肽聚糖結(jié)合蛋白BjApextrin2及其基因、生產(chǎn)方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及兩個(gè)肽聚糖結(jié)合蛋白及其編碼基因BjApextrin1和BjApextrin2，以及該蛋白在制備治療感染性疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)已有的EST序列通過5′RACE和3′RACE,從中國文昌魚的消化道中分離得到文昌魚BjApextrin1和BjApextrin2基因,其DNA序列如序列表中序列1和序列2所示。該基因編碼的蛋白（BjApextrin1和BjApextrin2），其氨基酸序列如序列表中序列3和序列4所示。本發(fā)明的基因BjApextrin1和BjApextrin2編碼的蛋白能夠識(shí)別和凝集革蘭氏陽性菌，并且特異結(jié)合細(xì)菌表面的生物大分子肽聚糖，可用于作為制備治療感染性疾病的藥物。
【專利說明】肽聚糖結(jié)合蛋白BjApextr in2及其基因、生產(chǎn)方法和應(yīng)用
[0001]本申請是申請?zhí)?01210439488.9、申請日為2012年I月6日，發(fā)明名稱為“肽聚糖結(jié)合蛋白BjApextrinl和BjApextrin2及其基因、生產(chǎn)方法和應(yīng)用”的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種新穎的肽聚糖結(jié)合蛋白基因及其編碼的蛋白BjApextrinl和BjApextrin2，以及該蛋白在制備治療感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]文昌魚屬于脊索動(dòng)物門(Chordata),頭索動(dòng)物亞門(Cephalochordata),是無脊椎動(dòng)物進(jìn)化到脊椎動(dòng)物的過渡類型，是五億年前脊椎動(dòng)物原始祖先的相似模型，一直以來是研究脊椎動(dòng)物發(fā)育的好材料。近年來，對文昌魚的免疫的研究引起了廣泛的重視，在其中發(fā)現(xiàn)了不少具有重要意義的免疫基因。
[0004]肽聚糖(Peptidoglycan, PGN)是幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁的主要成分之一,尤其富含于革蘭氏陽性菌中，也是宿主感知病原菌入侵、激活免疫反應(yīng)的一種重要的病源相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)。妝聚糖可以被多種模式識(shí)別分子識(shí)別，如肽聚糖識(shí)別蛋白(Peptidoglycan recognition proteins, PGRPs), Toll 樣受體 2 (Toll-like receptor2, TLR2)等。
[0005]Haag等運(yùn)用差顯技術(shù)將胚胎發(fā)育模式不同的海膽進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)Apextrin在直接發(fā)育模式的紅海膽(Heliocidaris erythrogramma)的胚胎中表達(dá)豐度明顯高于間接發(fā)育的結(jié)節(jié)海膽，胚胎原位雜交顯示Apextrin特異表達(dá)于紫海膽胚胎的外胚層。免疫組化實(shí)驗(yàn)證明Apextrin蛋白以分泌 泡的形式儲(chǔ)存在卵細(xì)胞里面，在卵細(xì)胞完成受精以后逐漸開始分泌，當(dāng)胚胎在囊胚期極化之后Apextrin蛋白就定位于胚胎頂端胞外基質(zhì)，故稱其為頂端胞外基質(zhì)蛋白(Apical extracellular matrix protein, Apextrin)。隨后人們又分別在水螅，珊瑚中發(fā)現(xiàn)Apextrin基因,胚胎原位雜交顯示Apextrin也可能參與了水螅和珊瑚的胚胎發(fā)育過程。
[0006]文昌魚Apextrin基因的表達(dá)量在細(xì)菌刺激12h后上調(diào)了上千倍；紅海膽在受到弧菌感染20h之后Apextrin蛋白的表達(dá)量也顯著增加。我們發(fā)現(xiàn)文昌魚的Apextrin可以能夠識(shí)別和凝集革蘭氏陽性菌，并且特異結(jié)合細(xì)菌表面的生物大分子肽聚糖，可用于作為制備治療感染性疾病的藥物，在養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種新的肽聚糖結(jié)合蛋白BjApextrinl和BjApextrin2及編碼該蛋白的基因。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供該蛋白的生產(chǎn)方法。
[0009]本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供該蛋白在制備治療感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明根據(jù)已有的EST序列通過5'和3' RACE，從中國文昌魚的消化道中分離得到文昌魚BjApextrinl和BjApextrin2基因，其DNA序列如序列表中序列I和序列2序列所示。
[0011]本發(fā)明所述基因編碼的蛋白BjApextrinl和BjApextrin2,其氨基酸序列如序列表中序列3和序列4序列所不；該蛋白等電點(diǎn)分別為6.05和5.03,分子量分別為56，671和52，516道爾頓。
[0012]BjApextrinl和BjApextrin2克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET32a上,得到重組表達(dá)載體 pET32a_BjApextrinl 和 pET32a_BjApextrin2。
[0013]該蛋白可以通過表達(dá)載體pET32a_BjApextrinl和pET32a_BjApextrin2在大腸桿菌以不溶的包涵體形式表達(dá)。
[0014]所述表達(dá)載體pET32a_BjApextrinl和pET32a_BjApextrin2以硫氧還蛋白為融合表達(dá)伴體，該系統(tǒng)使表達(dá)的BjApextrinl和BjApextrin2包涵體在硫氧還蛋白的幫助下通過變復(fù)性正確折疊成為可溶的蛋白。
[0015]本發(fā)明所選擇的青島文昌魚(Branchiostoma japonicum)采集于山東省沙子口水域。
[0016]本發(fā)明根據(jù)已有的EST序列通過5'和3' RACE，從中國文昌魚的消化道中分離得到文昌魚BjApextrinl和BjApextrin2基因(其DNA序列如序列表中序列I和序列2序列所示)。分別編碼504和462個(gè)氨基酸(其氨基酸序列如序列表中序列3和序列4序列所示)，等電點(diǎn)分別為6.05和5.03，分子量分別為56，671和52，516道爾頓。
[0017]本發(fā)明通過設(shè)計(jì)了兩對引物,將基因BjApextrinl和BjApextrin2克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET32a (Novagen公司)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)。表達(dá)載體pET32a-BjApextrinl和pET32a_BjApextrin2以硫氧還蛋白為融合表達(dá)伴體,該系統(tǒng)使表達(dá)的BjApextrinl和BjApextrin2包涵體在硫氧還蛋白的幫助下通過變復(fù)性正確折疊成為可溶的蛋白。該重組蛋白分別編碼670和628個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)分別為5.80和5.14，分子量分別為74，374和70，219道爾頓。通過對培養(yǎng)時(shí)間，誘導(dǎo)時(shí)間，溫度等條件的摸索和優(yōu)化，BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白的表達(dá)量較高,絕大部分以不可溶包涵體形式存在。
[0018]本發(fā)明還摸索和優(yōu)化了 BjApextrinl和BjApextrin2重組蛋白的純化條件,菌體進(jìn)行超聲破碎后，離心取沉淀進(jìn)行變復(fù)性可以得到較純的蛋白。
[0019]本發(fā)明的表達(dá)質(zhì)粒復(fù)制方法:參照Sambrook (Sambrook, et al.1989, Moleculardoing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法,用 CaCl2 的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.col1.DH5a或BL21 (DE3)菌株，用含氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌株,用Omega公司試劑盒提取質(zhì)粒。
[0020] 本發(fā)明通過細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)證明了該重組蛋白具有結(jié)合革蘭氏陽性細(xì)菌的活性。細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)表明該重組蛋白能夠使糞場球菌和黃色葡萄球菌發(fā)生凝集。酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-1 inked-1mmunosorbent assay, ELISA)表明該重組蛋白可以特異性地于肽聚糖結(jié)合，融合蛋白和肽聚糖做下拉實(shí)驗(yàn)(Pulldown assay)表明該重組蛋白對肽聚糖的結(jié)合活性隨肽聚糖濃度的增加而增強(qiáng)。
[0021]通過構(gòu)建缺失突變體我們發(fā)現(xiàn)BjApextrinl的模式識(shí)別功能是由C端的一段保守序列決定的?！緦＠綀D】

【附圖說明】 [0022]圖1a及圖1b 分別為 5' RACE和 3' RACE擴(kuò)增得到的BjApextrinl 和BjApextrin2基因目的片段。1.5' RACE擴(kuò)增片段；2.3' RACE擴(kuò)增片段；3.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)。
[0023]圖2a及圖2b分別為擴(kuò)增得到的BjApextrinl和BjApextrin2基因全長片段。
[0024]圖3 為重組表達(dá)質(zhì)粒 pET32a_BjApextrinl 和 pET32a_BjApextrin2 構(gòu)建圖。
[0025]圖4a及圖4b分別為重組BjApextrinl和BjApextrin2蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、變復(fù)性純化電泳圖。M,蛋白質(zhì)marker; I,未誘導(dǎo)的超聲上清；2，未誘導(dǎo)的超聲沉淀；3，誘導(dǎo)的超聲上清；4，誘導(dǎo)的超聲沉淀；5,純化后的TRX-Apextrinl和TRX-Apextrin2。
[0026]圖5為重組蛋白BjApextrinl和BjApextrin2的細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果:將約2 X IO7個(gè)各種不同的細(xì)菌用TBS (ρΗ7.5)洗滌平衡后，與Iyg目的蛋白在Iml TBS (ρΗ7.5)緩沖液中4°C振蕩孵育過夜；41:、12000\8離心11^11，沉淀用Iml TBS緩沖液洗5遍；用100 μ ITBS重懸菌體，再加入20 μ 16 X上樣緩沖液，混勻后沸煮IOmin ;然后進(jìn)行Western blot分析，用His單克隆抗體來檢測目的蛋白，Sepharose4B bead作為陰性對照進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。
[0027]圖6為重組蛋白BjApextrinl和BjApextrin2的細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果:將FITC標(biāo)記過的糞腸球菌和金黃色葡萄球菌與重組蛋白共孵育，在熒光顯微鏡下面觀測微生物的凝集情況。
[0028]圖7a及圖7b分別為重組蛋白BjApextrinl和BjApextrin2與細(xì)菌細(xì)胞壁純組分的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果:重組蛋白分別與LPS，LTA, PGN, Mannan和Zymosan進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。
[0029]圖8為重組蛋白BjApextrinl和BjApextrin2與肽聚糖Pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果:將I μ g目的蛋白分別與5，10，20，50 μ g的PGN進(jìn)行Pul I down實(shí)驗(yàn)。
[0030]圖9為重組蛋白BjApextrinl缺失突變體誘導(dǎo)表達(dá)、變復(fù)性純化電泳圖。M,蛋白質(zhì)marker ;第I泳道，未誘導(dǎo)的TRX- Δ C超聲上清；第2泳道，未誘導(dǎo)的TRX- Δ C超聲沉淀；第3泳道，誘導(dǎo)的TRX- Δ C超聲上清；第4泳道，誘導(dǎo)的TRX- Δ C超聲沉淀；第5泳道，純化后的TRX- Λ C ;第6泳道，未誘導(dǎo)的TRX- Δ N超聲上清?’第7泳道，未誘導(dǎo)的TRX- Δ N超聲沉淀；第8泳道，誘導(dǎo)的TRX- Δ N超聲上清；第9泳道，誘導(dǎo)的TRX- Δ N超聲沉淀；第10泳道，純化后的TRX- Δ N。
[0031]圖1Oa和IOb分別為重組蛋白BjApextrinl缺失突變體與金黃色葡萄球菌來源地的肽聚糖PGN (S.a)和枯草芽孢桿菌來源的肽聚糖PGN (B.s)的ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0032]以下實(shí)施將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0033]實(shí)施例1:中國文昌魚消化道總RNA的提取和cDNA的合成
[0034]總RNA的提取和RACE cDNA合成:收集中國文昌魚消化道，采用Trizol試劑法提取消化道總RNA。取I μ g總RNA，按照Τ0Υ0Β0公司的cDNA —鏈合成試劑盒(ReverTraAce- a -?, code N0.FSK-100)說明合成 cDNA—鏈。米用 Invitrogen 的 GeneRacer? Kit按照說明合成RACE cDNA—鏈。
[0035]實(shí)施例2:RACE 擴(kuò)增 BjApextrinl 和 BjApextrin2 基因 5'和 3'末端。[0036]根據(jù)已知的EST序列設(shè)計(jì)BjApextrinl的5' RACE擴(kuò)增的基因特異性引物為5' -GSP:5/ -CGTCATCTTCATCGTCCCA ACGGAA-3' ;BjApextrinl 的 3' RACE 擴(kuò)增的基因特異性引物為 3 ' -GSP: 5 ' -TTCCGCTTGGGACGATGAAGATG-3 '。BjApextrin2 的 5 ' RACE擴(kuò)增的基因特異性引物為 5' -GSP:5/ -CGTCTTCATCGTCCCACCGGAA-3 ' ;BjApextrin2 的3' RACE 擴(kuò)增的基因特異性引物為 3' -GSP: 5 ; -TTCCGGTGGGACGATGAAGAC-3 '。采用Takara公司的LA Taq聚合酶按照GeneRacer? Kit的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增得到的目前片段如圖1。將目的片段連接到pGEX Teasy vector(promega)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑選重組克隆測序。將5' RACE和3' RACE的測序結(jié)果進(jìn)行拼接后得到了 BjApextrinl和BjApextrin2基因的全長序列。BjApextrinl的全長序列含有一個(gè)長度為1515bp的開放閱讀框(open reading frame, 0RF),編碼504個(gè)氨基酸的蛋白；BjApextrin2的全長序列含有一個(gè)長度為1389bp的開放閱讀框(open reading frame, 0RF),編碼462個(gè)氨基酸的蛋白。
[0037]實(shí)施例3:BjApextrinl和BjApextrin2基因全長序列的擴(kuò)增及分析。
[0038]根據(jù)上面拼接得到的序列設(shè)計(jì)BjApextrinl基因全長序列的PCR引物 5 ' -AACGGCGGTTCTTCTCTGA-3 '和 5 ' -TGTAGTCGCATCAAGCTCTTTATT-3 '；BjApextrin2 基因全長序列的 PCR 引物 5 ' -CAAAGGAACGTCAGAACATTC-3 '和5' -TTTAGAGTGAGCCAGTTTGT-3'，采用 Takara 的 LA Taq 聚合酶擴(kuò)增 BjApextrinl 的全基因，分別擴(kuò)增得到的1578bp和1433bp片段的，電泳圖譜如圖2。將擴(kuò)增得到的目的片段連接到pGEX Teasy vector后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑選重組克隆測序。對測序結(jié)果進(jìn)行分析表明，獲得了 BjApextrinl和BjApextrin2基因全長序列。
[0039]實(shí)施例4:重組 pET32a_BjApextrinl 和 pET32a_BjApextrin2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0040]根據(jù)BjApextrinl基因的序列合成一對引物，上游引物含BamH I切割位點(diǎn)，下游引物含Xho I切割位點(diǎn)。
[0041]上游引物(FL-Fl):
[0042]5' -CGCGGATCCGCACCGACCGAAGTCGTACA-3'
[0043]BamH I
[0044]下游引物(FL-Rl):
[0045]5' -CCGCTCGAGCGAATAGTAACAGTAGTG GAGTCT-3'
[0046]Xho I
[0047]根據(jù)BjApextrin2基因的序列合成一對引物，上游引物含BamHI切割位點(diǎn)，下游引物含Xho I切割位點(diǎn)。
[0048]上游引物(FL-F2):
[0049]5' -GGAAGATCTATGAAATTCGCGCTGCTCG-3'
[0050]Bgl II
[0051]下游引物(FL-R2):
[0052]5' -CCGCTCGAGAGAGTAGTAGCAGTAGTGAATCCG-3'
[0053]Xho I
[0054]分別以含有BjApextrinl和BjApextrin2基因的pGEX Teasy質(zhì)粒為模板，F(xiàn)L-F1/FL-R1和FL-F2/FL-R2為引物PCR擴(kuò)增，得到特異擴(kuò)增的單一條帶，產(chǎn)物大小在1500左右。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到原核融合表達(dá)載體pET32a上，得到重組表達(dá)載體pET32a-BjApextrinl和pET32a_BjApextrin2 (其構(gòu)建過程如圖3所示)。表達(dá)載體中的外源基因序列經(jīng)測序鑒定正確。
[0055]實(shí)施例4:中國文昌魚BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白的表達(dá)和純化
[0056]將pET32a-BjApextrinl 和 pET32a_BjApextrin2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 (DE3)?；蚬こ叹暳呀馍锨逡汉统恋斫?jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，菌株經(jīng)誘導(dǎo)后在超聲裂解沉淀中有明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物帶，分子量與預(yù)測的理論值相符(圖4)。
[0057]對培養(yǎng)時(shí)間、誘導(dǎo)濃度、溫度等條件的摸索得出。基因工程菌的培養(yǎng)條件為:接單菌落于50ml氨芐抗性2 X YT液體培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)過夜，取過夜培養(yǎng)物5ml接種于500ml的氨芐抗性2XYT培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)至0D600=0.6 (擴(kuò)大培養(yǎng)約4h)，加入IOOmM IPTG至終濃度分別為0.1mM，18 °C，250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后離心收集菌體。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，在此條件下BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白的20%以上，處于不溶的包涵體狀態(tài)。將收集的超聲裂解沉淀用TBS緩沖液(50mM Tris.Cl，150mM NaCl, pH7.5，)重懸后，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)以200W的功率，冰上超聲30min (超聲4s,間歇4s), 4°C、12，OOOrpm離心30min。重復(fù)兩次。將得到沉淀按照Ig:50ml比例用8M尿素-TBS溶解，通過加入磁力攪拌器加速其溶解，室溫12，OOOrpm離心溶解液lOmin。將溶解的包涵體上清液裝入已處理的透析袋，把透析袋轉(zhuǎn)移至bufferA (50mM Tris.Cl, pH6.0,150mM NaCl，2mM 還原型谷胱苷肽(GSH)，0.2mM 氧化型谷胱苷肽(6556)，10%甘油，411尿素)，41:透析1211，然后將透析袋轉(zhuǎn)移至1311打6『B (50mM Tris ?Cl,pH6.0,150mM NaCl，2mM GSH，0.2mM GSSG，10%甘油，2M尿素)，4°C透析 12h，再將透析袋轉(zhuǎn)移至 buffer C (50mM 的 Tris.Cl, ρΗ6.0, 150mM NaCl，2mM GSH，0.2mM GSSG, 10% 甘油，IM 尿素)，4°C透析 12h，最后將透析袋轉(zhuǎn)移至 buffer D (50mM Tris *Cl,pH6.0,150mM NaCl, 10%甘油),4°C透析12h,更換新鮮透析buffer D,重復(fù)上一步。復(fù)性蛋白在4°C, 12，OOOrpm離心15min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(圖4)。
[0058]實(shí)施例5:中國文昌魚BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白的細(xì)菌結(jié)合活性分析
[0059]使用的細(xì)菌包括:革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌K12 (Escherichia coli K12)、鰻弧菌(Vibro anguillarum)、副溶血弧菌(Vibro paraheamoIyticus)和醋酸|丐不動(dòng)桿菌(Acinetobacter caloacetius);革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)> 溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、糞場球菌(Enterococcusfaecium)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和黃色微球菌(Micrococcus luteus)。將約2X IO7個(gè)各種不同的細(xì)菌用TBS (pH7.5)洗滌平衡后，與1μ g的BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白在Iml TBS (ρΗ7.5)緩沖液中4°C振蕩孵育過夜;4°C、12000X g離心lmin，沉淀用Iml TBS緩沖液洗5遍；用100 μ I TBS重懸菌體，再加入20 μ 16 X上樣緩沖液，混勻后沸煮IOmin ;然后進(jìn)行Western blot分析,用His單克隆抗體來檢測目的蛋白，Sepharose4B bead作為陰性對照進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。如圖5所不BjApextrinl和BjApextrin2重組蛋白可以結(jié)合革蘭氏陽性細(xì)菌，而不結(jié)合革蘭氏陰性細(xì)菌。
[0060]實(shí)施例6:中國文昌魚BjApextrinl和BjApextrin2重組蛋白的細(xì)菌凝集活性分析
[0061]將糞腸球菌和金黃色葡 萄球菌振蕩培養(yǎng)過夜后，6，OOOrpm離心收集2 X IO9的各種細(xì)菌后，用TBS (ρΗ7.5)清洗2次。加入50μ1 FITC溶液(溶于DMSO，終濃度為10mg/ml)后,用TBS補(bǔ)平至總體積Iml,避光搖晃lh。用TBS清洗7_8遍至溶液無色,最后懸浮在Iml含有IOmM的CaCl2的TBS溶液中備用。在96孔平板上進(jìn)行，每孔加入10 μ I的各種微生物懸浮液(終濃度大約I X 107CFU/ml的細(xì)菌或者I X 106CFU/ml酵母)，10 μ g的目的蛋白，用TBS補(bǔ)平至100 μ 1，混勻后避光靜置I~2h后在熒光顯微鏡下檢測凝集活性。如圖6所示BjApextrinl和BjApextrin2重組蛋白可以結(jié)合糞腸球菌和金黃色葡萄球菌發(fā)生凝集。
[0062] 實(shí)施例7:中國文昌魚BjApextrinl和BjApextrin2重組蛋白的細(xì)菌細(xì)胞壁純組分結(jié)合活性分析
[0063]通過ELISA試驗(yàn)來檢測重組蛋白對細(xì)菌細(xì)胞壁純組分的結(jié)合活性。使用的六種細(xì)菌細(xì)胞壁純組分分別為:來源于金黃色葡萄球菌的肽聚糖(PGN(S.a))、來源于枯草芽胞桿菌的肽聚糖(PGN(B.s))、酵母聚糖(Zymosan)、磷壁酸(Lipoteichoic acid, LTA)、脂多糖(LipopoIysaccharides, LPS)和甘露聚糖(Mannan)。由于 PGN、Mannan 和 Zymosan 均為為不溶物，實(shí)驗(yàn)前將這3種組分重懸在碳酸緩沖液中后用超聲波助溶，離心取上清進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。
[0064]I)包被:用碳酸緩沖液(0.1M NaHC03, 2.5mM Na2C03, pH9.6)溶解各種不同的細(xì)胞壁多糖組分。然后在每一個(gè)聚苯乙烯微量滴定板的反應(yīng)孔中加入20 μ g各組分，補(bǔ)充包被緩沖液至ΙΟΟμ 1，37°C孵育3h (空白對照孔不加入糖組分)。
[0065]2)洗滌:棄去孔內(nèi)溶液，用 200μ I TBST (TBS，0.05% Tween-20)洗 3 次，每次3min。
[0066]3)封閉:加入200 μ I封閉緩沖液(TBST，5%BSA)4°C孵育過夜。次日用TBST洗滌。
[0067]4)加樣:在反應(yīng)孔中加入不同濃度的重組蛋白，置于濕盒中于37°C孵育2h。然后用TBST洗漆,用硫氧還蛋白(thioredoxin, TRX)做陰性對照。
[0068]5)加酶標(biāo)一抗:于各反應(yīng)孔中，加入ΙΟΟμ I新鮮的用封閉緩沖液稀釋的小鼠His單克隆抗體(1:5，000)，置于濕盒中于37°C下孵育lh，洗滌。
[0069]6)加酶標(biāo)二抗:于各反應(yīng)孔中，加入ΙΟΟμ I用封閉緩沖液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 二抗(1:20，000)，置于濕盒中于37°C孵育lh，洗滌。
[0070]7)加底物緩沖液(100 μ g/ml 四甲基聯(lián)苯胺，0.24%Η202, 0.2M Na2HPO4, 0.1M 檸檬酸，pH5.5)顯色:于各反應(yīng)孔中，加入50 μ I TMB顯色液，從加入第一個(gè)孔開始記時(shí)。全部加完后避光37°C孵育IOmin。
[0071]8)終止反應(yīng):從第一孔開始計(jì)時(shí)后lOmin，每孔按照加入底物緩沖液的順序加入50 μ I 終止液(2Μ H2SO4) O
[0072]9)結(jié)果判定:在酶標(biāo)儀上于450nm處，用空白對照孔調(diào)零后測各孔的吸光值。如圖7所示，重組蛋白TRX-BjApextrinl和TRX-BjApextrin2對兩種來源的PGN都有顯著的結(jié)合活性，但是不結(jié)合其他細(xì)胞壁組分。
[0073]實(shí)施例8:中國文昌魚BjApextrinl和TRX_BjApextrin2融合蛋白的細(xì)菌不溶肽聚糖結(jié)合活性分析
[0074]通過Pulldown試驗(yàn)來檢測重組蛋白對不溶肽聚糖(PGN)的結(jié)合活性。將I μ g目的蛋白分別與5，10，20，50 μ g的兩種細(xì)菌來源的PGN在Iml TBS(pH7.5)緩沖液中4°C振蕩孵育過夜；4°C、12000Xg離心lmin，沉淀用Iml TBS緩沖液洗5遍；用100 μ I TBS重懸沉淀，再加入20 μ 16 X上樣緩沖液,混勻后沸煮IOmin ;然后進(jìn)行Western blot分析,用His單克隆抗體來檢測目的蛋白。如圖8所示,重組蛋白TRX-BjApextrinl和RX_BjApextrin2對兩種PGN都有顯著的結(jié)合活性，并且結(jié)合活性隨肽聚糖濃度的增加而增強(qiáng)。
[0075]實(shí)施例9:中國文昌魚BjApextrinl缺失突變體融合蛋白的表達(dá)和純化
[0076]根據(jù)BjApextrinl基因的序列和同源比對的結(jié)果設(shè)計(jì)構(gòu)建缺失突變體的引物，如下:
[0077]Δ C-R:
[0078]5' -CCGCTCGAGCTGTTTGGT AAACCGTTGGAGG-3'
[0079]BamH I
[0080]Δ N-F:
[0081]5' -CGCGGATCCCAAGGTGAAGT TGCGGCTGT-3'
[0082]Xho I
[0083]以含有BjApextrinl基因的pGEX Teasy質(zhì)粒為模板，用FL-F和Λ C-R為引物PCR擴(kuò)增得到C端缺失的片斷Λ C;用Λ N-F和FL-R為引物PCR擴(kuò)增得到端N缺失的片斷Λ N。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到原核融合表達(dá)載體pET32a上，得到重組表達(dá)載體pET32a_ Λ C和pET32a- Δ N (其構(gòu)建過程 如圖4所示相同)，重組表達(dá)載體經(jīng)測序鑒定正確。
[0084]將pET32a_AC和pET32a_AN質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2KDE3)?；蚬こ叹暳呀馍锨逡汉统恋斫?jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，菌株經(jīng)誘導(dǎo)后在超聲裂解沉淀中有明顯的特異表達(dá)產(chǎn)物帶。重組蛋白的純化條件及過程與實(shí)施例4相同，如圖9所示不溶的包涵體經(jīng)變復(fù)性可得到較純的重組蛋白。
[0085]實(shí)施例10:中國文昌魚BjApextrinl缺失突變體融合蛋白的細(xì)菌肽聚糖結(jié)合活性分析
[0086]用ELISA法檢測重組蛋白TRX- Λ C和TRX- Δ N對細(xì)菌肽聚糖結(jié)合活性，方法與實(shí)施例7相同。如圖10所示，TRX- Δ N對肽聚糖有顯著的結(jié)合活性，而TRX- Δ C沒有。
【權(quán)利要求】
1.一種肽聚糖結(jié)合蛋白BjApextrin2基因，其DNA序列如序列表中序列2所示。
2.由權(quán)利要求1所述BjApextrin2基因編碼的BjApextrin2蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。
3.權(quán)利要求2所述BjApextrin2蛋白的生產(chǎn)方法,按以下步驟進(jìn)行: (1)將權(quán)利要求1所述的BjApeXtrin2基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET32a，得到重組表達(dá)載體 pET32a_BjApextrin2 ； (2)將pET32a-BjApextrin2 轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株 BL21 (DE3)； (3)對轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)在液體培養(yǎng)基2XYT，37°C培養(yǎng)4小時(shí)后加入終濃度為0.2mM的IPTG在18°C誘導(dǎo)過夜； (4)重組中國文昌魚BjApextrin2融合蛋白的純化，具體是將菌液離心收集菌體，進(jìn)行超聲破碎，離心取沉淀進(jìn)行變復(fù)性，得到蛋白。
4.權(quán)利要求2所述的 BjApextrin2蛋白在作為制備治療感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK103468704SQ201310385551
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月6日
【發(fā)明者】徐安龍, 黃光瑞, 黃盛豐, 嚴(yán)信宇, 章玲玲, 楊平 申請人:中山大學(xué)