專利名稱：用于純化蛋白質(zhì)的方法
用于純化蛋白質(zhì)的方法本發(fā)明涉及用于從革蘭氏陰性宿主細胞樣品或其提取物純化重組蛋白質(zhì)的方法。更具體而言，將革蘭氏陰性宿主細胞樣品或其提取物調(diào)節(jié)至低pH，以實現(xiàn)蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶的沉淀。重組DNA技術(shù)已快速發(fā)展且用于抗體特別是治療用抗體的生產(chǎn)中。用于表達重組基因的系統(tǒng)是所討論的領(lǐng)域中的技術(shù)人員眾所周知的。這些包括在哺乳動物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞、細菌細胞以及轉(zhuǎn)基因動物和植物中的表達。表達系統(tǒng)的選擇取決于所編碼蛋白質(zhì)的特征，例如翻譯后修飾。其他考慮包括在具有所需質(zhì)量的材料的所需數(shù)量生產(chǎn)中涉及的時間且特別是成本。這些較后的考慮在具有監(jiān)管機構(gòu)批準(zhǔn)所需的質(zhì)量和治療大量患者所需的數(shù)量的治療用抗體生產(chǎn)中是特別重要的。用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的廣泛使用的系統(tǒng)是基于在大腸埃希桿菌(Escherichiacoli)(大腸桿菌(E.coli))中的表達。使用大腸桿菌遇到的具體問題是以治療所需的數(shù)量生產(chǎn)具有所需質(zhì)量的材料中的困難。特別地，涉及的時間和成本可以是高得驚人的。一個特別注意的問題是在來自大腸桿菌的抗體純化過程中的抗體得率中遭受的損失。盡管，按比例地，純化成本是治療用抗體產(chǎn)物的總成本的部分,但純化成本比例將隨著上游生產(chǎn)成本變得更便宜而進一步增加。因此，抗體的回收和純化中的改善將驅(qū)動生產(chǎn)成本進一步向下，與生產(chǎn)方式無關(guān)(Humphreys & Glover, Curr.0pin.Drug Discovery &Development，2001，4:172-185)。因此，存在例如通過增加產(chǎn)物回收和/或改善產(chǎn)品流線的質(zhì)量，將時間和/或成本節(jié)省引入治療用抗體生產(chǎn)且特別是純化內(nèi)的方法的需要。低產(chǎn)物得率通常是在下游純化步驟中注意到的特別問題。在下游純化中的具體問題涉及宿主 細胞蛋白質(zhì)(HCP)的分離，所述HCP在從宿主細胞中提取治療用抗體后釋放。已嘗試許多方法修飾，以便解決這個問題。此類方法的例子包括下述:目的蛋白質(zhì)可以沉淀且隨后與其他HCP污染物分離。然而，治療用抗體的沉淀可以對抗體造成不可逆性損傷。特異性沉淀目的蛋白質(zhì)的技術(shù)通常導(dǎo)致非蛋白質(zhì)性質(zhì)的污染物陷入沉淀物中，致使分離無效。可替代地，HCP可以從治療用抗體中沉淀出來。US7169908描述了加入乳酸依沙吖啶溶液，以沉淀宿主細胞雜質(zhì)。然而，諸如乳酸依沙吖啶的試劑的使用不適合于治療用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，因為它已用作流產(chǎn)試劑，并且如果它并未完全去除，則可以對于患者是有害的。來自CHO細胞培養(yǎng)物的HCP已使用小分子和pH調(diào)節(jié)進行沉淀，以便純化蛋白質(zhì)(Arunakumari A.等人Advances in Non-Protein A Purification Processes for HumanMonoclonal Antibodies Supplement to BioPharm International2009 年 3 月第 22-26頁)。雖然此類方法已對從宿主細胞污染物純化治療用抗體作出貢獻，但仍需要提供改良方法以減少來自微生物宿主細胞系統(tǒng)的HCP數(shù)量，而不負面影響治療用抗體的性質(zhì)，以便促進進一步的下游加工。再者，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)特定伴侶蛋白質(zhì)例如二硫化物異構(gòu)酶例如DsbC通過宿主的表達可以用于增加抗體或其片段的表達水平。然而，伴侶蛋白質(zhì)以顯著水平表達并且變成所述方法的需要去除的大副產(chǎn)物。去除大量污染物可以是挑戰(zhàn)性的，因為諸如柱色譜的方法發(fā)現(xiàn)難以去除大量蛋白質(zhì)污染物，由于柱捕鳥(column fowling)和需要使用大量試劑或溶劑。當(dāng)測試分離的DsbC時，它在低pH例如pH3是可溶的。然而，本發(fā)明人已驚訝地發(fā)現(xiàn)將PH調(diào)節(jié)為5或更低可以用于沉淀來自革蘭氏陰性菌宿主細胞的重組二硫化物異構(gòu)酶，從而促進目的重組蛋白質(zhì)例如治療用抗體的進一步加工。發(fā)明概述在一個方面，提供了用于從宿主細胞純化重組蛋白質(zhì)的方法，所述宿主細胞例如表達重組蛋白質(zhì)和重組二硫化物異構(gòu)酶或其提取物的革蘭氏陰性菌宿主細胞樣品；其包括:a.將宿主細胞樣品或其提取物的pH調(diào)節(jié)至pH5或更低，以沉淀重組二硫化物異構(gòu)酶；和b.分離沉淀的重組二硫化物異構(gòu)酶與重組蛋白質(zhì)，以提供重組蛋白質(zhì)樣品。本發(fā)明還提供了將用編碼重組蛋白質(zhì)或其提取物的表達載體轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌宿主細胞樣品的PH調(diào)節(jié)至pH5或更低的步驟的用途，以沉淀宿主細胞重組二硫化物異構(gòu)酶，隨后為沉淀的宿主細胞重組二硫化物異構(gòu)酶與重組蛋白質(zhì)的分離，且提供純化的重組蛋白質(zhì)樣品。在一個實施方案中，提供了用于從革蘭氏陰性菌宿主細胞樣品或所述宿主細胞的提取物純化重組抗體或其結(jié)合片段的方法，其中所述宿主細胞表達重組抗體或其結(jié)合片段和重組二硫化物異構(gòu)酶DsbC ;其中所述`方法包括:a.將宿主細胞樣品或其提取物的pH調(diào)節(jié)至在范圍3.5 - 5中的pH，以沉淀重組DsbC ;和b.分離沉淀的重組DsbC，以提供含有純化的重組抗體或其片段的樣品。令人驚訝的是，這個pH調(diào)節(jié)步驟從溶液中沉淀顯著數(shù)量的宿主細胞重組二硫化物異構(gòu)酶，從而允許宿主細胞重組二硫化物異構(gòu)酶與目的重組蛋白質(zhì)的分離。這通過減少溶液中與重組蛋白質(zhì)競爭色譜柱上的結(jié)合位點的宿主細胞二硫化物異構(gòu)酶來促進下游加工，特別是任何后續(xù)色譜法步驟例如非親和色譜捕獲。因此，HCP在色譜柱上的裝載是最小化的，并且當(dāng)使用相同大小和數(shù)目的色譜柱時，目的重組蛋白質(zhì)的得率得到改善。這減少了進一步下游純化的時間和成本。有趣的是，純DsbC在3.0 - 5范圍的pH不沉淀(參見圖4)。然而，當(dāng)存在于表達抗體或其結(jié)合片段的革蘭氏陰性細胞的復(fù)雜環(huán)境中或備選地在所述細胞的部分或全部內(nèi)容物的存在下時，那么DsbC沉淀。雖然不希望受理論束縛，但假定在即使通常蛋白質(zhì)在范圍
3.5 - 5中的pH是可溶的pH范圍中，宿主細胞或來自宿主細胞的提取物的復(fù)雜基質(zhì)環(huán)境催化二硫化物異構(gòu)酶例如DsbC的沉淀?？赡芤坏┏恋砥鹗?它就繼續(xù)且擴大。因此，根據(jù)本公開內(nèi)容的方法適合于在大規(guī)模上的使用，且因此在蛋白質(zhì)例如抗體的商業(yè)加工中是非常有用的。附圖簡述

圖1顯示了與對照ρΗ6.9相比較，在pH已調(diào)節(jié)至ρΗ5.0、ρΗ4.5或ρΗ3.0后，所觀察到的宿主細胞溶液的沉淀。
圖2顯示了與對照pH7相比較，在pH調(diào)節(jié)至pH5、pH4.5或pH3后，關(guān)于宿主細胞溶液在時間(T) =0時的反相HPLC分析的色譜圖。圖3顯示了與對照pH7相比較，在pH調(diào)節(jié)至pH5.0、pH4.5或pH3后，關(guān)于宿主細胞溶液在T=O時的反相HPLC分析的分開色譜圖。圖4顯示了與對照pH7相比較，在不同時間間隔后，在pH調(diào)節(jié)至pH3后，關(guān)于包含DsbC的溶液的反相HPLC分析的分開色譜圖。圖5顯示了與對照pH7相比較，在pH調(diào)節(jié)至pH5.0、pH4.5或pH3后，來自關(guān)于宿主細胞溶液在不同時間點時的反相HPLC分析的關(guān)于DsbC的峰總面積。圖6顯示了與對照pH7相比較，在pH調(diào)節(jié)至pH5.0、pH4.5或pH3后，來自關(guān)于宿主細胞溶液在不同時間點時的反相HPLC分析的關(guān)于DBP的峰總面積。圖7顯示了與對照ρΗ6.9相比較，在pH調(diào)節(jié)至pH5、pH4.5或pH3后，關(guān)于宿主細胞溶液的SDS-PAGE分析凝膠。圖8 顯示了序列 SEQ ID NO:1 至 16。圖9顯示了稱為⑶P870的化合物的結(jié)構(gòu)，其包含經(jīng)由半胱氨酸殘基與賴氨酰-馬來酰亞胺接頭共價連接的經(jīng)修飾的抗TNF Fab’片段，其中在賴氨酰殘基上的每個氨基具有與之共價附著的甲 氧基PEG殘基，其中η是約420。序列簡述SEQ ID NO:1 顯示了 CDP870 的 CDRHl 的氨基酸序列。SEQ ID NO:2 顯示了 CDP870 的 CDRH2 的氨基酸序列。SEQ ID NO:3 顯示了 CDP870 的 CDRH3 的氨基酸序列。SEQ ID NO:4 顯示了 CDP870 的 CDRLl 的氨基酸序列。SEQ ID NO:5 顯示了 CDP870 的 CDRL2 的氨基酸序列。SEQ ID NO:6 顯示了 CDP870 的 CDRL3 的氨基酸序列。SEQ ID NO:7顯示了輕鏈可變區(qū)⑶Ρ870的核苷酸和預(yù)測的氨基酸序列。SEQ ID NO:8顯示了重鏈可變區(qū)⑶Ρ870的核苷酸和預(yù)測的氨基酸序列。SEQ ID NO: 9顯示了移植的抗TNF a Fab CDP870輕鏈的氨基酸序列。SEQ ID NO: 10顯示了移植的抗TNF a Fab CDP870重鏈的氨基酸序列。SEQ ID NO: 11是加his標(biāo)簽的DsbC的核苷酸序列。SEQ ID NO: 12是加his標(biāo)簽的DsbC的氨基酸序列。SEQ ID NO: 13是包括信號序列的野生型spr基因的序列，所述信號序列是前26個
氨基酸殘基。SEQ ID NO: 14是不含信號序列的野生型spr基因的序列。SEQ ID NO: 15是包括起始密碼子上游的6個核苷酸ATGAAT的突變敲除Tsp基因的DNA序列。SEQ ID NO: 16顯示了編碼關(guān)于大腸桿菌Fab表達的基因間序列2 (IGS2)的寡核
苷酸盒。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的詳述本發(fā)明現(xiàn)在將更詳細地進行描述。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可互換使用，除非上下文另有說明?！半摹币庵?0個或更少的氨基酸。術(shù)語“多核苷酸”包括DNA、cDNA、RNA和mRNA。如本文使用的，在本說明書的背景中的術(shù)語“包含”應(yīng)解釋為“包括”。表達“細胞”、“細胞系”、“細胞培養(yǎng)物”和“菌株”可互換使用。如本文采用的宿主細胞提取物(來自其的提取物)用于指部分或全部宿主細胞內(nèi)容物，即.得自部分或總細胞裂解以從細胞中提取一些或所有化學(xué)物質(zhì)的材料，或.得自對細胞實施加工從而使得由細胞表達的一種或多種蛋白質(zhì)釋放到液相內(nèi)的材料。如本文采用的構(gòu)成宿主細胞的內(nèi)容物的化學(xué)物質(zhì)和材料指在細胞內(nèi)的液體、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖、脂多糖、肽聚糖、質(zhì)粒和染色體DNA、RNA、小分子例如氨基酸、金屬離子、氧化還原活性分子、tRNA和來自上述所有的片段。用于釋放來自細胞的一種或多種蛋白質(zhì)的方法包括熱處理和/或?qū)毎麑嵤┓橇呀鈮毫?或使用化學(xué)制品，包括:緩沖劑、螯合劑、去污劑、物理破壞和/或使用聲能和/或使用機械剪切。如本文采用的革蘭氏陰性細胞樣品指革蘭氏陰性細胞群體，例如至少兩種革蘭氏陰性細胞，但更具體而言在發(fā)酵過程特別是商業(yè)發(fā)酵過程中采用的分批。如本文采用的純化的重組抗體或其結(jié)合片段意指抗體或片段形式，其中存在比相應(yīng)未加工形式中更少的雜質(zhì)和污染物。它不一定預(yù)期是絕對術(shù)語，因為抗體或片段可以仍
需要進一步純化步驟。在一個實施方案中，由根據(jù)本發(fā)明的方法提供的純化重組抗體或其結(jié)合片段是基本上純的。如本文采用的基本上純的指其中抗體或其結(jié)合片段是超過90%純的，例如91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%純的，特別是95%純的或更多。本文描述的本發(fā)明基于令人驚訝和出乎意料的觀察:在用編碼重組蛋白質(zhì)分子的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞樣品已培養(yǎng)后，將PH調(diào)節(jié)至5或更低的步驟可以用于沉淀重組二硫化物異構(gòu)酶，并且這對蛋白質(zhì)的純化具有顯著有利的影響。本發(fā)明的步驟a)要求宿主細胞樣品或其提取物調(diào)節(jié)至pH5或更低、小于5的pH、pH4.5或更低、或pH3或更低。在優(yōu)選實施方案中，宿主細胞樣品或其提取物的pH調(diào)節(jié)至PH4.5或更低、更優(yōu)選pH約4.5。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)pH4.5對于沉淀是特別有利的，并且允許重組DsbC的分離。在一個實施方案中，宿主細胞樣品或其提取物的pH未調(diào)節(jié)至小于pH3或備選地小于pH3.5的pH。相應(yīng)地，宿主細胞樣品或其提取物的pH優(yōu)選調(diào)節(jié)至pH3-4.9、pH3.5-4.9、ρΗ3-4.5 或 ρΗ3.5-4.5。在一個實施方案中，宿主細胞樣品或其提取物的pH調(diào)節(jié)至ρΗ3或更低,更優(yōu)選pH約3。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)pH3或更低對于沉淀是有利的，并且允許重組DsbC以及宿主細胞二肽結(jié)合蛋白的分離。

然而，雖然pH3或更低適合于沉淀來自宿主細胞或提取物的DsbC蛋白質(zhì)，但低pH可能改變抗體或其結(jié)合片段的折疊構(gòu)象，并且因此當(dāng)考慮方法的所有參數(shù)時，可能不是最佳的。因此,用于沉淀宿主細胞蛋白質(zhì)的最佳pH將取決于由細胞表達的具體抗體或抗體片段，且特別是其在有關(guān)PH范圍中的穩(wěn)定性。至少一種二硫化物異構(gòu)酶例如至少DsbC采用該方法沉淀。在一個實施方案中，一種或多種其他宿主細胞蛋白質(zhì)也采用該方法沉淀。在本發(fā)明的方法的步驟a)中，在執(zhí)行任何進一步純化步驟例如離心和/或過濾前，和/或在一般是升高溶液pH的進一步pH調(diào)節(jié)前，宿主細胞溶液或其提取物可以保持在較低PH，例如pH5或更低任何合適的時間段。一般地，宿主細胞溶液或其提取物將保持24小時或更少、12小時或更少、6小時或更少、5小時或更少、2小時或更少、I小時或更少、30分鐘或更少、10分鐘或更少或7分鐘或更少。在采用本發(fā)明的方法后，在執(zhí)行進一步即后續(xù)加工例如進一步純化例如采用陰離子交換色譜的純化前，PH可以例如升高至pH6、6.5或7。本發(fā)明的方法的步驟a)可以在任何合適溫度執(zhí)行，例如室溫，例如20_23°C或降低的溫度例如1-10°C。因此，用于執(zhí)行該方法的合適溫度范圍包括至少1- 30°C。宿主細胞樣品或其提取物的pH調(diào)節(jié)可以使用能夠改變pH的任何合適的試劑執(zhí)行。合適試劑的例子是冰乙酸、氫氧化鈉、乙酸鈉或tris堿、及其組合。試劑可以是任何合適的濃度例如30或60% (v/v)冰乙酸、IM氫氧化鈉、IM乙酸鈉和2M或3M tris堿。這些試劑中的一種或多種對于在根據(jù)本公開內(nèi)容的方法中的使用是特別有利的，并且例如致使在治療用蛋白質(zhì)的純化中重組二硫化物異構(gòu)酶的沉淀和去除成為可能，因為它們是無毒的。

二硫化物異構(gòu)酶是這樣的酶，其催化當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)折疊時，在蛋白質(zhì)內(nèi)的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵形成和斷裂的酶。蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶在重組蛋白質(zhì)提取后從宿主細胞中釋放。在本發(fā)明的方法中使用的宿主細胞產(chǎn)生重組二硫化物異構(gòu)酶，并且因此重組二硫化物異構(gòu)酶構(gòu)成顯著比例的污染性宿主細胞蛋白質(zhì)。本發(fā)明已提供了時間和成本節(jié)省方式，以從重組蛋白質(zhì)中去除重組二硫化物異構(gòu)酶。重組二硫化物異構(gòu)酶例如DsbC可以包含在N和/或C末端上的組氨酸標(biāo)簽(his-標(biāo)簽)。組氨酸標(biāo)簽是有利的，因為它允許有效監(jiān)控以顯示DsbC污染已從抗體或其結(jié)合片段中去除。這是重要的，因為當(dāng)使用針對來自野生型大腸桿菌的細胞內(nèi)容物產(chǎn)生的多克隆血清時，DsbC的存在可以是難以檢測的，因為標(biāo)準(zhǔn)多克隆血清趨于對于DsbC是弱反應(yīng)或無反應(yīng)的，并且因此即使當(dāng)DsbC以高水平過表達時，也不能檢測到它。檢測標(biāo)簽例如聚-His的存在確保豐富過表達的DsbC的去除可以使用靈敏的免疫檢測方法進行監(jiān)控/證實。在優(yōu)選實施方案中，重組二硫化物異構(gòu)酶是DsbC。DsbC是在大腸桿菌的周質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的原核蛋白質(zhì)，其催化大腸桿菌中的二硫鍵形成。DsbC具有236的氨基酸序列長度(包括信號肽)和25.6KDa的分子量(UniProt編號P0AEG6)。DsbC首次在1994年鑒定(Missiakas等人The Escherichia coli dsbC(xprA)gene encodes a periplasmic protein involvedin disulfide bond formation, The EMBO Journal 第 13 卷，no8,第 2013-2020 頁，1994和 Shevchik 等人 Characterization of DsbC, a periplasmic protein of Erwiniachrysanthemi and Escherichia coli with disulfide isomerase activity, The EMBOJounral第13卷，no8，第2007-2012頁，1994)。DsbC蛋白質(zhì)可以包含在N和/或C末端上的組氨酸標(biāo)簽(hiS-標(biāo)簽)。DsbC的預(yù)期pi是5.7，并且his標(biāo)簽的DsbC的預(yù)測pi是6.3。蛋白質(zhì)的pi可以使用多種商購可得和公眾免費的軟件以及在線P〗預(yù)測設(shè)施例如ExPASy ProtParam進行預(yù)測。如果溶液的pH超過蛋白質(zhì)的pl，那么可以預(yù)期蛋白質(zhì)沉淀。然而，由圖4可見，當(dāng)調(diào)節(jié)至PH3時，不含宿主細胞或宿主細胞提取物的DsbC (his-標(biāo)記的)溶液不沉淀，因為DsbC的數(shù)量在pH調(diào)節(jié)后未減少。令人驚訝的是，已發(fā)現(xiàn)當(dāng)對包含重組DsbC的宿主細胞樣品或其提取物實施小于PH5的pH調(diào)節(jié)時，DsbC的確沉淀，顯著量的DsbC沉淀且可以與目的重組蛋白質(zhì)分離，如圖3中所示。相應(yīng)地，由蛋白質(zhì)例如DsbC的預(yù)測pi預(yù)測需要何種pH以允許來自宿主細胞樣品或其提取物的沉淀是不可能的。如本文使用的，“重組多肽”指使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建或產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。編碼二硫化物異構(gòu)酶的多核苷酸序列可以等同于編碼在細菌細胞中發(fā)現(xiàn)的二硫化物異構(gòu)酶的內(nèi)源序列。備選地，編碼二硫化物異構(gòu)酶的重組多核苷酸序列是突變形式的野生型二硫化物異構(gòu)酶序列，例如已去除限制位點。在其中二硫化物異構(gòu)酶是DsbC的實施方案中，可以去除限制位點EcoRI和/或加入編碼his-標(biāo)簽的序列。用于在本發(fā)明中使用的示例經(jīng)修飾的DsbC核苷酸序列顯示于SEQ ID NO: 11中，其編碼SEQ ID NO: 12中所示的加his-標(biāo)簽的DsbC氨基酸序列。 在一個實施方案中，突變型DsbC由具有通過-CXXC-代表的突變型活性位點的DsbC 蛋白質(zhì)組成，其中 XX 是 TF、GF、HH、NY、SF、MF、VH、SH、RF、FA、GA、MA、G1、AV、PS、QA、SV、PR、PP、AL、PL、FL、TR、LL、VL、QL、LQ。在本發(fā)明的方法的步驟a)之前，該方法可以包括培養(yǎng)用一種或多種表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞樣品，所述表達載體編碼重組蛋白質(zhì)和重組二硫化物異構(gòu)酶。樣品可以處于任何合適的規(guī)模，從蛋白質(zhì)的小規(guī)模生產(chǎn)到用于商業(yè)目的的蛋白質(zhì)的大規(guī)模制造。在一個實施方案中，其中蛋白質(zhì)是抗體，由宿主細胞產(chǎn)生的重組抗體可以是功能和非功能抗體的混合物。宿主細胞包含編碼二硫化物異構(gòu)酶的重組多核苷酸，其可以存在于轉(zhuǎn)化到細胞內(nèi)和/或整合到宿主細胞的基 因組內(nèi)的合適表達載體上。優(yōu)選地，編碼二硫化物異構(gòu)酶的多核苷酸是在細胞中的表達載體中，從而引起對于宿主細胞的基因組的最低限度破壞。重組蛋白質(zhì)和重組二硫化物異構(gòu)酶可以存在于同一表達載體或分開的表達載體上。在本發(fā)明中使用的細胞是革蘭氏陰性菌。最優(yōu)選地，細胞是大腸桿菌。細胞是已遺傳改造的重組細胞。大腸桿菌宿主細胞是能夠產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的突變株。重組大腸桿菌宿主細胞可以衍生自任何合適的大腸桿菌菌株，包括MC4100、TGl、TG2、DHB4、DH5 a、DHl、BL21、K12、XLlBlue和JM109。一個例子是大腸桿菌W3110 (ATCC27, 325)，用于重組蛋白質(zhì)發(fā)酵的常用宿主菌株。例子還包括經(jīng)修飾的大腸桿菌菌株，例如代謝突變株和蛋白酶缺陷株。宿主細胞經(jīng)遺傳改造為產(chǎn)生重組二硫化物異構(gòu)酶。產(chǎn)生重組二硫化物異構(gòu)酶的宿主細胞是特別有利的，因為重組二硫化物異構(gòu)酶的存在可以減少細胞裂解且可以幫助重組蛋白質(zhì)的加工。
在優(yōu)選實施方案中，宿主細胞包含編碼重組DsbC包括加his-標(biāo)簽的DsbC的多核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞可以包含一種或多種進一步的遺傳修飾。在一個實施方案中，宿主細胞可以具有降低的蛋白酶活性，其中所述細胞包含編碼具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白質(zhì)的突變型Tsp基因或是敲除突變的Tsp基因。例如，與野生型細胞相比較，宿主細胞可以具有降低的Tsp蛋白質(zhì)活性。Tsp (也稱為Prc)是60kDa周質(zhì)蛋白酶。Tsp的第一種已知底物是青霉素結(jié)合蛋白-3 (PBP3)(Determination of the cleavage site involved in C—terminal processing ofpenicillin-binding protein 3 of Escherichia coli ；Nagasawa H，Sakagami Y,SuzukiA，Suzuki H，Hara H，Hirota Y.J Bacteriol.1989Nov ；171 (11): 5890-3 和 Cloning，mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involvedin C—terminal processing of penicillin-binding protein3 ；Hara H， Yamamoto Y，Higashitani A, Suzuki H, Nishimura Y.J Bacteriol.1991Aug ；173 (15):4799-813)，但以后發(fā)現(xiàn)Tsp還能夠切割噬菌體尾部蛋白質(zhì)，并且因此將它重命名為尾部特異性蛋白酶(Tsp) (Silber 等人， Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，89:295-299 (1992))。在這個實施方案中，細胞具有與野生型細胞相比較降低的Tsp蛋白質(zhì)活性。表達“與野生型細胞相比較降低的Tsp蛋白質(zhì)活性”意指與野生型細胞的Tsp活性相比較，細胞的Tsp活性是降低的。細胞可以通過任何合適的方式進行修飾，以降低Tsp的活性。在一個實施方案中，降低的Tsp活性來自編碼Tsp的內(nèi)源多核苷酸和/或相關(guān)調(diào)節(jié)表達序列的修飾。修飾可以減少或停止Tsp基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，或與野生型Tsp蛋白質(zhì)相比較，可以提供具有降低的蛋白酶活性的表達的Tsp蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，相關(guān)調(diào)節(jié)表達序列進行修飾，以減少Tsp表達。例如，Tsp基因的啟動子可以是突變的，以阻止基因的表達。在優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的細胞攜帶編碼具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白質(zhì)的突變Tsp基因或敲除突變的Tsp基因。優(yōu)選地，染色體Tsp基因是突變的。Tsp (prc)活性的降低是希望的，以減少目的蛋白質(zhì)的蛋白酶解。然而，發(fā)現(xiàn)缺乏蛋白酶prc的細胞顯示在低摩爾滲透壓濃度時的熱敏生長。Hara等人分離了含有基因外阻遏因子(spr)突變的抗熱逆轉(zhuǎn)株(Hara等人，Microbial Drug Resistance, 2:63-72(1996))。Spr是18kDa膜結(jié)合的周質(zhì)蛋白酶，并且spr的底物是在細胞分裂過程中外膜中涉及細胞壁水解的Tsp和肽聚糖。spr基因指定為UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4 (SPR_EC0LI)o包含突變型spr基因的改善的蛋白酶缺陷株已得到描述。Chen等人(Chen C，Snedecor B,Nishihara JC,Joly JC,McFarland N,Andersen DC,Battersby JE,ChampionKM.Biotechnol Bioeng.2004Mar5 ；85 (5):463-74)描述了通過擴增基因的上游和下游區(qū)且將這些一起連接到包含選擇標(biāo)記和sprW174R突變的載體上,構(gòu)建攜帶prc (Tsp)和另一種蛋白酶DegP的不同組合的大腸桿菌菌株(大腸埃希桿菌的周質(zhì)中重組抗體片段的高水平累積需要三重突變型(Λ DegP Δ prc sprffl74R)宿主菌株。spr蛋白質(zhì)的野生型氨基酸序列顯示于在N末端上具有信號序列的SEQ IDNO: 13，和不含26個氨基酸的信號序列的SEQ ID NO: 14中(根據(jù)UniProt登記號P0AFV4)。在本發(fā)明中的spr蛋白質(zhì)序列的氨基酸編號包括信號序列。相應(yīng)地，spr蛋白質(zhì)的氨基酸I是SEQ ID NO: 13中所示的第一個氨基酸(Met)。
在進一步的實施方案中，細胞包含突變的spr基因。編碼spr蛋白質(zhì)的突變型spr基因可以具有在選自 C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147、H157 和 W174 的一個或多個氨基酸處的突變。優(yōu)選地，突變型spr基因編碼具有在選自C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147和H157的一個或多個氨基酸處的突變spr蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，突變型spr基因編碼具有在選自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的一個或多個氨基酸處的突變spr蛋白質(zhì)。spr突變能夠抑制包含突變Tsp基因的細胞的生長表型。氨基酸C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147、H157 和 W174 中的一個或多個可以突變?yōu)槿魏魏线m的氨基酸，其導(dǎo)致能夠抑制包含突變Tsp基因的細胞表型的spr蛋白質(zhì)。例如，S95、V98、Y115、D133和V135中的一個或多個可以突變?yōu)樾“被崂鏕ly或Ala。在優(yōu)選實施方案中，spr蛋白質(zhì)包含下述突變中的一個或多個:C94A、S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D 或 G、H145A、G147C 和 H157A。在進一步實施方案中，突變的spr基因編碼具有突變W174R的spr蛋白質(zhì)。在備選實施方案中，spr蛋白質(zhì)不具有突變W174R。關(guān)于本文的置換突變型的指名由字母隨后為數(shù)字隨后為字母組成。第一個字母指定野生型蛋白質(zhì)中的氨基酸。數(shù)字指在其中進行氨基酸置換的氨基酸位置，并且第二個字母指定用于替換野生型氨基酸的氨基酸。相應(yīng)地，在優(yōu)選實施方案中，在本發(fā)明中使用的細胞包含編碼DsbC的重組多核苷酸和突變的spr基因，如上所述。在進一步優(yōu)選實施方案中，與，在本發(fā)明中使用的細胞具有野生型細胞相比較降低的Tsp蛋白質(zhì)活性，并且包含編碼DsbC的重組多核苷酸和突變的spr基因，如上所述。在一個實施方案中，宿主細胞包含編碼具有伴侶蛋白活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白質(zhì)的突變DegP基因和/或突變ptr基因，其中所述突變ptr基因編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋 白質(zhì)，或是敲除突變的Ptr基因和/或突變的OmpT基因，其中所述突變的OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質(zhì)或是敲除突變的OmpT基因。在一個實施方案中，宿主細胞表達如下一種或多種蛋白質(zhì):.能夠促進蛋白質(zhì)折疊的一種或多種蛋白質(zhì),例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD ；和/或.能夠促進蛋白質(zhì)分泌或易位的一種或多種蛋白質(zhì)，例如SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY 和 Lep ;和 / 或.能夠促進二硫鍵形成的一種或多種蛋白質(zhì),例如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。上述蛋白質(zhì)中的一種或多種可以整合到細胞的基因組內(nèi)和/或插入表達載體中。在一個實施方案中，宿主細胞不包含編碼下述蛋白質(zhì)中的一種或多種的重組多核苷酸:.能夠促進蛋白質(zhì)折疊的一種或多種蛋白質(zhì),例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD ；.能夠促進蛋白質(zhì)分泌或易位的一種或多種蛋白質(zhì)，例如SecY、SecE、SecG、SecYEG、SecA、SecB、FtsY 和 Lep ;和.能夠促進二硫鍵形成的一種或多種蛋白質(zhì),例如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。在一個實施方案中，在本發(fā)明中使用的細胞與野生型細胞相比較具有降低的Tsp蛋白質(zhì)活性，并且如上所述包含編碼DsbC的重組多核苷酸和突變的spr基因，如上所述包含編碼DsbC的重組多核苷酸和突變的spr基因，以及FkpA和/或Skp。使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)一般在大腸桿菌宿主細胞的周質(zhì)或宿主細胞培養(yǎng)物上清液中表達，取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)和生產(chǎn)規(guī)模。用于將蛋白質(zhì)靶向這些區(qū)室的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，關(guān)于綜述參見Makrides, Microbiological Reviews, 1996,60,512-538。將蛋白質(zhì)導(dǎo)向大腸桿菌的周質(zhì)的合適信號序列的例子包括大腸桿菌PhoA、0mpA、OmpT> LamB和OmpF信號序列。蛋白質(zhì)可以通過依賴天然分泌途徑或通過誘導(dǎo)外膜的有限滲漏來靶向上清液，以引起蛋白質(zhì)分泌，其例子是使用PelB前導(dǎo)區(qū)、蛋白A前導(dǎo)區(qū)、細菌素釋放蛋白質(zhì)的共表達、絲裂霉素誘導(dǎo)的細菌素釋放蛋白質(zhì)連同甘氨酸加入培養(yǎng)基中、和kil基因的共表達用于膜滲透化。最優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，重組蛋白質(zhì)在宿主大腸桿菌的周質(zhì)中表達。重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌宿主細胞中的表達也可以處于可誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制下，由此重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的表達處于誘導(dǎo)型啟動子的控制下。適合于在大腸桿菌中使用的許多誘導(dǎo)型啟動子是本領(lǐng)域眾所周知的，并且取決于啟動子，重組蛋白質(zhì)的表達可以通過不同因素例如生 長培養(yǎng)基中的溫度和特定物質(zhì)的濃度進行誘導(dǎo)(Baneyx, Current Opinionin Biotechnology,1999,10:411-421 ；Goldstein 和 Doi，1995，Biotechnol.Annu.Rev,105-128)。誘導(dǎo)型啟動子的例子包括大腸桿菌lac、tac和trc啟動子,其可用乳糖或無法水解的乳糖類似物異丙基-β -D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，以及phoA、trp和araBAD啟動子，其分別通過磷酸鹽、色氨酸和L-阿拉伯糖誘導(dǎo)。表達可以通過例如誘導(dǎo)物的添加或當(dāng)誘導(dǎo)是溫度依賴性時溫度中的改變進行誘導(dǎo)。當(dāng)重組蛋白質(zhì)表達的誘導(dǎo)通過將誘導(dǎo)物加入培養(yǎng)物達到時，誘導(dǎo)物可以通過任何合適方法加入，取決于發(fā)酵系統(tǒng)和誘導(dǎo)物，例如通過單次或多次發(fā)射添加(shot addition)或通過誘導(dǎo)物經(jīng)過補料的逐步添加。應(yīng)當(dāng)理解在誘導(dǎo)物的添加和蛋白質(zhì)表達的實際誘導(dǎo)之間可以存在延遲，例如當(dāng)誘導(dǎo)物是乳糖時，在蛋白質(zhì)表達的誘導(dǎo)發(fā)生前可以存在延遲，而任何預(yù)先存在的碳源在乳糖前利用。大腸桿菌宿主細胞培養(yǎng)物(發(fā)酵)可以在任何培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基將支持大腸桿菌的生長和重組蛋白質(zhì)的表達。培養(yǎng)基可以是任何化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，例如Pirt
S.J.(1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation, Blackwell ScientificPublications中提供的那些，具有如本文描述的合適時控制生長率的修飾。合適培養(yǎng)基的例子是如由 Humphreys 等人，2002, Protein Expression and Purif ication, 26:309-320 描述的 ‘SM6E’。大腸桿菌宿主細胞的培養(yǎng)可以在任何合適的容器例如搖瓶或發(fā)酵罐中發(fā)生，取決于所需生產(chǎn)規(guī)模。多種大規(guī)模發(fā)酵罐是可獲得的，具有超過1，000升直到約100，000升的容量。優(yōu)選地，使用1，000-50, 000升的發(fā)酵罐，更優(yōu)選1，000-10, 000或12，000升。還可以使用具有在0.5-1，000升之間的容量的更小規(guī)模發(fā)酵罐。大腸桿菌的發(fā)酵可以在任何合適的系統(tǒng)中執(zhí)行，例如連續(xù)、分批或補料分批模式(Thiry & Cingolani, 2002, Trends in Biotechnology, 20:103-105),取決于所需蛋白質(zhì)和得率。當(dāng)需要營養(yǎng)物或誘導(dǎo)物的發(fā)射添加時，可以使用分批模式?？商娲?，可以使用補料分批培養(yǎng)，并且以最大特定生長率(其可以使用最初存在于發(fā)酵罐中的營養(yǎng)物維持)以分批模式預(yù)誘導(dǎo)生長的培養(yǎng)物和一種或多種營養(yǎng)素補料方案用于控制生長率直至發(fā)酵完成時。補料分批模式也可以使用預(yù)誘導(dǎo)，以控制大腸桿菌宿主細胞的代謝且允許達到更高的細胞密度(Lee, 1996, Tibtech, 14:98-105)。需要時，可以對宿主細胞實施來自發(fā)酵培養(yǎng)基的收集,例如宿主細胞可以通過離心、過濾或通過濃縮從樣品中收集。特別地，本發(fā)明的方法適合于具有治療質(zhì)量的抗體的大規(guī)模工業(yè)制造。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括在培養(yǎng)步驟后的離心步驟，隨后為通過加入提取緩沖液的細胞懸浮。在培養(yǎng)步驟后，該方法可以包括提取步驟，以從宿主細胞中釋放重組蛋白質(zhì)。提取可以通過任何合適的方法執(zhí)行，例如通過機械或壓力處理的細胞裂解、凍融處理、滲透休克、提取劑或熱處理。此類提取方法是本領(lǐng)域眾所周知的。在優(yōu)選實施方案中，將提取緩沖液加入樣品中，并且隨后對樣品實施熱處理步驟。熱處理步驟優(yōu)選如US5，665，866 (其內(nèi)容通過引用合并入本文)中詳細描述的。通過促進其他抗體有關(guān)材料的去除，熱處理步驟使得能夠獲得可溶、正確折疊且裝配的抗體的樣品?！罢_折疊且裝配的”抗體通過單個條帶的存在顯示，所述單個條帶對應(yīng)于關(guān)于裝配的重鏈和輕鏈在非還原SDS PAGE上的預(yù)期分子量。其他抗體有關(guān)材料一般不含重鏈和輕鏈或其部分、正確折疊且裝配的抗體的部分降解片段。熱處理步驟通過對樣品實施所需升高溫度來執(zhí)行。最優(yōu)選地，熱處理步驟在30°C-70°C的范圍內(nèi)執(zhí)行。溫度可以根據(jù)需要選擇，并且可以取決于用于純化的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在另一個實施方案中，溫度在范圍40°C -65°C內(nèi)，或優(yōu)選在范圍40°C _60°C內(nèi)，更優(yōu)選在范圍45°C _60°C內(nèi)，甚至更優(yōu)選在范圍50°C _60°C內(nèi)，且最優(yōu)選在55°C -60°C >58°C -60°C或59°C。因此，最低溫度是30°C、35°C或40°C，并且最高溫度是60°C、65°C或70°C。熱處理步驟優(yōu)選執(zhí)行延長時間段。熱處理的長度優(yōu)選在1-24小時之間、更優(yōu)選在4-18小時之間、甚至更 優(yōu)選在6-16小時之間且最優(yōu)選在10-14小時之間或在10-12小時之間，例如12小時。因此，熱處理的最少時間是1、2或3小時，并且最大值是20、22或24小時。在特定實施方案中，熱處理在50°C _60°C執(zhí)行10-16小時，且更優(yōu)選在59°C執(zhí)行10-12小時。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解溫度和時間可以選擇為適合所討論的樣品和待生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的特征。在提取步驟后，在調(diào)節(jié)pH的步驟前，可以對樣品實施離心和/或過濾步驟。實施本發(fā)明的步驟a)的樣品是宿主細胞樣品或其提取物。相應(yīng)地，步驟a)可以例如對下述執(zhí)行:.包含表達重組蛋白質(zhì)和重組二硫化物異構(gòu)酶的宿主細胞群體的溶液；.在離心和/或過濾以去除宿主細胞后，表達重組蛋白質(zhì)和重組二硫化物異構(gòu)酶的宿主細胞群體的上清液；.在提取步驟例如熱處理后，表達重組蛋白質(zhì)和重組二硫化物異構(gòu)酶的宿主細胞群體的提取物；或.在提取步驟例如熱處理，和一個或多個后續(xù)離心和/或過濾步驟后，表達重組蛋白質(zhì)和重組二硫化物異構(gòu)酶的宿主細胞群體的提取物。在步驟a)前，宿主細胞溶液或其提取物處于合適pH，一般地宿主細胞溶液或其提取物的pH是pH5-10，優(yōu)選pH6-8或約pH7。在步驟a)前，宿主細胞溶液或其提取物的pH可以取決于目的重組蛋白質(zhì)的pi。如果PH調(diào)節(jié)至或超過蛋白質(zhì)的pl，那么蛋白質(zhì)可以具有沉淀的趨勢。因此，在PH調(diào)節(jié)步驟前，溶液的pH低于重組蛋白質(zhì)的pi是優(yōu)選的，以確保pH調(diào)節(jié)步驟不使溶液的pH達到或超過重組蛋白質(zhì)的pi。例如，如果重組蛋白質(zhì)的pi是約
8,那么溶液的pH優(yōu)選小于pH8,以便使重組蛋白質(zhì)的沉淀最小化。使pH下降至小于pH5的步驟也優(yōu)選避免重組蛋白質(zhì)的pi。蛋白質(zhì)的pi將取決于它在其中的溶液的離子強度。相應(yīng)地，蛋白質(zhì)在水或極低離子強度緩沖液中的計算的Pl可能不同于蛋白質(zhì)在包含緩沖液和HCP的宿主細胞樣品或其提取物中的pi。蛋白質(zhì)的Pi可以比蛋白質(zhì)在水或極低離子強度緩沖液中的測量Pi低1、1.5或2個pH單位。因此，宿主細胞溶液或其提取物的pH優(yōu)選維持在比目的重組蛋白質(zhì)在水或極低離子強度緩沖液中測量的pi低1、1.5或2個pH單位的pH。在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟b)中，沉淀的重組二硫化物異構(gòu)酶與重組蛋白質(zhì)分離，以產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)樣品。步驟b) —般包括離心和/或過濾，以便分離沉淀的重組二硫化物異構(gòu)酶。與步驟a)前重組二硫化物異構(gòu)酶的數(shù)量相比較，所得到的重組蛋白質(zhì)樣品具有減少數(shù)量的重組二硫化物異構(gòu)酶。優(yōu)選地，在步驟b)后的重組蛋白質(zhì)樣品基本上不含重組二硫化物異構(gòu)酶。然而，一些重組二硫化物異構(gòu)酶保留在樣品中是可能的，其可以通過以后的純化步驟去除。技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法確定重組二硫化物異構(gòu)酶是否仍存在于重組蛋白質(zhì)樣品中。例如，ELISA分析可以用于檢測重組二硫化物異構(gòu)酶，例如DsbC0可以使用對于重組二硫化物異構(gòu)酶例如DsbC特異性的抗體，或如果重組二硫化物異構(gòu)酶是加his-標(biāo)簽的，例如DsbC-his-標(biāo)簽，那么抗His-標(biāo)簽抗體可以用于檢測重組二硫化物異構(gòu)酶。如本文采用的基本上不含意指含有5%w/w或更少，例如4、3、2、1或0.5%w/w或更少。在一個實施方案中，當(dāng)宿主細胞樣品或其提取物的pH調(diào)節(jié)至pH3或更低(例如PH3)時，宿主細胞蛋白質(zhì)二肽結(jié)合蛋白(也稱為“DBP”)沉淀且在步驟b)中與重組蛋白質(zhì)分離。在這個實施方案中，所得到的重組蛋白質(zhì)樣品也具有減少數(shù)量的宿主細胞二肽結(jié)合蛋白(DBP)。優(yōu)選地，所得到的重組蛋白質(zhì)樣品基本上不含DBP。優(yōu)選地，所得到的重組蛋白質(zhì)樣品也具有減少數(shù)量的其他宿主細胞蛋白質(zhì)，其也可以在步驟a)過程中沉淀。優(yōu)選地，所得到的重組蛋白質(zhì)樣品基本上不含其他宿主細胞蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的步驟a)和b)后，目的重組蛋白質(zhì)的得率一般是75%或更多、80%或更多、85%或更多或90%或更多。在步驟b )后，重組蛋白質(zhì)樣品的pH可以調(diào)節(jié)至合適pH用于貯存重組蛋白質(zhì)或用于執(zhí)行下游純化步驟，例如色譜法。如先前討論的，通過確保PH不在重組蛋白質(zhì)的pl，溶液的PH可以調(diào)節(jié)為使目的重組蛋白質(zhì)的沉淀降到最小化。優(yōu)選地，重組蛋白質(zhì)樣品的pH調(diào)節(jié)至pH5 - 7、更優(yōu)選pH5-6。所需確切pH將取決于重組蛋白質(zhì)的性質(zhì)，包括蛋白質(zhì)的pl，以及將執(zhí)行何種下游純化步驟。任何合適的試劑都可以用于調(diào)節(jié)重組蛋白質(zhì)樣品的PH，例如選自NaOH、乙酸鈉或Tris堿的堿。
備選地，該方法在不包括步驟b)后的pH調(diào)整步驟。在這個實施方案中，重組蛋白質(zhì)樣品的PH可以適合于重組蛋白質(zhì)的貯存和/或一個或多個后續(xù)下游純化步驟。在一個實施方案中，在步驟a)中，宿主細胞樣品或其提取物的pH調(diào)節(jié)至pH4.5，步驟b)包括離心和過濾，并且隨后對步驟b)后所得到的重組蛋白質(zhì)溶液實施在pH4.5的陽離子交換色譜法步驟。備選地，色譜法步驟可以在較高pH執(zhí)行，例如pH或以上，例如5 - 8，特別是6或7。在步驟b)后，可以對重組蛋白質(zhì)樣品實施一個或多個進一步純化步驟，以便去除污染物和/或不需要的蛋白質(zhì)片段例如抗體片段。一般地，對重組蛋白質(zhì)樣品實施一個或多個色譜法步驟，其中每個色譜法步驟可以隨后為過濾步驟，例如微量過濾、滲濾或超濾。一個或多個色譜法步驟可以是親和或非親和色譜法步驟。在一個實施方案中，色譜法是非親和色譜法步驟，例如陽離子或陰離子離子交換色譜法。在一個實施方案中，在步驟a)中，宿主細胞樣品或其提取物的pH調(diào)節(jié)至pH4.5，步驟b)包括離心和過濾，并且隨后對步驟b)后所得到的重組蛋白質(zhì)溶液實施在pH4.5的陽離子交換色譜法步驟。當(dāng)非親和色譜法步驟用于下游純化中時，本發(fā)明的方法是特別有利的。這是因為大量宿主細胞蛋白質(zhì)包括重組·二硫化物異構(gòu)酶可以與色譜柱結(jié)合，如果它們先前未分離。相應(yīng)地，色譜柱結(jié)合所需重組蛋白質(zhì)的能力減少。宿主細胞蛋白質(zhì)包括重組二硫化物異構(gòu)酶的分離增加后續(xù)非親和色譜柱的能力，其提供用于純化重組蛋白質(zhì)的更快速和更便宜的方法。在本發(fā)明的步驟a)過程中，重組蛋白質(zhì)可以是部分解折疊的，而溶液保持在pH5或更低。然而，蛋白質(zhì)的部分解折疊是可逆的，并且在沉淀的二硫化物異構(gòu)酶分離后，蛋白質(zhì)溶液的PH可以調(diào)節(jié)至超過5的pH，優(yōu)選pH5 - 7或pH5_6，并且蛋白質(zhì)隨后可以采用其原始折疊構(gòu)象。因此，總體上，低PH保持步驟提供相對溫和的條件用于去除雜質(zhì)，具有最低限度長期后果。通過本發(fā)明的方法提供的重組蛋白質(zhì)樣品包含顯著比例的功能蛋白質(zhì)。由宿主細胞表達的目的重組蛋白質(zhì)優(yōu)選具有6或更高的pi，更優(yōu)選7或更高的PL.如先前討論的，如果蛋白質(zhì)具有6或更高的pl，那么通過使樣品的pH維持低于蛋白質(zhì)的Pl，優(yōu)選低于蛋白質(zhì)在水或極低離子強度緩沖液中的pi 1、1.5或2個pH單位，更容易使蛋白質(zhì)的沉淀最小化，并且將樣品的PH調(diào)節(jié)至pH5或更低的步驟不將溶液的pH調(diào)節(jié)至蛋白質(zhì)的pi。目的重組蛋白質(zhì)優(yōu)選是重組抗體。重組抗體優(yōu)選具有pI6-10、7-10、6-9、7-9、8_9、
6、7、8或9。在步驟a)之前、過程中和之后，樣品的pH優(yōu)選維持低于重組抗體的pl，更優(yōu)選低于重組抗體pll、1.5或2個pH單位，以便確?？贵w的最小限度沉淀。在優(yōu)選實施方案中，重組抗體具有pI7-9，并且在步驟a)中，將樣品的pH調(diào)節(jié)至PH3-4.5，更優(yōu)選 ρΗ4.5。重組抗體的具體例子是如本文和W001/094585中描述的抗TNF Fab’CDP870，其具有 PI8。在一個實施方案中，重組蛋白質(zhì)或其結(jié)合片段是抗TNF Fab’⑶P870。如本文使用的，‘功能抗體’包括保留特異性識別或結(jié)合它們所針對產(chǎn)生的抗原(同源抗原)的能力的抗體分子，所述抗原即是針對其是特異性的抗原。功能抗體的生產(chǎn)通過在非還原SDS-PAGE上對應(yīng)于抗體預(yù)期分子量的單個條帶的存在,或通過使用BIAcore或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法例如但不限于ELISA的直接結(jié)合測定顯示。非功能抗體包括不識別其同源抗原的片段，并且包括不正確折疊或不正確裝配的抗體、游離重鏈和輕鏈及其片段，包括部分降解的抗體片段，其不識別或結(jié)合其同源抗原?？贵w的結(jié)合片段是能夠結(jié)合抗體對于其是特異性的抗原的片段。在優(yōu)選例子中，重組抗體分子是至少部分抗體輕鏈和至少部分抗體重鏈，從而使得所表達的輕鏈和重鏈抗體分子中的至少一些能夠組合以形成功能抗體。如本文使用的，‘抗體’包括具有全長重鏈和輕鏈的抗體；其功能活性片段、結(jié)合片段、衍生物或類似物，并且可以是但不限于VH、VL、VHH、Fab、經(jīng)修飾的Fab、改變的鉸鏈Fab、Fab’、F (ab’ )2或Fv片段；輕鏈或重鏈單體或二聚體；單鏈抗體，例如其中重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域通過肽接頭連接的單鏈Fv, Fab-Fv,或雙重特異性抗體,例如Fab_dAb,如PCT/GB2008/003331 中所述的?？贵w可以是多克隆、單克隆、二、三或四價抗體，人源化或嵌合抗體。這些抗體及其片段可以是天然存在、人源化、嵌合或CDR移植的抗體，并且標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可以根據(jù)需要用于修飾、添加或缺失氨基酸或結(jié)構(gòu)域。人源化抗體是來自非人物種的抗體分子，其具有來自非人物種的一個或多個互補決定區(qū)(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)(參見例如US5，585，089)。使用本發(fā)明的方法純化的抗體分子可以具有免疫球蛋白分子的任何種類(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亞類。用于產(chǎn)生這些抗體分子的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，Shrader等人，W092/02551 ;Ward 等人，1989，Nature，341:544 ；Orlandi 等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86:3833 ；Riechmann 等人，1988, Nature, 322:323 ；Bird 等人，1988，Science, 242:423 ；Queen 等人，US5, 585，089 ；Adair, W091/09967 !Mountain 和 Adair,1992，Biotechnol.Genet.Eng.Rev,10:1-`142 ；Verma 等人，1998, Journal of Immunological Methods,216:165-181)。單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法制備,例如雜交瘤技術(shù)(Kohler &Milstein, 1975, Nature, 256:495-497)、三源雜交瘤技術(shù)、人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，1983, Immunology Today,4:72)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,第 77-96 頁，Alan R Liss, Inc., 1985)。嵌合抗體是由免疫球蛋白基因編碼的那些抗體，所述免疫球蛋白基因已經(jīng)遺傳改造，從而使得輕鏈和重鏈基因由屬于不同物種的免疫球蛋白基因區(qū)段組成。這些嵌合抗體可能是較少抗原性的。二價抗體可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備(MiIstein等人，1983,Nature305:537-539 ；W093/08829, Traunecker 等人，1991，EMBO J.10:3655-3659)。二、三和四價抗體可以包含多重特異性或可以是單特異性的(參見例如W092/22853)?？贵w序列還可以使用單一淋巴細胞抗體方法生成，基于由單一淋巴細胞生成的免疫球蛋白可變區(qū)cDNA的分子克隆和表達，所述單一淋巴細胞選擇用于特異性抗體的產(chǎn)生，如由 Babcook，J.等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93 (15): 7843-7848 和 W092/02551中所述的。后面的方法依賴個別抗體生產(chǎn)細胞的分離，其隨后克隆擴增然后篩選產(chǎn)生識別其同源抗原的抗體的那些克隆，和需要時，其可變重(Vh)和輕(')鏈基因的序列的后續(xù)鑒定。備選地，產(chǎn)生識別其同源抗原的抗體的細胞可以一起培養(yǎng)，隨后為篩選?？贵w可以是對于任何靶抗原特異性的。抗原可以是細胞相關(guān)蛋白質(zhì)，例如在細胞例如細菌細胞、酵母細胞、T細胞、內(nèi)皮細胞或腫瘤細胞上的細胞表面蛋白質(zhì)，或它可以是可溶性蛋白質(zhì)。目的抗原也可以是任何醫(yī)學(xué)有關(guān)蛋白質(zhì)例如在疾病或感染過程中上調(diào)的那些蛋白質(zhì)，例如受體和/或其對應(yīng)配體。細胞表面蛋白質(zhì)的特定例子包括粘附分子，例如整聯(lián)蛋白例如β I整聯(lián)蛋白，例如VLA-4、E-選擇素、P選擇素或L-選擇素、⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、CD7、CD8、CDlla、CDllb、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、CD 134 (0X40 )、I COS、BCMP7、CD 137、CD27L、CDCP1、CSFI 或 CSF1-受體、DPCRl、DPCRl、dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、連接素樣 2、NKCCU PTK7、RAIGU TCAMU SC6、BCMP101、BCMP84、BCMPlUDTD、癌胚抗原(CEA)、人乳脂球蛋白(HMFG1和2)、MHC I類和MHC II類抗原、KDR和VEGF、PD-1、DC-SIGN、TL1A、IL-7受體A，和合適時其受體?？扇苄钥乖ò准毎樗乩鏘L-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-14、IL-16或IL-17，例如IL17A和/或IL17F，病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨細胞病毒抗原，免疫球蛋白例如IgE，干擾素例如干擾素α、干擾素β或干擾素Y，腫瘤壞死因子TNF(以前稱為腫瘤壞死因子-α且在本文中稱為TNF或TNFa ),腫瘤壞死因子-β ,集落刺激因子例如G-CSF或GM-CSF，以及血小板衍生的生長因子例如I3DGF- a和TOGF- β、WISP-1，和合適時其受體。其他抗原包括細菌細胞表面抗原，細菌毒素，病毒例如流感、EBV、HepA, B和C，生物恐怖劑，放射性核素和重金屬，以及蛇和蜘蛛毒液和毒素。在一個實施方案中，抗體可以用于功能上改變目的抗原的活性。例如，抗體可以直接或間接中和、拮抗或激動所述抗原的活性。在優(yōu)選實施方案中，抗體是抗TNF抗體，更優(yōu)選如WOO1/094585 (其內(nèi)容通過引用合并入本文)中所述的抗TNF Fab’⑶P870。在一個實施方案中，對于 人TNFa具有特異性的抗體包含重鏈，其中可變結(jié)構(gòu)域包含對于⑶RHl具有SEQ ID NO:1所示序列、對于CDRH2具有SEQ ID NO: 2所示序列、或?qū)τ贑DRH3具有SEQ ID NO:3所示序列的CDR。在一個實施方案中，抗體包含輕鏈，其中可變結(jié)構(gòu)域包含對于⑶RLl具有SEQ IDN0:4所示序列、對于CDRL2具有SEQ ID NO: 5所示序列、或?qū)τ贑DRL3具有SEQ ID NO: 6所不序列的⑶R。在一個實施方案中，抗體包含重鏈，其中可變結(jié)構(gòu)域包含對于⑶RHl具有SEQ IDN0:1所示序列、對于CDRH2具有SEQ ID NO: 2所示序列、或?qū)τ贑DRH3具有SEQ ID NO: 3所示序列的⑶R，和輕鏈，其中可變結(jié)構(gòu)域包含對于⑶RLl具有SEQ ID NO:4所示序列、對于CDRL2具有SEQ ID NO:5所示序列、或?qū)τ贑DRL3具有SEQ IDN0:6所示序列的CDR。在一個實施方案中，抗體包含對于CDRHl的SEQ ID NO: 1、對于CDRH2的SEQ IDNO:2、對于 CDRH3 的 SEQ ID NO:3、對于 CDRLl 的 SEQ ID NO:4、對于 CDRL2 的 SEQ ID NO:5和對于 CDRL3 的 SEQ ID NO:6?？贵w優(yōu)選是⑶R移植的抗體分子且一般地可變結(jié)構(gòu)域包含人受體構(gòu)架區(qū)和非人供體CDR。優(yōu)選地，抗體包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域⑶P870 (SEQ ID NO:7)和重鏈可變結(jié)構(gòu)域CDP870 (SEQ ID NO:8)。優(yōu)選抗體是經(jīng)修飾的Fab片段，其中所述修飾是對其重鏈的C末端添加一個或多個氨基酸，以允許效應(yīng)分子或報道分子的附著。優(yōu)選地，另外的氨基酸形成含有一個或兩個半胱氨酸殘基的經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)，效應(yīng)分子或報道分子可以與所述半胱氨酸附著。此類經(jīng)修飾的Fab片段優(yōu)選具有包含作為SEQ ID NO: 10給出的序列或由作為SEQ ID NO: 10給出的序列組成的重鏈，和包含作為SEQ ID N0:9給出的序列或由作為SEQ ID N0:9給出的序列組成的輕鏈。在本發(fā)明中使用的宿主細胞包含編碼抗體的DNA序列。優(yōu)選地，DNA序列編碼抗體的重鏈和輕鏈。在一個優(yōu)選實施方案中，DNA序列編碼輕鏈且包含SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 9中所示的序列(⑶P870)或其簡并等價物。在備選優(yōu)選實施方案中，DNA序列編碼重鏈且包含SEQ ID N0:8或SEQ ID NO: 10中所示的序列(CDP870)或其 簡并等價物。DNA序列可以包含例如通過化學(xué)加工產(chǎn)生的合成DNA、cDNA、基因組DNA或其任何組合。如果存在的話，抗體的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可以就抗體分子的所提議功能且特別是可能需要的效應(yīng)子功能而言進行選擇。例如，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM結(jié)構(gòu)域。特別地，當(dāng)抗體分子預(yù)期用于治療用途且需要抗體效應(yīng)子功能時，可以使用人IgG恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，尤其是IgGl和IgG3同種型。備選地，當(dāng)抗體分子預(yù)期用于治療用途且不需要抗體效應(yīng)子功能時，例如僅用于阻斷TNFa活性，可以使用IgG2和IgG4同種型。用于表達重組蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。用于表達重組抗體分子的宿主細胞的合適例子包括細菌例如革蘭氏陽性或革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌，或酵母細胞例如釀酒酵母(S.cerevisiae)，或哺乳動物細胞例如CHO細胞，和骨髓瘤或雜交瘤細胞系例如NSO細胞。最優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，重組抗體在細菌例如大腸桿菌中產(chǎn)生(參見 Verma 等人，1988, J.1mmunol.Methods216:165-181 ；Simmons 等人，2002, J.1mmunol.Methods263:133-147)。在表達后，抗體可以例如通過綴合至另一個實體例如效應(yīng)分子進一步加工。相應(yīng)地，根據(jù)本發(fā)明的方法可以包含使效應(yīng)分子與抗體附著的進一步步驟。如本文使用的術(shù)語效應(yīng)分子包括例如抗腫瘤藥，藥物，毒素(例如細菌或植物起源的酶促活性的毒素及其片段，例如蓖麻蛋白及其片段)，生物學(xué)活性蛋白質(zhì)例如酶、其他抗體或抗體片段，合成或天然存在的聚合物，核酸及其片段例如DNA、RNA及其片段，放射性核素、特別是放射性碘、放射性同位素，螯合金屬，納米顆粒和報道基團例如熒光化合物或可以通過NMR或ESR光譜法檢測的化合物。效應(yīng)分子可以通過任何合適方法與抗體或其片段附著，例如抗體片段可以進行修飾，以附著至少一種效應(yīng)分子，如W005/003171或W005/003170 (其內(nèi)容通過引用合并入本文)中所述的。W005/003171或W005/003170還描述了合適的效應(yīng)分子?？贵w可以具有用于螯合重金屬原子的大環(huán)，或通過共價橋接結(jié)構(gòu)與之附著的毒素例如蓖麻蛋白。備選地，重組DNA技術(shù)的程序可以用于產(chǎn)生抗體分子，其中完全免疫球蛋白分子的Fe片段(CH2、CH3和鉸鏈結(jié)構(gòu)域)、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域或CH3結(jié)構(gòu)域已替換為功能非免疫球蛋白蛋白質(zhì)例如酶或毒素分子，或已通過肽連接與之附著。在其中抗體是在其重鏈的C末端上具有一個或多個氨基酸(以允許效應(yīng)或報道分子附著)的經(jīng)修飾的Fab片段的實施方案中，另外的氨基酸優(yōu)選形成含有一個或兩個半胱氨酸殘基的經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)，效應(yīng)分子或報道分子可以與所述半胱氨酸附著。優(yōu)選的效應(yīng)基團是聚合物分子，其可以與經(jīng)修飾的Fab片段附著，以增加其體內(nèi)半衰期。一般而言，聚合物分子可以是合成或天然存在的聚合物，例如任選取代的直鏈或支鏈聚燒撐、聚亞烯基(polyalkenylene)或聚氧化烯聚合物或分支或未分支的多糖,例如同多糖或雜多糖?？梢源嬖谟谏鲜龊铣删酆衔锷系奶囟ㄈ芜x取代基包括一個或多個羥基、甲基或甲氧基。合成聚合物的特定例子包括任選取代的直鏈或支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其是任選取代的聚(乙二醇)，例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。特別的天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈淀粉、右旋糖酐、糖原或其衍生物。如本文使用的“衍生物”預(yù)期包括反應(yīng)性衍生物，例如硫醇選擇的反應(yīng)基團例如馬來酰亞胺等。反應(yīng)基團可以直接或通過接頭區(qū)段與聚合物連接。應(yīng)當(dāng)理解此類基團的殘基在一些情況下構(gòu)成產(chǎn)物的部分，作為在抗體片段和聚合物之間的連接基團。聚合物的大小可以根據(jù)需要改變，但一般在500Da_50，OOODa、優(yōu)選5000-40，OOODa且更優(yōu)選25，000-40, OOODa的平均分子量范圍中。聚合物大小可以特別基于產(chǎn)物的預(yù)期用途進行選擇。因此，例如，當(dāng)產(chǎn)物預(yù)期離開循環(huán)且滲透組織例如用于在腫瘤治療中使用時，使用例如具有約5，OOODa的分子量的小分子量聚合物可以是有利的。對于其中產(chǎn)物保留在循環(huán)中的應(yīng)用，使用例如具有在25，000Da-40, OOODa的范圍中的分子量的更高分子量聚合物可以是有利的。 特別優(yōu)選的聚合物包括聚烷撐聚合物，例如聚(乙二醇)或尤其是甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其是具有在約25，OOODa-約40，OOODa的范圍中的分子量。與經(jīng)修飾的抗體片段附著的每個聚合物分子可以共價連接至位于片段中的半胱氨酸殘基的硫原子。共價連接將一般是二硫鍵或特別是硫-碳鍵。當(dāng)需要時，抗體片段可以具有與之附著的一個或多個效應(yīng)分子或報道分子。效應(yīng)分子或報道分子可以通過位于片段中的任何可獲得的氨基酸側(cè)鏈或末端氨基酸官能團與抗體片段附著，例如任何游離氨基、亞氨基、羥基或羧基。一個或多個效應(yīng)分子或報道分子可以附著至在抗體重鏈和/或輕鏈的C末端或朝向C末端的氨基酸。活化聚合物可以用作如上所述的聚合物修飾的抗體片段制備中的原材料。活化聚合物可以是含有硫醇反應(yīng)基團例如α -鹵代羧酸或酯的任何聚合物，例如碘乙酰胺、酰亞胺例如馬來酰亞胺、乙烯基砜或二硫化物。此類原材料可以是商購獲得的(例如由Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA),或可以使用常規(guī)化學(xué)程序由商購可得的原材料制備。關(guān)于附著聚(乙二醇)(PEG)部分，參考 “Poly (ethyleneglycol) Chemistry,Biotechnical and Biomedical Applications，，，1992, J.Milton Harris (編輯)，PlenumPress, New York, “Poly (ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications，，，1997, J.Milton Harris and S.Zalipsky(編輯)，American Chemical Society, WashingtonDC and “Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the BiomedicalSciences”，1998, M.Aslam and A.Dent, Grove Publishers, New York。當(dāng)希望獲得連接至效應(yīng)分子或報道分子的抗體片段時，這可以通過標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)或重組DNA程序制備，其中適當(dāng)時在與活化聚合物反應(yīng)前或后，抗體片段直接或經(jīng)由偶聯(lián)劑連接至效應(yīng)分子或報道分子。特定化學(xué)程序包括例如W093/62331、W092/22583、W090，195和W089/1476中所述的那些。備選地，當(dāng)效應(yīng)分子或報道分子是蛋白質(zhì)或多肽時，連接可以使用重組DNA程序達到，例如如W086/01533和EP-A-0392745中所述的。優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法提供的經(jīng)修飾的Fab片段是根據(jù)公開于EP-A-0948544中的方法PEG化的(即具有與之共價附著的PEG (聚(乙二醇))。優(yōu)選地，抗體是如圖9中所示PEG化的經(jīng)修飾的Fab片段。如圖2中所示，經(jīng)修飾的Fab片段已使賴氨酰-馬來酰亞胺-衍生基團與在重鏈的經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)的C末端上的半胱氨酸殘基之一附著，其中賴氨酰殘基的兩個氨基各自具有與之共價連接的具有約20，OOODa的分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基，從而使得甲氧基聚(乙二醇)殘基的總平均分子量是約40，OOODa，更優(yōu)選地賴氨酰-馬來酰亞胺-衍生基團是[1-[[[2-[[3_ (2，5-二氧代-1-吡咯烷基)-1-氧代丙基]氨基]乙基]氨基]-羰基]-1，5-戊烷二基(pentanediyl)]雙(亞氨基羰基)。賴氨酸殘基共價連接至馬來酰亞胺基團。向賴氨酸殘基上的氨基各自附著具有約20，OOODa的分子量的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。整個效應(yīng)分子的總分子量因此是約40，OOODa0相應(yīng)地，根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選包含使賴氨酰-馬來酰亞胺基團與在重鏈的C末端上的半胱氨酸殘基之一附著，其中賴氨酰殘基的每個氨基具有與之共價連接的具有約20，OOODa的分子量的甲氧 基聚(乙二醇)殘基。優(yōu)選地，在圖9中所示的化合物中，抗體部分的重鏈具有作為SEQ ID NO: 10給出的序列，并且輕鏈具有在SEQ ID N0:9所示的序列。這種化合物在本文中稱為⑶P870。本發(fā)明的每個實施方案的優(yōu)選特征關(guān)于其他實施方案各自已作必要的修正。本說明書中引用的所有出版物包括但不限于專利和專利申請通過引用合并入本文，如同每個個別出版物特別且個別指出通過引用合并入本文，好像完全闡述一樣。本公開內(nèi)容明確公開包含特定整體組合的實施方案。本公開內(nèi)容還延伸至由所述整體組合組成或基本上由所述整體組合組成的實施方案。參數(shù)選擇和/或?qū)嵤┓桨缚梢匀缂夹g(shù)上可行的組合。本發(fā)明現(xiàn)在將就下述實施例而言進行描述，所述實施例僅是舉例說明性的且不應(yīng)以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實施例
_7]實施例1:表達重組DsbC和重組抗體的宿主細胞系的生成對于所有實驗，大腸桿菌細胞系W3110用作親本野生型細胞系。產(chǎn)生攜帶下述突變的細胞系:a.突變的Tsp基因；b.突變的Tsp基因且攜帶重組DsbC ；c.突變的Tsp基因和突變的spr基因；d.突變的Tsp基因和突變的spr基因且攜帶重組DsbC。
攜帶突變的Tsp基因MXE001 (ATsp)的細胞系的生成MXE001菌株如下生成:Tsp盒作為Sal I, Not I限制片段移動到類似限制的pK03質(zhì)粒內(nèi)。pK03質(zhì)粒使用pSClOl復(fù)制起點(ItepA)的溫度敏感突變株連同氯霉素標(biāo)記，以強迫且選擇染色體整合事件。編碼果聚糖蔗糖酶的sacB基因?qū)τ谠谡崽巧仙L的大腸桿菌是致命的，并且因此(連同氯霉素標(biāo)記和PSClOl起點一起)用于強迫且選擇去整合和質(zhì)粒消除事件。這種方法先前已得到描述(Hamilton 等人，1989, Journal of Bacteriology, 171,4617-4622 和Blomfield 等人，1991, Molecular Microbiology, 5,1447-1457)。pK03 系統(tǒng)去除除了整合基因外的來自宿主基因組的所有選擇標(biāo)記。構(gòu)建下述質(zhì)粒。PMXE191包含如SEQ ID NO: 15中所示的敲除突變的Tsp基因，包含EcoR I和AseI限制標(biāo)記。隨后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到電轉(zhuǎn)感受態(tài)大腸桿菌W3110細胞內(nèi)，所述W3110細胞使用Miller, E.Μ.和 Nickoloff, J.A.,“Escherichia coli electrotransformation, ” inMethods in Molecular Biology,第 47 卷,Nickoloff, J.A.(編輯),Humana Press, Totowa,NJ, 105 (1995)中發(fā)現(xiàn)的方法制備。第I天，在以2500V、25y F和200Ω電穿孔前，在冷凍的BioRad0.2cm電穿孔小杯中，將40 μ I大腸桿菌細胞與(IOpg)I μ I PK03DNA混合。立即加入1000 μ 12χΡΥ，并且通過以250rpm在溫箱中在30°C振蕩I小時回收細胞。在將100 μ I等分試樣鋪平板到在30°C和43°C預(yù)溫的含有以20μ g/ml氯霉素的2xPY瓊脂平板上之前，將細胞1/10連續(xù)稀釋到2χΡΥ中。將平板在30°C和43°C溫育過夜。第2天，在30°C生長的菌落數(shù)目給出電穿孔效率的估計，而在43°C存活生長的菌落代表潛在的整合事件。挑取來自43°C平板的單個菌落且重懸浮于10ml2xPY中。將100 μ I這個鋪平板到預(yù)溫至30°C含有5% (w/v)蔗糖的2xPY瓊脂平板上，以生成單個菌落。將平板在30°C溫育過夜。第3天，菌落在此處代表潛在的同時去整合和質(zhì)粒消除事件。如果去整合和消除事件在生長早期發(fā)生，那么大量菌落團塊將是克隆的。挑取單個菌落且重復(fù)鋪平板到含有以20 μ g/ml氯霉素或5% (w/v)蔗糖的2xPY瓊脂上。將平板在30°C溫育過夜。第4天，在蔗糖上生長且在氯霉素上死亡的菌落代表潛在的染色體替換和質(zhì)粒消除事件。挑取這些且通過用突變特異性寡核苷酸的PCR篩選。將生成正確大小的陽性PCR條帶菌落劃線培養(yǎng)，以產(chǎn)生在含有5% (w/v)蔗糖的2xPY瓊脂上的單個菌落，并且將平板在30°C溫育過夜。第5天，PCR陽性、氯霉素敏感和蔗糖抗性的大腸桿菌的單個菌落用于制備甘油原種，化學(xué)感受態(tài)細胞，且充當(dāng)PCR模板用于用5’和3’側(cè)翼寡核苷酸的PCR反應(yīng)，以生成PCR產(chǎn)物用于使用Taq聚合酶的直接DNA測序。通過使用寡核苷酸引物PCR擴增包含非天然存在的Ase I限制位點的Tsp基因區(qū)域，測試細胞株MXEOOl以證實攜帶突變的Tsp基因的基因組DNA的成功修飾。隨后在與Ase I限制性酶溫育前和后， 通過凝膠電泳分析DNA的擴增區(qū)，以證實在突變基因中非天然存在的Ase I限制位點的存在。
通過使單個細胞菌落在95°C在20ullx PCR緩沖液中加熱10分鐘制備裂解產(chǎn)物。允許混合物冷卻至室溫，隨后以13，200rpm離心10分鐘。取出上清液且標(biāo)記為‘細胞裂解產(chǎn)物’。使用Tsp寡核苷酸對擴增每個株。使用標(biāo)準(zhǔn)PCR程序擴增DNA。
Sul緩沖液 xlO ( Roche)
IuIdNTF 混合物(Roche, IOmIVl mix )
1.5u! 5’寡核苷酸(5 pmol)
1.5ul 3’寡核苷酸 (5 pmol)
2ul細胞裂解產(chǎn)物
0.5ul Taq DNA 聚合酶(Roche 5ll/ul)
38.5ul H20PCR 循樸。
94 0CI分鐘 94 0CI分鐘) 55VI分鐘)重復(fù)30個循環(huán)
72 0CI分鐘)
72 0C10分鐘一旦反應(yīng)完成,就取出25ul至新離心管用于由Ase I消化。向25ul PCR反應(yīng)中加入19ul H20、5ul緩沖液3 (NEB)Uul Ase I (NEB)，混合且在37°C溫育2小時。向剩余PCR反應(yīng)中，加入5ul加樣緩沖液(x6)，且將20ul裝載到0.8%TAE瓊脂糖凝膠(Invitrogen)加溴化乙唳(5ull0mg/ml原液)上，且以100伏特運行I小時。將IOul大小標(biāo)記(Perfect DNA標(biāo)記0.l_12Kb, Novagen)裝載到最后一個泳道中。一旦Ase I消化完成，就加入IOul加樣緩沖液(x6)，且將20ul裝載到0.8%TAE200ml瓊脂糖凝膠(Invitrogen)加上溴化乙唳(5ull0mg/ml原液)上，且以100伏特運行I小時。將IOul大小標(biāo)記(Perfect DNA標(biāo)記0.l_12Kb,Novagen)裝載到最后一個泳道中。兩個凝膠都使用UV透照器(transluminator)顯現(xiàn)。擴增的基因組片段顯示對于Tsp2.8Kb的正確大小條帶。在用Ase I消化后，這證實在Tsp缺陷株MXEOOl中但不在W3110對照中所引入的Ase I位點的存在。MXEOOl:使用Tsp引物組擴增的基因組DNA和所得到的DNA用Ase I消化，以產(chǎn)生
2.2 和 0.6Kbps 條帶。W3110PCR擴增的DNA不通過Ase I限制性酶消化。攜帶突變spr基因的細胞系和攜帶突變Tsp基因和突變spr基因的細胞系的生成生成spr突變且使用互補測定選擇。
使用Clontech 隨機誘變多樣性pcr試劑盒使spr基因突變，所述試劑盒引入1-2個突變/lOOObp。將突變的spr PCR DNA克隆到可誘導(dǎo)的表達載體[pTTO CDP870]內(nèi)，其表達⑶P870Fab’連同spr突變體。隨后將這個連接電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株MXE001(Δ Tsp)內(nèi)，所述菌株使用在 Miller, E.M.和 Nickoloff, J.A., “Escherichia colielectrotransformation, ” in Methods in Molecular Biology,第 47 卷，Nickoloff,J.A.(編輯),Humana Press, Totowa,NJ, 105 (1995)中發(fā)現(xiàn)的方法制備。使用下述方案,將40ul電轉(zhuǎn)感受態(tài)MXE001、2.5ul連接(100pg DNA)加入0.2cm電穿孔小杯中，使用BioRadGenepulser Xcell用下述條件2500V、25 μ F和200 Ω執(zhí)行電轉(zhuǎn)化。在電轉(zhuǎn)化后，加入ImlSOC (Invitrogen)(預(yù)溫至37°C )，并且將細胞伴隨輕輕攪動在37°C靜置I小時以回收。將細胞鋪平板到低滲瓊脂(5g/L酵母提取物、2.5g/L胰蛋白胨、15g/L瓊脂(都是Difco))上，并且在40°C溫育。將形成菌落的細胞在43°C再鋪平板到HLB上，以證實在低滲透條件下在高溫生長至MXEOOl菌株的能力的恢復(fù)。質(zhì)粒DNA由所選克隆制備且測序以鑒定spr突變。使用這種方法，分離在spr蛋白質(zhì)中的五個單一突變和一個雙重突變，其補充如下Δ Tsp表型:1.V98E2.D133A3.V135D4.V135G5.G147C6.S95F 和 Y115Fspr (C94A、H145A、H157A)和W174R在上文鑒定的個別突變和三個催化三聯(lián)突變用于生成新菌株，使用野生型W3110大腸桿菌菌株(基因型:F-LAM-1N (rrnD-rrnE) Irphl(ATCC編號27325))，以產(chǎn)生來自實施例1的spr突變株或MXE001菌株，以制備組合的Δ Tsp/突變型spr菌株。使用基因替換載體系統(tǒng)生成下述突變型大腸桿菌細胞株，使用pK03同源重組/替換質(zhì)粒(Link 等人，1997, Journal of Bacteriology, 179,6228-6237),如實施例1 對于MXE001生成所述的。表I
權(quán)利要求
1.一種用于從革蘭氏陰性菌宿主細胞樣品或其提取物純化重組蛋白質(zhì)的方法，其中所述宿主細胞表達重組蛋白質(zhì)和重組二硫化物異構(gòu)酶DsbC ;其中所述方法包括: a.將宿主細胞樣品或其提取物的pH調(diào)節(jié)至pH5或更低，以沉淀重組二硫化物異構(gòu)酶；和 b.分離沉淀的重組二硫化物異構(gòu)酶與重組蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細胞樣品或其提取物的PH調(diào)節(jié)至pH4.5或更低。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述宿主細胞樣品或其提取物的pH調(diào)節(jié)至pH4.5-3.00
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述宿主細胞樣品或其提取物的pH調(diào)節(jié)至ρΗ3或更低。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中在步驟a)中，使宿主細胞二肽結(jié)合蛋白進一步沉淀，并且在步驟b)中，使宿主細胞二肽結(jié)合蛋白進一步與所述重組蛋白質(zhì)分離。
6.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述二硫化物異構(gòu)酶包含組氨酸標(biāo)簽。
7.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述革蘭氏陰性菌宿主細胞是大腸桿菌。
8.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述宿主細胞包含F(xiàn)kpa和/或Skp。
9.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中在步驟a)中，所述宿主細胞樣品或其提取物的pH使用冰乙酸調(diào)節(jié)至低于5的pH。
10.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述宿主細胞樣品或其提取物保持在pH5或更低一小時或更短。
11.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中在步驟b)中的分離包括離心和/或過濾。
12.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中在步驟b)后，該方法包括對所述重組蛋白質(zhì)樣品實施色譜法的進一步純化步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述色譜法是離子交換色譜法。
14.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中在步驟b)后，將所述重組蛋白質(zhì)樣品的pH調(diào)節(jié)至PH5-7。
15.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中在步驟a)前，將提取緩沖液加入所述宿主細胞樣品或其提取物，并且對所述宿主細胞樣品或其提取物實施熱處理步驟。
16.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述重組蛋白質(zhì)具有PI6-9。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述重組蛋白質(zhì)具有PI8-9。
18.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述重組蛋白質(zhì)是重組抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述重組抗體是單克隆、人源化或嵌合抗體或者其片段，例如其結(jié)合片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或權(quán)利要求19的方法，其中所述重組抗體是Fab或Fab’片段。
21.根據(jù)權(quán)利要求18 - 20中任一項的方法，其中所述重組抗體是對于人TNFa特異性的。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述抗體重鏈，其中所述可變結(jié)構(gòu)域包含對于⑶RHl具有SEQ ID NO:1所示的序列、對于CDRH2具有SEQ ID NO: 2所示的序列和對于CDRH3具有SEQ ID NO: 3所示的序列的⑶R，和輕鏈，其中所述可變結(jié)構(gòu)域包含具有對于⑶RLl具有SEQID NO:4所示的序列、對于CDRL2具有SEQ ID NO: 5的序列和對于CDRL3的SEQ ID N0:6的序列的⑶R。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述抗體包含在SEQID NO:7所示的輕鏈可變區(qū)序列和在SEQ ID N0:8所示的重鏈可變區(qū)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述抗體是Fab片段，并且包含具有SEQID NO: 10所示的序列的重鏈和具有在SEQ ID NO:9所示的序列的輕鏈。
25.將用編碼重組蛋白質(zhì)的表達載體轉(zhuǎn)化的革蘭氏陰性菌宿主細胞樣品或其提取物的PH調(diào)節(jié)至pH5或更低的步驟的用途，以沉淀宿主細胞重組二硫化物異構(gòu)酶，使所述沉淀的宿主細胞重組二硫化物異構(gòu)酶與所述重組蛋白質(zhì)分離，且產(chǎn)生純化的重組蛋白質(zhì)樣品。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于從革蘭氏陰性菌宿主細胞樣品或其提取物純化重組蛋白質(zhì)的方法，其中所述宿主細胞表達重組蛋白質(zhì)和重組二硫化物異構(gòu)酶DsbC；所述方法包括a.將宿主細胞樣品或其提取物的pH調(diào)節(jié)至pH5或更低，以沉淀重組二硫化物異構(gòu)酶；和b.分離沉淀的重組二硫化物異構(gòu)酶與Dsbc重組蛋白質(zhì)，以產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)樣品。
文檔編號C07K16/24GK103189385SQ201180036417
公開日2013年7月3日 申請日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者G·B·威爾德 申請人:Ucb醫(yī)藥有限公司