒng)的色譜分離手段不能實(shí)現(xiàn)對(duì)其高效、快速分離。傳統(tǒng)研究中，通常使用多步硅膠柱層析以及聯(lián)用制備液相等方法分離制備紅花中5-羥色胺衍生物，不僅耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，不能在線檢測(cè)，也會(huì)造成死吸附，損失較大，得率較低。
[0004]高速逆流色譜(high-speedcountercurrent chromatography, HSCCC)是一種連續(xù)高效的液-液分配色譜技術(shù)，由于不需要固體支撐體，物質(zhì)的分離依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而實(shí)現(xiàn)，因而避免了因不可逆吸附而引起的樣品損失、失活、變性等，樣品的理論回收率為100%，特別適合于天然物活性成分的分離。利用高速逆流色譜從紅花中分離制備5-羥色胺衍生物的工業(yè)化生產(chǎn)，目前尚未見國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)和專利報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開了高速逆流色譜從紅花籽柏中分離制備香豆酰)5_羥色胺和阿魏酰5-羥色胺的方法，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。
[0006]本發(fā)明可以通過以下措施實(shí)現(xiàn):
高速逆流色譜分離紅花籽柏中2個(gè)5-羥色胺衍生物的方法包括以下步驟:
①將氯仿、甲醇和0.1 mol/L HCL水溶液混合成混合溶劑，分層；
②將5-羥色胺衍生物粗提物溶于①步驟的下層中；
③取①步驟混合溶劑分層，下相作為固定相，上相作為流動(dòng)相，將固定相和流動(dòng)相先后泵入高速逆流色譜內(nèi)，將②步驟溶液經(jīng)進(jìn)樣閥進(jìn)入色譜柱，進(jìn)樣完畢后繼續(xù)泵入流動(dòng)相；
④依據(jù)檢測(cè)器譜圖分別收集分離物，濃縮，即得香豆酰)5_羥色胺和阿魏酰5-羥色胺單體。
[0007]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明利用高速逆流色譜并采用了合理的溶劑體系從紅花中獲得高純度的香豆酰)5-羥色胺和阿魏酰5-羥色胺單體，該技術(shù)不需要使用固相載體，無不可逆吸附，樣品無損失、無污染、高效、快速、低成本分離制備5-羥色胺衍生物，獲得的5-羥色胺衍生物純度可達(dá)95%以上。
[0008]本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、操作方便、安全、重復(fù)性好，可工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]本發(fā)明一種運(yùn)用高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法有如下附圖:
圖1是本發(fā)明高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法2個(gè)5-羥色胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；
圖2是本發(fā)明高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法5-羥色胺衍生物譜圖；
圖3是本發(fā)明高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法5 —羥色胺衍生物提物液相檢測(cè)圖；
圖4是本發(fā)明高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法N —阿魏酰5-羥色胺衍生物單體液相檢測(cè)圖；
圖5是本發(fā)明高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法N-(P-香豆酰)5-羥色胺衍生物單體液相檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明高速逆流色譜從紅花籽柏中制備2個(gè)5-羥色胺衍生物方法技術(shù)方案作進(jìn)一步·描述。
[0011]如圖1 一圖5所示，本發(fā)明高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法包括以下步驟:
①將氯仿、甲醇和0.1 mol/L HCL水溶液混合成混合溶劑，分層；
②將5-羥色胺衍生物粗提物溶于①步驟的下層中；
③取①步驟混合溶劑分層，下相作為固定相，上相作為流動(dòng)相，將固定相和流動(dòng)相先后泵入高速逆流色譜內(nèi)，將②步驟溶液經(jīng)進(jìn)樣閥進(jìn)入色譜柱，進(jìn)樣完畢后繼續(xù)泵入流動(dòng)相；
④依據(jù)檢測(cè)器譜圖分別收集分離物，濃縮，即得香豆酰)5_羥色胺和阿魏酰5-羥色胺單體。
[0012]所述的步驟①中的氯仿、甲醇和0.1 mol/L HCL水溶液的體積比為3~5: 4:
3~5。
[0013]所述的步驟②中5-羥色胺衍生物粗提物溶于混合溶劑后的濃度為10~30 mg/
mLo
[0014]所述的5-羥色胺衍生物粗提物由下列方法制備:將紅花籽柏按液料比5~20:1回流提取0.5~2 h，提取I~3次合并提取液，濃縮至干，用60~90%甲醇溶解，等體積正己烷萃取，取甲醇相蒸干，用乙酸乙酯溶解，然后等體積水萃取，取乙酸乙酯相蒸干備用。
[0015]所述的高速逆流色譜儀流速范圍為I~3 mL/min,轉(zhuǎn)速范圍為600~900 r/min。
[0016]所述的檢測(cè)波長(zhǎng)為210~360nm。[0017]實(shí)施例一:
1、5-羥色胺衍生物粗提物制備
取紅花籽柏300 g用無水乙醇(液料比:15:1)回流提取I h，提取3次合提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，500 ml 80%甲醇溶解，等體積正己烷萃取，取甲醇相蒸干，300 ml乙酸乙酯溶解，然后等體積水萃取，取乙酸乙酯相蒸干備用。
[0018]2、高速逆流分離制備5-羥色胺衍生物
在分液漏斗中配制氯仿-甲醇-0.1 mol/L HCL水(1: 1: 1，v/v)兩相溶劑系統(tǒng)，充分振搖后靜置過夜。下相為固定相，上相為流動(dòng)相，使用前分別超聲脫氣30 min0取100 mg待分離樣品粉末，震蕩完全溶解于10 mL下相溶液中，備用。
[0019]用15 mL/min流速將溶劑系統(tǒng)下相泵入主機(jī)并充滿分離螺線管，開啟循環(huán)水浴并將溫度設(shè)定為25 °C。開啟主機(jī)電源以850 r/min正向旋轉(zhuǎn)，待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以1.5 mL/min流速泵入流動(dòng)相，待流動(dòng)相從管柱出口流出且基線穩(wěn)定后，將樣品溶液由進(jìn)樣圈注入。管柱出口處流出液在310 nm波長(zhǎng)下連續(xù)檢測(cè)，根據(jù)如圖2所示色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分，從100 mg待分離樣品中一次性分離制備得到18.5 mg Ar-香豆酰)5-輕色胺和16.9 mg阿魏酰5-羥色胺。HPLC檢測(cè)純度分別為97.3%和98.8%，如圖4、圖5所示。
[0020]HPLC 分析條件:色譜柱:Eslipse XDB C18 (4.6 mm*250 mm, 5 ym),流動(dòng)相:甲醇-水(35:65 ~45:55，O ~15 min ;45:55 ~52:48，15 ~30 !11；[11),流速1.0 mL/min,柱溫25 °C，檢測(cè)波長(zhǎng)310 nm。
[0021]3、結(jié)構(gòu)鑒定
峰 I =1H-NMR (DMSO-Or6, 400 MHz) δ= 2.97 (2Η, t)，3.55 (2H, t)，6.37 (1H, d,/=15.5 Hz), 6.70 (1H, d, /=7.5 Hz), 6.81 (1H, d, /=8.5 Hz), 6.82 (1H, d, /=8.5Hz), 6.95 (1H, d, /=2.5 Hz), 7.07 (1H, S)，7.18 (1H, d, / = 8.7 Hz), 7.40 (2H,d, /= 8.5 Hz), 7.43 (1H, d, / = 15.5 Hz) ; (DMSO-Or6, 400 MHz) S= 25.071 (C-1O),40.03 (C-ll), 102.11 (C_4)，111.08 (C_6)，111.39 (C_7)，111.51 (C_3)，115.24(C-3' 50，117.38 (C-8 0，122.77 (C_2)，126.71 (C—1)，128.17 (C_9)，129.35(C-2' 60，131.86 (C-8), 140.47 (C-7 ^), 149.82 (C_5)，159.32 (C-40，167.98(CO)。確定為化合物#-(/7-香豆酰)5-羥色胺。
[0022]化合物2，粉末狀。1H-NMR ((DMSO-J6, 400 MHz) S= 2.97 (2H, t)，3.56 (2H,t), 3.86 (3H), 6.38 (1H, d, /=15.5 Hz), 6.71 (1H, d, /=2.5 Hz), 6.82 (1H, d,/=8.5 Hz), 6.95 (1H, d, /=2.5 Hz), 7.05 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.07 (1H, S)，7.15(1H, d, / = 1.5 Hz), 7.18 (1H, d, /=8.7 Hz), 7.42 (1H, d, / = 15.5 Hz) ; 13C-NMR(DMS0-14, 400 MHz) δ= 25.07 (C-10), 40.09 (C-ll), 54.99 (OCH3), 102.13 (C_4)，110.51 (C-60, 111.10 (C_6)，111.41 (C-7), 111.55 (C_3)，115.24 (C-30，117.68(C-8 ^), 121.97 (C-2，)，122.98 (C_2)，127.11 (C-1), 128.25 (C_9)，131.92(C-8), 140.69 (C-7 0, 147.95 (C-5 0, 148.60 (C-40, 149.87 (C_5)，167.95 (CO)。確定為化合物阿魏酰5-羥色胺。
[0023]實(shí)施例二:
1、5-羥色胺衍生物粗提物制備
5-羥色胺衍生物粗提物制備同實(shí)施例一。[0024]2、高速逆流分離制備5-羥色胺衍生物
在分液漏斗中配制氯仿-甲醇-0.1 mol/L HCL水(3.5:4:4.5，v/v)兩相溶劑系統(tǒng)，充分振搖后靜置過夜。下相為固定相，上相為流動(dòng)相，使用前分別超聲脫氣30 min。取120mg待分離樣品粉末，震蕩完全溶解于10 mL下相溶液中，備用。
[0025]用15 mL/min流速將溶劑系統(tǒng)下相泵入主機(jī)并充滿分離螺線管，開啟循環(huán)水浴并將溫度設(shè)定為25 °C。開啟主機(jī)電源以850 r/min正向旋轉(zhuǎn)，待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以2.0 mL/min流速泵入流動(dòng)相，待流動(dòng)相從管柱出口流出且基線穩(wěn)定后，將樣品溶液由進(jìn)樣圈注入。管柱出口處流出液在310 nm波長(zhǎng)下連續(xù)檢測(cè)，根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分，從120 mg待分離樣品中一次性分離制備得到19.8 mg香豆酰)5_羥色胺和17.4 mg阿魏酰5-羥色胺。HPLC檢測(cè)純度分別為96.5%和97.7%。
[0026]實(shí)施例三:
1、5-羥色胺衍生物粗提物制備
5-羥色胺衍生物粗提物制備同實(shí)施例一。
[0027]2、高速逆流分離制備5-羥色胺衍生物
在分液漏斗中配制氯仿-甲醇-0.1 mol/L HCL水(1: 1: 1，v/v)兩相溶劑系統(tǒng)，充分振搖后靜置過夜。下相為固定相，上相為流動(dòng)相，使用前分別超聲脫氣30 min。取100 mg待分離樣品粉末，震蕩完全溶解于10 mL下相溶液中，備用。
[0028]用15 mL/min流速將溶劑系統(tǒng)下相泵入主機(jī)并充滿分離螺線管，開啟循環(huán)水浴并將溫度設(shè)定為25 °C。開啟主機(jī)電源以800 r/min正向旋轉(zhuǎn)，待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以2.5 mL/min流速泵入流動(dòng)相，待流動(dòng)相從管柱出口流出且基線穩(wěn)定后，將樣品溶液由進(jìn)樣圈注入。管柱出口處流出液在280 nm波長(zhǎng)下連續(xù)檢測(cè)，根據(jù)色譜圖(見圖2)手動(dòng)收集各色譜峰組分，從100 mg待分離樣品中一次性分離制備得到18.2 mg Ar-(p-香豆酰)5-輕色胺和16.3 mg阿魏酰5-羥色胺。HPLC檢測(cè)純度分別為96.5%和97.1%。
[0029]實(shí)施例四:
1、5-羥色胺衍生物粗提物制備
取紅花籽柏500 g用無水乙醇(液料比:10:1)回流提取1.5 h，提取3次合提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，700 ml 70%甲醇溶解，等體積正己烷萃取，取甲醇相蒸干，500 ml乙酸乙酯溶解，然后等體積水萃取，取乙酸乙酯相蒸干備用。
[0030]2、高速逆流分離制備5-羥色胺衍生物
在分液漏斗中配制氯仿-甲醇-0.1 mol/L HCL水(1: 1: 1，v/v)兩相溶劑系統(tǒng)，充分振搖后靜置過夜。下相為固定相，上相為流動(dòng)相，使用前分別超聲脫氣30 min。取100 mg待分離樣品粉末，震蕩完全溶解于10 mL下相溶液中，備用。
[0031]用15 mL/min流速將溶劑系統(tǒng)下相泵入主機(jī)并充滿分離螺線管，開啟循環(huán)水浴并將溫度設(shè)定為25 °C。開啟主機(jī)電源以850 r/min正向旋轉(zhuǎn)，待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以1.5 mL/min流速泵入流動(dòng)相，待流動(dòng)相從管柱出口流出且基線穩(wěn)定后，將樣品溶液由進(jìn)樣圈注入。管柱出口處流出液在310 nm波長(zhǎng)下連續(xù)檢測(cè)，根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分，從100 mg待分離樣品中一次性分離制備得到18.5 mg香豆酰)5_羥色胺和16.9 mg阿魏酰5-羥色胺。HPLC檢測(cè)純度分別為97.3%和98.8%。
[0032]實(shí)施例五:1、5-羥色胺衍生物粗提物制備
取紅花籽柏I kg用無水乙醇(液料比:15:1)回流提取2 h，提取2次合提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，1000 ml 85%甲醇溶解，等體積正己烷萃取，取甲醇相蒸干，600 ml乙酸乙酯溶解，然后等體積水萃取，取乙酸乙酯相蒸干備用。
[0033]2、高速逆流分離制備5-羥色胺衍生物
在分液漏斗中配制氯仿-甲醇-0.1 mol/L HCL水(4:5:5，v/v)兩相溶劑系統(tǒng)，充分振搖后靜置過夜。下相為固定相，上相為流動(dòng)相，使用前分別超聲脫氣30 min。取150 mg待分離樣品粉末，震蕩完全溶解于10 mL下相溶液中，備用。
[0034]用15 mL/min流速將溶劑系統(tǒng)下相泵入主機(jī)并充滿分離螺線管，開啟循環(huán)水浴并將溫度設(shè)定為25 °C。開啟主機(jī)電源以850 r/min正向旋轉(zhuǎn)，待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以2.0 mL/min流速泵入流動(dòng)相，待流動(dòng)相從管柱出口流出且基線穩(wěn)定后，將樣品溶液由進(jìn)樣圈注入。管柱出口處流出液在260 nm波長(zhǎng)下連續(xù)檢測(cè)，根據(jù)色譜圖手動(dòng)收集各色譜峰組分，從150 mg待分離樣品中一次性分離制備得到23.5 !^#-&-香豆酰)5-羥色胺和20.7 mg阿魏酰5-羥色胺。HPLC檢測(cè)純度分別為95.7%和96.3%。
【權(quán)利要求】
1.一種高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟: ①將氯仿、甲醇和0.1 mol/L HCL水溶液混合成混合溶劑，分層； ②將5-羥色胺衍生物粗提物溶于①步驟的下層中； ③?、俨襟E混合溶劑分層，下相作為固定相，上相作為流動(dòng)相，將固定相和流動(dòng)相先后泵入高速逆流色譜內(nèi)，將②步驟溶液經(jīng)進(jìn)樣閥進(jìn)入色譜柱，進(jìn)樣完畢后繼續(xù)泵入流動(dòng)相； ④依據(jù)檢測(cè)器譜圖分別收集分離物，濃縮，即得香豆酰)5_羥色胺和阿魏酰5-羥色胺單體。
2.如權(quán)利要求1所述的高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法，其特征在于:所述的步驟①中的氯仿、甲醇和0.1 mol/L HCL水溶液的體積比為3~5: 4: 3~5。
3.如權(quán)利要求1所述的高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法，其特征在于:所述的步驟②中5-羥色胺衍生物粗提物溶于混合溶劑后的濃度為10~30 mg/mL。
4.如權(quán)利要求1或3所述的高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法，其特征在于所述的5-羥色胺衍生物粗提物由下列方法制備:將紅花籽柏按液料比5~20:1回流提取0.5~2 h，提取I~3次合并提取液，濃縮至干，用60~90%甲醇溶解，等體積正己烷萃取，取甲醇相蒸干，用乙酸乙酯溶解，然后等體積水萃取，取乙酸乙酯相蒸干備用。
5.如權(quán)利要求1所述的高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法，其特征在于:所述的高速逆流色譜儀流速范圍為I~3 mL/min，轉(zhuǎn)速范圍為600~900 r/min。
6.如權(quán)利要求1所述的高速逆流色譜從紅花籽柏中制備5-羥色胺衍生物方法，其特征在于:所述的檢測(cè)波長(zhǎng)為210~360nm。
【文檔編號(hào)】C07D209/16GK103588696SQ201310402221
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】丁晨旭, 李文聰, 王小艷, 張秋龍, 王洪倫, 索有瑞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所