專利名稱：一種膠原蛋白低聚肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低聚肽的制備方法，特別地，本發(fā)明涉及一種膠原蛋白低聚肽的制備方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是一種生物性高分子物質(zhì)，英文學(xué)名Collagen。在動(dòng)物細(xì)胞中扮演結(jié)合組織的角色，為生物科技產(chǎn)業(yè)最具關(guān)鍵性的原材料之一，也是需求量十分龐大的最佳生醫(yī)材料。其應(yīng)用領(lǐng)域包括生醫(yī)材料、化妝品、食品工業(yè)等。膠原蛋白是人體延緩衰老必須補(bǔ)足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，占人體全身總蛋白質(zhì)的30%以上，一個(gè)成年人的身體內(nèi)約有3公斤膠原蛋白。它廣泛地存在于人體的皮膚、骨骼、肌肉、軟骨、關(guān)節(jié)、頭發(fā)組織中，起著支撐、修復(fù)、保護(hù)的三重抗衰老作用。然而，并不是所有的膠原蛋白都能被人體吸收利用。膠原蛋白屬大分子級(jí)別蛋白質(zhì)，進(jìn)入人體后需要通過復(fù)雜的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，才能被人體吸收和利用，吸收利用率僅停留在2. 5%。對(duì)于人體，膠原蛋白的重要作用可以說毋庸置疑，無論是對(duì)于美容保養(yǎng)還是生命健康，膠原蛋白都發(fā)揮著現(xiàn)代生物學(xué)的重要意義。膠原蛋白低聚肽又叫短肽膠原蛋白或小肽膠原蛋白或寡肽，是兩個(gè)以上十個(gè)以下氨基酸組成的肽，具有很強(qiáng)的生物活性。膠原蛋白低聚肽是一種三維螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，主要存在于人體皮膚、骨骼、目艮睛、牙齒、肌腱、內(nèi)臟(包括心、胃、腸、血管)等部位，其功能是維持皮膚和組織器官的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，也是修復(fù)各損傷組織的重要原料物質(zhì)。膠原蛋白低聚肽是細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，其分子在細(xì)胞外基質(zhì)中聚集為超分子結(jié)構(gòu)。膠原蛋白低聚肽中的每一條膠原鏈都是左手螺旋構(gòu)型。3條左手螺旋鏈叉相互纏繞成右手螺旋結(jié)構(gòu)，即超螺旋結(jié)構(gòu)閉膠原蛋白低聚肽獨(dú)特的三重螺旋結(jié)構(gòu)，使其分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性寸。膠原蛋白低聚肽在人體內(nèi)具有主動(dòng)吸收、快速吸收、直接吸收的特點(diǎn)，具有抑制血壓上升、良好的生物相溶性和低抗原性特點(diǎn)，而且氨基酸組成與大分子膠原蛋白一致，另外膠原蛋白低聚肽由于分子量小，易于滲透入皮膚起到促進(jìn)皮膚膠原代謝和再生的作用，因此，膠原蛋白低聚肽可以在醫(yī)藥、保健品、化妝品等行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。CN101297673A公開了一種魚膠原低聚肽的加工方法，選用已脫灰、脫脂的干魚鱗為原料，經(jīng)過清洗、預(yù)處理、酶解、過濾、脫色、脫味、脫鹽、無菌過濾、濃縮、噴霧干燥處理后， 得到以干基計(jì)蛋白含量彡95%、灰分< 0. 5%、平均分子量為700DaltOn的魚膠原低聚肽粉。膠原蛋白低聚肽可以用多種方法制備得到，也可以從多種組織中提取得到。動(dòng)物皮是提取膠原蛋白的主要來源，但動(dòng)物皮中往往含有大量的腥臭味物質(zhì)，這些物質(zhì)在提取過程中不去除，會(huì)嚴(yán)重影響最終膠原蛋白產(chǎn)品的風(fēng)味與純度。如何解決這些這些問題，改善膠原蛋白低聚肽的質(zhì)量是本發(fā)明需要解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種膠原蛋白低聚肽的制備方法，所述方法解決了目前膠原蛋白產(chǎn)品普遍存在的腥臭難聞、顏色深黃等問題，通過本發(fā)明制備得到的膠原蛋白低聚肽具有很好的吸收、滲透性，可廣泛應(yīng)用于化妝品、食品等行業(yè)中。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案所述膠原蛋白低聚肽的制備方法，其包括以下步驟(1)將干凈的動(dòng)物皮加水并加酸浸泡；(2)將步驟(1)得到的動(dòng)物皮清洗至中性，加水并加表面活性劑浸泡；(3)將步驟⑵得到的動(dòng)物皮清洗至中性，浙干水分，加水，然后加酶進(jìn)行酶解，得到水解液；(4)將上述水解液中加入活性炭進(jìn)行活性炭吸附；(5)將步驟(4)得到的溶液離心，取上層清液，通過微孔濾膜過濾；(6)將步驟( 過濾得到的透過液先通過超濾膜處理，再通過納濾膜進(jìn)行納濾處理，然后濃縮；(7)將步驟(6)中得到的濃縮液進(jìn)行干燥，得到膠原蛋白低聚肽。本發(fā)明所述的“動(dòng)物”指的是任何可以按所公開的方法從中提取出膠原蛋白低聚肽的動(dòng)物，例如，動(dòng)物可選自偶蹄目、兔形目、嚙齒目、奇蹄目、食肉目和有袋目的哺乳動(dòng)物。當(dāng)上述很多動(dòng)物都具有水平相同的家系和生物學(xué)特性，當(dāng)許多種動(dòng)物，如牛、綿羊、小鼠和豬的膠原蛋白都具有相似的形態(tài)學(xué)即皮的構(gòu)造、高度的氨基酸和核苷酸序列同源性，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易預(yù)見到本發(fā)明所述的方法適用于所有動(dòng)物。作為優(yōu)選方案，所述動(dòng)物皮選自魚皮、豬皮、驢皮、牛皮、馬皮、綿羊皮、山羊皮、袋鼠皮、腹鼠皮和無尾熊皮中的一種或者至少兩種的組合，所述組合例如魚皮/豬皮、驢皮/ 牛皮、馬皮/綿羊皮、山羊皮/袋鼠皮、魚皮/豬皮/驢皮，優(yōu)選魚皮、豬皮、驢皮、牛皮中的一種或者至少兩種的組合。優(yōu)選地，所述動(dòng)物皮為新鮮動(dòng)物皮或/和干的動(dòng)物皮，優(yōu)選新鮮動(dòng)物皮。作為優(yōu)選方案，所述干凈的動(dòng)物皮通過清洗的方式得到。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲知的其他可使動(dòng)物皮干凈的方式均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。本發(fā)明所述的新鮮動(dòng)物皮指從動(dòng)物活體取下并未出現(xiàn)明顯變質(zhì)變味的動(dòng)物皮，例如-18°C以下冷凍3個(gè)月內(nèi)的動(dòng)物皮或者經(jīng)曬干后半年以內(nèi)使用的動(dòng)物皮。當(dāng)所述動(dòng)物皮選自豬皮、驢皮或牛皮中的一種或者至少兩種的組合時(shí)，所述動(dòng)物皮需刮脂或/和脫毛。如果所述的動(dòng)物皮不含有毛，則只需要進(jìn)行刮脂。以此類推，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)其選擇的動(dòng)物皮的種類自行選擇是否需要進(jìn)行刮脂、脫毛。所述動(dòng)物皮可以整塊放入容器中加水并加酸處理，作為優(yōu)選方案，步驟(1)中將動(dòng)物皮切成小塊，適合進(jìn)行后續(xù)處理，所述小塊的長(zhǎng)優(yōu)選為1 3cm，寬優(yōu)選為1 3cm。所述小塊例如長(zhǎng)為1 3cm的動(dòng)物皮小塊，或者寬為1 3cm的動(dòng)物皮小塊。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲知的任意可將動(dòng)物皮切成小塊的方式均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，本發(fā)明典型的但非限制性的例子如可以通過機(jī)械剪切將動(dòng)物皮切成小塊。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所用動(dòng)物皮的重量自行選擇加入水的重量，作為優(yōu)選方案，步驟(1)中加入動(dòng)物皮重2 20倍的水，例如4倍、6倍、7倍、8倍、9倍、11倍、12倍、 13倍、14倍、16倍、17倍、18倍、19倍，優(yōu)選3 15倍，進(jìn)一步優(yōu)選5 10倍。所述水選自蒸餾水、去離子水、高純水、超純水中的一種或者至少兩種的組合，優(yōu)選去離子水。步驟(1)中所述酸選自鹽酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、丙酮酸、甲酸中的一種或者至少兩種的混合物，所述混合物例如鹽酸/醋酸、鹽酸/檸檬酸、鹽酸/乳酸、鹽酸/丙酮酸、鹽酸/甲酸、鹽酸/檸檬酸/乳酸、鹽酸/甲酸/乳酸，優(yōu)選鹽酸、醋酸、檸檬酸、乳酸中的一種或者至少兩種的混合物。步驟(1)中加酸調(diào)節(jié)pH 值為 0.2 5，例如 0·3、0·4、0·5、0·6、0·7、0·8、0·9、1· 1、 1. 2、1· 3、1· 4、1· 5、4· 9、4· 8、4· 7、4· 6、4· 5、4· 4、4· 3、4· 2、4· 1、4· 0、3· 9、3· 8、3· 7、3· 6、3· 5、
3. 4，優(yōu)選0. 3 4. 5，進(jìn)一步優(yōu)選0· 5 4。為了更好的進(jìn)行浸泡處理，本發(fā)明步驟(1)中所述浸泡優(yōu)選在攪拌條件下進(jìn)行。 此處僅為優(yōu)選，并非限制，所述浸泡在不攪拌的條件下仍可進(jìn)行。所述攪拌方式本發(fā)明對(duì)此不作限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行選擇攪拌方式，本發(fā)明典型的但非限制性的例如可以采用機(jī)械攪拌方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行選擇浸泡的溫度，作為優(yōu)選方案，本發(fā)明步驟(1)中所述浸泡在室溫下進(jìn)行。所述浸泡時(shí)間為1 10h，例如1. 5h、2. 5h、3. 5h、a、5. 5h』h、6. 5h、 7h、7. 5h,8h,8. 5h,9h,9.釙，優(yōu)選2 他，進(jìn)一步優(yōu)選3 釙。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行選擇攪拌的時(shí)間，所述攪拌的時(shí)間可以和浸泡時(shí)間相同，也可以不同。當(dāng)攪拌時(shí)間與浸泡時(shí)間相同時(shí)，意指所述浸泡的整個(gè)過程均在攪拌下進(jìn)行，當(dāng)攪拌時(shí)間與浸泡時(shí)間不相同時(shí)，意指所述浸泡有一部分時(shí)間在攪拌條件下進(jìn)行，一部分不在攪拌條件下進(jìn)行。步驟(2)中加入動(dòng)物皮重2 20倍的水，例如4倍、6倍、7倍、8倍、9倍、11倍、12 倍、13倍、14倍、16倍、17倍、18倍、19倍，優(yōu)選3 15倍，進(jìn)一步優(yōu)選5 10倍。所述水選自蒸餾水、去離子水、高純水、超純水中的一種或者至少兩種的組合，優(yōu)選去離子水。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過自己掌握的知識(shí)以及表面活性劑的建議加入量自行選擇加入表面活性劑的量，作為優(yōu)選方案，本發(fā)明步驟O)中加入動(dòng)物皮重0.005 2%的表面活性劑，例如 0. 006 %,0. 007 %,0. 008%,0. 009%U. 9%U. 8%U. 7%U. 6%U. 5%, 1. 4%、1. 3%、1. 2%，優(yōu)選 0. 01 1.5%，進(jìn)一步優(yōu)選 0.01 1% 步驟O)中所述表面活性劑選自非離子型表面活性劑和/或陰離子表面活性劑， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲知的大多數(shù)的非離子型表面活性劑或者陰離子表面活性劑均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，作為優(yōu)選方案，所述表面活性劑選自脂肪醇聚氧乙烯醚、十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉中的一種或者至少兩種的混合物。所述混合例如脂肪醇聚氧乙烯醚/十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉/脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉、脂肪醇聚氧乙烯醚/十二烷基硫酸鈉/十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉/十二烷基苯磺酸鈉 /脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉。本發(fā)明所述的表面活性劑相對(duì)分子量較小、水溶性好，去脂去味效果較好。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行選擇浸泡的溫度，作為優(yōu)選方案，本發(fā)明步驟O)中所述浸泡在在 20 50°C溫度下進(jìn)行，例如 21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、 29°C、30°C、49°C、48°C、47°C、46°C、45°C、44°C、43°C、42°C、41°C，優(yōu)選 25 45°C，進(jìn)一步優(yōu)選 30 35°C進(jìn)行。所述浸泡時(shí)間為 1 20h，例如 2h、2. 5h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、 llh、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h，優(yōu)選 1· 5 15h，進(jìn)一步優(yōu)選 2 10h。本發(fā)明步驟( 中所述浸泡優(yōu)選在攪拌條件下進(jìn)行。此處僅為優(yōu)選，并非限制，所述浸泡在不攪拌的條件下仍可進(jìn)行。所述攪拌方式本發(fā)明對(duì)此不作限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行選擇攪拌方式，本發(fā)明典型的但非限制性的例如可以采用機(jī)械攪拌方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行選擇攪拌的時(shí)間，所述攪拌的時(shí)間可以和浸泡時(shí)間相同，也可以不同。當(dāng)攪拌時(shí)間與浸泡時(shí)間相同時(shí)，意指所述浸泡的整個(gè)過程均在攪拌下進(jìn)行，當(dāng)攪拌時(shí)間與浸泡時(shí)間不相同時(shí)，意指所述浸泡有一部分時(shí)間在攪拌條件下進(jìn)行，一部分不在攪拌條件下進(jìn)行。步驟(3)加水至底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 50%，例如12%、14%、16%、18%、20%、 22%、24%、洸％、沘％、30%、48%、46%、44%、42%、40%，優(yōu)選 15 40%，進(jìn)一步優(yōu)選 20 30%。所述水選自蒸餾水、去離子水、高純水、超純水中的一種或者至少兩種的組合。 所述“底物”即本領(lǐng)域膠原蛋白制備過程-酶解過程中所述的底物，為本領(lǐng)域公知常識(shí)，本發(fā)明對(duì)此不再贅述。步驟(3)中加入動(dòng)物皮重0.05 10%的酶，例如0.06%、1%、1.5%、2%、2.5%、 3%,3. 5%,4%,4. 5%,5%,5. 5%,6%,6. 5%,7%,7. 5%,8%,8. 5%,9%,9. 5%, ^it 0. 1 8%，進(jìn)一步優(yōu)選0. 1 5%。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有公知常識(shí)自行選擇酶，作為優(yōu)選方案，步驟(3)中所述酶選自中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、金屬基質(zhì)蛋白酶、胰蛋白酶、微生物蛋白酶、動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶中的一種或者至少兩種的混合物，例如中性蛋白酶/堿性蛋白酶、胃蛋白酶/木瓜蛋白酶、金屬基質(zhì)蛋白酶/胰蛋白酶、微生物蛋白酶/動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶、胃蛋白酶/木瓜蛋白酶\微生物蛋白酶，進(jìn)一步優(yōu)選中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、金屬基質(zhì)蛋白酶中的一種或者至少兩種的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所選用酶的種類自行選擇酶解的溫度，作為優(yōu)選方案， 步驟⑶中所述酶解的溫度為30 80°C，例如32°C、34°C、36°C、38°C、39°C、4rC、43°C、 45 "C >47 °C >49 °C >51 "C >53 "C >55 "C >57 "C >59 "C >79 "C >77 °C、75 °C、73 °C、71°C，優(yōu)選 40 70 0C，進(jìn)一步優(yōu)選45 65°C。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所選用酶的種類自行選擇酶解的時(shí)間，作為優(yōu)選方案， 步驟(3)中所述酶解的時(shí)間為 0. 5 8h, 1. 2h、l. 8h、2h、2. 5h、3h、3. 5h、4h、4. 5h、5h、5. 5h、 6h、6. 5h、7h、7. 5h，進(jìn)一步優(yōu)選0. 8 6h，進(jìn)一步優(yōu)選1 5h。本發(fā)明所述清洗至中性意指清洗至pH為6. 5 7. 5，呈中性狀態(tài)，優(yōu)選清洗至pH 為7。步驟中所述活性炭的重量為水解液重量的0. 05 10%，0. 06%、1%、1. 5%、 2%、2. 5%、3%、9%、8%、7%，優(yōu)選0. 1 8%，進(jìn)一步優(yōu)選0. 1 5%。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲知的任意的粉末狀或者顆粒狀活性劑均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，作為優(yōu)選方案，本發(fā)明所述活性炭為粉末狀活性炭。本發(fā)明中采用活性炭進(jìn)行吸附可以起到脫色的作用。步驟(4)中所述吸附在30 100°C溫度下進(jìn)行，例如45°C、50°C、55°C、60°C、 70°C、80°C、75°C、85°C、90°C、95°C，優(yōu)選；35 90°C，進(jìn)一步優(yōu)選 40 80°C ；步驟(4)中所述吸附的時(shí)間為 0. 2 5h，0. 4h、l. 2h、l. 5h、l. 8h、2. 3h、2. 8h、3. 3h、3. 8h、4. lh、4. 4h、4. 7h、 4. 9h，優(yōu)選0. 5 3h，進(jìn)一步優(yōu)選0· 5 lh。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以自行選擇離心的轉(zhuǎn)速和時(shí)間，作為優(yōu)選方案，步驟(5)中所述離心的轉(zhuǎn)速為1000 8000轉(zhuǎn)/分，例如1500轉(zhuǎn)/分、1800轉(zhuǎn)/分、2300轉(zhuǎn)/分、2800轉(zhuǎn) / 分、3300 轉(zhuǎn) / 分、3800 轉(zhuǎn) / 分、4300 轉(zhuǎn) / 分、4800 轉(zhuǎn) / 分、5300 轉(zhuǎn) / 分、5800 轉(zhuǎn) / 分、6300 轉(zhuǎn)/分、6800轉(zhuǎn)/分、7300轉(zhuǎn)/分、7800轉(zhuǎn)/分、7900轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選2000 6000轉(zhuǎn)/分， 進(jìn)一步優(yōu)選3000 4000轉(zhuǎn)/分；步驟(5)中所述離心的時(shí)間為5 40min，6min、llmin、 14min、17min、19min、22min、24min、28min、31min、34min、37min、39min,優(yōu)選 8 30min,進(jìn)一步優(yōu)選10 20min。本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的微孔濾膜均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，作為優(yōu)選方案，步驟(5)中所述微孔濾膜的孔徑為 0. 5 8μ ，例如 Ιμπκ . 5μπ 、2μπ 、2. 5μπ 、3μπ 、3. 5μπ 、4μπ 、 4. 5 μ m>5 μ m>5. 5 μ m、6 μ m、6. 5 μ m>7 μ m>7. 5 μ m, 0. 8 ~ 7 μ m, 3 一1 5 μ m。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲知的任意的超濾膜均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，本發(fā)明對(duì)此不作限制。 本發(fā)明典型的但非限制性的超濾膜的孔徑為2nm 20nm，例如3nm、5nm、lOnm、15nm,本發(fā)明所述超濾膜主要是截留分子量為3000DaltOn。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲知的任意的納濾膜均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，本發(fā)明對(duì)此不作限制。本發(fā)明典型的但非限制性的納濾膜的孔徑為lnm、 2nm，本發(fā)明所述納濾膜主要是截留分子量為300 400DaltOn。同時(shí)，由于納濾膜本體帶有電荷性，其具有較高的脫鹽性能，在本發(fā)明中其可以脫除無機(jī)鹽，保證膠原蛋白的純度。本發(fā)明對(duì)濃縮的具體方法、形式不作限制，作為優(yōu)選方案，步驟(6)中濃縮至固形物含量為10%以上，優(yōu)選15%以上，進(jìn)一步優(yōu)選20%以上。步驟(7)中所述干燥選自真空干燥、鼓風(fēng)干燥、微波干燥、紅外線干燥、噴霧干燥中的一種，優(yōu)選噴霧干燥。本發(fā)明的目的之二在于提供一種由上述所述的方法制備得到的膠原蛋白低聚肽， 所述膠原蛋白低聚肽的相對(duì)分子量主要分布在lOOODalton以下，優(yōu)選地，相對(duì)分子量小于 lOOODalton的低聚肽高斯分布峰面積百分比超過85%，優(yōu)選超過90%。通過本發(fā)明所述的方法制備得到的膠原蛋白低聚肽可以在醫(yī)藥、保健品、化妝品等行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)本發(fā)明以以動(dòng)物皮(魚皮、豬皮、驢皮、牛皮等)為原料，經(jīng)過酸及表面活性劑預(yù)處理、生物酶酶解、脫色、膜分離、干燥得到膠原蛋白低聚肽。本發(fā)明通過前處理與后處理相結(jié)合的精制方法，制得無色無異味的膠原蛋白低聚肽，相對(duì)分子量主要分布在 IOOODalton以下，優(yōu)選地，相對(duì)分子量小于lOOODalton的低聚肽高斯分布峰面積百分比超過85%，優(yōu)選超過90%; ( 本發(fā)明解決了目前膠原蛋白產(chǎn)品普遍存在的腥臭難聞、顏色深黃等問題，得到的膠原蛋白低聚肽粉末顏色潔白、無任何腥臭味、口感好，具有很好的吸收、 滲透性，可廣泛應(yīng)用于化妝品、食品等行業(yè)中。
具體實(shí)施例方式為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實(shí)施例如下
實(shí)施例1一種膠原蛋白低聚肽的制備方法，其包括以下步驟(1)將刮脂、脫毛且清洗干凈的新鮮豬皮切成長(zhǎng)寬均為Icm的小塊，加入豬皮重2 倍的水，再加入鹽酸調(diào)節(jié)PH值至5，常溫?cái)嚢杞軮h ；(2)將步驟(1)得到的豬皮清洗至中性，加入豬皮重2倍的去離子水、加入豬皮重 0. 005%的十二烷基硫酸鈉，在20°C溫度下攪拌浸泡20h ；(3)將步驟( 得到的豬皮清洗至中性，浙干水分，加入去離子水至底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，然后加豬皮重0.5%的微生物蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解溫度為30°C，酶解時(shí)間為 8h，得到水解液；(4)將上述水解液中加入水解液重量的0. 05%的活性炭，在30°C溫度下進(jìn)行活性炭吸附5h ；(5)將步驟(4)得到的溶液離心，離心轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為40分鐘，取上層清液，通過孔徑為0. 5 μ m微孔濾膜過濾；(6)將步驟( 過濾得到的透過液首先通過超濾膜處理，再通過納濾膜進(jìn)行納濾處理，然后濃縮至固形物含量在10%以上；(7)將步驟(6)中得到的濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，得到膠原蛋白低聚肽。實(shí)施例2一種膠原蛋白低聚肽的制備方法，其包括以下步驟(1)將刮脂、脫毛且清洗干凈的新鮮驢皮切成長(zhǎng)寬均為2cm的小塊，加入驢皮重20 倍的水，再加入鹽酸調(diào)節(jié)PH值至0. 2，常溫?cái)嚢杞軮Oh ；(2)將步驟(1)得到的驢皮清洗至中性，加入驢皮重20倍的去離子水、加入驢皮重 2%的脂肪醇聚氧乙烯醚，在50°C溫度下攪拌浸泡Ih ；(3)將步驟( 得到的驢皮清洗至中性，浙干水分，加入去離子水至底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%，然后加驢皮重10%的微生物蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解溫度為60°C，酶解時(shí)間為 1.5h，得到水解液；(4)將上述水解液中加入水解液重量的10%的活性炭，在100°C溫度下進(jìn)行活性炭吸附0. 2h ；(5)將步驟(4)得到的溶液離心，離心轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為5分鐘，取上層清液，通過孔徑為8 μ m微孔濾膜過濾；(6)將步驟( 過濾得到的透過液首先通過超濾膜處理，再通過納濾膜進(jìn)行納濾處理，然后濃縮至固形物含量在20%以上；(7)將步驟(6)中得到的濃縮液進(jìn)行真空干燥干燥，得到膠原蛋白低聚肽。實(shí)施例3一種膠原蛋白低聚肽的制備方法，其包括以下步驟(1)將刮脂、脫毛且清洗干凈的新鮮豬皮切成長(zhǎng)寬均為3cm的小塊，加入豬皮重10 倍的水，再加入鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3. 5，常溫?cái)嚢杞葑C；(2)將步驟(1)得到的豬皮清洗至中性，加入豬皮重10倍的去離子水、加入豬皮重的十二烷基硫酸鈉，在35°C溫度下攪拌浸泡IOh ；(3)將步驟( 得到的豬皮清洗至中性，浙干水分，加入去離子水至底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，然后加豬皮重5%的微生物蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解溫度為50°C，酶解時(shí)間為4h， 得到水解液；(4)將上述水解液中加入水解液重量的5%的活性炭，在70°C溫度下進(jìn)行活性炭吸附3h ；(5)將步驟(4)得到的溶液離心，離心轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為30min，取上層清液，通過孔徑為0. 5 μ m微孔濾膜過濾；(6)將步驟( 過濾得到的透過液首先通過超濾膜處理，再通過納濾膜進(jìn)行納濾處理，然后濃縮至固形物含量在20%以上；(7)將步驟(6)中得到的濃縮液進(jìn)行紅外干燥，得到膠原蛋白低聚肽。實(shí)施例4一種膠原蛋白低聚肽的制備方法，其包括以下步驟(1)將清洗干凈的新鮮魚皮切成長(zhǎng)為1cm、寬為2cm的小塊，加入魚皮重15倍的水，再加入鹽酸調(diào)節(jié)PH值至4，常溫浸泡4h ；(2)將步驟(1)得到的魚皮清洗至中性，加入魚皮重15倍的去離子水、加入魚皮重 1. 2%的脂肪醇聚氧乙烯醚，在40°C溫度下攪拌浸泡他；(3)將步驟( 得到的魚皮清洗至中性，浙干水分，加入去離子水至底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，然后加魚皮重4. 5%的微生物蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解溫度為50°C，酶解時(shí)間為 3h，得到水解液；(4)將上述水解液中加入水解液重量的4. 5%的活性炭，在45°C溫度下進(jìn)行活性炭吸附3h ；(5)將步驟(4)得到的溶液離心，離心轉(zhuǎn)速為3500轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為15分鐘，取上層清液，通過孔徑為6 μ m微孔濾膜過濾；(6)將步驟( 過濾得到的透過液首先通過超濾膜處理，再通過納濾膜進(jìn)行納濾處理，然后濃縮至固形物含量在15%以上；(7)將步驟(6)中得到的濃縮液進(jìn)行真空干燥干燥，得到膠原蛋白低聚肽。根據(jù)本行業(yè)常用的高效液相分析方法檢測(cè)分子量的通則JY/T 024-1996, GB/T 22492-2008標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)本發(fā)明所述的膠原蛋白低聚肽進(jìn)行相對(duì)分子量分布分布測(cè)試，結(jié)果如表1所示，得到的膠原蛋白低聚肽的相對(duì)分子量主要分布在lOOODalton以下。表1膠原蛋白低聚肽相對(duì)分子量分布
分子量范圍 Jt0iHfi 數(shù)均分子量重均分子量 (%, λ220ηιη)
>3000__005__3231__3243
Γ 3000 20000.0725282570----
2000 1000__084__1215__1251
1000 500__14.23__620__648
500 180__71.55__258__278
<18013.26 I / I /申請(qǐng)人:聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種膠原蛋白低聚肽的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟(1)將干凈的動(dòng)物皮加水并加酸浸泡；(2)將步驟(1)得到的動(dòng)物皮清洗至中性，加水并加表面活性劑浸泡；(3)將步驟( 得到的動(dòng)物皮清洗至中性，浙干水分，加水，然后加酶進(jìn)行酶解，得到水解液；(4)將上述水解液中加入活性炭進(jìn)行活性炭吸附；(5)將步驟(4)得到的溶液離心，取上層清液，通過微孔濾膜過濾；(6)將步驟( 過濾得到的透過液先通過超濾膜處理，再通過納濾膜進(jìn)行納濾處理，然后濃縮；(7)將步驟(6)得到的濃縮液進(jìn)行干燥，得到膠原蛋白低聚肽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述動(dòng)物皮選自魚皮、豬皮、驢皮、牛皮、馬皮、綿羊皮、山羊皮、袋鼠皮、腹鼠皮和無尾熊皮中的一種或者至少兩種的組合，優(yōu)選魚皮、 豬皮、驢皮、牛皮中的一種或者至少兩種的組合；優(yōu)選地，當(dāng)所述動(dòng)物選自豬皮、驢皮、牛皮中的一種或者至少兩種的組合時(shí)，動(dòng)物皮需刮脂或/和脫毛；優(yōu)選地，所述動(dòng)物皮為新鮮動(dòng)物皮或/和干的動(dòng)物皮，優(yōu)選新鮮動(dòng)物皮；優(yōu)選地，所述干凈的動(dòng)物皮通過清洗的方式得到；優(yōu)選地，步驟(1)中將動(dòng)物皮切成小塊；優(yōu)選地，所述小塊的長(zhǎng)優(yōu)選1 3cm，寬優(yōu)選1 3cm ；優(yōu)選地，步驟(1)中加入動(dòng)物皮重2 20倍的水，優(yōu)選3 15倍，進(jìn)一步優(yōu)選5 10倍；優(yōu)選地，步驟(1)中所述水選自蒸餾水、去離子水、高純水、超純水中的一種或者至少兩種的組合，優(yōu)選去離子水；優(yōu)選地，步驟(1)中所述酸選自鹽酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、丙酮酸、甲酸中的一種或者至少兩種的混合物，優(yōu)選鹽酸、醋酸、檸檬酸、乳酸中的一種或者至少兩種的混合物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中加酸調(diào)節(jié)pH值為0.2 5， 優(yōu)選0. 3 4. 5，進(jìn)一步優(yōu)選0. 5 4 ；優(yōu)選地，步驟(1)中所述浸泡在攪拌條件下進(jìn)行； 優(yōu)選地，步驟(1)中所述浸泡在室溫下進(jìn)行；優(yōu)選地，步驟(1)中所述浸泡時(shí)間為1 10h，優(yōu)選2 他，進(jìn)一步優(yōu)選3 證； 優(yōu)選地，步驟O)中加入動(dòng)物皮重2 20倍的水，優(yōu)選3 15倍，進(jìn)一步優(yōu)選5 10倍；優(yōu)選地，步驟O)中所述水選自蒸餾水、去離子水、高純水、超純水中的一種或者至少兩種的組合，優(yōu)選去離子水。
4.如權(quán)利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，步驟O)中加入動(dòng)物皮重0.005 2%的表面活性劑，優(yōu)選0.01 1.5%，進(jìn)一步優(yōu)選0.01 ；優(yōu)選地，步驟O)中所述表面活性劑選自非離子型表面活性劑和/或陰離子表面活性劑，優(yōu)選脂肪醇聚氧乙烯醚、十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉中的一種或者至少兩種的混合物；優(yōu)選地，步驟O)中所述浸泡在20 50°C溫度下進(jìn)行，優(yōu)選25 45°C，進(jìn)一步優(yōu)選 30 ;35°C ；浸泡時(shí)間為1 20h，優(yōu)選1. 5 15h，進(jìn)一步優(yōu)選2 IOh ；優(yōu)選地，步驟O)中所述浸泡在攪拌條件下進(jìn)行；優(yōu)選地，步驟C3)加水至底物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 50%，優(yōu)選15 40%，進(jìn)一步優(yōu)選 20 30% ；優(yōu)選地，所述水選自蒸餾水、去離子水、高純水、超純水中的一種或者至少兩種的組合， 優(yōu)選去離子水。
5.如權(quán)利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，步驟(3)中加入動(dòng)物皮重0.05 10%的酶，優(yōu)選0. 1 8%，進(jìn)一步優(yōu)選0. 1 5% ；優(yōu)選地，步驟(3)中所述酶選自中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、金屬基質(zhì)蛋白酶、胰蛋白酶、微生物蛋白酶、動(dòng)物蛋白復(fù)合水解酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶中的一種或者至少兩種的混合物，進(jìn)一步優(yōu)選中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、 金屬基質(zhì)蛋白酶中的一種或者至少兩種的混合物；優(yōu)選地，步驟(3)中所述酶解的溫度為30 80°C，優(yōu)選40 70°C，進(jìn)一步優(yōu)選45 65 0C ；優(yōu)選地，步驟(3)中所述酶解的時(shí)間為0. 5 8h，進(jìn)一步優(yōu)選0. 8 6h，進(jìn)一步優(yōu)選 1 5h0
6.如權(quán)利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述活性炭的重量為水解液重量的0. 05 10%，優(yōu)選0. 1 8%，進(jìn)一步優(yōu)選0. 1 5% ；優(yōu)選地，所述活性炭為粉末狀活性炭；優(yōu)選地，步驟⑷中所述吸附在30 100°C溫度下進(jìn)行，優(yōu)選35 90°C，進(jìn)一步優(yōu)選 40 80°C ；優(yōu)選地，步驟中所述吸附的時(shí)間為0. 2 5h，優(yōu)選0. 5 3h，進(jìn)一步優(yōu)選0. 5 lh。
7.如權(quán)利要求1-6之一所述的方法，其特征在于，步驟(5)中所述離心的轉(zhuǎn)速為 1000 8000轉(zhuǎn)/分，優(yōu)選2000 6000轉(zhuǎn)/分，進(jìn)一步優(yōu)選3000 4000轉(zhuǎn)/分；優(yōu)選地，步驟(5)中所述離心的時(shí)間為5 40min，優(yōu)選8 30min，進(jìn)一步優(yōu)選10 20min ；優(yōu)選地，步驟( 中所述微孔濾膜的孔徑為0. 5 8 μ m，優(yōu)選0. 8 7 μ m，進(jìn)一步優(yōu)選 1 5 μ m。
8.如權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，步驟(6)中濃縮至固形物含量為 10%以上，優(yōu)選15%以上，進(jìn)一步優(yōu)選20%以上。
9.如權(quán)利要求1-8之一所述的方法，其特征在于，步驟(7)中所述干燥選自真空干燥、 鼓風(fēng)干燥、微波干燥、紅外線干燥、噴霧干燥中的一種，優(yōu)選噴霧干燥。
10.一種由權(quán)利要求1-9之一所述的方法制備得到的膠原蛋白低聚肽，其特征在于，所述膠原蛋白低聚肽的相對(duì)分子量主要分布在lOOODalton以下；優(yōu)選地，相對(duì)分子量小于lOOODalton的低聚肽高斯分布峰面積百分比超過85%，優(yōu)選超過90%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膠原蛋白低聚肽的制備方法。所述方法以動(dòng)物皮為原料，經(jīng)過酸及表面活性劑預(yù)處理、酶解、脫色、膜分離、干燥得到膠原蛋白低聚肽。通過所述方法得到的膠原蛋白相對(duì)分子量主要分布在1000Dalton以下，優(yōu)選地，相對(duì)分子量小于1000Dalton的低聚肽高斯分布峰面積百分比超過85％，優(yōu)選超過90％，為膠原蛋白低聚肽。本發(fā)明解決了目前膠原蛋白產(chǎn)品普遍存在的腥臭難聞、顏色深黃等問題，得到的膠原蛋白低聚肽粉末顏色潔白、無任何腥臭味、口感好，具有很好的吸收、滲透性，可廣泛應(yīng)用于化妝品、食品等行業(yè)中。
文檔編號(hào)C07K2/00GK102559826SQ20121003428
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月15日
發(fā)明者于雪源, 胡如桂 申請(qǐng)人:胡如桂