專利名稱：Trpc6抗原多肽和抗trpc6的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種TRPC6抗原多肽和抗TRPC6的單克隆抗體。
背景技術(shù)：
TRPC6(瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道6)蛋白是重要的足細(xì)胞膜蛋白之一，其基因突變產(chǎn)物可導(dǎo)致大量蛋白尿，從而引起局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)和進(jìn)行性腎衰竭。有研究發(fā)現(xiàn)在人類非遺傳性蛋白尿性腎臟疾病如FSGS、微小病變性腎病和膜性腎病患者中，TRPC6 表達(dá)顯著增加，并且成群分布，有節(jié)段性密集型。FSGS是一種常見(jiàn)的腎小球疾病，人群發(fā)生率約為百萬(wàn)分之二，其臨床特征為大量蛋白尿、腎病綜合征和進(jìn)行性腎功能不全。FSGS約占激素耐藥性腎病綜合征兒童的7 15%，占成人激素耐藥性腎病綜合征的15 20%。FSGS是一種病理學(xué)診斷，其依據(jù)是光學(xué)顯微鏡下所描述的一種僅累及部分腎小球(局灶)的部分節(jié)段性血管袢的瘢痕形成模式(硬化)。該硬化可發(fā)生于多種情況，僅以光學(xué)顯微鏡下病理形態(tài)學(xué)特征命名的FSGS在臨床診斷治療方面均表現(xiàn)出極大的異質(zhì)性。由于免疫病理檢查可能因穿刺時(shí)未取到局灶性的硬化腎小球，或因病理切片制作數(shù)目過(guò)少而未觀察到節(jié)段性的硬化病灶，從而會(huì)導(dǎo)致FSGS的漏診。目前用于檢測(cè)TRPC6的均為多克隆抗體，在應(yīng)用中非特異性結(jié)合因素多，難于評(píng)價(jià)和分析結(jié)果，而TRPC6單克隆抗體的制備可以克服這些局限性。此外，有關(guān)各組織TRPC6表達(dá)的測(cè)定多以mRNA檢測(cè)為主，沒(méi)有在蛋白水平上分析，利用TRPC6單克隆抗體構(gòu)建體外免疫學(xué)技術(shù)方法，測(cè)定蛋白水平的表達(dá)，更有利于疾病的分析與病情愈后監(jiān)測(cè)?？谷薚RPC6多肽單克隆抗體制備是采用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，該技術(shù)的基礎(chǔ)是細(xì)胞融合。骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞融合后，可形成能分泌針對(duì)單一抗原表位的均質(zhì)的高特異性的抗體，即單克隆抗體。由于骨髓瘤細(xì)胞在體外可以連續(xù)傳代，而脾細(xì)胞是終末細(xì)胞不能在體外增殖，因此將兩種細(xì)胞融合后既具有腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖特性，又具有淋巴細(xì)胞能分泌特異性抗體的能力，同時(shí)也克服了免疫淋巴細(xì)胞不能在體外增殖的缺點(diǎn)，融合的細(xì)胞被稱為淋巴細(xì)胞雜交瘤。為了能建立簡(jiǎn)便乙型的檢測(cè)方法對(duì)FSGS進(jìn)行診斷，首先需要篩選合適的TRPC6多肽序列，獲得良好的免疫原，但目前并沒(méi)有免疫原性好且特異性高的抗原多肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種TRPC6抗原多肽。本發(fā)明的另一目的是提供一株能分泌抗上述TRPC6抗原多肽的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明的又一目的是提供上述TRPC6抗原多肽的單克隆抗體。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
為了能建立簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)方法對(duì)FSGS進(jìn)行診斷，首先篩選合適的TRPC6多肽序列，獲得良好的免疫原，便可以制備抗TRPC6的單克隆抗體?；趩慰寺】贵w的優(yōu)勢(shì)可用于免疫學(xué)方法的構(gòu)建，可特異性的用于FSGS過(guò)程中TRPC6蛋白表達(dá)的測(cè)定。具體技術(shù)方案如下
一種TRPC6抗原多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。TRPC6蛋白共有931個(gè)氨基酸，經(jīng)過(guò)對(duì)其進(jìn)行穿膜區(qū)域、保守區(qū)域等多方面的研究，最終篩選確定15個(gè)氨基酸序列即KDLTKVTLGDNVKYY，作為抗原多肽，既避開(kāi)了穿膜結(jié)構(gòu)，又具有高度的保守性(在人、大鼠和小鼠中均有)。一株雜交瘤細(xì)胞株H8，是由上述TRPC6抗原多肽作為抗原制備得到，能夠分泌抗TRPC6的單克隆抗體，于2012年3月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC-C201236。一種抗TRPC6的單克隆抗體，是由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌得到的。 該抗TRPC6的單克隆抗體的制備方法如下
(1)TRPC6抗原多肽合成,與KLH (keyhole limpet hemocyanin,血藍(lán)蛋白)歐聯(lián)后免疫小鼠；
(2)雜交瘤細(xì)胞株制備與篩選取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，培養(yǎng)，然后用常規(guī)間接ELISA檢測(cè)技術(shù)篩選，建立雜交瘤細(xì)胞株；
(3)單抗的純化及鑒定對(duì)所得雜交瘤細(xì)胞株分泌的單抗進(jìn)行純化，可以采用辛酸-硫酸銨沉淀法或離子交換層析法純化，SDS-PAGE電泳分析純化結(jié)果，經(jīng)鑒定最終得到抗TRPC6的單克隆抗體。上述抗TRPC6的單克隆抗體可作為體外免疫診斷試劑用于檢測(cè)與TRPC6分子表達(dá)相關(guān)疾病，如局灶性節(jié)段性腎小球硬化等。也可以用于TRPC6蛋白過(guò)表達(dá)的組織及疾病監(jiān)測(cè)，或經(jīng)改造人源化后與藥物偶聯(lián)進(jìn)行免疫靶向治療。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
I.分析特性表明，本發(fā)明的TRPC6抗原多肽的抗原指數(shù)預(yù)測(cè)1.034，表露性預(yù)測(cè)值I. 000，柔韌性預(yù)測(cè)值I. 008，^ -轉(zhuǎn)角預(yù)測(cè)值I. 022。其中作為免疫原最重要的參數(shù)為抗原指數(shù)，其預(yù)測(cè)值與網(wǎng)上檢索的序列EKLSMEPNQEETN (SEEQ ID NO: 2，抗原指數(shù)預(yù)測(cè)0. 928)比較有優(yōu)勢(shì)，免疫效果較佳，檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)1:12800，達(dá)到制備單克隆抗體的要求。2.本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株可以在體外“永久”地存活并傳代，只要不發(fā)生細(xì)胞株的基因突變就可以無(wú)限量的生產(chǎn)抗體，適合持續(xù)性研究及進(jìn)一步的產(chǎn)業(yè)化。3.本發(fā)明的抗TRPC6的單克隆抗體，同已有的多克隆抗體相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)①免疫用的抗原可以不純，但可獲得大量高度特異的、均一的抗體。理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)、便于人為處理和質(zhì)量控制。②由于可能得到“無(wú)限量”的均一性抗體，所以適用于以標(biāo)記抗體為特點(diǎn)的免疫學(xué)分析方法，如ELISA技術(shù)、膠體金技術(shù)等。③由于單克隆抗體的高特異性和單一生物學(xué)功能，經(jīng)改造人源化后與藥物偶聯(lián)可免疫導(dǎo)向治療，此外也可用于放射免疫診斷等。同類產(chǎn)品是多克隆抗體，其缺點(diǎn)是抗體類型不均一，在應(yīng)用檢測(cè)中非特異性結(jié)合因素多，難以判斷和分析結(jié)果。經(jīng)初步建立的測(cè)定方案I檢測(cè)大鼠腦蛋白的TRPC6蛋白表達(dá)，測(cè)定結(jié)果的OD值為0. 9，可測(cè)定總蛋白含量為2. 5 u g/mL,同樣多抗測(cè)定結(jié)果的OD值為
0.4，可測(cè)定總蛋白含量為IOy g/mL水平，可見(jiàn)二者的敏感度不同，采用雙單抗建立的酶標(biāo)方法敏感，而換成多抗敏感度降低，并且有非特異因素。本發(fā)明的抗TRPC6的單克隆抗體可特異性識(shí)別各種組織細(xì)胞表達(dá)的TRPC6蛋白，該單克隆抗體可用于ELISA方法的建立，借以監(jiān)測(cè)與TRPC6分子表達(dá)相關(guān)的組織和疾病。


圖I 蛋白軟件RPC6合成肽序列圖譜。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，除作特殊說(shuō)明外，均為本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段。實(shí)施例I TRPC6抗原多肽設(shè)計(jì) (I) TRPC6合成肽段的序列篩選
以TRPC6蛋白為研究對(duì)象，在TRPC6分子上尋找一段序列，不能太長(zhǎng)，15個(gè)氨基酸左右，必須是保守區(qū)內(nèi)，在不同種屬間不變；并確定是胞內(nèi)還是包外段(TRPC6分子復(fù)雜，有6次跨膜結(jié)構(gòu))；比對(duì)種屬間的同源性(NCBI中的protein blast);同時(shí)要考慮其他蛋白是否也有此序列，用于鑒定診斷的抗體最好此段序列在同一家族的其他分子中沒(méi)有才具有特異性，否則易發(fā)生交叉反應(yīng)，不能作為體外診斷試劑的應(yīng)用。(2 ) TRPC6合成肽段抗原表位及親水性等分析
選擇的序列作為TRPC6合成肽段進(jìn)行抗原表位等特性預(yù)測(cè)，應(yīng)按照以下幾點(diǎn)要求設(shè)計(jì)親水性、表露性、柔韌性、免疫原性及結(jié)構(gòu)分析，應(yīng)用IEDB分析方法(immune epitopedatabase, IEDB),同時(shí)通過(guò)蛋白質(zhì)軟件(Lasergene710WinInstall)以及 protein blast 分析確定，并與已知的制備抗體的序列(TRPC6多克隆抗體)比較。經(jīng)過(guò)上述幾項(xiàng)分析，所篩選的肽段親水性較好，且在I. 9^2. 9之間，相對(duì)比較均勻；從抗原性預(yù)測(cè)分析該序列抗原性各段均較好，在0. 998^1. 071之間；再進(jìn)一步應(yīng)用蛋白軟件進(jìn)行序列特性分析，該序列的螺旋、轉(zhuǎn)角、親水性以及抗原指數(shù)上均符合以上IEDB分析結(jié)果，尤其抗原指數(shù)優(yōu)勢(shì)顯著，結(jié)果見(jiàn)圖I。通過(guò)以上系列性分析，最終獲得一段符合要求的序列，即KDLTKVTLGDNVKYY (SEQID NO:I)。實(shí)施例2制備抗TRPC6的單克隆抗體 (I)抗原肽合成與動(dòng)物免疫
根據(jù)實(shí)施例I設(shè)計(jì)的抗原多肽，該多肽與KHL偶聯(lián)，免疫BALB/c健康小鼠，鼠齡在6 12周，雌雄不限。為避免小鼠反應(yīng)不佳或免疫過(guò)程中死亡，可同時(shí)免疫3 4只小鼠。采用多點(diǎn)免疫，二、三次免疫后采用間接ELISA法測(cè)定小鼠血清效價(jià)，選擇免疫效價(jià)高者進(jìn)行加強(qiáng)免疫后準(zhǔn)備細(xì)胞融合。(2)骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
選擇小鼠骨髓瘤P3X63Ag8. 653細(xì)胞株(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈半貼壁狀態(tài)，每:T5天傳代一次，傳代時(shí)用吸管輕輕吹下瓶壁上的細(xì)胞，再轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)液即可，一瓶細(xì)胞可分2^3瓶，傳代3代后收集細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，以備細(xì)胞融合使用。選用8周左右的Balb/c小鼠，制備脾細(xì)胞懸液，作為飼養(yǎng)細(xì)胞備用。(3)細(xì)胞融合
細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細(xì)胞混合后加入PEG使細(xì)胞彼此融合。取加強(qiáng)免疫三天后的小鼠，首先眼球放血，收集血清可用于陽(yáng)性對(duì)照。然后拉頸處死取小鼠脾細(xì)胞方法同飼養(yǎng)細(xì)胞，獲得免疫小鼠脾細(xì)胞懸液，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)量(5xl07 /只)。脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞為5:1比例，在PEG作用下融合，分別加入96孔培養(yǎng)板，4-5板，常規(guī)選擇HAT、HT培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞克隆長(zhǎng)滿覆蓋大于10%孔底時(shí)測(cè)定上清中單抗分泌陽(yáng)性者為保留陽(yáng)性孔，將進(jìn)一步經(jīng)過(guò)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆篩選。(4)有限稀釋法、 篩選陽(yáng)性株一般選用的骨髓瘤細(xì)胞為HAT敏感細(xì)胞株，所以只有融合的細(xì)胞才能待續(xù)生長(zhǎng)。融合細(xì)胞克隆后經(jīng)有限稀釋后(一般稀釋至0. 8個(gè)細(xì)胞/孔)，按Poisson法計(jì)算，應(yīng)有36%的孔為I個(gè)細(xì)胞/孔。同樣是細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋大于10%孔底時(shí)，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)抗體含量。經(jīng)過(guò)三次亞克隆話篩選，選高分泌特異性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。經(jīng)過(guò)反復(fù)凍存和復(fù)蘇的雜交瘤細(xì)胞系，經(jīng)染色體分析穩(wěn)定，抗體檢測(cè)保持陽(yáng)性的細(xì)胞系進(jìn)行建株并命名(H8)，同時(shí)送武漢大學(xué)保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC-C201236。(5)單克隆抗體的制備、凍存及建株
單克隆抗體的制備包括體外制備和體內(nèi)腹水制備。體外細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)采用無(wú)血清培養(yǎng)法；體內(nèi)普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠，先用液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞株HS接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5 IOmL的腹水。(6)腹水制備及單抗的純化、鑒定
采用小鼠腹水瘤方法制備腹水，收集腹水，共進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，得到的單抗分別編號(hào)為H8-1、H8-2和H8-3。三批單抗用正辛酸-硫酸銨法純化，SDS-PAGE電泳鑒定重鏈和輕鏈；同時(shí)采用ELISA法分析抗體的類型及其亞類。純化結(jié)果見(jiàn)表I。表I腹水純化前后效價(jià)比較
權(quán)利要求
1.一種TRPC6抗原多肽，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。
2.一株雜交瘤細(xì)胞株H8，其特征在于由權(quán)利要求I所述TRPC6抗原多肽作為抗原制備得到，能夠分泌抗TRPC6的單克隆抗體，于2012年3月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC-C201236。
3.一種抗TRPC6的單克隆抗體，其特征在于由權(quán)利要求2所述雜交瘤細(xì)胞株H8分泌得到。
4.權(quán)利要求3所述抗TRPC6的單克隆抗體在制備與TRPC6分子表達(dá)相關(guān)疾病檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述與TRPC6分子相關(guān)疾病為局灶性節(jié)段性腎小球硬化。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了TRPC6抗原多肽和抗TRPC6的單克隆抗體。該TRPC6抗原多肽由15個(gè)氨基酸組成，具體序列如SEQIDNO:1所示。以前述蛋白分子為抗原，免疫小鼠，制備篩選得到一株雜交瘤細(xì)胞株H8，于2012年3月7日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC-C201236。該細(xì)胞株能夠持續(xù)穩(wěn)定地分泌抗TRPC6的單克隆抗體。該單克隆抗體能夠特異性識(shí)別各種組織細(xì)胞表達(dá)的TRPC6蛋白，可用于ELISA方法的建立，借以監(jiān)測(cè)與TRPC6分子相關(guān)的疾病，因此可以用于制備診斷與TRPC6分子相關(guān)疾病藥物。
文檔編號(hào)C07K7/08GK102659929SQ201210145560
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月11日
發(fā)明者劉曉波, 張萃, 李紅枝, 梅儷凡, 黃超賢 申請(qǐng)人:廣東藥學(xué)院