一種高性能類蛛絲蛋白材料及其生物合成方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物材料學(xué)領(lǐng)域，以蜘蛛拖絲基因?yàn)榛A(chǔ)人工定向突變部分氨基酸序列，通過大腸桿菌過表達(dá)方法和Ni柱純化技術(shù)獲得新的重組蛛絲蛋白，靜電紡絲后獲得硬度和彈性都優(yōu)于天然蛛絲蛋白的類蛛絲蛋白。本發(fā)明的類蛛絲蛋白是SEQ?ID?NO：5所示的氨基酸序列的n倍體，其中n為等于1或大于1的整數(shù)，例如，3倍體、6倍體或其它整數(shù)倍體。
【專利說明】一種高性能類蛛絲蛋白材料及其生物合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高性能類蛛絲蛋白，所述類蛛絲蛋白是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的η倍體，其中η為等于I或大于I的整數(shù)，本發(fā)明還涉及利用生物法合成高性能蛋白材料的方法。
技術(shù)背景
[0002]蜘蛛絲是一種天然蛋白質(zhì)纖維，具有高強(qiáng)度、高彈性、高斷裂能等機(jī)械性能以及顯著的可降解性、組織相容性等生物學(xué)特性，在生物醫(yī)學(xué)、材料、紡織和軍事裝備等領(lǐng)域均有重大潛在應(yīng)用價值。蜘蛛絲作為一種蛋白質(zhì)纖維，從上世紀(jì)90年代開始成為新材料的研究熱點(diǎn)。蜘蛛絲的力學(xué)性能、熱學(xué)性能優(yōu)異，與杜邦公司生產(chǎn)的Kevlar相比，斷裂伸長率是后者的7倍，斷裂能是后者的10倍，性質(zhì)足以超越Kevlar這種備受推崇的“合成鋼絲”。在以后的研究中，有的研究者直接對蜘蛛絲冠以“生物鋼”的美譽(yù)。從商業(yè)上講，蜘蛛絲具有巨大的市場。
[0003]盡管蜘蛛絲有如此廣泛的用途，但蜘蛛的產(chǎn)絲量少且不易大規(guī)模飼養(yǎng)，而天然蛛絲蛋白序列結(jié)構(gòu)特征(含有多種重復(fù)序列)為人工獲得高性能類蜘蛛絲提供了重要依據(jù)。運(yùn)用化學(xué)或生物的手段生產(chǎn)高性能類蛛絲蛋白是目前研究的熱點(diǎn)。天然蛛絲蛋白富含丙氨酸和甘氨酸，丙氨酸富集區(qū)可以形成疏水的β_折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)，是蛛絲蛋白具有高強(qiáng)度的重要原因；而親水的甘氨酸富集區(qū)形成了 α-螺旋，是蛛絲蛋白具有高彈性的關(guān)鍵原因
[I];其它氨基酸(絲氨酸，酪氨酸，精氨酸，脯氨酸等)也在蛛絲結(jié)構(gòu)的形成中起到了重要的作用。這表明，蛛絲蛋白的序列結(jié)構(gòu)特征造就了其它人造纖維材料無法比擬的優(yōu)異性能。近20年來，隨著基因技術(shù)和基因化學(xué)合成方法的建立與發(fā)展，誕生了利用活細(xì)胞的合成體系創(chuàng)造新蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)工程，國內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室據(jù)此已進(jìn)行了人工合成蜘蛛絲蛋白的嘗試[2，3]。但是經(jīng)過紡絲工藝得到的人造蜘蛛絲，力學(xué)性能與天然蜘蛛絲還有較大的差距。因此，利用基因工程技術(shù)，通過改造天然蛛絲蛋白的序列結(jié)構(gòu)特征來提高蛛絲的力學(xué)性能成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。Valluzzi R等利用基因工程技術(shù)在蛛絲蛋白富含丙氨酸的區(qū)域側(cè)翼添加甲硫氨酸[4], 一定程度上改善了蛛絲蛋白的水溶性；Winkler S等通過在蛛絲蛋白基因序列中并入AMP蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)，從而在蛋白中引入帶有正電荷的磷酸基團(tuán)，這種帶有正電荷的磷酸基團(tuán)可以阻止β -折疊之間的疏水相互作用[5]。Vendrely C和Huemmerich D等都推測在蛛絲蛋白序列中引入一些側(cè)鏈化學(xué)活性較好的氨基酸可以改善蛛絲的性能[6，7]。但是，以上研究主要針對蛛絲蛋白的白組裝進(jìn)行研究，并沒有取得彈性、韌性等性能優(yōu)于天然蛛絲蛋白的異源表達(dá)蛋白。
[0004]蜘蛛絲基因組很大，目前國內(nèi)外是利用已知蜘蛛絲基因組中DNA、氨基酸主要重復(fù)序列信息，人工合成其類似物的DNA片段，通過大腸桿菌[8-10]，畢赤酵母[11]，山羊乳腺細(xì)胞[12，13]、家蠶表達(dá)系統(tǒng)[14]以及植物馬鈴薯和煙草[15]來生產(chǎn)蜘蛛絲蛋白。但是動植物表達(dá)宿主存在著表達(dá)周期長、重組絲蛋白產(chǎn)量低和成本昂貴的缺點(diǎn)，酵母宿主與大腸桿菌宿主相比具有培養(yǎng)周期較長的缺點(diǎn)。大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)是周期短，操作簡便，細(xì)胞易于破碎，成本低廉，適合蛛絲蛋白低倍體的表達(dá)。然而受限于原核表達(dá)系統(tǒng)的固有缺陷，目前已報道的利用大腸桿菌生產(chǎn)蜘蛛絲蛋白存在表達(dá)量低、力學(xué)性能較差等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對大腸桿菌生產(chǎn)蜘蛛絲蛋白存在表達(dá)量低、力學(xué)性能較差等問題，利用蛛絲蛋白低倍體不宜產(chǎn)生翻譯提前終止錯誤的特點(diǎn)進(jìn)行表達(dá)，并且通過定點(diǎn)突變提高了蛛絲蛋白的彈性和韌性等性能，獲得了性能優(yōu)于天然蛛絲蛋白性能的突變體蛛絲蛋白。
[0006]本發(fā)明的一個目的是提供一種類蛛絲蛋白，所述類蛛絲蛋白是SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列的η倍體，其中η為等于I或大于I的整數(shù)。所述類蛛絲蛋白的性能優(yōu)于天然蛛絲蛋白性能，例如，與天然蛋白相比較，所述類蛛絲蛋白的硬度和彈性都有較大的提高。
[0007]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述類蛛絲蛋白是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的3倍體或6倍體。SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的其它整數(shù)倍體與天然蛛絲蛋白相比較也具有改善的性能，因此也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0008]在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述類蛛絲蛋白的氨基酸序列為SEQ IDNO:3，其是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的3倍體。在另一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述類蛛絲蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:7，其是SEQID NO:5所示的氨基酸序列的6倍體。
[0009]本發(fā)明的目的在于通過大腸桿菌異源表達(dá)技術(shù)和靜電紡絲技術(shù)獲得一種在硬度和彈性上都有所改善的絲蛋白，為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，本發(fā)明提供一種生物合成本發(fā)明的高性能類蛛絲蛋白的方法，所述方法包括下述步驟:
[0010](I)根據(jù)本發(fā)明所述的類蛛絲蛋白的氨基酸序列人工合成相應(yīng)的核苷酸序列，并針對要用于表達(dá)的宿主進(jìn)行密碼子優(yōu)化；
[0011](2)將步驟(I)合成的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列重組到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，然后克隆到所述宿主的細(xì)胞中，篩選得到工程重組宿主細(xì)胞；
[0012](3)培養(yǎng)步驟(2)得到的所述工程重組宿主細(xì)胞，表達(dá)所述類蛛絲蛋白；
[0013](4)純化得到所述類蛛絲蛋白。
[0014]其中，所用的宿主可以是大腸桿菌，但并不限于此，還可以采用酵母菌等常用工程菌。其中步驟⑴所述人工合成相應(yīng)的核苷酸序列為SEQ IDNO:8的η倍體，其中η為等于I或大于I的整數(shù)。
[0015]可以利用上述方法合成SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的3倍體、6倍體或其它整數(shù)倍體的類蛛絲蛋白。當(dāng)合成的類蛛絲蛋白為SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的3倍體時，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3，相應(yīng)地，針對大腸桿菌表達(dá)宿主密碼子優(yōu)化的編碼核苷酸序列可以為SEQ IDNO:4。當(dāng)合成的類蛛絲蛋白為SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的6倍體時，其氨基酸序列為SEQ ID NO:7，相應(yīng)地，針對大腸桿菌表達(dá)宿主密碼子優(yōu)化的編碼核苷酸序列可以為SEQ ID Ν0:6。
[0016]當(dāng)表達(dá)宿主選擇大腸桿菌時，可用的表達(dá)載體可以為本領(lǐng)域常用的大腸桿菌表達(dá)載體，例如，但不限于，pET-30a(+) ,pACY dut-1等。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的知識，能夠依據(jù)所選用的宿主選擇適用的表達(dá)載體。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，密碼子優(yōu)化、基因的人工合成、重組方法和克隆方法、以及蛋白的表達(dá)和純化均是本領(lǐng)域中的常規(guī)方法。[0017]更具體地，合成本發(fā)明的高性能類蛛絲蛋白的方法的步驟如下:
[0018]a、本發(fā)明所涉及蛛絲蛋白11R26來源于金絲蜘蛛大壺狀腺絲蛋白(Nephilaclavipes major ampul late spidroin 1)，蛋白序列見 SEQ ID NO:1,其基因序列是根據(jù)蛋白序列人工合成的，并針對大腸桿菌對基因序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，獲得的基因序列為SEQID N0:2?；蛐蛄忻艽a子優(yōu)化及合成由上海生工生物公司提供；
[0019]b、將11R26單倍體序列中的所有Ser (見圖7，SEQ ID NO:1中下劃線標(biāo)出)轉(zhuǎn)變成Cys，得到ZF4(見圖7，SEQ ID NO:3，下劃線標(biāo)出對應(yīng)的位點(diǎn))，相應(yīng)人工合成并優(yōu)化突變體ZF4基因序列為SEQ ID N0:4(見圖7，SEQ ID NO:4，相應(yīng)突變位點(diǎn)下劃線標(biāo)出)?；蛐蛄忻艽a子優(yōu)化及合成由上海生工生物公司提供；
[0020]C、將11R26和ZF4的基因(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4)分別重組到表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+) (Novagen)上，轉(zhuǎn)化Ε.coli BL21 (DE3)，獲得工程大腸桿菌菌株(轉(zhuǎn)化技術(shù)為常規(guī)技術(shù)，具體方法參見分子克隆試驗(yàn)指南，美國冷泉港出版社);
[0021]d、挑取帶有重組質(zhì)粒pet30a_llR26/ZF4的陽性克隆接種到添加50 μ g ?πι1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，180-220rpm條件下，37°C過夜培養(yǎng)；
[0022]e、將過夜培養(yǎng)的工程大腸桿菌按I %的接種量轉(zhuǎn)接到50mL含50 μ g mL—1卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，在37°C和180-220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約為0.6-0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.5mmol.L_\繼續(xù)培養(yǎng)3_5小時，離心收集菌體；
[0023]f、菌體用ddH20洗滌后用裂解緩沖液(IOmM咪唑，6M尿素，lOmMTris-HCl，IOOmM磷酸二氫鈉，pH 8.0)溶解，130W超聲破碎菌體細(xì)胞，4°C，1000Orpm離心30min，收集上清，Ni柱純化目的蛋白；
[0024]g、將純化的蛛絲蛋白11R26(即，野生型蛛絲蛋白，作為對照)和ZF4(即，本發(fā)明的一種重組類蛛絲蛋白)進(jìn)行透析，收集沉淀，_80°C凍干；將凍干的兩種蛛絲蛋白溶于六氟異丙醇(IOOmg πι1), 23-30kV靜電紡絲在云母片上；
[0025]h、原子力顯微鏡(Dimension3100原子力顯微鏡)HARM0NIX模式檢測云母片上絲的力學(xué)性能，比較兩種絲纖維的力學(xué)性能后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過轉(zhuǎn)變序列后獲得的蛛絲蛋白ZF4硬度和彈性都有明顯改善。
[0026]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0027]本發(fā)明通過定向突變，改變了蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，然后通過大腸桿菌表達(dá)的方法獲得表達(dá)量較高的類蛛絲蛋白，相對于天然蛛絲蛋白(即，野生型蛛絲蛋白)序列，一級結(jié)構(gòu)中的巰基數(shù)目增加，從而提高了絲纖維中肽鏈之間二硫鍵數(shù)目，增加了蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性，從而增加絲纖維的彈性和硬度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中:
[0029]圖1蛛絲蛋白11R26(A)和類蛛絲蛋白ZF4(B)基因重組載體構(gòu)建圖；
[0030]圖2重組蛛絲蛋白11R26和類蛛絲蛋白ZF4Ni柱(GE healthcare)純化后的電泳圖，泳道I為11R26(即野生型)純化后蛋白，泳道2為ZF4(即突變型)純化后蛋白，箭頭所指為表達(dá)的蛛絲蛋白，泳道3為ZF4表達(dá)菌株破碎液，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)簽；
[0031]圖3重組蛛絲蛋白11R26(A)和類蛛絲蛋白ZF4(B)靜電紡絲掃描電鏡圖；[0032]圖4重組蛛絲蛋白11R26(A)和類蛛絲蛋白ZF4(B)硬度力學(xué)曲線變化圖；
[0033]圖5重組蛛絲蛋白11R26(A)和類蛛絲蛋白ZF4(B)彈性模量變化圖；
[0034]圖6重組蛛絲蛋白6倍體Ni柱(GE healthcare)純化后電泳圖，泳道I為重組蛛絲蛋白6倍體蛋白條帶(即，η = 6)，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)簽；
[0035]圖711R26蛋白(野生型蛛絲蛋白)和ZF4蛋白(突變型蛛絲蛋白)的氨基酸序列及其針對大腸桿菌密碼子優(yōu)化的編碼核苷酸序列，其中下劃線表示突變的位點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。
[0037]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，除非另外說明，實(shí)施例中所用的試劑均為市售分析純級別的試劑。
[0038]實(shí)施例1:蛛絲蛋白拖絲基因11R26和ZF4序列合成和重組載體的構(gòu)建
[0039]由上海生工有限公司合成SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4，并在5’和3’端分別引入EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)。
[0040]構(gòu)建蛛絲蛋白11R26(野生型，對照)和ZF4(突變體)重組表達(dá)載體具體過程如下:將上海生工有限公司合成的重組載體pMD18-T-llR26/ZF4EcoRI/HindIII雙切后，膠回收試劑盒(購自O(shè)mega)回收小的片段，同時EcoRI/Hindlll雙切表達(dá)載體pET_30a(+)(Novagen),柱純化試劑盒(購自O(shè)mega)直接過柱回收線性pET_30a (+)。將前面回收的小片段分別和線性表達(dá)載體pET_30a(+)用T4DNA Ligase(TaKaRa)進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒 pet30a-llR26 和 pet30a_ZF4(圖1)。
[0041]實(shí)施例2:重組質(zhì)粒pet30a_llR26和pet30a_ZF4在大腸桿菌的表達(dá)和純化
[0042]挑取帶有重組質(zhì)粒pet30a-l 1R26和pet30a_ZF4的陽性克隆接種到添加50μ g.ml/1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，180-220rpm條件下，37°C過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)的工程大腸桿菌按I %的接種量轉(zhuǎn)接到50mL含50 μ g.mL—1卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，在37°C和180-220rpm的條件下振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約為0.6-0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度
0.5mmol.L_\繼續(xù)培養(yǎng)3_5小時，離心收集菌體；
[0043]菌體ddH20洗滌后用裂解緩沖液(IOmM咪唑，6M尿素，lOmMTris-HCl，IOOmM磷酸二氫鈉，pH 8.0)溶解，130W超聲破碎菌體細(xì)胞(工作時間5s，間歇時間5s，共50min)，4°C，IOOOOrpm離心30min，收集上清；將上清液過AKTA N1-NTA純化柱，電腦記錄，等流穿的蛋白量達(dá)到一定體積時，用裂解緩沖液洗滌至電壓穩(wěn)定；洗滌緩沖液(20mM咪唑，6M尿素，IOmMTris-HCl，IOOmM磷酸二氫鈉，pH 8.0)洗滌雜蛋白，當(dāng)電壓不再變化或變化較小時用5倍柱體積的洗脫緩沖液洗柱(250mM咪唑，6M尿素，IOmM Tris_HCl，IOOmM磷酸二氫鈉，pH 8.0)，收集目的蛋白(目的蛋白SDS-PHAGE檢測結(jié)果如圖2所示)。
[0044]實(shí)施例3:重組蛛絲蛋白11R26和ZF4靜電紡絲以及力學(xué)性能測試
[0045]將純化的蛛絲蛋白11R26和ZF4洗脫液倒于透析袋，雙蒸水透析24小時，每2_3小時更換一次，收集沉淀，-80°C凍干。將已凍干的兩種蛛絲蛋白溶于六氟異丙醇(IOOmg/ml)，50°C加熱套溶解12小時以上，注入Iml注射器，23_30kV靜電紡絲，將云母片固定在傾斜60度角的硬紙片上，置于注射器下方鋁箔紙上，變換角度，使紡出的絲落在云母片上，經(jīng)掃描電鏡觀察如圖3A和圖3B所示；
[0046]原子力顯微鏡(Dimension3100原子力顯微鏡)HARM0NIX模式檢測云母片上絲的力學(xué)性能，比較兩種絲纖維的力學(xué)性能，獲得硬度和彈性都優(yōu)于天然蛋白的蛛絲蛋白。
[0047]通過比較圖4A和圖4B，改變序列(ser-cys)后的蛋白ZF4蛋白絲的硬度比未改變序列前的蛋白絲硬度有了明顯的改善，反應(yīng)在力學(xué)曲線上增加了 2倍左右；
[0048]通過比較圖5A和圖5B兩種絲纖維的彈性模量變化圖，改變序列(ser-cys)的ZF4蛋白絲的彈性模量值主要分布在0.8以上區(qū)域，0.SGPa區(qū)域以下沒有值分布，最大彈性模量值約為2.3GPa，而未改變序列的11R26蛋白絲彈性模量變化值基本分布在小于0.8GPa區(qū)域，大于0.8GPa區(qū)域基本沒有值分布，大部分分布在小于0.6GPa區(qū)域，最大彈性模量值約為1.3GPa，說明改變序列后的ZF4比11R26蛋白絲的彈性模量值要高，也說明彈性有了明顯的改善和提聞。
[0049]在表1中，突變體ZF4的最大斷裂強(qiáng)度(32.13nN)比11R26(10.08nN)增加了兩倍；平均彈性模量ZF4(1.356GPa)比11R26(0.513GPa)增加了 1.5倍左右。
[0050]表1:突變體ZF4和未突變體蛋白絲的力學(xué)性能比較
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種類蛛絲蛋白，所述類蛛絲蛋白是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的η倍體，其中η為等于I或大于I的整數(shù)。
2.權(quán)利要求1所述的類蛛絲蛋白，其中所述類蛛絲蛋白是SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的3倍體、6倍體或其它整數(shù)倍體。
3.權(quán)利要求1所述的類蛛絲蛋白，其中所述類蛛絲蛋白的氨基酸序列為SEQID Ν0:3。
4.權(quán)利要求1所述的類蛛絲蛋白，其中所述類蛛絲蛋白的氨基酸序列為SEQID Ν0:7。
5.一種生物合成權(quán)利要求1所述的類蛛絲蛋白的方法，所述方法包括下述步驟: (1)根據(jù)權(quán)利要求1所述類蛛絲蛋白的氨基酸序列人工合成相應(yīng)的核苷酸序列，并針對要用于表達(dá)的宿主進(jìn)行密碼子優(yōu)化； (2)將步驟(I)合成的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列重組到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，然后克隆到所述宿主的細(xì)胞中，篩選得到工程重組宿主細(xì)胞； (3)培養(yǎng)步驟(2)得到的所述工程重組宿主細(xì)胞，表達(dá)所述類蛛絲蛋白； (4)純化得到所述類蛛絲蛋白。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述宿主為大腸桿菌。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟(I)所述人工合成相應(yīng)的核苷酸序列為SEQIDNO:8的η倍體，其中η為等于I或大于I的整數(shù)。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟(I)所述人工合成相應(yīng)的核苷酸序列為SEQIDNO:4 或 SEQ ID NO:6。
9.一種纖維，所述纖維由通過權(quán)利要求5所述的方法得到的類蛛絲蛋白通過紡絲獲得。
10.由權(quán)利要求5所述的方法得到的類蛛絲蛋白的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K14/435GK103833838SQ201210478545
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月22日
【發(fā)明者】咸漠, 張海波, 劉煒, 周鳳麗 申請人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所