專利名稱：一種分離恩拉霉素a和恩拉霉素b的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分離技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種使用反相鍵合硅膠層析色譜分離純化恩拉霉素的方法。
背景技術(shù)：
恩拉霉素(enramycin)又名恩來霉素、恩霉素、安來霉素、持久霉素，是由放線菌(Streptomyces fungicidicus)發(fā)酵而得,是不飽和脂肪酸與十幾種氨基酸結(jié)合的多肽類抗生素，主要組分有恩拉霉素A和B，是其鹽酸鹽形式應(yīng)用。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有顯著抑菌作用，主要阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。敏感細(xì)菌有金黃葡萄球菌、表皮葡萄球菌、檸檬色葡萄球菌、釀膿鏈球菌等。而肺炎球菌、枯草桿菌、炭疽桿菌、破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌亦較敏感。白色或微黃白色粉末(粗品呈灰色或灰褐色的粉末，有特臭)。234 238°C分解，易溶于稀鹽酸、微溶于水、甲醇、乙醇，不溶于丙酮。恩拉霉素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有很強(qiáng)的活性，特別是對(duì)腸內(nèi)的有害梭狀芽孢桿菌(Clostridium)抑制力很強(qiáng)。長(zhǎng)期使用后不容易產(chǎn)生抗藥性，因它改變了腸道內(nèi)的細(xì)菌群，所以對(duì)飼料中營(yíng)養(yǎng)成分的利用效果好，可以促進(jìn)豬、雞增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率。
為了避免由于抗生素的濫用引起耐藥菌株大量繁殖或使藥物在畜產(chǎn)品中的殘留量增大，對(duì)畜禽生長(zhǎng)及人體健康造成直接危害，應(yīng)用畜禽專用的抗生素飼料添加劑已迫在眉睫。由于恩拉霉素具有優(yōu)良的促生長(zhǎng)和改善飼料利用率的作用，恩拉霉素內(nèi)服極不易被吸收，藥物主要通過糞便排出體外。因此被世界上許多國(guó)家推薦作為抗生素促生長(zhǎng)劑。市場(chǎng)上主要的來源是先靈葆雅公司的菌絲體預(yù)混劑。恩拉霉素A的分子式為C107H138C12N26031，分子量為2355 ;恩拉霉素B的分子式為C108H140C12N26031，分子量為2369 ;如下圖所示的化學(xué)式，恩拉霉素A和恩拉霉素B的區(qū)別在于R基團(tuán)位置上恩拉霉素A位甲基，恩拉霉素B為乙基。為了對(duì)恩拉霉素A和恩拉霉素B進(jìn)行有效的研究和檢測(cè)，需要分離純化獲得較純的單體化合物作為對(duì)照研究。
權(quán)利要求
1.一種分離恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法，其包括如下步驟步驟I，取含恩拉霉素A和恩拉霉素B的混合物進(jìn)行溶解，溶解液為30%甲醇的鹽酸水溶液，pH為3. 0-4. O ;步驟2，將粒徑為10-50 μ m的十八烷基反相鍵合硅膠層析填料用甲醇浸泡后，裝柱，再用含30%甲醇的pH4. 0-5. 5的O. 01-0. 05M磷酸二氫鈉-磷酸水溶液平衡層析柱后制成反相層析柱備用；步驟3，將步驟I中溶解液上樣反相層析柱，上樣量為I-IOmg混合物/mL填料體積，再用4-6倍填料體積的步驟2中的磷酸二氫鈉-磷酸水溶液洗脫雜質(zhì)，形成含有恩拉霉素A和恩拉霉素B的反相層析柱；步驟4，采用1-3倍填料體積的含有32%-36%甲醇的步驟2中的磷酸二氫鈉-磷酸水溶液對(duì)步驟3得到的含有恩拉霉素A和恩拉霉素B的反相層析柱進(jìn)行洗脫，收集得含有恩拉霉素A的洗脫液A ;步驟5，采用3-6倍填料體積的步驟2中的磷酸二氫鈉-磷酸水溶液洗脫，逐步提高磷酸二氫鈉-磷酸水溶液中甲醇含量至40%進(jìn)行梯度洗脫，棄洗脫液；步驟6，采用3-8倍填料體積的含有40%-50%甲醇的步驟2中的磷酸二氫鈉-磷酸水溶液對(duì)步驟4處理后的反相層析柱進(jìn)行洗脫，收集得含有恩拉霉素B的洗脫液B。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分離恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法，其特征在于所述的步驟I中恩拉霉素A和恩拉霉素B的總重量占混合物總重量的50%以上，恩拉霉素A和恩拉霉素B的重量比為1:0. 5-1. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分離恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法，其特征在于所述的步驟I中30%甲醇的鹽酸水溶液的用量為O. 25-0. 5mL/mg混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分離恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法，其特征在于所述的步驟4和步驟6中的洗脫方式為梯度洗脫或階段洗脫。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分離恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法，其特征在于所述的步驟4中的洗脫方式為含有35%甲醇的步驟2中的磷酸二氫鈉-磷酸水溶液的階段洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分離恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法，其特征在于所述的步驟6中的洗脫方式為含有45%甲醇的步驟2中的磷酸二氫鈉-磷酸水溶液的階段洗脫。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分離恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法，其特征在于流動(dòng)相流速為每小時(shí)10-25個(gè)填料體積。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分離恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法，其特征在于全程流速為每小時(shí)15個(gè)填料體積。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種分離恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法，其特征在于所述的磷酸二氫鈉-磷酸水溶液為PH4. O的O. 03M磷酸二氫鈉-磷酸水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離恩拉霉素A和恩拉霉素B的方法，包括如下步驟，步驟1，取含恩拉霉素A和恩拉霉素B的混合物進(jìn)行溶解、；步驟2，將十八烷基反相鍵合硅膠層析填料用甲醇浸泡后裝柱；步驟3，將步驟1中溶解液上樣反相層析柱用4-6倍填料體積的磷酸二氫鈉-磷酸水溶液洗脫；步驟4，采用含有32%-36%甲醇的磷酸二氫鈉-磷酸水溶液對(duì)步驟3得到的含有恩拉霉素A和恩拉霉素B的反相層析柱進(jìn)行洗脫；步驟5，逐步提高磷酸二氫鈉-磷酸水溶液中甲醇含量至40%進(jìn)行梯度洗脫；步驟6，采用含有40%-50%甲醇的磷酸二氫鈉-磷酸水溶液對(duì)步驟4處理后的反相層析柱進(jìn)行洗脫。該方法能夠有效分離恩拉霉素A和恩拉霉素B。
文檔編號(hào)C07K7/08GK102898510SQ201210433029
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月4日
發(fā)明者樂占線 申請(qǐng)人:樂占線