專利名稱：樺木醇的分離純化及樺木酸的生物和化學轉化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及樺木醇的分離純化及樺木酸的生物和化學轉化方法。
背景技術：
最近二十年，羽扇豆烷系列化合物的三萜類用于多種疾病的治療。其中樺木醇為主要的一種三萜類化合物，廣泛地分布在自然界中，并且被應用于好多領域。因此已有大量
文獻報告樺木醇及其衍生物研究和應用的有重要性。樺木醇及其衍生物的分子結構如下:
權利要求
1.樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉化方法，其特征在于所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉化方法是按照以下步驟進行的: 一、取樺樹皮原料粉碎，水洗后，浸入質量百分含量為2%的氫氧化鈉溶液中，在溫度為20(T240°C，壓力為1.2^3.4MPa的條件下處理3 5min，冷卻至室溫后，用水淋洗樺樹皮原料表面pH至中性，然后在105°C溫度下干燥f2h，得處理原料； 二、在溫度為75°C條件下，采用質量百分含量為95%乙醇對步驟一得到的處理原料進行回餾提取2h，重復回餾提取I次，合并提取液，將提取液蒸發(fā)濃縮至1/20體積，在溫度為5(T60°C條件下過濾，收集濾液，在溫度為4°C條件下結晶，收集結晶物，減壓干燥，得到樺木醇粗品； 三、將步驟二得到的樺木醇粗品用8倍體積的溶液溶解，濾出沉淀，收集上清液，在溫度為4°C的條件下重結晶，收集結晶物，減壓干燥，得到樺木醇結晶品；其中，溶液是由氯仿:無水乙醇按體積比為1:20的比例混合而成； 四、在液體培養(yǎng)基中加入菌培養(yǎng)細胞進行預備培養(yǎng)，得到預備培養(yǎng)液；向預備培養(yǎng)液中加入步驟三得到的樺木醇 結晶品，然后在溫度為25°C 30°C、轉速為200r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)18h，得到樺木酸轉化液，向樺木酸轉化液中加入正己烷，混合均勻，過硅膠層析柱，收集柱層析液，重結晶，得到樺木酸；其中，步驟二中所述的處理原料與質量百分含量為95%乙醇的質量體積比為lg:l(Tl5mL ;步驟四中所述的樺木醇結晶品與預備培養(yǎng)液的質量體積比為Ig:9 llmL，樺木酸轉化液與正己烷的體積比為1:1，所述的菌為優(yōu)化的黃綠蜜環(huán)菌； 其中，所述的黃綠蜜環(huán)菌的菌種優(yōu)化方法如下: a、選取黃綠蜜環(huán)菌的出發(fā)菌株，重懸，吹干，取鏡檢無細胞重疊出發(fā)菌株置于水冷靶臺上平皿內進行N+離子注入，注入能量為20keV ;注入劑量為60X2.6 X IO13 200 X 2.6 X 1013ions / cm2、靶室真空度為2 X 10 ,脈沖注入時間為5s，注入時間間隔為55s，然后用無菌水洗脫，稀釋，涂分離平皿，在恒溫箱中溫度為28°C條件下，培養(yǎng)4飛山挑選與出發(fā)菌菌落形態(tài)不同的單菌落轉接于斜面培養(yǎng)基上，在溫度為28 V的條件下，活化培養(yǎng)4 5(1，制成含孢子數(shù)約KTlO7Cfu / mL的孢子懸浮液； b、將孢子懸浮液按1%的接種量接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，在溫度為28°C、轉速為120r / min的條件下培養(yǎng)2d，再加入底物溶液，繼續(xù)在溫度為28°C、轉速為120r / min的條件下培養(yǎng)4d，測定發(fā)酵液中樺木酸的含量，篩選出樺木酸轉化得率高于黃綠蜜環(huán)菌出發(fā)菌株40-50%的高轉化率菌株，進行連續(xù)傳代5次，即完成黃綠蜜環(huán)菌的菌種優(yōu)化； 所述的斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，按質量百分含量計是由30%的馬鈴薯、2%的葡萄糖、3%的瓊脂和余量的水組成； 發(fā)酵液體培養(yǎng)基，按質量百分含量計是由30%的馬鈴薯、2%的葡萄糖和余量的水組成； 底物溶液為質量百分含量為90%的樺木醇溶解于二甲基亞砜而成的濃度為7 8mg /mL的溶液。
2.根據(jù)權利要求1所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉化方法，其特征在于步驟四中所述的預備培養(yǎng)具體操作如下:取4mnT5mm2斜面培養(yǎng)菌絲體，采用無菌水將黃綠蜜環(huán)菌絲體稀釋成孢子數(shù)含量為106cfu/mL的孢子懸浮液，將孢子懸浮液按1%的接種量接種于液體培養(yǎng)基中，在轉速為120r/min，溫度為25°C 30°C的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48h，得預備培養(yǎng)液；其中，液體培養(yǎng)基為馬鈴薯綜合培養(yǎng)基，按質量百分含量計，是由2%的可溶性淀粉、I %的葡萄糖、0.5%的蛋白胨、0.5%的酵母膏、0.3%的尿素、0.2%的ΚΗΡ04、0.1%的MgSO4.7Η20、0.003%的 FeSO4 和余量的水組成，pH 為 7.0。
3.根據(jù)權利要求1所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉化方法，其特征在于步驟二中所述的處理原料與質量百分含量為95%乙醇的質量體積比為lg:5 8mL。
4.根據(jù)權利要求1所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉化方法，其特征在于步驟四中所述的樺木醇結晶品與預備培養(yǎng)液的質量體積比為Ig:10mL。
5.根據(jù)權利要求1所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的生物轉化方法，其特征在于所述的篩選出樺木酸轉化得率高于黃綠蜜環(huán)菌出發(fā)菌株50%的高轉化率菌株。
6.樺木醇的分離純化及樺木酸的化學轉化方法，其特征在于所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的化學轉化方法 是按照以下步驟進行的: 一、取樺樹皮原料粉碎，水洗后，浸入質量百分含量為2%的氫氧化鈉溶液中，在溫度為20(T240°C，壓力為1.2^3.4MPa的條件下處理3飛min，冷卻至室溫后，用水淋洗樺樹皮原料表面pH至中性，然后在105°C溫度下干燥f2h，得處理原料； 二、在溫度為75°C條件下，采用質量百分含量為95%乙醇對步驟一得到的處理原料進行回餾提取2h，重復回餾提取I次，合并提取液，將提取液蒸發(fā)濃縮至1/20體積，在溫度為5(T60°C條件下過濾，收集濾液，在溫度為4°C條件下結晶，收集結晶物，減壓干燥，得到樺木醇粗品； 三、將步驟二得到的樺木醇粗品用8倍體積的溶液溶解，濾出沉淀，收集上清液在溫度為4°C的條件下重結晶，收集結晶物，減壓干燥，得到樺木醇結晶品；其中，溶液是由氯仿:無水乙醇按體積比為1:20的比例混合而成； 四、取步驟三得到的樺木醇結晶品，在攪拌條件下，用丙酮溶解，然后冷卻至50C 10°C，按樺木醇結晶品與瓊斯試劑摩爾比為1:5 7的比例混合均勻，在溫度為20°C條件下反應3h，過濾，去除沉淀，收集濾液減壓干燥，將干燥后的固相物用乙酸乙酯提取，收集有機相乙酸乙酯，依次用等體積的蒸餾水和等體積的質量百分含量為10%碳酸氫鈉溶液洗滌，然后用無水硫酸鎂干燥，得樺木酮酸粗品；用8 10倍體積乙醚溶解樺木酮酸粗品，過硅膠層析柱，收集柱層析液，減壓干燥，得樺木酮酸純品，然后用硼氫化鈉/四氫呋喃還原，生成樺木酸粗提物；將樺木酸粗提物與甲醇按質量體積比為Ig:20mL的比例混合，加熱煮沸15 20min，冷卻至室溫重結晶，即得樺木酸； 其中，步驟二中所述的處理原料與質量百分含量為95%乙醇的質量體積比為lg:l(Tl5mL ;步驟四中所述的樺木醇結晶品與丙酮的質量體積比為Ig:2飛mL ;步驟四中所述的固相物與乙酸乙酯的質量體積比為Ig:10mL，樺木酮酸純品與硼氫化鈉/四氫呋喃的質量體積比為Ig:3 5mL。
7.根據(jù)權利要求6所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的化學轉化方法，其特征在于步驟二中所述的處理原料與質量百分含量為95%乙醇的質量體積比為lg:5 8mL。
8.根據(jù)權利要求6所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的化學轉化方法，其特征在于步驟四中所述的樺木醇結晶品與丙酮的質量體積比為Ig:3.5mL。
9.根據(jù)權利要求6所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的化學轉化方法，其特征在于步驟四中所述的按樺木醇結晶品與瓊斯試劑摩爾比為1:6的比例混合均勻。
10.根據(jù)權利要求6所述的樺木醇的分離純化及樺木酸的化學轉化方法，其特征在于步驟四中所述的樺木酮酸純品與硼氫化鈉/四氫呋喃的質量體積比為1g:4mL。
全文摘要
樺木醇的分離純化及樺木酸的生物和化學轉化方法，它涉及樺木醇的分離純化及樺木酸的生物和化學轉化方法。本發(fā)明要解決現(xiàn)有制備樺木醇，分離樺木酸存在的收率低，純度和轉化率不高的問題，本發(fā)明方法為對樺樹皮原料在堿性條件下進行瞬間的高溫高壓處理，采用乙醇進行提取，過濾，結晶，再用氯仿/乙醇溶解重結晶，然后樺木醇氧化至樺木酮酸，將樺木酮酸還原至樺木酸；或者將枯草芽孢桿菌、高大毛霉或黃綠蜜環(huán)菌發(fā)酵菌液與樺木醇及緩沖液共同培養(yǎng)使樺木醇轉化成樺木酸。本發(fā)明的方法工藝簡單，產(chǎn)品純度高，操作方便，成本低，經(jīng)濟效益顯著。
文檔編號C07J63/00GK103193854SQ201310061698
公開日2013年7月10日 申請日期2013年2月27日 優(yōu)先權日2013年2月27日
發(fā)明者張宏偉, 王雷, 王東凱, 邢巖, 李鵬, 林琳, 楊志興 申請人:黑龍江省科學院高技術研究院