一種從正常人血漿中提取純化前白蛋白pa的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種快速從正常人血漿中提取純化前白蛋白（PA）的方法。包括以下步驟：1）人血漿中加入NaCl，充分溶解；2）用酚溶液處理，萃取富集含前白蛋白（PA）的組分；3）含前白蛋白（PA）的組分透析置換緩沖液；4)AKTA系統(tǒng)離子交換層析快速中度純化PA；5)AKTA系統(tǒng)Sephacryl系列分子篩層析后續(xù)純化PA；6）AKTA系統(tǒng)Superdex系列分子篩層析精細(xì)純化PA；本發(fā)明的方法能夠很好的分離PA，制備的PA具有非常高的純度和活性，純度可達(dá)98%以上，被倍比稀釋64倍后仍能與抗血清發(fā)生清晰沉淀反應(yīng)，且操作安全方便，提取周期短，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】—種從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種快速從正常人血漿中提取純化前白蛋白(PA)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]前白蛋白(Prealbumin, PA)是肝臟細(xì)胞合成的一種血清蛋白質(zhì)，由4個相同的亞基組成，分子量約55KD，消光系數(shù)(E280nm) 13.6，半衰期1.9天，電泳時遷移在白蛋白之前，故稱為前白蛋白，主要生理功能是參與血清中甲狀腺和視黃醇的運(yùn)輸，并具有胸腺激素活性，可通過促進(jìn)籬淋巴細(xì)胞的成熟來增加機(jī)體免疫力。血清中前白蛋白的測定結(jié)果在臨床上是反應(yīng)肝功能和機(jī)體營養(yǎng)狀態(tài)的重要指標(biāo)，常見于營養(yǎng)不良者。由于前白蛋白半衰期很短，可以反映肝臟合成和分解代謝的輕微改變，其血清濃度降低的幅度與肝實質(zhì)損害的程度密切相關(guān)，因此在臨床上也常見于肝功能損傷、肝硬化、外傷及感染患者。臨床上，把檢測前白蛋白含量的變化作為衡量肝功能損害和營養(yǎng)不良的一種敏感可靠的指標(biāo)。因此前白蛋白的提取純化，在診斷中擁有良好的應(yīng)用前景。對于前白蛋白已報道的分離純化方法，大多是需要大量的血漿，步驟繁瑣，操作復(fù)雜，難以用于生產(chǎn)用的常規(guī)操作和臨床研究。EP0711786A2、US5310878A公開了一種純化人血漿前白蛋白的方法，這一方法在特定環(huán)境下運(yùn)用離子交換、免疫擴(kuò)散、親和層析、分子排阻層析以及多步緩沖液置換、濃縮等共計11步提取方法。然而，改方法步驟繁瑣而復(fù)雜，從而目的蛋白得率降低，并且提取流程耗時較長，難于滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計簡便、快速提取純化前白蛋白(PA)的方法。
[0004]本發(fā)明提供了一種從正常人血漿中提取純化前白蛋白(PA)的方法。該方法包括下列步驟:
[0005]I)人血漿中加入NaCl，充分溶解；
[0006]2)用酚溶液處理，萃取富集含前白蛋白(PA)的組分；
[0007]3)含前白蛋白(PA)的組分透析置換緩沖液；
[0008]4) GE AKTA?快速蛋白層析儀purifierlOO系統(tǒng)離子交換層析快速中度純化PA ；
[0009]5) AKTA系統(tǒng)Sephacryl系列分子篩層析后續(xù)純化PA ；
[0010]6) AKTA系統(tǒng)Superdex系列分子篩層析精細(xì)純化PA，得到高純度的PA。
[0011]所述步驟I)的人血漿為健康人群捐獻(xiàn)的正常人血漿，加入NaCl的濃度為5%~30% (w/v)，優(yōu)選 10~25%，最適 20% ;
[0012]所述步驟2)中所使用的酚溶液包含但不限于甲酚、萘酚、氯酚、苯酚或石炭酸。
[0013]所使用的酚溶液的濃度范圍在0.5^10% (w/v)，優(yōu)選2~7%，最優(yōu)選5.5% ；
[0014]所述步驟2)中萃取PA的方法步驟為將待處理血漿在磁力攪拌器的持續(xù)攪拌的條件下逐滴加入酚溶液，酚溶液的滴入速度為f 10毫升/分鐘；
[0015]所述步驟2)中萃取PA的方法，血漿與酚溶液混合物在4°C下靜置0.5^2小時，用高速離心機(jī)離心取出沉淀，留上清液，離心力為300(Tl2000g ；
[0016]所述步驟3中所使用的透析液為磷酸緩沖液，濃度范圍l(Tl00mM，優(yōu)選50mM;pH范圍 7-10，優(yōu)選 pH7.4 ；
[0017]步驟3)的含前白蛋白PA的組分透析方法為將組分裝入截留分子量為8000-20000道爾頓的透析袋，浸入上述磷酸緩沖液中，4°C下每隔3飛小時更換緩沖液一次，更換次數(shù)5~8次；
[0018]所述步驟4中所使用的AKTA純化系統(tǒng)為陰離子交換層析，層析柱的選擇包含但不限于 HiTrap Q FF, HiPrep Q FF, HiPrep DEAE FF 或 HiTrap Capto Q FF，優(yōu)選 HiTrapCapto Q FF ；
[0019]所述步驟4中陰離子交換層析的操作條件為:A液:50mM磷酸緩沖液，pH7.4 ;B液:50mM磷酸緩沖液、IM氯化鈉溶液，pH 7.4 ;流速為f 3毫升/分鐘；首先使用A液過3個柱床體積，得穿透峰一；后0~20% (v/v) B液過3個柱床體積得洗脫峰二 ；最后用20%~?00%Β液過3個柱床體積，得洗脫峰三；
[0020]所述步驟5中所使用的AKTA純化系統(tǒng)為分子篩層析，層析柱的選擇包含但不限于Sephacryl S-100、S-200、S-300 ；Sephadex G-100、G-200、G_300 ;SuperdexG-100、G-200 或G-300 ;優(yōu)選 S印hacryl S-100 ；
[0021]所述步驟5中Sephacryl S-100分子篩層析的層析條件為:層析液:50mM磷酸緩沖液，pH 7.4 ;流速為1-3毫升/分鐘；洗脫體積為1-2個柱床體積；
[0022]所述步驟6中所使用的AKTA純化系統(tǒng)為分子篩層析，層析柱的選擇包含但不限于Sephadex G-75、G_100、；Superdex G-75、G-100 ;優(yōu)選 Superdex G-75。
[0023]所述步驟6中Sephacryl S-100分子篩層析的層析條件為:層析液:50mM磷酸緩沖液，pH 7.4 ;流速為1-3毫升/分鐘；洗脫體積為1-2個柱床體積；
[0024]本發(fā)明的方法能夠很好的分離PA，制備的PA具有非常高的純度和活性，純度可達(dá)98%以上，被倍比稀釋64倍后仍能與抗血清發(fā)生清晰沉淀反應(yīng)，且操作安全方便，提取周期短，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1HiTrap Capto Q FF強(qiáng)離子交換層析純化PA:中間主峰為含PA組分；
[0026]圖2S印hacryl S200分子篩層析純化PA圖譜:第二峰為含PA組分
[0027]圖3Superdex G75分子篩層析純化PA圖譜:中間主峰為含PA組分；
[0028]圖4純化后PA組分瓊脂糖雙擴(kuò)散結(jié)果:中間孔:抗PA抗體；周圍孔:自頂端逆時針方向:lmg/ml PA依次為:原倍、1: 2、1: 4、1: 8、1:16、1:32倍稀釋；
[0029]圖5BCA法測總蛋白含量擬合直線圖譜:
[0030]X軸:標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度(微克/毫升)'Y軸:標(biāo)準(zhǔn)蛋白A570吸光度值；
[0031]擬合公式:y=0.0Ollx+0.1757;線性相關(guān)系數(shù) R2=0.9928
【具體實施方式】[0032]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0033]以下原料市售得到。
[0034]實施例1:酚沉淀法富集PA
[0035]取100ml人血漿中溶解20g NaCl，充分溶解使NaCl溶解度達(dá)到20% (w/v);配置120ml的5.5% (w/v)的苯酚水溶液，通風(fēng)櫥內(nèi)緩慢逐滴滴入，充分混勻，靜置30min ；1000Og(8500轉(zhuǎn)/分鐘)離心15min后，棄去沉淀，保留上清液；上清液經(jīng)0.8 μ m的水相濾頭過濾后，裝入透析袋，4°C透析(50mMPBS pH7.4) 48小時，每隔6~12小時更換一次透析液；
[0036]實施例2:強(qiáng)陰離子交換層析中度純化PA
[0037]HiTrap Capto Q FF (美國GE醫(yī)療公司產(chǎn)品)強(qiáng)陰離子交換層析:A液(50mM磷酸緩沖液(pH7.4) ；B液(50mM磷酸緩沖液、IM氯化鈉，ρΗ7.4)，待100ml待純化組分泵入層析柱后，首先在ΑΚΤΑ?快速蛋白層析儀purifierlOO系統(tǒng)上用50ml A液沖洗層析柱，洗掉非特異性吸附的雜蛋白，然后設(shè)定程序，洗脫50ml的A、B混合液形成總體積為5個柱床體積的0~20% (v/v) B液(100%~80%Α液)的線性洗脫，除去雜蛋白，后用50ml (5個柱床體積)20%~100% B液(80%~0%Α液)線性洗脫，洗脫峰中含PA，收集PA洗脫液約45ml ；
[0038]實施例3:分子篩 層析精度純化PA
[0039]首先用S印hacryl S200分子篩(美國GE醫(yī)療公司產(chǎn)品)層析柱中度純化，純化條件為:待純化樣品上樣量約12ml，洗脫流速為I毫升/分鐘，洗脫400ml(洗脫圖譜見圖2)，收集吸收峰二 30ml，棄峰一；
[0040]Superdex G75 (美國GE醫(yī)療公司產(chǎn)品)分子篩層析精細(xì)純化，純化條件為:待純化樣品上樣量約5ml，洗脫流速為I毫升/分鐘，洗脫250ml (洗脫圖譜見圖3)收集最大的吸收峰組分20ml，得到高純度的前白蛋白。
[0041 ] 實施例4:純化PA純度的鑒定
[0042]將用Superdex G75 (美國GE醫(yī)療公司產(chǎn)品)分子篩層析精細(xì)純化的蛋白組分含量用BCA法蛋白濃度定量試劑盒(ThermoFisher公司Pieirce1''BCA ProteinAssay Kit)檢測；BCA法是世界上常用的蛋白濃度監(jiān)測方法之一，參考文獻(xiàn):Smith，P.K.etal.Anal.Biochem.，150，76-85 (1985).擬合曲線后(見圖 5)代入公式(y=0.0011χ+0.1757)測得純化后組分總蛋白濃度為1.01mg/ml;
[0043]同時將用Superdex G75 (美國GE醫(yī)療公司產(chǎn)品)分子篩層析精細(xì)純化的蛋白組分用市售上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司生產(chǎn)的人載脂蛋白A/B定量檢測試劑盒，在全自動生化檢測分析儀(日立AU400)上檢測，在全自動生化檢測分析儀上檢測，檢測到PA含量為 0.997mg/ml;
[0044]PA 純度為(0.997/1.01) *100%=98.7%
[0045]表1BCA法測總蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)蛋白與待測蛋白的A5700D值
【權(quán)利要求】
1.一種從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，該方法包括下列步驟: O人血漿中加入NaCl，充分溶解； 2)用酚溶液處理，萃取富集含前白蛋白PA的組分； 3)含前白蛋白PA的組分透析置換緩沖液； 4)GE AKTA?快速蛋白層析儀purifierlOO系統(tǒng)離子交換層析快速中度純化PA ； 5)AKTA系統(tǒng)S^hacryl系列分子篩層析后續(xù)純化PA ； 6)AKTA系統(tǒng)Superdex系列分子篩層析精細(xì)純化PA，得到高純度的PA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟1)加入NaCl的濃度為5%~30% w/v，優(yōu)選10~25%，最優(yōu)選20%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟2)中所使用的酚溶液選自甲酚、萘酚、氯酚、苯酚或石炭酸；酚溶液的濃度范圍為0.5%~10% w/v，優(yōu)選2%~7%，最優(yōu)選5.5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟2)中萃取PA的方法步驟為將待處理血漿在磁力攪拌器的持續(xù)攪拌的條件下逐滴加入酚溶液，酚溶液的滴入速度為1-10毫升/分鐘；血漿與酚溶液混合物在4°C下靜置0.5^2小時，用高速離心機(jī)離心取出沉淀，留上清液，離心力為3000-l2000g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟3)中所使用的透析液為磷酸緩沖液，濃度范圍l0-l00mM，優(yōu)選50mM;pH范圍7_10，優(yōu)選pH7.4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟3)含前白蛋白PA的組分透析方法為將所述組分裝入截留分子量為8000-20000道爾頓的透析袋，浸入上述磷酸緩沖液中，4°C下每隔3飛小時更換緩沖液一次，更換次數(shù)為5、次。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟4)中所使用的AKTA純化系統(tǒng)為陰離子交換層析，層析柱選自HiTrap Q FF、HiPr印Q FF, HiPrep DEAE FF 或 HiTrap Capto Q FF，優(yōu)選 HiTrap Capto Q FF。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟4)中陰離子交換層析的操作條件為:A液:50mM磷酸緩沖液，pH 7.4 ；B液:50mM磷酸緩沖液、IM氯化鈉溶液，pH 7.4 ;流速為f 3毫升/分鐘；首先使用A液過3個柱床體積，得穿透峰一；后0-20%Β液過3個柱床體積得洗脫峰二 ；最后用20%~?00%Β液過3個柱床體積，得洗脫峰二。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟5)中所使用的AKTA純化系統(tǒng)為分子篩層析，層析柱選自S^hacryl S-100、S-200、S-300 ；Sephadex G-100、G-200、G-300 ；Superdex G-100、G-200 或 G-300 ；優(yōu)選Sephacryl S-1OO ;分子篩層析的層析條件為:層析液:50mM磷酸緩沖液，pH 7.4 ;流速為1-3毫升/分鐘；洗脫體積為f 2個柱床體積。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從正常人血漿中提取純化前白蛋白PA的方法，其特征在于，所述步驟6)使用的AKTA純化系統(tǒng)為分子篩層析系統(tǒng)，層析柱選自Sephadex G-75、G_100、Superdex G-75 或 G-100 ;優(yōu)選 Superdex G-75 ;所述步驟 6 中 Sephacryl S-1OO 分子篩層析的條件為:層析 液:50mM磷酸緩沖液，pH7.4 ;流速為1~3毫升/分鐘；洗脫體積為1~2個柱床體積。
【文檔編號】C07K1/18GK103833843SQ201210489310
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月27日
【發(fā)明者】張海濤, 張躍建, 孫衛(wèi)兵, 高曉猛 申請人:上海復(fù)星醫(yī)藥（集團(tuán)）股份有限公司, 上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司