專利名稱：具有酸激活特性的抗菌肽AMitP及其合成和在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化藥物領(lǐng)域，涉及ー種新的抗菌肽化合物及其合成，尤其涉及ー種具有酸激活特性的抗菌肽AMitP及其合成方法；本發(fā)明同時(shí)還涉及該抗菌肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是威脅人類健康的重要疾病之一?；熓侵委熌[瘤或減緩腫瘤生長(zhǎng)的ー種有效的常規(guī)方法。但是多數(shù)傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物選擇性差、毒副作用強(qiáng)，以及腫瘤的多藥耐藥等原因嚴(yán)重影響了臨床療效(Accounts Chem. Res. , 2007, 41，98)。提高選擇性成為發(fā)展抗腫瘤藥物需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。因此現(xiàn)在迫切需要發(fā)展ー類廣譜、高選擇性、具有新的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制的藥物?？咕?antimicrobial peptide)—般是由少于50個(gè)氨基酸構(gòu)成的雙親性陽(yáng)離子多肽，它是生物進(jìn)化過(guò)程中保留下來(lái)的重要分子防御機(jī)制的一部分(Nature，2002,415，389)?？咕牡姆肿恿啃?、熱穩(wěn)定性和水溶性好，較一般抗生素和抗腫瘤藥物沒(méi)有免疫原性和耐藥性，因而具有廣泛的應(yīng)用前景。除了具有抗菌作用外，抗菌肽還具有很好的抗腫瘤活性(Biochim. Biophys. Acta. , 2008, 1778, 357)?？咕牡闹饕饔梅绞绞菍?duì)細(xì)胞膜的破壞首先帶正電荷的抗菌肽通過(guò)靜電作用吸附到帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜上，當(dāng)數(shù)量達(dá)到閾值之后，抗菌肽便會(huì)在膜上形成孔道而破壞細(xì)胞膜，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的外流(Pharmacol. Rev. , 2003, 55, 27)。盡管這種獨(dú)特的作用方式賦予抗菌肽一定的選擇性和很好的抗腫瘤活性，但同時(shí)也使抗菌肽具有一定的毒副作用，如對(duì)血紅細(xì)胞以及其它正常組織細(xì)胞的損傷。此外，抗菌肽本身所帯的多價(jià)正電荷也會(huì)引發(fā)體內(nèi)系統(tǒng)毒性。這些毒副作用嚴(yán)重阻礙了抗菌肽發(fā)展成為臨床藥物。Mitoparan (MitP)是以抗菌肽Mastoparan為模板,通過(guò)氨基酸替換而得到的一個(gè)正電荷數(shù)和雙親性都提高的抗菌肽化合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MitP殺細(xì)胞的活性明顯優(yōu)于Mastoparan (Biochim. Biophys. Acta. , 2008, 1783, 849)。但是和其它許多抗菌妝一樣，毒副作用限制了其作為優(yōu)秀的藥物用于臨床。迄今降低抗菌肽毒性的方法主要是氨基酸的替換，盡管這種方法在一定程度上能夠降低抗菌肽的毒性(主要是針對(duì)紅細(xì)胞的毒性)，但是得到的抗菌肽化合物對(duì)正常細(xì)胞仍具有一定的殺傷作用，特別是體內(nèi)給藥時(shí)，往往會(huì)因?yàn)榫植靠咕臐舛冗^(guò)高而對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，從而產(chǎn)生不可避免的毒副作用。另外ー些降低抗菌肽毒性的方法往往是以犧牲抗菌肽的殺細(xì)胞活性為代價(jià)的(Cancer Res., 2009, 69，3458)，從而造成魚(yú)與熊掌不能兼得。因而發(fā)展新策略以降低抗菌肽的毒副作用對(duì)于提高其臨床應(yīng)用十分必要。如何降低抗菌肽的毒副作用并保留其破膜活性是發(fā)展抗菌肽類藥物首要解決的 問(wèn)題。利用正常組織細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的差異可有效提高抗菌肽的選擇性，降低肽的毒性。研究表明腫瘤組織細(xì)胞由于代謝快、供氧不足等原因，細(xì)胞通過(guò)糖酵解提供能量產(chǎn)生大量乳酸，但腫瘤血管異常又不能及時(shí)清除，最終導(dǎo)致腫瘤組織微環(huán)境呈酸性。近年來(lái)，以這種酸性微環(huán)境為靶點(diǎn)的藥物得到了較快的發(fā)展(J. Control Release, 2008, 132，164)。因此這種酸性微環(huán)境可以成為提高抗菌肽選擇性有效的靶點(diǎn)。大多數(shù)研究表明，帶正電荷的抗菌肽通過(guò)靜電作用吸附到帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜上是發(fā)揮破膜活性的第一歩，也是非常關(guān)鍵的ー步(Nature，2002, 415，389; Biochim.Biophys. Acta. , 2008, 1778, 357)。因而通過(guò)控制靜電吸附作用可以顯著降低抗菌肽的
細(xì)胞毒性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種能夠提高抗菌肽的選擇性、降低抗菌肽的毒副作用的具有酸激活特性的抗菌肽化合物AMitP ；
本發(fā)明的另ー目的是提供ー種合成具有酸激活特性的抗菌肽化合物AMitP的方法；
本發(fā)明還有ー個(gè)目的，就是提供ー種以該個(gè)具有酸激活特性的抗菌肽化合物AMitP為活性成分，在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。(一)具有酸激活特性的抗菌肽化合物AMitP
本發(fā)明具有酸激活特性的抗菌肽化合物AMitP，是以抗菌肽MitP為模板，將其序列中的賴氨酸(K)替換成谷氨酸(E)和組氨酸(H)，合成一系列在正常生理?xiàng)l件下帶負(fù)電荷的陰離子多肽MUPe ;陰離子多肽再與抗菌肽MitP通過(guò)ニ硫鍵連接，得到具有酸激活特性的活抗菌肽化合物AMitP。其結(jié)構(gòu)是如下
XINLKKLAKL(Aib)KKIL-NH2
^iHNLEHLAHL(Ajb)E 曰 L-MH2
本發(fā)明具有酸激活特性的抗菌肽化合物在不同PH條件下發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化如下在正常生理?xiàng)l件下，陰離子多肽MUPe序列中的谷氨酸(E)可以通過(guò)靜電作用與MitP序列中賴氨酸(K)吸引在一起，既可降低MitP中的正電荷數(shù)量，也可限制MitP的結(jié)構(gòu)變化，從而降低MitP的活性；但是在酸性pH條件下，陰離子多肽MitPE中的谷氨酸(E)側(cè)鏈羧基被中和，失去與MitP中賴氨酸(K)的靜電吸引，從而釋放出MitP，恢復(fù)其活性。因此，通過(guò)利用陰離子多肽MUPe在不同pH條件下所帶電荷的變化，從而控制與其相連的抗菌肽與細(xì)胞膜的靜電吸附作用，從而達(dá)到提高抗菌肽選擇性的目的(見(jiàn)圖I)。(ニ)具有酸激活特性的抗菌肽的制備
本發(fā)明具有酸激活特性的抗菌肽化合物的制備方法，包括以下エ藝步驟
(I)抗菌肽Cys-MitP及其對(duì)應(yīng)的陰離子多肽化合物CyS-MitPE的固相合成
a.樹(shù)脂預(yù)處理將Rink-Amide-MBHA樹(shù)脂加入ニ氯甲烷，攪拌20 40min,使樹(shù)脂充分溶脹后減壓抽干溶劑；
b.脫F-moc保護(hù)在溶脹后的樹(shù)脂中加入脫保護(hù)試劑，攪拌2 5min后抽干，重復(fù)4次，使Fmoc基團(tuán)完全脫除，最后用DMF洗滌除凈脫保護(hù)試劑，得到脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹(shù)脂；
所述脫保護(hù)試劑由哌啶與DMF以1:3 1:5的體積比混合而成。C.縮合依次將Rink-Ami de-MBHA樹(shù)脂:Γ4倍摩爾量的Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸、N-羥基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲-六氟磷酸鹽溶于DMF中，再加入Rink-Amide-MBHA樹(shù)脂6 8倍摩爾量的ニ異丙基こ胺后混勻得混合溶液；然后投入到所述脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹(shù)脂，在氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)4(T60min ;通過(guò)茚檢試劑檢測(cè)反應(yīng)程度，反應(yīng)完全后用DMF重復(fù)洗漆；
d.肽鏈的延長(zhǎng)分別按CINLKKLAKL(Aib)KKIL、CINLEHLAHL(Aib)EEIL的順序重復(fù)步驟b、C，直至接肽完成為止；
e.肽鏈從樹(shù)脂上的切割分別按照步驟b的方法將最后一個(gè)連接的氨基酸的Fmoc基團(tuán)完全脫除，用DCM、MeOH交替洗滌樹(shù)脂，充分抽干溶劑后，按每克肽樹(shù)脂加入10 25mL的切割試劑，于室溫下切割反應(yīng)I. 5^3小時(shí)；收集切割試劑并減壓旋干，用こ醚沉淀，再用水充分溶解沉淀并除去こ醚相，水相經(jīng)冷凍干燥，得白色固體粉末粗肽Cys-MitP和Cys-MitP15 ；
所述切割試劑是由三氟こ酸、苯酚、苯甲硫醚、1，2-こニ硫醚、水以82. 5 5 5 5 :2. 5 5的體積比混合而成。 f.粗肽的脫鹽和純化以體積濃度1(Γ20%的こ酸溶液為流動(dòng)相，分別將粗肽Cys-MitP和Cys-MitP15通過(guò)Sephadex G25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱脫鹽,利用紫外檢測(cè)儀收集主峰后冷凍干燥，得到脫鹽的肽化合物；再利用反向高效液相色譜柱進(jìn)行分離純化，收集主峰，冷凍干燥后得到白色的純肽固體粉末Cys-MitP和Cys_MitPE ；
(2)抗菌肽Cys-MitP序列中半胱氨酸側(cè)鏈巰基的活化將Cys-MitP溶于甲醇與水的混合溶液中；加入Cys-MitP摩爾量1(Γ12倍的ニ硫ニ吡啶，反應(yīng)l(Tl6 h，利用反向高效液相色譜柱進(jìn)行分離純化，收集主峰，冷凍干燥，得到巰基活化的Cys-MitP ；
所述甲醇與水的混合溶液中，甲醇與水的體積比為1:廣1:5。(3)將巰基活化的Cys-MitP與Cys_MitPE以I: f 1:2的摩爾比溶于甲醇與水的混合溶液中；反應(yīng)1(T16 h，利用反向高效液相色譜柱進(jìn)行分離純化，收集主峰，冷凍干燥，得到目標(biāo)產(chǎn)物AMitP ；
所述甲醇與水的混合溶液中，甲醇與水的體積比為1:廣1:5。本發(fā)明合成的多肽產(chǎn)品通過(guò)電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)進(jìn)行表征，結(jié)果表明所純化得到的多肽的實(shí)際分子量與理論分子量相符。(三)具有酸激活特性的抗菌肽抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)
I、體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)
試驗(yàn)方法采用MTT法來(lái)檢測(cè)酸激活抗菌肽的抗腫瘤活性加藥前24小時(shí)將Hela細(xì)胞按照I X IO4個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μ L細(xì)胞懸液。加藥時(shí)吸出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液并在每孔中加入100 μ L pH值分別為7. 4,6. 0,5. O含有不同濃度肽的培養(yǎng)液。藥物孵育4小時(shí)后，在每孔中加入10 11し的階1'溶液(5 11^/111し)，37で孵育4小吋。之后將培養(yǎng)液吸出并在每孔中加入150 UL的DMSO溶解藍(lán)紫色的甲瓚結(jié)晶?；靹蚴昼姾?，用酶標(biāo)儀(Bio-reader 680)檢測(cè)在570nm波長(zhǎng)下的光吸收值并計(jì)算IC50值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表I。表I的結(jié)果顯示，MitP的抗腫瘤活性并未表現(xiàn)出pH依賴性，陰離子多肽MitPE在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)(0.625 mol/L^O mol/L)并未表現(xiàn)出活性，只有將兩者相連而合成的AMitP在酸性條件下具有很高的抗腫瘤活性，而在正常生理?xiàng)l件下的抗腫瘤活性明顯降低。表I MitP、AMitP和MitPE在不同pH條件下的抗腫瘤活性サL半抑制濃度IC5.3 (μΜ)
藥物 -
pH TApH 6.0pH 5.0
MilP 11JP±0.15 11.98=0.92 13.61±1.48 MjtPi ND ND ND AMitP _34.m±3.99 14.16=230 _10.24=0.4權(quán)利要求
1.具有酸激活特性的抗菌肽化合物AMitP，其結(jié)構(gòu)式如下 ^lNLKKLAKL(Aib)KKIL-NH2S "^-CINLEHLAHL(Aib)EEIL-NH2
2.如權(quán)利要求I所述具有酸激活特性的抗菌肽化合物AMitP的制備方法，包括以下エ藝步驟 (1)抗菌肽Cys-MitP及其對(duì)應(yīng)的陰離子多肽化合物Cys_MitPE的固相合成 a.樹(shù)脂預(yù)處理將Rink-Amide-MBHA樹(shù)脂加入ニ氯甲烷，攪拌20 40min,使樹(shù)脂充分溶脹后減壓抽干溶劑； b.脫F-moc保護(hù)在溶脹后的樹(shù)脂中加入脫保護(hù)試劑，攪拌2 5min后抽干，重復(fù)4次，使Fmoc基團(tuán)完全脫除，最后用DMF洗滌除凈脫保護(hù)試劑，得到脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹(shù)脂； c.縮合依次將Rink-Amide-MBHA樹(shù)脂3 4倍摩爾量的Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸、N-羥基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲-六氟磷酸鹽溶于DMF中，再加入Rink-Amide-MBHA樹(shù)脂6 8倍摩爾量的ニ異丙基こ胺后混勻得混合溶液；然后投入到所述脫除Fmoc基團(tuán)保護(hù)的樹(shù)脂，在氬氣保護(hù)下攪拌反應(yīng)4(T60min ;通過(guò)茚檢試劑檢測(cè)反應(yīng)程度，反應(yīng)完全后用DMF重復(fù)洗漆； d.肽鏈的延長(zhǎng)分別按CINLKKLAKL(Aib)KKIL、CINLEHLAHL (Aib)EEIL的順序重復(fù)步驟b、C，直至接肽完成為止； e.肽鏈從樹(shù)脂上的切割分別按照步驟b的方法將最后一個(gè)連接的氨基酸的Fmoc基團(tuán)完全脫除，用DCM、MeOH交替洗滌樹(shù)脂，充分抽干溶劑后，按每克肽樹(shù)脂加入10 25mL的切割試劑，于室溫下切割反應(yīng)I. 5^3小時(shí)；收集切割試劑并減壓旋干，用こ醚沉淀，再用水充分溶解沉淀并除去こ醚相，水相經(jīng)冷凍干燥，得白色固體粉末粗肽Cys-MitP和Cys-MitP15 ； f.粗肽的脫鹽和純化以體積濃度1(Γ20%的こ酸溶液為流動(dòng)相，分別將粗肽Cys-MitP和Cys-MitP15通過(guò)Sephadex G25交聯(lián)葡聚糖凝膠柱脫鹽,利用紫外檢測(cè)儀收集主峰后冷凍干燥，得到脫鹽的肽化合物；再利用反向高效液相色譜柱進(jìn)行分離純化，收集主峰，冷凍干燥后得到白色的純肽固體粉末Cys-MitP和Cys_MitPE ； (2)抗菌肽Cys-MitP序列中半胱氨酸側(cè)鏈巰基的活化將Cys-MitP溶于甲醇與水的混合溶液中；加入Cys-MitP摩爾量1(Γ12倍的ニ硫ニ吡啶，反應(yīng)l(Tl6 h，利用反向高效液相色譜柱進(jìn)行分離純化，收集主峰，冷凍干燥，得到巰基活化的Cys-MitP ； (3)將巰基活化的Cys-MitP與Cys-MitPE以I:f 1:2的摩爾比溶于甲醇與水的混合溶液中；反應(yīng)1(T16 h，利用反向高效液相色譜柱進(jìn)行分離純化，收集主峰，冷凍干燥，得到目標(biāo)產(chǎn)物AMitP。
3.如權(quán)利要求2所述具有酸激活特性的抗菌肽化合物AMitP的制備方法，其特征在于步驟(l)b中，所述脫保護(hù)試劑由哌啶與DMF以1:3 1:5的體積比混合而成。
4.如權(quán)利要求2所述具有酸激活特性的抗菌肽化合物AMitP的制備方法，其特征在于步驟(I) e中，所述切割試劑是由三氟こ酸、苯酚、苯甲硫醚、1,2-こニ硫醚、水以82. 5 5 5 5 2. 5 5的體積比混合而成。
5.如權(quán)利要求2所述具有酸激活特性的抗菌肽化合物AMitP的制備方法，其特征在于步驟(2)、(3)中，所述甲醇與水的混合溶液中，甲醇與水的體積比為1:廣1:5。
6.如權(quán)利要求I所述具有酸激活特性的抗菌肽化合物AMitP在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng) 用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種高效低毒的具有抗腫瘤活性的酸激活抗菌肽，是以抗菌肽MitP為模板，將其序列中的賴氨酸(K)替換成谷氨酸(E)和組氨酸(H)，合成在正常生理?xiàng)l件下帶負(fù)電荷的陰離子多肽MitPE；陰離子多肽再與抗菌肽MitP通過(guò)二硫鍵連接，得到具有酸激活特性的活抗菌肽化合物。本發(fā)明合成的抗菌肽具有明顯的酸依賴活性在酸性條件下才具有優(yōu)秀的殺細(xì)胞活性，而在正常生理?xiàng)l件下的殺細(xì)胞活性顯著降低。這一特點(diǎn)可提高抗菌肽的選擇性，減弱抗菌肽對(duì)正常組織細(xì)胞的損傷，降低抗菌肽的毒副作用，為開(kāi)發(fā)抗菌肽類藥物提供了廣闊的前景。
文檔編號(hào)C07K1/20GK102718844SQ201210221080
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月29日
發(fā)明者宋竟婧, 開(kāi)明, 張偉, 張邦治, 王銳 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)