漿細胞或成漿細胞的選擇方法、靶抗原特異性抗體的制備方法、新的單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】提供由廣泛的動物物種高效率地制作抗原特異性單克隆抗體的技術(shù)，利用該技術(shù)提供新的抗原特異性單克隆抗體。用靶抗原對非人動物進行免疫，從免疫成立后的非人動物中采集淋巴液等，或者，從具有抗靶抗原抗體的人采集淋巴液等，將采集的淋巴液等和(1)標(biāo)記的靶抗原以及(2)選擇性地與漿細胞和/或成漿細胞結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)混合，選擇上述(1)標(biāo)記的靶抗原和(2)標(biāo)記物質(zhì)所結(jié)合的細胞。根據(jù)上述方法，選擇與靶抗原特異性結(jié)合的漿細胞和成漿細胞中的至少一種細胞，從選擇的細胞中采集抗靶抗原抗體基因，鑒定其核苷酸序列，根據(jù)鑒定的基因的核苷酸序列制備所述抗體或抗體片段，并制備靶抗原特異性抗體或抗體片段。
【專利說明】漿細胞或成漿細胞的選擇方法、靶抗原特異性抗體的制備方法、新的單克隆抗體
[0001]相關(guān)申請的相互參照
本申請主張于2011年3月30日申請的日本特愿2011 — 075135號的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容作為公開而特別引用于此。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及漿細胞或成漿細胞的選擇方法、靶抗原特異性抗體的制備方法、新的單克隆抗體。更詳細而言，本發(fā)明涉及與靶抗原特異性結(jié)合的漿細胞或成漿細胞的選擇方法、使用利用該方法得到的漿細胞或成漿細胞制備靶抗原特異性抗體的方法、以及利用該抗體制備方法新得到的新的單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0003]目前，抗體藥品開發(fā)中使用的單克隆抗體，大多是將小鼠抗體人源化而得到的抗體。其原因在于，作為單克隆抗體制作方法，確立了小鼠雜交瘤法。但是，對于作為抗體藥物的靶標(biāo)的人蛋白的功能性抗原表位中的多數(shù)，人-小鼠間的氨基酸序列同源性高，即使用這樣的抗原對小鼠進行免疫，由于 免疫耐受，也難以得到特異性高的抗體。因此，必須制作數(shù)量巨大的雜交瘤并進行篩選，直至獲得具有高能力的抗體。于是，為了開發(fā)新的抗體藥品，人們對盡可能與人的抗原具有不同的氨基酸序列的動物物種進行免疫，回避免疫耐受的限制，從而尋求用于高效率地生產(chǎn)具有高能力的單克隆抗體的方法。
[0004]以往的單克隆抗體制作廣泛采用下述方法:通過使抗體產(chǎn)生細胞與骨髓瘤細胞融合，制作具有自主增殖能力的雜交瘤，再從中篩選具有產(chǎn)生具備靶標(biāo)特異性的抗體的能力的克隆。但是，雜交瘤方法存在幾個缺點。其中一個缺點是，由于雜交瘤技術(shù)是限于小鼠抗體產(chǎn)生細胞的方法，所以難以在其他動物物種中應(yīng)用。而且，雜交瘤的篩選費時費事，這也是缺點。另外，即使進行篩選，也無法保證得到具有抗原特異性抗體產(chǎn)生能力的克隆，這也是個問題。
[0005]為了克服上述缺點，在人單克隆抗體的制作中，開發(fā)了應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點法(ELISP0T)的具有抗原特異性抗體產(chǎn)生能力的漿細胞(抗原特異性漿細胞)的鑒定法(日本特開 2009 - 34047 號公報:專利文獻 I (W02009/017226、US2011/0294678A1)(它們的全部內(nèi)容作為公開而特別引用于此))。該方法是將由人淋巴細胞純化的漿細胞放入實施了特殊加工的微孔中，將由漿細胞大量分泌的抗體固定在漿細胞周圍的底座上，使標(biāo)記抗原與其反應(yīng)，從而進行抗原特異性漿細胞的鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]但是，在上述專利文獻I記載的方法中，抗原特異性漿細胞的鑒定需要特殊的裝置，細胞的回收也需要非常繁雜的操作。而且，在該方法中，必須進行使用細胞表面抗原的漿細胞的純化操作，所以無法由尚未確立漿細胞鑒定法的動物物種制作抗原特異性單克隆抗體。
[0007]因此，本發(fā)明的目的在于:克服上述缺點，提供由廣泛的動物物種高效率地制作抗原特異性單克隆抗體的技術(shù)。
[0008]而且，本發(fā)明的目的還在于:利用上述新開發(fā)的制作抗原特異性單克隆抗體的技術(shù)，提供新的抗原特異性單克隆抗體。
[0009]B細胞在細胞膜上表達抗體(膜型抗體)，抗原與其結(jié)合，從而引起免疫球蛋白基因的類別轉(zhuǎn)換和體細胞高頻率突變，其結(jié)果，選出與抗原的親和性增強的B細胞。該高親和性B細胞中的一部分分化成漿細胞，成為抗體產(chǎn)生細胞。已知隨著該分化，漿細胞通過免疫球蛋白基因的選擇性剪接使膜型抗體的表達消失，使分泌型抗體大量表達(ImmunologicalReviews, Sarah A.0racki, Jennifer A.Walker, Margaret L.Hibbs, Lynn M.Corcoran, David M.Tarlinton, Special Issue: B-Lymphocyte Biology,第 237 卷，第I期，第140-159頁，September 2010:非專利文獻2 (其全部內(nèi)容作為公開而特別引用于此))。
[0010]在進行大鼠、豚鼠、兔的漿細胞分析的過程中，發(fā)明人新發(fā)現(xiàn)了:在由這些動物得到的漿細胞表面，有能夠進行抗原結(jié)合分析的量的膜型抗體分子在表達。由此認為:通過使標(biāo)記抗原與在漿細胞表面表達的高親和性膜型抗體直接結(jié)合，有可能可以鑒定抗原特異性漿細胞。但是，在漿細胞膜上表達的抗體分子的量少，因此即使存在與標(biāo)記抗原特異性結(jié)合的漿細胞，由于標(biāo)記抗原的非特異性吸附而產(chǎn)生的噪音，也難以鑒定抗原特異性漿細胞。
[0011]作為通過使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性熒光色素來高效率地鑒定漿細胞的方法，發(fā)明人開發(fā)了“漿細胞鑒定和分離用熒光探針以及使用該探針的漿細胞的鑒定或分離方法”，并申請了專利[W02011/118579 (其全部內(nèi)容作為公開而特別引用于此)]。
[0012]發(fā)明人發(fā)現(xiàn):利用只是使熒光標(biāo)記抗原和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)親和性熒光色素與由免疫動物制備的細胞懸浮溶液作用的單純的操作，可以鑒定抗原特異性漿細胞，完成了本發(fā)明。
[0013]本發(fā)明如下。
[0014][I]選擇與靶抗原特異性結(jié)合的漿細胞和成漿細胞中的至少一種的方法，該方法包括:
從非人動物中采集來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞，在體外用靶抗原致敏所采集的來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞，或者，用靶抗原對非人動物進行免疫，
從免疫成立后的非人動物中采集來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞，將上述致敏的或采集的來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞和(I)標(biāo)記的靶抗原以及(2)選擇性地與漿細胞和/或成漿細胞結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)混合，
選擇上述⑴標(biāo)記的靶抗原和⑵標(biāo)記物質(zhì)所結(jié)合的細胞。
[0015][2]選擇與靶抗原特異性結(jié)合的人的漿細胞和成漿細胞中的至少一種的方法，該方法包括:
從人中采集來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞，在體外用靶抗原致敏所采集的來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞，或者，從具有抗靶抗原抗體的人中采集來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞，
將上述致敏的或采集的來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞和(I)標(biāo)記的靶抗原以及(2)選擇性地與漿細胞和/或成漿細胞結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)混合，
選擇上述(I)標(biāo)記的靶抗原和(2)標(biāo)記物質(zhì)所結(jié)合的細胞。
[0016][3]靶抗原特異性抗體或抗體片段的制備方法，該方法包括:
利用權(quán)利要求1或2所述的方法選擇與靶抗原特異性結(jié)合的漿細胞和成漿細胞中的至少一種細胞，
從選擇的細胞中采集抗靶抗原抗體基因，鑒定其核苷酸序列，
根據(jù)鑒定的基因的核苷酸序列，制備上述抗體或抗體片段。
[0017][4]權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法，其中，
選擇性地與漿細胞和/或成漿細胞結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)是用于漿細胞和/或成漿細胞的鑒定或分離的熒光探針，該熒光探針對細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性高于其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細胞器的染色選擇性，通過利用該熒光探針進行的染色，可以識別漿細胞和成漿細胞與漿細胞和成漿細胞以外的細胞。
[0018][5]權(quán)利要求4所述的方法，其中，上述熒光探針選自(I)兩親性、陽離子型且具有中等程度的脂溶性的物質(zhì)、以及(2)對顯示出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布的蛋白具有一定以上的親和性的物質(zhì)。
[0019][6]權(quán)利要求5所述的方法，其中，上述兩親性的兩親性指數(shù)(Al)為+6>AI>0，中等程度的脂溶性的疏水性指數(shù)(1gP)為+6>l ogP>0，一定以上的親和性的解離常數(shù)為0.?μΜ~0.1nM的范圍。
[0020][7]權(quán)利要求4~6中任一項所述的方法，其中，上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細胞器是質(zhì)膜、線粒體、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、核、中心體、細胞質(zhì)基質(zhì)、吞噬體、核內(nèi)體或聚集體。
[0021][8]權(quán)利要求4~7中任一項所述的方法,其中，上述突光探針選自突光標(biāo)記格列本脲、熒光標(biāo)記布雷菲德菌素Α、熒光探針和熒光蛋白。
[0022][9]序列表的SEQ ID NO:1所示抗人胰島素的豚鼠抗體的Y鏈恒定區(qū)的基因或編碼具有序列表的SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的Y鏈恒定區(qū)的妝的基因。
[0023][10]序列表的SEQ ID NO: 2所示抗人胰島素的豚鼠抗體的κ鏈恒定區(qū)的基因或編碼具有序列表的SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的κ鏈恒定區(qū)的妝的基因。
[0024][11]序列表的SEQ ID NO: 3所示抗人胰島素的豚鼠抗體的λ鏈恒定區(qū)的基因或編碼具有序列表的SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的λ鏈恒定區(qū)的妝的基因。
[0025][12]具有序列表的SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的Y鏈恒定區(qū)的肽。
[0026][13]具有序列表的SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的κ鏈恒定區(qū)的肽。
[0027][14]具有序列表的SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的λ鏈恒定區(qū)的肽。
[0028][15]序列表的SEQ ID NO: 7~SEQ ID NO: 18中任一個所示的抗人胰島素的豚鼠抗體的Y鏈可變區(qū)的基因或編碼具有SEQ ID NO: 19~SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO:89~SEQ ID NO: 91中任一個所示的氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的、鏈可變區(qū)的妝的基因。
[0029][16]序列表的SEQ ID NO: 31~SEQ ID NO: 42中任一個所示的抗人胰島素的豚鼠抗體的κ鏈可變區(qū)的基因或編碼具有SEQ ID NO: 43~SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO:86~SEQ ID NO: 88中任一個所示的氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的κ鏈可變區(qū)的妝的基因。
[0030][17]具有 SEQ ID NO: 19 ~SEQ ID NO: 30 和 SEQ ID NO: 89 ~SEQ ID NO: 91中任一個所示的氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的Y鏈可變區(qū)的肽。
[0031][18]具有 SEQ ID NO: 43 ~SEQ ID NO: 54 和 SEQ ID NO: 86 ~SEQ ID NO: 88中任一個所示的氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的κ鏈可變區(qū)的肽。
[0032][19]抗人胰島素的豚鼠單克隆抗體，該抗體具有Y鏈，所述Y鏈具有SEQ ID NO:19~SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 89~SEQ ID NO: 91中任一個所示的氨基酸序列作為可變區(qū)，并且具有SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列作為恒定區(qū)。
[0033][20]抗人胰島素的豚鼠單克隆抗體，該抗體具有κ鏈，所述κ鏈具有SEQ ID NO:43~SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 86~SEQ ID NO: 88中任一個所示的氨基酸序列作為可變區(qū)，并且具有SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列作為恒定區(qū)。
[0034][21]抗人胰島素的 豚鼠單克隆抗體，該抗體包含κ鏈或者Υ鏈，所述κ鏈包含下述κ鏈⑶R1、κ鏈⑶R2和κ鏈⑶R3中各一個的任意組合，所述Y鏈包含下述Y鏈⑶R1、Y鏈⑶R2和Y鏈⑶R3中各一個的任意組合。
【權(quán)利要求】
1.選擇與靶抗原特異性結(jié)合的漿細胞和成漿細胞中的至少一種的方法，該方法包括: 從非人動物中采集來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞，在體外用靶抗原致敏所采集的來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞，或者，用靶抗原對非人動物進行免疫； 從免疫成立后的非人動物中采集來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞；將上述致敏的或采集的來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞和(I)標(biāo)記的靶抗原以及(2)選擇性地與漿細胞和/或成漿細胞結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)混合；以及選擇上述(I)標(biāo)記的靶抗原和(2)標(biāo)記物質(zhì)所結(jié)合的細胞。
2.選擇與靶抗原特異性結(jié)合的人的漿細胞和成漿細胞中的至少一種的方法，該方法包括: 從人中采集來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞，在體外用靶抗原致敏所采集的來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞，或者，從具有抗靶抗原抗體的人中采集來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞； 將上述致敏的或采集的來自淋巴液、淋巴組織、血細胞樣品或骨髓的細胞和(I)標(biāo)記的靶抗原以及(2)選擇性地與漿細胞和/或成漿細胞結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)混合；以及選擇上述⑴標(biāo)記的靶抗原和⑵標(biāo)記物質(zhì)所結(jié)合的細胞。
3.靶抗原特異性抗體或抗體片段的制備方法，該方法包括: 利用權(quán)利要求1或2所述的方法選擇與靶抗原特異性結(jié)合的漿細胞和成漿細胞中的至少一種細胞； 從選擇的細胞中采集抗靶抗原抗體基因，鑒定其核苷酸序列；以及 根據(jù)鑒定的基因的核苷酸序列，制備上述抗體或抗體片段。
4.權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法，其中， 選擇性地與漿細胞和/或成漿細胞結(jié)合的標(biāo)記物質(zhì)是用于漿細胞和/或成漿細胞的鑒定或分離的熒光探針，該熒光探針對細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色選擇性高于其對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細胞器的染色選擇性，通過利用該熒光探針進行的染色，可以識別漿細胞和成漿細胞與漿細胞和成漿細胞以外的細胞。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述熒光探針選自:(1)兩親性、陽離子型且具有中等程度的脂溶性的物質(zhì)；以及(2)對顯示出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布的蛋白具有一定以上的親和性的物質(zhì)。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中，上述兩親性的兩親性指數(shù)(Al)為+6>AI>0，中等程度的脂溶性的疏水性指數(shù)(1gP)為+6>logP>0，一定以上的親和性的解離常數(shù)為0.?μΜ~0.1nM的范圍。
7.權(quán)利要求4~6中任一項所述的方法，其中，上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的細胞器是質(zhì)膜、線粒體、高爾基體、溶酶體、過氧化物酶體、核、中心體、細胞質(zhì)基質(zhì)、吞噬體、核內(nèi)體或聚集體。
8.權(quán)利要求4~7中任一項所述的方法,其中，上述突光探針選自突光標(biāo)記格列本脲、熒光標(biāo)記布雷菲德菌素Α、熒光探針和熒光蛋白。
9.具有序列表的SEQID NO:1所示核苷酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的Y鏈恒定區(qū)的基因或編碼具有序列表的SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的Y鏈恒定區(qū)的肽的基因。
10.具有序列表的SEQID NO: 2所示核苷酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的κ鏈恒定區(qū)的基因或編碼具有序列表的SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的K鏈恒定區(qū)的肽的基因。
11.具有序列表的SEQID NO: 3所示核苷酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的λ鏈恒定區(qū)的基因或編碼具有序列表的SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的λ鏈恒定區(qū)的肽的基因。
12.具有序列表的SEQID NO: 4所示氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的gamma鏈恒定區(qū)的肽。
13.具有序列表的SEQID NO: 5所示氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的κ鏈恒定區(qū)的肽。
14.具有序列表的SEQID NO: 6所示氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的λ鏈恒定區(qū)的肽。
15.序列表的SEQID NO: 7~SEQ ID NO: 18中任一個所示的抗人胰島素的豚鼠抗體的Y鏈可變區(qū)的基因或編碼SEQ ID NO: 19~SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 89~SEQID NO: 91中任一個所示的抗人胰島素的豚鼠抗體的Y鏈可變區(qū)的肽的基因。
16.序列表的SEQID NO: 31~SEQ ID NO: 42中任一個所示的抗人胰島素的豚鼠抗體的K鏈可變區(qū)的基因或編碼SEQ ID NO: 43~SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 86~SEQID NO: 88中任一個所示的抗人胰島素的豚鼠抗體的K鏈可變區(qū)的肽的基因。
17.具有SEQ ID NO: 19 ~SEQ ID NO: 30 和 SEQ ID NO: 89 ~SEQ ID NO: 91 中任一個所示的氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的Y鏈可變區(qū)的肽。
18.具有SEQ ID NO: 43 ~SEQ ID NO: 54 和 SEQ ID NO: 86 ~SEQ ID NO: 88 中任一個所示的氨基酸序列的抗人胰島素的豚鼠抗體的K鏈可變區(qū)的肽。
19.抗人胰島素的豚鼠單克隆抗體，該抗體具有Y鏈，所述Y鏈具有SEQID NO: 19~SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 89~SEQ ID NO: 91中任一個所示的氨基酸序列作為可變區(qū)，并且具有SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列作為恒定區(qū)。
20.抗人胰島素的豚鼠單克隆抗體，該抗體具有K鏈，所述K鏈具有SEQID NO: 43~SEQ ID NO: 54和SEQ ID NO: 86~SEQ ID NO: 88中任一個所示的氨基酸序列作為可變區(qū)，并且具有SEQ ID NO: 5所示氨基酸序列作為恒定區(qū)。
21.抗人胰島素的豚鼠單克隆抗體，該抗體包含K鏈或gamma鏈，所述Κ鏈包含下述K鏈⑶R1、K鏈⑶R2和K鏈⑶R3中各一個的任意組合，所述Y鏈包含下述Y鏈⑶R1、Y鏈⑶R2和Y鏈⑶R3中各一個的任意組合:
【文檔編號】C07K16/18GK103534352SQ201280016777
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月30日
【發(fā)明者】黑澤信幸, 磯部正治 申請人:國立大學(xué)法人富山大學(xué)