結(jié)合abca1多肽的抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及結(jié)合天然ABCA1多肽的分離的抗體及其在檢測(cè)組織樣品中的ABCA1多肽中的用途。
【專利說明】結(jié)合ABCA1多肽的抗體
[0001]本發(fā)明涉及結(jié)合ABCAl多肽的抗體及其在檢測(cè)ABCAl多肽的方法中的用途。
[0002]ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Al (ATP-binding cassette transporter Al,ABCA1)是依賴ATP的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其介導(dǎo)膽固醇和磷脂向胞外缺乏脂質(zhì)的HDL顆粒的流出。人ABCAl多肽的氨基酸序列在Seq.1d.N0.1中給出。ABCAl是通過磷脂和載脂蛋白的新生HDL顆粒的裝配所必不可少的。ABCAl充當(dāng)從細(xì)胞到載脂蛋白的脂質(zhì)流出的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物，并且因此參與降低動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。ABCAl在影響血漿HDL水平方面是關(guān)鍵性的。在肝和小腸中有活性，產(chǎn)生大部分循環(huán)的HDL。編碼ABCAl的基因的缺陷被證明是家族性低α脂蛋白血癥(familial hypoalphalipoproteinemia, FHA)的一個(gè)遺傳病因。
[0003]市售的抗ABCAl抗體不適用于檢測(cè)組織樣品中的天然ABCAl多肽。
[0004]因此，需要能夠檢測(cè)組織樣品中的天然ABCAl多肽的抗ABCAl抗體。
[0005]在第一方面，本發(fā)明涉及結(jié)合天然ABCAl多肽的分離的抗體。
[0006]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述ABCAl多肽是人ABCAl多肽。
[0007]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗-ABCAl抗體是單克隆抗體。
[0008]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗體通過用表達(dá)ABCAl多肽(優(yōu)選人ABCAl多肽)的全細(xì)胞免疫合適的動(dòng)物來(lái)產(chǎn)生。
[0009]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗體包含可獲自選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-3/84 (DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-4/18 (DSM ACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞系的抗體的VH結(jié)構(gòu)域的⑶R3，和可獲自選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-3/84 (DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-3/125 (DSMACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-4/18(DSM ACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞的抗體的VL結(jié)構(gòu)域的⑶R3。
[0010]在另一個(gè)一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗體包含可獲自選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-3/84 (DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-4/18 (DSM ACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞系的抗體的VH結(jié)構(gòu)域的CDRl至CDR3，和可獲自選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-3/84 (DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-3/125 (DSMACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-4/18(DSM ACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞的抗體的VL結(jié)構(gòu)域的⑶Rl至⑶R3。
[0011]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗體包含可獲自選自由ABCA1-3/84(DSMACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系 ABCAl-3/125(DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-4/18 (DSMACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞系的抗體的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域。
[0012]在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述抗體由選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1_3/84(DSMACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系 ABCAl-3/125(DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-4/18 (DSMACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
[0013]在另一方面，本發(fā)明涉及選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-3/84(DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-3/125(DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-4/18 (DSMACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞系。[0014]在另一方面，本發(fā)明涉及分離的核酸，所述分離的核酸包含編碼可獲自選自由雜交瘤細(xì)胞系 ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-4/18(DSM ACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞系的抗體的VH結(jié)構(gòu)域的序列。
[0015]在另一方面中，本發(fā)明提供分離的核酸，所述分離的核酸包含編碼可獲自選自由雜交瘤細(xì)胞系 ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-4/18(DSM ACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞系的抗體的VL結(jié)構(gòu)域的序列。
[0016]在另一方面中，本發(fā)明提供分離的核酸，所述分離的核酸包含編碼由選自由雜交瘤細(xì)胞系 ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-4/18 (DSM ACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體的序列。
[0017]在另一方面中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的核酸的載體和包含本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。
[0018]在另一方面中，本發(fā)明提供產(chǎn)生抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生所述抗體。
[0019]在另一方面中，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗體在檢測(cè)動(dòng)物的組織樣品中的ABCAl多肽中的用途。
[0020]在本發(fā)明的用途的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述組織樣品是全血。
[0021 ] 在本發(fā)明的用途的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述動(dòng)物是人受試者。
[0022]在另一方面中，本發(fā)明提供檢測(cè)動(dòng)物的組織樣品中的ABCAl多肽的方法，所述方法包括:`[0023]a)提供所述動(dòng)物的組織樣品，
[0024]b)使用本發(fā)明的抗體檢測(cè)步驟a)的樣品中的ABCAl多肽。
[0025]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述組織樣品是全血。
[0026]在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述動(dòng)物是人受試者。
[0027]在一個(gè)具體實(shí)施方案，步驟b)中的對(duì)ABCAl多肽的檢測(cè)通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。
[0028]附圖簡(jiǎn)述
[0029]圖1顯示術(shù)語(yǔ)“染色指數(shù)”。藍(lán)色:表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系；白色:親本細(xì)胞系 293。
[0030]圖2a:在FACS測(cè)定中使用商業(yè)的抗-ABCAl抗體Novus DyLight488在表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系(FLP293/ABCA1細(xì)胞系)中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)；染色指數(shù)為1.54 (熒光FLP293ABCA1細(xì)胞系/熒光FLP293親本細(xì)胞系);藍(lán)色:表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系；白色:親本細(xì)胞系293?？贵w稀釋:1:200
[0031]圖2b:在FACS測(cè)定中使用商業(yè)的抗-ABCAl抗體ab81950生物素在表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系(FLP293/ABCA1細(xì)胞系)中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)；染色指數(shù)為1.24(熒光FLP293ABCA1細(xì)胞系/熒光FLP293親本細(xì)胞系);藍(lán)色:表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系；白色:親本細(xì)胞系293。抗體稀釋:1:200
[0032]圖2c:在FACS測(cè)定中使用商業(yè)的抗-ABCAl抗體Novus生物素在表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系(FLP293/ABCA1細(xì)胞系)中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)；染色指數(shù)為1.28(熒光FLP293ABCA1細(xì)胞系/熒光FLP293親本細(xì)胞系);藍(lán)色:表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系；白色:親本細(xì)胞系293?？贵w稀釋:1:200[0033]圖2d:在FACS測(cè)定中使用商業(yè)的抗-ABCA1抗體abl8180在表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系(FLP293/ABCA1細(xì)胞系)中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)；染色指數(shù)為1.41 (熒光FLP293ABCA1細(xì)胞系/熒光FLP293親本細(xì)胞系);藍(lán)色:表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系；白色:親本細(xì)胞系293?？贵w稀釋:1:200[0034]圖2e:在FACS測(cè)定中使用商業(yè)的抗-ABCA1抗體ab66217在表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系(FLP293/ABCA1細(xì)胞系)中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)；染色指數(shù)為1.84(熒光FLP293ABCA1細(xì)胞系/熒光FLP293親本細(xì)胞系);藍(lán)色:表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系；白色:親本細(xì)胞系293?？贵w稀釋:1:200[0035]圖3a:在FACS測(cè)定中使用本發(fā)明的抗-ABCAl抗體ABCA1-3/84在表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系(FLP293/ABCA1細(xì)胞系)中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)；染色指數(shù)為8.9 (熒光FLP293ABCA1細(xì)胞系/熒光FLP293親本細(xì)胞系);藍(lán)色:表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系；白色:親本細(xì)胞系293?？贵w濃度:0.1 μ g/ml[0036]圖3b:在FACS測(cè)定中使用本發(fā)明的抗-ABCAl抗體ABCA1-3/84在表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系(FLP293/ABCA1細(xì)胞系)中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)；染色指數(shù)為10.4(熒光FLP293ABCA1細(xì)胞系/熒光FLP293親本細(xì)胞系);藍(lán)色:表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系；白色:親本細(xì)胞系293?？贵w濃度:1 μ g/ml[0037]圖3c:在FACS測(cè)定中使用本發(fā)明的抗-ABCAl抗體ABCA1-3/84在表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系(FLP293/ABCA1細(xì)胞系)中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)；染色指數(shù)為10.5 (熒光FLP293ABCA1細(xì)胞系/熒光FLP293親本細(xì)胞系);藍(lán)色:表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系；白色:親本細(xì)胞系293?？贵w濃度dOyg/ml[0038]圖4a:在FACS測(cè)定中使用本發(fā)明的抗-ABCAl抗體ABCA1-3/125在表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系(FLP293/ABC Al細(xì)胞系)中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)；染色指數(shù)為49.7 (熒光FLP293ABCA1細(xì)胞系/熒光FLP293親本細(xì)胞系);藍(lán)色:表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系；白色:親本細(xì)胞系293?？贵w濃度:0.1 μ g/ml[0039]圖4b:在FACS測(cè)定中使用本發(fā)明的抗-ABCAl抗體ABCA1-3/125在表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系(FLP293/ABCA1細(xì)胞系)中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)；染色指數(shù)為47.0 (熒光FLP293ABCA1細(xì)胞系/熒光FLP293親本細(xì)胞系);藍(lán)色:表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系；白色:親本細(xì)胞系293。抗體濃度:1 μ g/ml[0040]圖4c:在FACS測(cè)定中使用本發(fā)明的抗-ABCAl抗體ABCA1-3/125在表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系(FLP293/ABCA1細(xì)胞系)中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)；染色指數(shù)為46.9 (熒光FLP293ABCA1細(xì)胞系/熒光FLP293親本細(xì)胞系);藍(lán)色:表達(dá)ABCAl的FLP293細(xì)胞系；白色:親本細(xì)胞系293?？贵w濃度dOyg/ml。[0041]圖5:利用兩種不同的LXR激動(dòng)劑和LPS在⑶14+單核細(xì)胞上的ABCAl的增量調(diào)節(jié)；將全血與LXR激動(dòng)劑或LPS溫育24h。ABCAl的檢測(cè)通過FACS使用抗-ABCAl抗體ABCA1-3/125 進(jìn)行。[0042]圖6:產(chǎn)生的抗-ABCAl 單克隆抗體 ABCA1_3/84、ABCA1_3/125 和 ABCA1-4/18 的蛋白印跡分析。將以下細(xì)胞裂解液用于蛋白印跡法測(cè)試產(chǎn)生的抗-ABCAl單克隆抗體的特異性:[0043]第I道:刺激的THPI細(xì)胞-裂解液
[0044]第2道:未刺激的THPI細(xì)胞-裂解液
[0045] 第3 道:FLP293-hu-ABCAl (表達(dá) ABCAl 的 FLP293 細(xì)胞系)
[0046]第4道:FLP293 (陰性對(duì)照)
[0047]第5道:MWM(分子量標(biāo)記)
[0048]第6 道:HEK-293-hu-ABCAl (DB272_in pANITA2) _6His (表達(dá)具有 His 標(biāo)簽的人ABCAl蛋白的HEK細(xì)胞系)
[0049]圖7:ABCA1蛋白的蛋白印跡分析?？寺?表達(dá)大量的ABCA1，這由檢測(cè)到全長(zhǎng)蛋白(約240-kDA)和一些較小的種類指示。比較起來(lái)，在未轉(zhuǎn)染的FLP細(xì)胞系中沒有檢測(cè)到ABCAl蛋白。
[0050]圖8 =ABCAlmRNA表達(dá)的qPCR分析:在過表達(dá)ABCAl的克隆4與親本系之間相比，持家基因GAPDH的Cp值保持不變(18.00±0.24對(duì)比18.56±0.20)。相比之下，在未轉(zhuǎn)染的系中Cp值指示極低的ABCAlmRNA表達(dá)(36.00 ±0.73)，而在克隆4-ABCA1系中Cp值指示高水平(21.64±0.48)。使用ddCp方法計(jì)算差異指示:與親本FLP細(xì)胞系相比，克隆4表達(dá)更多的ABCAl轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(21，000倍)。
[0051]圖9:在FACS測(cè)定中使用本發(fā)明的抗-ABCAl抗體ABCA1-4/18在THP-1細(xì)胞中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)。用LXR激動(dòng)劑過夜處理THP-1細(xì)胞以誘導(dǎo)ABCAl表達(dá)或用對(duì)照DMSO進(jìn)行對(duì)照處理。將細(xì)胞用I U g/mlABCAl特異性抗體(克隆4/18)或同種型對(duì)照染色，之后用PE綴合的抗小鼠IgGl的第二抗體染色?？?ABCAl抗體ABCA1-4/18產(chǎn)生基礎(chǔ)ABCAl信號(hào)與同種型對(duì)照的良好分離。
[0052]圖10:在FACS測(cè)定中使用本發(fā)明的抗-ABCAl抗體ABCA1-3/125在THP-1細(xì)胞中檢測(cè)ABCAl表面表達(dá)。用LXR激動(dòng)劑過夜處理THP-1細(xì)胞以誘導(dǎo)ABCAl表達(dá)或用對(duì)照DMSO進(jìn)行對(duì)照處理。將細(xì)胞用I U g/mlABCAl特異性抗體(克隆3/125)或同種型對(duì)照染色，之后用PE綴合的抗小鼠IgGl的第二抗體染色。
[0053]圖11:通過蛋白印跡法使用小鼠抗-ABCAlmAb克隆3/84顯示ABCAl蛋白的人組織分布。
[0054]圖12:利用小鼠抗-ABCAlmAb克隆3/84的在人肝中的ABCAl的免疫組化染色。綠色:位于肝細(xì)胞細(xì)胞膜中的ABCAl蛋白，以及藍(lán)色:細(xì)胞核的DAPI染色。
[0055]本發(fā)明實(shí)施方案詳述
[0056]術(shù)語(yǔ)“染色指數(shù)”當(dāng)在本文中使用時(shí)被定義如下:
[0057]
染色指數(shù)=—^y.1 值炎.1:通度處.達(dá).....ABCAl.......(!MlIJMM^
丨丨丨髓光強(qiáng)度ABCAHlj性的親木細(xì)胞系
[0058]術(shù)語(yǔ)“抗體”涵蓋不同形式的抗體結(jié)構(gòu)，其包括但不限于完整抗體和抗體片段。本發(fā)明的抗體可以是人源化抗體，嵌合抗體，或另外的遺傳改造的抗體，只要保持本發(fā)明的特征性質(zhì)。
[0059]“抗體片段”包含全長(zhǎng)抗體的一部分，優(yōu)選其可變結(jié)構(gòu)域，或至少其抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w片段的實(shí)例包括雙抗體、單鏈抗體分子和形成自抗體片段的多特異性抗體。ScFv抗體在例如 Houston, J.S., Methods in Enzymol (酶學(xué)方法)? 203 (1991) 46-96)中進(jìn)行描述。此外，抗體片段包含這樣的單鏈多肽，其具有Vh結(jié)構(gòu)域的特征，即能夠與\結(jié)構(gòu)域一起組裝，或具有結(jié)合于ABCAl的\結(jié)構(gòu)域的特征，即能夠與Vh結(jié)構(gòu)域一起組裝形成功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)并由此提供所述性質(zhì)。
[0060]術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”用于本文中時(shí)，指單一氨基酸組分的抗體分子制劑。
[0061]術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指一種抗體，其包括來(lái)自一種來(lái)源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)，以及源自不同來(lái)源或物種的恒定區(qū)的至少一部分，其通常通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備。包括鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體是優(yōu)選的。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其它優(yōu)選形式是這樣的那些，其中恒定區(qū)已經(jīng)被從初始抗體的恒定區(qū)進(jìn)行修飾或改變以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fe受體(FcR)結(jié)合的特性。也將這種嵌合抗體稱作“類別轉(zhuǎn)換抗體”。嵌合抗體是被表達(dá)的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，該基因包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。制備嵌合抗體的方法包括在本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。見，例如，Morrison，S.L.，等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad Sc1.USA) 81 (1984) 6851-6855 ；US 專利號(hào) 5，202，238 和 5，204，244。
[0062]術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”指這樣的抗體，其中的構(gòu)架或“互補(bǔ)性決定區(qū)”(CDR)已經(jīng)被修飾為包括與母體免疫球蛋白相比特異性不同的免疫球蛋白的CDR。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將鼠CDR移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)以制備“人源化抗體”。見例如，Riechmann，L.等，自然(Nature) 332 (1988) 323-327 ;和 Neuberger，M.S.等，自然(Nature) 314 (1985) 268-270。特別優(yōu)選的CDR對(duì)應(yīng)于識(shí)別以上指出的關(guān)于嵌合抗體的抗原的那些代表性序列。本發(fā)明涵蓋的“人源化抗體”的其它形 式是這樣的那些，其中恒定區(qū)已經(jīng)另外被從初始抗體的恒定區(qū)進(jìn)行修飾或改變以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fe受體(FcR)結(jié)合的特性。
[0063]用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“人抗體”意欲包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(van Dijk, Μ.Α.和van de Winkel7J.G.,當(dāng)前化學(xué)生物學(xué)觀點(diǎn)(Curr.0pin.Chem.Biol).5 (2001) 368-374)。人抗體還可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)中產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在免疫時(shí)能夠在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的條件下產(chǎn)生人抗體的全部所有組成成分或選擇部分(selection)。在所述種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移人種系免疫球蛋白基因陣列將導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人抗體(見例如Jakobovits，A.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))90 (1993) 2551-2555 Jakobovits,A.等，Nature (自然)362 (I993) 255_258 ；Brueggemann, Μ.等，Year Tmmunol.(免疫學(xué)年度)7 (1993) 33-40)。人抗體還可以在卩遼菌體展示文庫(kù)中產(chǎn)生(Hoogenboom, H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)227 (1992) 381-388 ；Marks, J.D.等，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志)222(1991)581-597)。Cole等和Boerner等的技術(shù)也可以用于制備人單克隆抗體(Cole 等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體和癌癥治療)，Alan R.Liss, p.77 (1985);和 Boemer, P.等，J.1mmunol.147 (1991) 86-95)。如已經(jīng)對(duì)按照本發(fā)明的嵌合和人源化抗體所提及地，術(shù)語(yǔ)“人抗體”用于本文中時(shí)還包括這樣的抗體，其在恒定區(qū)內(nèi)進(jìn)行修飾以產(chǎn)生按照本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或FcR結(jié)合的特性，例如通過“類別轉(zhuǎn)換”即改變或突變Fe部分(例如由IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4突變)進(jìn)行。[0064]術(shù)語(yǔ)“表位”包括能夠特異性結(jié)合抗體的任何多肽決定簇。在某些實(shí)施方案中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面定群(groupings),諸如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；⑶以谀承?shí)施方案中，可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，和或特定的帶電特性。表位是被抗體結(jié)合的抗原區(qū)域。
[0065]“可變結(jié)構(gòu)域”(輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域(')，重鏈的可變結(jié)構(gòu)域(Vh))用于本文中時(shí)，表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每對(duì)輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域?？勺冚p鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)且每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)，所述構(gòu)架區(qū)的序列普遍保守，其通過3個(gè)“高變區(qū)”(或互補(bǔ)決定區(qū)，⑶R)相連接。構(gòu)架區(qū)采用(6-折疊構(gòu)象且⑶R可以形成連接折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過構(gòu)架區(qū)以其三維結(jié)構(gòu)保持并與來(lái)自另一條鏈的CDR—起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。抗體重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在按照本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/親和力方面發(fā)揮特別重要的作用并因此提供本發(fā)明的另一個(gè)目的。[0066]用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“抗體的抗原結(jié)合部分”指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基?？贵w的抗原結(jié)合部分包括來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或“FR”區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域從N端到C端包括結(jié)構(gòu)域FRi，CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特別地，重鏈的CDR3是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域并且限定抗體的性質(zhì)。按照Kabat等，免疫目的的蛋白質(zhì)序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第 5 版，公眾健康服務(wù)，國(guó)家健康研究所(Public Health Service, National Institutes of Health), Bethesda,MD.(1991))的標(biāo)準(zhǔn)定義確定⑶R和FR區(qū)域，和/或來(lái)自“高變環(huán)”的那些殘基。
[0067]術(shù)語(yǔ)“ABCA1多肽”在本文中使用是指來(lái)自任何動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物物種，包括人)的天然ABCAl多肽和ABCAl變體。ABCAl多肽可以分離自多種來(lái)源，包括人組織類型，或通過重組和/或合成方法制備。人ABCAl多肽的氨基酸序列在Seq.1d.N0.1中給出。
[0068]"分離的"抗體是已經(jīng)與其天然環(huán)境的組分分離的抗體。在一些實(shí)施方案中，將抗體純化至超過95%或99%純度，如由例如電泳(例如，SDS-PAGE，等電聚焦(IEF)，毛細(xì)管電泳)或色譜(例如，離子交換或反相HPLC)測(cè)定的。對(duì)于用于評(píng)估抗體純度的方法的綜述，見例如，F(xiàn)latman 等，J.Chromatogr.B848:79-87 (2007)。
[0069]“分離的”核酸分子是這樣的核酸分子，其已經(jīng)與其天然環(huán)境的組分分離。分離的核酸包括包含在通常含有核酸分子的細(xì)胞中的核酸分子，但是核酸分子存在于染色體外或存在于與其天然的染色體位置不同的染色體位置處。
[0070]“編碼抗-ABCAl抗體的分離的核酸”是指編碼抗體重鏈和輕鏈(或其片段)的一種或多種核酸分子，包括在單個(gè)載體或分離的載體中的這樣的核酸分子，以及存在于宿主細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)位置處的這樣的核酸分子。
[0071]當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"載體"是指能夠使與其相連的另一種核酸增殖的核酸分子。該術(shù)語(yǔ)包括作為自身-復(fù)制核酸結(jié)構(gòu)的載體以及結(jié)合到宿主細(xì)胞的基因組中的載體(所述載體已經(jīng)被引入到所述宿主細(xì)胞中)。某些載體能夠引導(dǎo)與其操作相連的核酸的表達(dá)。這樣的載體在本文中被稱為"表達(dá)載體"。
[0072]可以使用重組方法和組合物例如如在美國(guó)專利第4，816，567號(hào)中所述的，來(lái)制備抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供編碼本文所述的抗-ABCAl抗體的分離的核酸。這樣的核酸可以編碼包含所述抗體的\的氨基酸序列和/或包含所述抗體的Vh的氨基酸序列(例如，所述抗體的輕鏈和/或重鏈)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含這樣的核酸的一個(gè)或多個(gè)載體(例如，表達(dá)載體)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含這樣的核酸的宿主細(xì)胞。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含(例如，被轉(zhuǎn)化以):(1)包含編碼包含抗體的'的氨基酸序列和包含抗體的Vh的氨基酸序列的核酸的載體，或者(2)第一載體和第二載體，所述第一載體包含編碼包含抗體的\的氨基酸序列的核酸，而所述第二載體包含編碼包含抗體的Vh的氨基酸序列的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核的，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或淋巴細(xì)胞(例如，Y0、NSO、Sp20細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過制備抗-ABCAl抗體的方法，其中所述方法包括在適于表達(dá)所述抗體的條件下培養(yǎng)如以上提供的包含編碼所述抗體的核酸的宿主細(xì)胞，以及任選地從宿主細(xì)胞(或宿主細(xì)胞培養(yǎng)基)回收所述抗體。
[0073]為了重組制備本發(fā)明的抗體，分離編碼抗體的核酸，例如如上所述的，并將其插入到一種或多種載體中用以在宿主細(xì)胞中進(jìn)一步克隆和/或表達(dá)。可以使用常規(guī)方法容易地對(duì)這樣的核酸進(jìn)行分離和測(cè)序(例如，通過使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的募核昔酸探針)。
[0074]適用于克隆或表達(dá)編碼抗體的載體的宿主細(xì)胞包括本文中所述的原核和真核細(xì)胞。例如，抗體可以在細(xì)菌中制備，尤其是在不需要糖基化和Fe效應(yīng)子功能時(shí)。對(duì)于在細(xì)菌中表達(dá)抗體片段和多肽，參見例如，美國(guó)專利號(hào)5，648，237,5, 789，199和5，840，523。(也參見 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B.K.C.Lo, ed., Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254，其描述了抗體片段在大腸桿菌中的表達(dá))。在表達(dá)后，抗體可以分離自可溶級(jí)分中的細(xì)菌細(xì)胞糊，并且可以被進(jìn)一步純化。
[0075]從生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤克隆抗體基因的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，可以使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)利用免疫球蛋白特異性引物從雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)增可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域(Vh和Vl)的 遺傳信息(Methods Mol Med.2004 ；94:447-58)。然后可以將編碼可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域(％和八)的核酸克隆在合適的載體中以用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)。
[0076]用于在生物學(xué)樣品中檢測(cè)和/或測(cè)量多肽的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括但不限于，蛋白印跡法，流式細(xì)胞術(shù)，ELISA或RIA，或多種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。例如，在蛋白印跡法中，能夠結(jié)合變性蛋白的抗體，如多克隆抗體，可以用于檢測(cè)ABCAl多肽。測(cè)量多肽的方法的實(shí)例是ELISA。此類蛋白定量是基于能夠捕獲特異性抗原的抗體，以及能夠檢測(cè)捕獲的抗原的第二抗體。
[0077]優(yōu)選的用于檢測(cè)天然ABCAl多肽的方法是流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)方法描述于以下文獻(xiàn)中:Handbook of Flow Cytometry Method(流式細(xì)胞術(shù)方法手冊(cè))，J.PaulRobinson(編者)；Flow Cytometry-A Basic Introduction(流式細(xì)胞術(shù)-基本介紹),Michael G Ormerod(2008)和 Current Protocols in Cytometry(2010), Wiley0
[0078]實(shí)施例和方法
[0079]本發(fā)明的單克隆抗人ABCAl抗體
[0080]以下三種生產(chǎn)針對(duì)人ABCAl的單克隆抗體的小鼠雜交瘤細(xì)胞系已經(jīng)于2011年I月20日以霍夫曼-拉羅奇有限公司(F.Hoffmann-La Roche Ltd.)的名義交托DSMZ-(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)保藏，并且獲得以下列出的保藏號(hào):
[0081]ABCA1-3/84 = DSMACC3109[0082]ABCA1-3/125 = DSMACC3110
[0083]ABCA1-4/18 = DSMACC3111
[0084]單克隆抗人ABCAl抗體制備
[0085]ABCAl蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞表面的表達(dá)。
[0086]使用表達(dá)質(zhì)粒pANITA2在HEK細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)人ABCAl胞外結(jié)構(gòu)域。表達(dá)人ABCAl胞外結(jié)構(gòu)域的、來(lái)源于HEK的細(xì)胞系通過穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染建立。
[0087]為了獲得高表達(dá)細(xì)胞系，在利用抗-FLAG抗體的表面染色后，通過熒光激活的細(xì)胞分選將轉(zhuǎn)染子分離到高表達(dá)的細(xì)胞集群(pool)中。分選到高表達(dá)細(xì)胞集群中的細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度的判定條件為比所有轉(zhuǎn)染子的平均熒光強(qiáng)度高2.1-4.3倍。
[0088]通過蛋白印跡分析測(cè)試表達(dá)人ABCAl的細(xì)胞系的表達(dá)，顯示具有預(yù)期分子量的蛋白的聞水平的表達(dá)
[0089]ABCAl特異性抗體在用轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞免疫的小鼠中的開發(fā)
[0090]我們的方法使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(HEK293)，所述細(xì)胞在其細(xì)胞表面上表達(dá)重組抗原。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞還用于測(cè)量血清轉(zhuǎn)化，雜交瘤選擇和抗體表征。通過以其天然構(gòu)象遞呈抗原以用于免疫和雜交瘤選擇，該過程促進(jìn)能夠結(jié)合內(nèi)源蛋白的抗體的生成。
[0091]通過免疫純化重組蛋白產(chǎn)生免疫復(fù)合物，并且使用這些免疫復(fù)合物作為免疫抗原，從而獲得免疫原。免疫純化通過蛋白印跡分析使用抗-His標(biāo)簽單克隆抗體確認(rèn)。
[0092]將用免疫復(fù)合物免疫的小鼠的脾細(xì)胞與PAI骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生B細(xì)胞雜交瘤。將融合的細(xì)胞分配到微滴定培養(yǎng)板孔中。為了確定生產(chǎn)ABCAl特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，使用兩步篩選方法，所述方法完全不`需要純化的重組蛋白。首先通過ELISA測(cè)試所有培養(yǎng)物的孔用于IgG產(chǎn)生。在第二步中，通過IFA對(duì)所有IgG產(chǎn)生為陽(yáng)性的孔進(jìn)行結(jié)合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的抗體的篩選。被點(diǎn)在多孔載玻片上的轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞用個(gè)體雜交瘤上清液染色并且通過熒光顯微術(shù)分析。未轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞充當(dāng)每個(gè)樣品的陰性對(duì)照。
[0093]通過蛋白印跡法檢驗(yàn)對(duì)產(chǎn)生的單克隆抗體ABCA1-3/84、ABCA1-3/125和ABCA1-4/18的特異性(圖6)。THPl =人單核細(xì)胞細(xì)胞系。
[0094]細(xì)胞培養(yǎng)物
[0095]將人胚腎細(xì)胞(Flip_In293細(xì)胞，Invitrogen)保持在補(bǔ)充以10%胎牛血清、2mML-谷氛酸胺和抗生素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco，s modified Eagle，smedium, DMEM)中。使用Fugene-6 (Roche Biochemicals)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，如由生產(chǎn)商所述的。
[0096]將人外周血單核細(xì)胞(THP-1，ATCC_F-6430)培養(yǎng)在補(bǔ)充以0.05mM2-巰基乙醇(Invitrogen)和 10%熱失活 FBS (Invitrogen)的 RPMI_1640Glutamax (Invitrogen)中。細(xì)胞濃度不超過1E06個(gè)細(xì)胞/ml。最大傳代數(shù)為30。
[0097]質(zhì)粒:將編碼全長(zhǎng)人ABCAl的6.5_kb DNA片段亞克隆到XhoI消化的、Klenow加載的質(zhì)粒PN721中。在序列驗(yàn)證后，回收6.5-kb片段并且進(jìn)一步將其亞克隆到質(zhì)粒pCDNA5-FRT (Invitrogen)中。
[0098]制備ABCAl穩(wěn)定的細(xì)胞系
[0099]表達(dá)人ABCAl的單克隆的穩(wěn)定細(xì)胞系通過以下方法獲得:一起共轉(zhuǎn)染pcDNA5-FRT-ABCAl 和 pOG44 質(zhì)粒(Invitrogen),使用 Fugene-6 (Roche Biochemicals),在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在不存在zeocin的情況下,根據(jù)制造商的建議進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后一天，加入潮霉素B至終濃度50 u g/ml，并且每3-4天更換培養(yǎng)基直至出現(xiàn)潮霉素B抗性菌落。選擇個(gè)體菌落并且使其進(jìn)一步在潮霉素B的存在下增殖。通過定量PCR和蛋白印跡分析評(píng)估個(gè)體克隆的ABCAl表達(dá)?；谶@些結(jié)果，選擇克隆4作為基礎(chǔ)的高ABCAl表達(dá)細(xì)胞系。
[0100]ABCAl蛋白表達(dá)的蛋白印跡分析:以IO6個(gè)細(xì)胞/孔將FLP或克隆4細(xì)胞在12孔板中培養(yǎng)48小時(shí)。在Laemmli緩沖液/核酸酶(benzonase)中裂解細(xì)胞并且將變性的樣品施用到3-8% Tris-醋酸凝膠并且通過一維凝膠電泳分離。分離的蛋白通過電印跡(electroblotting)轉(zhuǎn)移到膜上。通過與小鼠單克隆Ab ABCAl (Neuromics)以及之后的山羊抗-小鼠IgG-HRP (Abcam#20043)溫育來(lái)檢測(cè)ABCAl (圖7)。
[0101]人組織的蛋白印跡分析:使用來(lái)自Biochain Institute, Inc., Hayward, CA94545,USA的人組織裂解液。以與前文所述相同的方式進(jìn)行印跡法。通過與小鼠抗-ABCAlmAb (克隆3/84)以及之后的山羊-抗-小鼠IgG-HRP溫育來(lái)檢測(cè)ABCAl (圖11)。
[0102]ABCAlmRNA表達(dá)的定量PCR分析:以5x10s個(gè)細(xì)胞/孔將FLP或克隆4細(xì)胞在96孔板中在37°培養(yǎng)48小時(shí)。使用自動(dòng)化系統(tǒng)根據(jù)制造商的說明(Qiagen)分離總RNA。在Lightcycler480儀器(Roche)上使用一步試劑混合物(Qiagen)和探針/引物組(AppliedBiosystems)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-QPCR從而檢測(cè)ABCAl和GAPDH mRNA的相對(duì)表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均Ct值(N = 8孔/條件)+/_SD(圖8)。[0103]抗體和第2步試劑
[0104]測(cè)試其對(duì)ABCAl的特異性的市售的單克隆第一抗體來(lái)自Abeam?和:Ncwusr (克隆HJl和克隆AB.H10)。測(cè)試的兔多克隆抗體來(lái)自Abeam? (ab81950)。第二步試劑鏈霉親和素 PE 和山羊-Ct -小鼠 IgG PE 來(lái)自 Southern Biolcclinolog}'.=
[0105]除了商業(yè)抗體以外，評(píng)估內(nèi)部生產(chǎn)的三種鼠抗-ABCAl雜交瘤上清液在流式細(xì)胞術(shù)中在檢測(cè)ABCAl方面的表現(xiàn)。通過應(yīng)用第二試劑(來(lái)自Southern Biotechnologylv的鏈霉親和素PE、山羊-抗-小鼠IgG PE和IgGlPE)進(jìn)行檢測(cè)。純化兩種克隆(克隆ABCA1-3/84和ABCA1-3/125)的雜交瘤上清液，再測(cè)試并滴定。在之后的時(shí)間點(diǎn)，測(cè)試來(lái)源于克隆ABCA1-3/18的抗體并且與使用THP-1細(xì)胞的ABCA1-3/125進(jìn)行比較。將以下抗體用于鑒別特異性人血亞群:CD3Pacific blue，克隆UCHT1，CD14PerCP_Cy5.5，克隆M5E2，CD15APC，克隆 HI98，CD16APC-Cy7，克隆 3G8，CD19PE_Cy7，克隆 SJ25CI 和 CD66b FITC,克隆G10F5。所有CD標(biāo)記特異性抗體獲自Becton Ikkmsun'
[0106]FLP293、來(lái)源于FLP293的細(xì)胞和THP-1細(xì)胞的FACS分析
[0107]對(duì)于FACS分析，將FLP293細(xì)胞用不含鈣和鎂的D-PBS (Ci丨bco 1:_)清洗并且與
0.02% EDTA (Sigma?)溫育。在收獲后，將其用冷的d-pbs洗滌兩次，之后進(jìn)行抗體染色。簡(jiǎn)言之，將0.8-lxlO6個(gè)細(xì)胞/樣品重懸在100 U I含有1:200稀釋的第一抗體的BD染色緩沖液/2% FCS(Becton Diekmsoulf )中。溫育時(shí)間為在+4°C在黑暗中45分鐘。將細(xì)胞用冷的BD染色緩沖液/2% FCS洗滌一次并且加入100 u I稀釋在BD染色緩沖液/2% FCS中的第二步試劑。在于+4°C在黑暗中溫育45分鐘并且用冷的BD染色緩沖液/2% FCS洗滌兩次后，分析所述細(xì)胞。以與以上關(guān)于FLP293細(xì)胞所述的相同的方式處理非粘附的THP-1細(xì)胞，但是省去了在含有EDTA的緩沖液中溫育。[0108]在FACS Canto II (Becton Dickinson? )上分析細(xì)胞。利用 FlowJo 軟件
(Tree Star* )進(jìn)行評(píng)估。
[0109]ABCAl全血測(cè)定和FACS染色
[0110]對(duì)于全血FACS分析，在所有例子中使用內(nèi)部生產(chǎn)的抗-ABCAl克隆3/125。將全Na-肝素血與指定的激動(dòng)劑在37°C溫育24小時(shí)。在溫育后，將初級(jí)抗-ABCAl特異性抗體以1:800的最終稀釋加入到100 μ I的全血中，在冰上，在黑暗中，進(jìn)行30分鐘。
[0111]紅細(xì)胞用Ix紅細(xì)胞裂解緩沖液(Becton Diekmsoi/ )裂解并洗滌。隨后，加入I:250 稀釋的 100 μ I 的次級(jí)山羊-a - /Jn 鼠 IgGiPE (Southern Biotechnology?^)并在 +40C溫育20分鐘，隨后是兩次洗滌步驟。
[0112]在+4°C在黑暗中加入細(xì)胞亞群特異性抗體20分鐘，之后在分析前進(jìn)行洗滌步驟。
[0113]細(xì)胞在FACS Canto II (Becton Dickinson?' )上分析。利用 FlowJo 軟件(Tree Star* )進(jìn)行評(píng)估。
[0114]免疫組化染色
[0115]對(duì)人肝FFPE切片(5mm, Biochain)進(jìn)行脫/K，利用檸檬酸緩沖液(ThermoScientific)進(jìn)行超聲處理，并且與小鼠抗-ABCAlmAb (克隆3/84, lmg/ml)溫育I小時(shí)，之后是第二抗體檢測(cè)(lmg/ml進(jìn)行I小時(shí)，Alexa I'luor? 488驢抗-小鼠IgG(H+L)，Invitrogen, Basel, Switzerland)和 DAPI 染色
[0116]雖然為了清楚理解已經(jīng)通過說明和實(shí)例在一些細(xì)節(jié)上描述上述發(fā)明，但是描述和實(shí)施例不應(yīng)被視為限制本 發(fā)明的范圍。本文中引用的所有專利和科學(xué)文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用完整地清楚地并入。
【權(quán)利要求】
1.結(jié)合ABCAl多肽的分離的抗體，其中所述抗體結(jié)合天然ABCAl多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的抗體，其中所述ABCAl多肽是人ABCAl多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離的抗體，其是單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的分離的抗體，其中所述抗體通過用表達(dá)所述ABCAl多肽、優(yōu)選人ABCAl多肽的全細(xì)胞免疫合適的動(dòng)物產(chǎn)生。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的分離的抗體，其中所述抗體包含可獲自選自由雜交瘤細(xì)胞系 ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-4/18(DSM ACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞系的抗體的VH結(jié)構(gòu)域的⑶R3，和可獲自選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-3/84(DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-3/125 (DSMACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-4/18 (DSM ACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞的抗體的VL結(jié)構(gòu)域的⑶R3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的分離的抗體，其中所述抗體包含可獲自選自由雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-3/84 (DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-4/18(DSM ACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞系的抗體的VH結(jié)構(gòu)域的CDRl至CDR3，和可獲自選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-3/84(DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-3/125(DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-4/18 (DSM ACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞的抗體的VL結(jié)構(gòu)域的⑶Rl至⑶R3。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6所述的分離的抗體，其中所述抗體包含可獲自選自由ABCA1-3/84 (DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-4/18 (DSM ACC 3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞系的抗體的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7所述的分離的抗體，其中所述抗體由選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-3/84(DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-3/125 (DSMACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCA1-4/18 (DSMACC3111)組成的組的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。
9.雜交瘤細(xì)胞系，其選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-3/84(DSMACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-3/125(DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-4/18 (DSMACC3111)組成的組。
10.分離的核酸，其包含編碼可獲自雜交瘤細(xì)胞系的抗體的VH結(jié)構(gòu)域的序列，所述雜交瘤細(xì)胞系選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-3/84(DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-3/125(DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-4/18 (DSMACC3111)組成的組。
11.分離的核酸，其包含編碼可獲自雜交瘤細(xì)胞系的抗體的VL結(jié)構(gòu)域的序列，所述雜交瘤細(xì)胞系選自由雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-3/84(DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-3/125(DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-4/18 (DSMACC3111)組成的組。
12.分離的核酸，其包含編碼雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體的序列，所述雜交瘤細(xì)胞系選自由雜交瘤細(xì)胞系 ABCAl-3/84(DSM ACC3109)、雜交瘤細(xì)胞系 ABCA1-3/125 (DSM ACC3110)和雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)BCAl-4/18(DSM ACC3111)組成的組。
13.載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求10至12所述的核酸。
14.宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求13所述的載體。
15.產(chǎn)生抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞以致產(chǎn)生所述抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至8所述的抗體在檢測(cè)動(dòng)物的組織樣品中的ABCAl多肽中的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的用途，其中所述組織樣品是全血。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的用途，其中所述動(dòng)物是人受試者。
19.檢測(cè)動(dòng)物的組織樣品中的ABCAl多肽的方法，所述方法包括: a)提供所述動(dòng)物的組織樣品， b)使用權(quán)利要求1至8的抗體檢測(cè)步驟a)的樣品中的ABCAl多肽。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述組織樣品是全血。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的方法，其中所述動(dòng)物是人受試者。
22.根據(jù)權(quán)利要求19至21所述的方法，其中步驟b)中對(duì)ABCAl多肽的檢測(cè)通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。
23.如本文之前、尤其 是關(guān)于前述實(shí)施例所述的發(fā)明。
【文檔編號(hào)】C07K16/18GK103596976SQ201280029293
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月15日
【發(fā)明者】芭芭拉·?？ㄘ悹柼? 于格·馬蒂勒, 埃弗森·諾戈切克, 伯恩哈德·賴斯, 王海燕 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司