專利名稱：卷曲蛋白結(jié)合藥劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域主要涉及與人類卷曲受體(frizzled receptors)結(jié)合的多肽及其他藥劑，還涉及使用所述多肽或其他藥劑來(lái)治療諸如癌癥等疾病的方法。
背景技術(shù)：
在發(fā)達(dá)國(guó)家中癌癥是引起死亡的主要原因之一，僅在美國(guó)每年就有超過(guò)一百萬(wàn)人被診斷患有癌癥并有500，000人死亡。據(jù)估算，總體上每3個(gè)人中有超過(guò)I個(gè)人在其一生中將發(fā)展某種形式的癌癥。有200種或多種不同類型的癌癥，其中4種——乳腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌和前列腺癌——占所有新病例的一半以上(Jemal等，2003，CancerJ. Clin. 53:5-26)。已經(jīng)將Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑鑒定為癌癥療法的潛在靶點(diǎn)。Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑是胚胎模式形成、胚后組織維持和干細(xì)胞生物學(xué)的若干關(guān)鍵調(diào)控途徑之一。更具體而言，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在細(xì)胞極性產(chǎn)生和包括干細(xì)胞群的自我更新在內(nèi)的細(xì)胞命運(yùn)特化中起重要作用。Wnt途徑的非調(diào)控活化與多種人類癌癥有關(guān)，其中該活化能夠改變腫瘤細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn)，從將腫瘤細(xì)胞保持在未分化且增殖的狀態(tài)。因此癌的發(fā)生能夠通過(guò)篡奪體內(nèi)平衡機(jī)制來(lái)進(jìn)行，所述體內(nèi)平衡機(jī)制控制通過(guò)干細(xì)胞而進(jìn)行的正常發(fā)育和組織修復(fù)(綜述見(jiàn)于Reya和Clevers, 2005, Nature 434:843 ;Beachy 等，2004，Nature432:324)。在果蠅發(fā)育無(wú)翅(Wg)突變體中首次闡明了 fct信號(hào)傳導(dǎo)途徑，該途徑來(lái)自鼠原癌基因 int-Ι (現(xiàn)名為 Wntl) (Nusse 和 Varmus, 1982，Cell 31:99-109 ；Van Ooyen和 Nusse, 1984, Cell 39:233-40 ；Cabrera 等，1987，Cell 50:659-63 ；Rijsewijk 等，1987，(^1150:649-57)。1社基因編碼分泌型脂質(zhì)修飾糖蛋白，其中19種已在哺乳動(dòng)物中鑒定出。這些分泌型配體激活由卷曲(Frizzled，F(xiàn)zd)受體家族成員和低密度脂蛋白(LDL)受體相關(guān)蛋白5或6(LPR5/6)組成的受體復(fù)合體。Fzd受體是屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族的具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白，其包含具有10個(gè)保守半胱氨酸的大型細(xì)胞外N端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)或Fri結(jié)構(gòu)域。人類FZD受體有10種FZD1MFZDlO0對(duì)于特定的Wnt，不同的Fzd CRD具有不同的親和力(Wu和Nusse, 2002，J. Biol.Chem. 277:41762-9)，而且已將Fzd受體劃分為活化下文所描述的經(jīng)典β -catenin途徑的Fzd受體和活化非經(jīng)典途徑的Fzd受體(MiIIer等，1999，Oncogene 18:7860-72)。為了形成可結(jié)合FZD配體的受體復(fù)合體，F(xiàn)ZD受體與LRP5/6相互作用，LRP5/6是具有由6個(gè)YWTD氨基酸重復(fù)序列分隔的四個(gè)細(xì)胞外EGF樣結(jié)構(gòu)域的單次穿膜蛋白(Johnson等,2004，J. BoneMineral Res. 19:1749)。經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑在結(jié)合受體時(shí)被激活，并且由直接與Fzd受體相互作用的散亂蛋白(Dishevelled, Dsh, 一種細(xì)胞質(zhì)蛋白)介導(dǎo)，導(dǎo)致β -catenin在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定和積累。在無(wú)Wnt信號(hào)的情況下，β-catenin定位于細(xì)胞質(zhì)中的降解復(fù)合體(destructioncomplex),該降解復(fù)合體包括腫瘤抑制蛋白結(jié)腸腺瘤息肉蛋白(APC)和軸蛋白(Axin)。這些蛋白發(fā)揮下述功能作為關(guān)鍵骨架使糖原合成酶激酶(GSK)-3i3結(jié)合并磷酸化β -catenin，從而將其標(biāo)記以便通過(guò)泛素/蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。Dsh的活化導(dǎo)致GSK3 0的磷酸化和降解復(fù)合體的解離。積累的細(xì)胞質(zhì)β-catenin隨后輸送至細(xì)胞核，在細(xì)胞核中β -catenin與Tcf/Lef家族的DNA結(jié)合蛋白相互作用，從而激活轉(zhuǎn)錄。除經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)途徑外，Wnt配體還激活β-catenin非依賴型途徑(Veeman等，
2003,Dev. Cell 5:367-77) 0已表明非經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)參與多種過(guò)程，但其中最有說(shuō)服力的是通過(guò)與果蠅平面細(xì)胞極性(PCP)途徑相似的機(jī)制來(lái)參與原腸胚形成活動(dòng)。非經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的其他潛在機(jī)制包括鈣流動(dòng)、JNK和小G蛋白及異源三聚體G蛋白。在經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑之間經(jīng)常觀察到拮抗作用，一些證據(jù)表明非經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)能夠抑制癌的形成(Olson和 Gibo, 1998, Exp. Cell Res. 241:134 ;Topol 等，2003，J. CellBiol. 162:899-908)。因此，在某些背景下，F(xiàn)zd受體可作為經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)因子。舉例而言，F(xiàn)ZD6 在與FZDl共表達(dá)時(shí)通過(guò)TAKl-NLK途徑抑制Wnt-3a所引起的經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)(Golan等，
2004,JBC 279:14879-88)。類似地，F(xiàn)zd2 在 Wnt_5a 存在的情況下通過(guò) TAKl-NLK MAPK 級(jí)聯(lián)對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)起到拮抗作用(Ishitani等，2003，Mol. Cell. Biol. 23:131-9)。經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑還在小腸和結(jié)腸干細(xì)胞群的維持中起核心作用，該途徑的不當(dāng)激活在結(jié)腸直腸癌中起主導(dǎo)作用(Reya和Clevers, 2005，Nature 434:843)。腸吸收上皮的構(gòu)造為絨毛和隱窩。干細(xì)胞居于隱窩中并緩慢分裂產(chǎn)生快速增殖的細(xì)胞，后者產(chǎn)生上行離開隱窩并占據(jù)腸絨毛的所有分化細(xì)胞群。fct信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)在控制沿隱窩-絨毛軸的細(xì)胞命運(yùn)中起主導(dǎo)作用，并且對(duì)維持干細(xì)胞群而言必不可少。同源重組所造成的Tcf7/2遺傳丟失(Korinek等，1998，Nat. Genet. 19:379)或強(qiáng)分泌型Wnt抗結(jié)劑 Dickkopf-I(Dkkl)(Pinto 等，2003，Genes Dev. 17:1709-13 ；Kuhnert 等，2004，Proc.Nat’ I. Acad. Sci. 101:266-71)的過(guò)表達(dá)會(huì)破壞Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，從而致使腸干細(xì)胞群耗盡。結(jié)腸直腸癌最常見(jiàn)是由Wnt信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)中的激活性突變引發(fā)的。在全部結(jié)腸直腸癌中大約5%至10%是遺傳性的，其中一種主要形式是家族性腺瘤息肉病(FAP)，該病是一種常染色體顯性疾病，其中約80%的患病個(gè)體具有結(jié)腸腺瘤息肉病(APC)基因的種系突變。在包括Axin和β-catenin在內(nèi)的其他Wnt途徑組分中也已經(jīng)鑒定出了突變。個(gè)別腺瘤是含有第二失活等位基因的上皮細(xì)胞的無(wú)性系長(zhǎng)出物，而大量的FAP腺瘤通過(guò)在致癌基因和/或腫瘤抑制基因增加突變而不可避免地導(dǎo)致腺癌的發(fā)展。此外，fct信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活，包括APC和β -catenin的功能獲得性突變，能夠在小鼠模型中引發(fā)增生性發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)(Oshima 等，1997，Cancer Res. 57:1644-9 ；Harada 等，1999，EMBO J. 18:5931-42)。隨著在通過(guò)鼠病毒的近位插入而轉(zhuǎn)化的乳腺腫瘤中將Wntl (原inti)鑒定為癌基因，首次揭示了 fct信號(hào)傳導(dǎo)在癌癥中的作用(Nusse和Varmus, 1982，Cell31:99-109)。之后已積累了 fct信號(hào)傳導(dǎo)在乳腺癌中作用的其他證據(jù)。舉例而言，乳腺中β-catenin的轉(zhuǎn)基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致增生和腺癌(Imbert等，2001，J. Cell Biol. 153:555-68 ；Michaelson和Leder, 2001, Oncogene 20:5093-9),而Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的丟失則破壞正常的乳腺發(fā)育(Tepera 等，2003，J. Cell Sci. 116:1137-49 ;Hatsell 等，2003，J. Mammary Gland Biol.Neoplasia 8:145-58)。最近已顯示W(wǎng)nt信號(hào)傳導(dǎo)可激活乳腺干細(xì)胞(Liu等,2004，Proc.Nat’ I Acad. Sci. 101:4158)。在人類乳腺癌中，β-catenin的積累在超過(guò)50%的癌中意味著激活的fct信號(hào)傳導(dǎo)，雖然未鑒定出特異性突變，但是已觀察到了卷曲受體表達(dá)的上調(diào)(Brennan 和 Brown, 2004，J. Mammary Gland Neoplasia9:119-31 ；Malovanovic 等，
2004,Int. J. Oncol. 25:1337—42)。FZD10、FZD8、FZD7、FZD4和FZD5是10種已鑒定的人類Wnt受體中的5種。在肺中FzdlO與Wnt7b共表達(dá)，而且細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究已表明FzdlO/LRP5共受體在響應(yīng)于Wnt7b 時(shí)激活經(jīng)典 Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)途徑(Wang 等，2005，Mol. Cell Biol. 25:5022-30)。在包括子宮頸、胃和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系在內(nèi)的多種癌細(xì)胞系中，以及在包括約40%的原發(fā)性胃癌、結(jié)腸癌和滑膜肉瘤在內(nèi)的原發(fā)性癌中，F(xiàn)ZD10 mRNA發(fā)生上調(diào)(Saitoh等，2002, Int. J. Oncol. 20:117-20 ；Terasaki 等，2002, Int. J. Mol. Med. 9:107-12 ；Nagayama等，2005，Oncogene 1-12)。在若干人類癌細(xì)胞系、原發(fā)性胃癌和腎癌中FZD8發(fā)生上調(diào)(Saitoh 等，2001，Int. J. Oncol. 18:991-96 ；Kirikoshi 等，2001，Int. J. Oncol. 19:111-5 ；Janssens等，2004，Tumor Biol. 25:161-71)。FZD7的表達(dá)遍及胃腸道，并且在6例人類原 發(fā)性胃癌中的一例中發(fā)生上調(diào)(Kirikoshi等，2001，Int. J. Oncol. 19:111-5)。結(jié)腸癌細(xì)胞系中FZD7胞外域的表達(dá)引起形態(tài)學(xué)變化，并且在異種移植模型中使腫瘤生長(zhǎng)下降(Vincan等，2005，Differentiation 73:142-53)。在卵黃囊和胎盤血管發(fā)生中FZD5發(fā)揮必不可少的作用(Ishikawa等,2001，Dev. 128:25-33)，并且在與Wnt/ β -catenin信號(hào)傳導(dǎo)的活化有關(guān)的腎癌中發(fā)生上調(diào)(Janssens等，2004，TumorBiology 25:161-71)。FZD4在腸隱窩上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，并且是在正常組織中相對(duì)于瘤組織顯示差異表達(dá)的若干因子中的一種(Gregorieff 等，2005, Gastroenterologyl29:626-38)。因此，將 FZD 受體鑒定為癌干細(xì)胞(cancer stem cell)的標(biāo)記物,使得這些蛋白成為癌癥療法的理想祀點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供與一種或多種人類卷曲受體(FZD)結(jié)合的新型藥劑，所述藥劑包括但不限于與兩種或多于兩種人類卷曲受體結(jié)合的抗體或其他藥劑，以及這些藥劑的使用方法。本發(fā)明還提供新型多肽，例如與一種或多種卷曲受體結(jié)合的抗體、此類抗體的片段和與此類抗體有關(guān)的其他多肽。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑、抗體、其他多肽或與FZD結(jié)合的藥劑，與在本文中稱為生物學(xué)結(jié)合部位(BBS)的FZD區(qū)域結(jié)合，本發(fā)明人現(xiàn)已將所述區(qū)域首次鑒定為用于抑制fct信號(hào)傳導(dǎo)和/或腫瘤生長(zhǎng)的靶點(diǎn)。還提供了具有與多于一種FZD結(jié)合的抗原結(jié)合部位的抗體和其他多肽。還提供了包含編碼所述多肽的核酸序列的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的載體。另外提供了含有本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸的細(xì)胞。還提供了包含所述新型FZD結(jié)合藥劑或抗體的組合物(例如,藥物組合物)。此外還提供制造和使用所述新型FZD結(jié)合藥劑或抗體的方法，例如使用所述新型FZD結(jié)合藥劑或抗體來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或治療癌癥的方法。因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供與人類卷曲受體特異性結(jié)合的藥劑。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑抑制配體(例如fct)與人類卷曲受體生物學(xué)結(jié)合部位(BBS)的結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑與人類卷曲受體內(nèi)生物學(xué)結(jié)合部位(BBS)的至少一部分結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑與BBS的結(jié)合導(dǎo)致了對(duì)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和/或腫瘤生長(zhǎng)的抑制。在某些實(shí)施方式中，人類卷曲受體是FZD8，并且所述藥劑與下述(a)、(b)和/或(c)的至少一部分結(jié)合(a)由氨基酸72 (F)、74至75 (PL)、78⑴、92⑴、121至122 (LM)和129至132(WPDR(SEQ ID NO:70))構(gòu)成的 FZD8 的構(gòu)象表位；(b)由序列 QDEAGLEVHQFWPL(SEQ IDNO:67)組成的FZD8的區(qū)域；(c)由序列QYGFA(SEQ ID NO:66)組成的FZD8的區(qū)域。在某些實(shí)施方式中，由所述藥劑結(jié)合的人類卷曲受體選自由FZDl、FZD2、FZD5、FZD7或FZD8組成的組，并且所述藥劑與所述人類卷曲受體中的序列Q(DE/ED)AGLEVHQF(Y/W)PL(SEQ IDNO:24)的至少一部分結(jié)合。舉例而言，在某些實(shí)施方式中，人類卷曲受體是FZD8，并且所述藥劑與FZD8中的序列QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO: 67)的至少一部分結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑與序列GLEVHQ(SEQ ID NO:25)的至少一部分結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，人類卷曲受體是FZDI、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9或FZDIO，并且所述藥劑與對(duì)應(yīng)于由QDEAGLEVHQFWPL (SEQ ID NO: 67)組成的FZD8的區(qū)域的人類卷曲受體的區(qū)域的至少一部分結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑與？2014202、？205、？207和/或？2058中的序列(K/Q) (F/Y)GF(Q/A) (SEQ IDNO:69)的至少一部分結(jié)合。舉例而言，在某些實(shí)施方式中，人類卷曲受體是FZD8，并且所述藥劑與FZD8中的序列QYGFA(SEQ ID NO:66)的至少一部分結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，人類卷曲受體是FZDI、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD9或FZD10，并且所述藥劑與對(duì)應(yīng)于由QYGFA(SEQ ID NO:66)組成的FZD8區(qū)域的人類卷曲受 體區(qū)域的至少一部分結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑特異性地結(jié)合兩種或更多種、三種或更多種或四種或更多種人類卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑特異性地結(jié)合包括FZD5和FZD8在內(nèi)的人類卷曲受體。在某些替代性實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合藥劑是與人FZD受體(如，F(xiàn)ZD8)在其生物學(xué)結(jié)合部位(BBS)的裂縫(cleft)中結(jié)合的藥劑。作為非限制性的實(shí)例而言，所述藥劑可以與表16中列出的一個(gè)或多個(gè)裂縫(cleft)殘基結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑結(jié)合FZD8的L75。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑包含多肽，所述多肽包含與選自由SEQ IDN0:98至SEQ ID NO: 111和SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 116組成的組的序列具有至少約80%的序列同一性的序列。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑包含SEQID NO: 112。在一些實(shí)施方式中，所述藥劑可以包含SEQ ID NO: 108。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供與抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人類卷曲受體的特異性結(jié)合的藥劑(例如，在體外競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中)，其中所述抗體具有包含SEQ ID N0:10的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID N0:12或SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，所述抗體具有包含SEQ ID NO: 10的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑競(jìng)爭(zhēng)對(duì)兩種或更多種、三種或更多種或四種或更多種人類卷曲受體的特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑競(jìng)爭(zhēng)與？201、？2024205、？207或？208的特異性結(jié)合。在再一個(gè)方面中，本發(fā)明提供與抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)FZD5和/或FZD8的特異性結(jié)合的藥齊U，其中所述抗體具有包含SEQ ID NO:85的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO:86的輕鏈可變區(qū)。在另外一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了 FZD結(jié)合藥劑，該藥劑(a)與多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FZD8的BBS ;和/或(b)能夠?qū)⒍嚯膹腇ZD8上置換下來(lái)，所述多肽與FZD8的BBS結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述多肽包含與選自由SEQ ID N0:98至SEQ ID NO: 111和SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 116組成的組的序列具有至少80%的同一性的序列。在某些替代性實(shí)施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO: 112.的序列。
在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供與兩種或更多種人類卷曲受體特異性地結(jié)合的藥齊U。在某些實(shí)施方式中，所述兩種或更多種卷曲受體包括(a)FZDl和選自由FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組的第二卷曲受體；(b)FZD2和選自由FZD5、FZD7和FZD8組成的組的第二卷曲受體；(c)FZD5和FZD7 ;或(d)FZD7和FZD8。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑特異性地結(jié)合三種或更多種(即3、4或5種)人類卷曲受體，其中所述三種或更多種人類卷曲受體包括FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些實(shí)施方式中，所述三種或更多種人類受體包括FZD5和FZD8。在某些實(shí)施方式中，所述三種或更多種人類卷曲受體還包括FZD3、FZD4、FZD6、FZD9 和 / 或 FZDlO。在另外一個(gè)方面中，本發(fā)明提供與人類卷曲受體特異性結(jié)合的多肽，其中所述多肽具有包含下述(a)、(b)和/或(c)的重鏈可變區(qū)(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: I)或其具有1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體的重鏈⑶Rl ； (b)包含VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQID NO: 2)或其具有1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體的重鏈⑶R2 ； (c)包含NFIKYVFAN(SEQID NO:3)或其具有1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體的重鏈⑶R3。在某些實(shí)施方式中，所述 多肽特異性地結(jié)合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些實(shí)施方式中，所述多肽特異性地結(jié)合包括FZD5和FZD8在內(nèi)的兩種或更多種人類卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供與人類卷曲受體特異性結(jié)合的多肽，其中所述多肽具有包含下述(a)、(b)和/或(c)的輕鏈可變區(qū)(a)輕鏈CDR1，所述輕鏈CDRl包含 S⑶KLGKKYAS (SEQ ID N0:4)或 SGDNIGSFYVH(SEQ ID 勵(lì):7)，或者具有1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 7的變體；(b)輕鏈CDR2，所述輕鏈CDR2包含EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5)或 DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8)，或者具有 I、2、3 或 4 個(gè)氨基酸取代的SEQ ID NO: 5 或SEQ ID NO:8 的變體；(c)輕鏈CDR3，所述輕鏈CDR3包含 SSFAGNSLE(SEQ IDN0:6)或QSYANTLSL(SEQ ID NO: 9)，或者具有I、2、3或4個(gè)氨基酸取代的SEQ ID NO: 6或SEQ ID N0:9的變體。在某些實(shí)施方式中，所述多肽特異性地結(jié)合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些實(shí)施方式中，所述多肽特異性地結(jié)合包括FZD5和FZD8在內(nèi)的兩種或更多種人類卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述氨基酸取代是保守性取代。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供具有下述(a)和/或(b)的多肽(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: I)的重鏈 CDR1、包含 VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQ ID NO: 2)的重鏈CDR2 和包含 NFIKYVFAN(SEQ ID NO: 3)的重鏈 CDR3 ; (b)包含 S⑶KLGKKYAS (SEQ ID NO:4)或 S⑶NIGSFYVH(SEQ ID NO: 7)的輕鏈CDRl、包含EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5)或DKSNRPSG (SEQID NO: 8)的輕鏈 CDR2 和包含 SSFAGNSLE(SEQID NO: 6)或 QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9)的輕鏈CDR3。在某些實(shí)施方式中，所述多肽特異性地結(jié)合人類卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述多肽特異性地結(jié)合兩種或更多種(例如至少FZD5和FZD8)、三種或更多種或四種或更多種人類卷曲受體。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供與人類卷曲受體特異性地結(jié)合的抗體，其中所述人類卷曲受體選自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組，其中所述抗體具有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)含有(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: I)或其具有1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體的重鏈CDRl ;包含VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQID NO: 2)或其具有1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體的重鏈⑶R2 ;和包含NFIKYVFAN(SEQ ID NO: 3)或其具有1、2、3或4個(gè)氨基酸取代的變體的重鏈⑶R3 ;和/或(b)輕鏈⑶Rl，所述輕鏈⑶Rl包含S⑶KLGKKYAS (SEQID N0:4)、S⑶NIGSFYVH(SEQ ID NO: 7)，或者具有1、2、3或4個(gè)保守性氨基酸取代的SEQID NO:4 或 SEQID NO: 7 的變體；輕鏈 CDR2，所述輕鏈 CDR2 包含 EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5)、DKSNRPSG (SEQ ID N0:8)，或者具有1、2、3或4個(gè)保守性氨基酸取代的SEQ ID N0:5或SEQID NO: 8 的變體；輕鏈 CDR3，所述輕鏈 CDR3 包含 SSFAGNSLE (SEQ IDNO: 6)、QSYANTLSL (SEQID NO: 9)，或者具有I、2、3或4個(gè)保守性氨基酸取代的SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 9的變體。在某些實(shí)施方式中，所述抗體具有(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: I)的重鏈CDR1、包含 VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQ IDNO:2)的重鏈 CDR2 和包含 NFIKYVFAN(SEQ ID NO:3)的重鏈 CDR3 ;和/或(b)包含 SGDKLGKKYAS (SEQ ID NO:4)或 SGDNIGSFYVH(SEQ ID NO: 7)的輕鏈 CDRl、包含 EKDNRPSG (SEQ ID NO: 5)或 DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8)的輕鏈 CDR2 和包含SSFAGNSLE (SEQ ID NO: 6)或 QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9)的輕鏈 CDR3。在某些實(shí)施方式中，所述抗體具有(a)包含GFTFSHYTLS (SEQ ID NO: I)的重鏈CDR1、包含VIS⑶GSYTYYADSVKG(SEQID NO: 2)的重鏈 CDR2 和包含 NFIKYVFAN (SEQ IDNO: 3)的重鏈 CDR3 ;和 / 或(b)包含S⑶NIGSFYVH(SEQ ID NO: 7)的輕鏈 CDRl、包含 DKSNRPSG (SEQ ID NO: 8)的輕鏈 CDR2 和包含 QSYANTLSL (SEQ ID NO: 9)的輕鏈 CDR3。 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供包含下述(a)和/或(b)的多肽(a)與SEQ IDNO: 10的序列同一性至少為約80%的多肽；(b)與SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14的序列同一性至少為約80%的多肽。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含下述(a)和/或(b)的多肽(a)與SEQ ID NO: 10的序列同一性至少為約80%的多肽；(b)與SEQ ID NO: 14的序列同一性至少為約80%的多肽。在某些實(shí)施方式中，所述多肽特異性地結(jié)合人類卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述多肽特異性地結(jié)合兩種或更多種、三種或更多種或四種或更多種人類卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，人類卷曲受體選自由FZDI、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供例如與人類FZD5和/或FZD8特異性地結(jié)合的抗體等藥劑，其中所述抗體具有(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO:77)或其具有1、2、3或4個(gè)保守性氨基酸取代的變體的重鏈CDRl ;包含TISYSSSNTYYADSVKG(SEQID NO:78)或其具有1、2、3或4個(gè)保守性氨基酸取代的變體的重鏈⑶R2 ;和包含SIVFDY (SEQ IDNO:79)或其具有1、2、3或4個(gè)保守性氨基酸取代的變體的重鏈CDR3 ;和/或(b)包含SGDALGNRYVY(SEQ ID N0:80)或其具有1、2、3或4個(gè)保守性氨基酸取代的變體的輕鏈⑶Rl ；包含SG (SEQ ID N0:81)或其具有1、2、3或4個(gè)保守性氨基酸取代的變體的輕鏈⑶R2 ；包含GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO:82)或其具有1、2、3或4個(gè)保守性氨基酸取代的變體的輕鏈CDR3。在某些實(shí)施方式中，所述抗體具有(a)包含GFTFSSYYIT(SEQ ID NO: 77)的重鏈CDR1、包含 TISYSSSNTYYADSVKG(SEQ ID NO: 78)的重鏈 CDR2 和包含 SIVFDY(SEQ IDNO: 79)的重鏈 CDR3 ;和 / 或(b)包含 SGDALGNRYVY (SEQ ID NO: 80)的輕鏈 CDRl、包含 SG (SEQ IDNO:81)的輕鏈 CDR2 和包含 GSWDTRPYPKY(SEQ ID NO:82)的輕鏈 CDR3。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供與FZD5和/或FZD8特異性地結(jié)合的多肽，其中所述多肽包括(a)與SEQ ID NO:85的同一性至少為約80%的多肽；和/或(b)與SEQ IDNO:86的同一性至少為約80%的多肽。在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供與下述IgG抗體中的任一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人類FZDl、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8的特異性結(jié)合的藥劑，所述IgG抗體為18R8、18R5、18R4605和18R4805。在再一個(gè)方面中，本發(fā)明提供與抗FZD的IgG抗體44R24競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人類FZD5和/或FZD8的特異性結(jié)合的藥劑。在每個(gè)前述方面以及本文所述的其他方面的某些實(shí)施方式中，所述藥劑或多肽是抗體。在某些替代性實(shí)施方式中，所述藥劑不是抗體。在每個(gè)前述方面以及本文所述的其他方面的某些實(shí)施方式中，所述藥劑或多肽或抗體與其所結(jié)合的一種或多種人類卷曲受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)特異性地結(jié)合。在每個(gè)前述方面以及本文所述的其他方面的某些實(shí)施方式中，所述藥劑或多肽或抗體與其所結(jié)合的一種或多種人類卷曲受體的Fri結(jié)構(gòu)域(Fri)特異性地結(jié)合。
在每個(gè)前述方面以及本文其他部分所述的其他方面的某些實(shí)施方式中，所述抗體或其他多肽的單個(gè)抗原結(jié)合部位特異性地結(jié)合(或能夠結(jié)合)多于一種人類卷曲受體。在每個(gè)前述方面以及本文所述的其他方面的某些實(shí)施方式中，所述藥劑或多肽或抗體抑制配體與人類卷曲受體的結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述配體是fct，包括但不限于Wnt3a0在每個(gè)前述方面以及本文所述的其他方面的某些實(shí)施方式中，與FZD結(jié)合的藥劑或多肽或抗體是該FZD的拮抗劑。在每個(gè)前述方面以及本文所述的其他方面的某些實(shí)施方式中，所述藥劑或多肽或抗體抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方式中，受到抑制的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑所抑制的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是非經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在某些實(shí)施方式中，fct信號(hào)傳導(dǎo)是非經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。在每個(gè)前述方面以及本文所述的其他方面的某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑或多肽或抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)。本發(fā)明還提供抗體18R8、18R5、18R4605、44R24和18R4805及其片段。本發(fā)明還提供包含F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑、多肽或抗體的組合物(例如，藥物組合物)。本發(fā)明提供在受試者中抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)(例如經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo))和/或抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括施用治療有效量的FZD結(jié)合藥劑或多肽或抗體。還提供了降低腫瘤的致瘤性的方法，所述腫瘤含有癌干細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括對(duì)具有腫瘤的受試者施用治療有效量的FZD結(jié)合藥劑或多肽或抗體。在某些實(shí)施方式中，通過(guò)施用所述抗體減少了腫瘤中癌干細(xì)胞的頻率。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑的施用使得腫瘤中的致瘤性細(xì)胞分化為非致瘤狀態(tài)。還提供了誘導(dǎo)受試者腫瘤中的細(xì)胞進(jìn)行分化的方法，所述方法包括對(duì)所述受試者施用治療有效量的FZD結(jié)合藥劑、多肽或抗體。另外提供了治療受試者的癌癥的方法，所述方法包括對(duì)所述受試者施用治療有效量的FZD結(jié)合藥劑、多肽或抗體。此外，還提供了降低實(shí)體瘤基質(zhì)中的成肌纖維細(xì)胞活化的方法，所述方法包括使所述基質(zhì)接觸治療有效量的FZD結(jié)合藥劑、多肽或抗體。在其他方面中，提供了治療與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)活化有關(guān)的疾病的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括對(duì)有需要的受試者施用有效量的FZD結(jié)合藥劑、多肽或抗體。在某些實(shí)施方式中，所述疾病是癌癥。在某些實(shí)施方式中，所述疾病是多囊腎病。在某些實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合藥劑是與一種或多種人類FZD受體的BBS結(jié)合的多肽。在某些實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合多肽包含與選自由SEQ ID N0:98至SEQID N0:111和SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 116組成的組的序列具有至少80%同一性的序列。在一些實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合多肽包含SEQ ID NO: 112的序列。在某些替代性實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合多肽是18R5。在某些實(shí)施方式中，包括施用FZD結(jié)合藥劑、多肽或抗體的方法還包括對(duì)受試者施用第二抗癌藥劑(例如化療劑)。在某些實(shí)施方式中，所述第二藥劑是吉西他濱(gemcitabine)、依立替康(irinotecan)或紫杉醇。在某些實(shí)施方式中，所述第二藥劑是血管發(fā)生抑制劑和/或Notch信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供包含選自由SEQ ID NO: 10至15組成的組的序列的多肽。同樣提供了包含選自由SEQ ID N0:85至86組成的組的序列的多肽。還提供了包含編碼所述多肽的核酸序列的多核苷酸。
在又一個(gè)方面中，本發(fā)明提供包含選自由SEQ ID NO: 17至12組成的組的序列的多核苷酸。另外提供了包含選自由SEQ ID N0:87至90、92和94至95組成的組的序列的
多核苷酸。在再一個(gè)方面中，本發(fā)明提供多核苷酸，所述多核苷酸包含在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與選自由SEQ ID勵(lì)17、19、21、87至90、92和94至95組成的組的多核苷酸雜交或者與編碼選自由SEQ ID NO: 10、12、14和85至86組成的組的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括在高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與由SEQ ID N0:17、19或21組成的多核苷酸雜交或者與編碼SEQ ID NO: 10、12或14的多核苷酸雜交的多核苷酸。在每個(gè)前述方面以及本文所述的其他方面的某些實(shí)施方式中，對(duì)所述藥劑或多肽或抗體或多核苷酸進(jìn)行了分離。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑或多肽或抗體或多核苷酸基本純凈。本發(fā)明還提供Wnt基因標(biāo)簽(gene signature),可用于鑒定可能會(huì)對(duì)用FZD結(jié)合藥劑(例如，人類卷曲受體的拮抗劑和/或fct信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑)或Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的其他抑制劑進(jìn)行的治療產(chǎn)生應(yīng)答的腫瘤和/或患者。還提供了使用fct基因標(biāo)簽來(lái)選擇可用FZD結(jié)合藥劑或fct信號(hào)傳導(dǎo)的其他抑制劑治療的患者的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法涉及對(duì)fct基因標(biāo)簽中的一種或多種基因的水平進(jìn)行評(píng)估。還提供了篩選可對(duì)抗利用fct基因標(biāo)簽所鑒定的腫瘤的候選藥物的方法。還提供了在所述方法中有用的陣列、試劑盒和其他組合物。本發(fā)明還提供篩選Wnt信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑、潛在候選藥物或其他藥劑的方法。這些方法包括但不限于包括對(duì)第一實(shí)體瘤中的一種或多種分化標(biāo)記物的水平和第二實(shí)體瘤中的一種或多種分化標(biāo)記物的水平進(jìn)行比較的方法，所述第一實(shí)體瘤已暴露于所述藥劑，而第二實(shí)體瘤未暴露于所述藥劑。在某些實(shí)施方式中，這些方法包括(a)使第一實(shí)體瘤暴露于所述藥劑，而第二實(shí)體瘤不暴露于所述藥劑；(b)對(duì)第一實(shí)體瘤和第二實(shí)體瘤中的一種或多種分化標(biāo)記物的水平進(jìn)行評(píng)估；和(C)對(duì)第一實(shí)體瘤和第二實(shí)體瘤中的一種或多種分化標(biāo)記物的水平進(jìn)行比較。在某些替代性實(shí)施方式中，所述方法涉及FZD受體或包含BBS中的一個(gè)或多個(gè)取代的FZD受體的衍生物，或者已被鑒定為與BBS的一部分結(jié)合的多肽或藥劑的應(yīng)用。正如提供了將這些藥劑用于抑制fct信號(hào)傳導(dǎo)和/或治療的方法，同樣也提供了使用篩選方法鑒定的藥劑，或者具有使用所述篩選方法鑒定的藥劑的特性的藥劑。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了篩選具有作為Wnt信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的活性或可能的活性的測(cè)試化合物的方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括將(a)測(cè)試化合物對(duì)于第一多肽的結(jié)合親和力與(b)該化合物對(duì)于第二多肽的結(jié)合親和力進(jìn)行比較，所述第一多肽包含在其BBS中具有一個(gè)或多個(gè)取代的人類FZD受體(例如，F(xiàn)ZD8)的Fri結(jié)構(gòu)域，所述第二多肽包含野生型Fri結(jié)構(gòu)域。如果該測(cè)試化合物對(duì)于所述第二多肽具有比對(duì)于所述第一多肽更高的親和力，則該化合物被鑒定為fct信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑或fct信號(hào)傳導(dǎo)的可能抑制劑。在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括先確定該測(cè)試化合物對(duì)于所述第一和第二多肽的結(jié)合親和力的另外的步驟。還提供了包括突變體Fri結(jié)構(gòu)域的可用于所述法的試劑。還提供了通過(guò)這樣的方法鑒定為fct信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑(或至少為潛在Wnt抑制劑)的藥劑。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了篩選具有作為Wnt信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的活性或可能的活性的測(cè)試化合物的方法，該方法包括確定所述測(cè)試化合物是否能夠與FZD結(jié)合藥劑 (該藥劑與BBS結(jié)合)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人類FZD受體的結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，該化合物與所述多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的能力表明了該化合物具有作為fct信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的活性或可能的活性。在再一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了篩選具有作為Wnt信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的活性或可能的活性的測(cè)試化合物的替代性方法。在某些實(shí)施方式中，所述方法包括確定該測(cè)試化合物是否能夠?qū)ZD結(jié)合藥劑(該藥劑與BBS結(jié)合)從與其結(jié)合的所述人類FZD受體上置換下來(lái)。如果該測(cè)試化合物能夠置換所述FZD結(jié)合藥劑，則該化合物具有作為fct信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的活性或可能的活性。還提供了在以上所指出的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合以及置換測(cè)定中有用的試劑，所述試劑包括但并不限于下述多肽該多肽包含與選自由SEQ ID N0:98至SEQ IDNO: 111和SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 116組成的組的序列具有至少約80%的同一性的序列。同樣也提供了通過(guò)這種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合以及置換測(cè)試鑒定為fct信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑(或至少為潛在Wnt抑制劑)的藥劑。在本發(fā)明的方面或?qū)嵤┓绞接民R庫(kù)什組或可選要素的其他分組進(jìn)行描述時(shí)，本發(fā)明不僅涵蓋作為一個(gè)整體列出的整個(gè)組，而且還單獨(dú)涵蓋該組中的每個(gè)成員以及大組的所有可能的小組，以及缺少一個(gè)或多個(gè)組成員的大組。本發(fā)明還包括在要求保護(hù)的發(fā)明中明確排除該組中的任何一個(gè)或多個(gè)成員。


圖I :18R8結(jié)合多種人類卷曲受體。FACS分析展示了 18R8與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞上的FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8序列結(jié)合。顯示了 18R8與HEK293細(xì)胞結(jié)合的FACS繪圖，所述HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染有編碼所示FZD的表達(dá)載體和GFP表達(dá)載體。共轉(zhuǎn)染(GFP陽(yáng)性)細(xì)胞群中染色的升高表明18R8的結(jié)合。FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8的FACS繪圖用粗線加框，從而突出這些顯示與18R8結(jié)合的FZD。圖2 :抗FZD抗體18R5與細(xì)胞上的多種人類卷曲受體結(jié)合。FACS分析展示了 18R5同18R8 —樣與細(xì)胞上的FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8序列結(jié)合。將不同濃度的抗體18R8和18R5與過(guò)表達(dá)所示FZD的HEK293細(xì)胞進(jìn)行共溫育，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估了抗體的結(jié)合。雖然18R8和18R5都與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8結(jié)合，但是18R5的結(jié)合具有更高的親和力。圖3 :在穩(wěn)定表達(dá)與熒光素酶連接的8xTCF啟動(dòng)子元件的STF293細(xì)胞中進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定。用含有Wnt3A以及不同濃度的18R8和18R5的條件培養(yǎng)基處理細(xì)胞，并隨后在18小時(shí)后使用Dual-Glo熒光素酶檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)(Promega)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明18R8和18R5均抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，而且18R5的結(jié)合親和力比18R8更高。圖4 :18R8通過(guò)多個(gè)Wnt阻斷TCF信號(hào)傳導(dǎo)。在穩(wěn)定表達(dá)與熒光素酶連接的8xTCF啟動(dòng)子元件的STF293細(xì)胞中進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定。通過(guò)使用Fugene 6 (Roche)以編碼所示W(wǎng)nt蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞(ATCC)來(lái)產(chǎn)生各種過(guò)表達(dá)Wnt的細(xì)胞。用18R8處理STF293細(xì)胞并添加過(guò)表達(dá)Wnt的HEK293細(xì)胞，隨后在18小時(shí)后使用Dual-Glo熒光素酶檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。圖5 18R8直接抑制Wnt與FZD的結(jié)合。在穩(wěn)定表達(dá)8xTCF啟動(dòng)子元件的STF293細(xì)胞中進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定。在用或不用蛋白A瓊脂糖微球的情況下，將如圖所示 含有Wnt3A條件培養(yǎng)基、純化的FZD8-FC和/或18R8的混合物于4°C共溫育2小時(shí)。溫育后移除蛋白A瓊脂糖凝膠微球并將其加至STF293細(xì)胞。18小時(shí)后使用Dual-Glo熒光素酶測(cè)定報(bào)告系統(tǒng)對(duì)經(jīng)處理的STF293細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。該實(shí)驗(yàn)顯示，在無(wú)18R8的情況下Fzd8-Fc能夠抑制Wnt3A刺激信號(hào)傳導(dǎo)的能力，但是18R8能夠阻斷FZD8與Wnt3A結(jié)合的能力，當(dāng)使用瓊脂糖A微球從共溫育物中除去FZDS-Fc (和18R8)時(shí)信號(hào)傳導(dǎo)的恢復(fù)即證明了這一點(diǎn)。圖6 :對(duì)18R8與突變FZD8 (與野生型FZD8相比)的結(jié)合的FACS分析。為了評(píng)估FZD上的18R8表位，進(jìn)行了表位作圖研究。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染研究中將編碼GFP的表達(dá)載體與表達(dá)構(gòu)建體共同使用，所述表達(dá)構(gòu)建體能夠表達(dá)帶N端FLAG標(biāo)簽和C端⑶4跨膜結(jié)構(gòu)域及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的人類FZD8的Fri結(jié)構(gòu)域。還制備了該表達(dá)載體的多種變體，所述變體具有在FZD8序列內(nèi)的選定氨基酸取代，用來(lái)編碼在不與18R8結(jié)合的其他特定FZD的Fri結(jié)構(gòu)域中對(duì)應(yīng)位置的氨基酸。隨后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估18R8結(jié)合這些FZD8序列變體的能力。如共轉(zhuǎn)染(GFP陽(yáng)性)細(xì)胞群中的染色降低所示，發(fā)現(xiàn)18R8的結(jié)合需要FZD8的某些位置的氨基酸，包括FZD8的氨基酸66至71和126至127。以線框突出了顯示18R8與共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群結(jié)合的FACS繪圖區(qū)域，以粗線顯示表現(xiàn)出顯著下降的18R8結(jié)合的氨基酸取代的線框。圖7 :顯示出18R5和18R8在人類FZD8上具有相似的結(jié)合表位。使用此前顯示出可破壞18R8結(jié)合的一系列氨基酸變體，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)評(píng)估18R5與18R8結(jié)合表位的類似表位結(jié)合的能力。如共轉(zhuǎn)染(GFP陽(yáng)性)細(xì)胞群中的染色降低所示，發(fā)現(xiàn)與18R8和18R5結(jié)合均需要包括FZD8的氨基酸66至71和126至127在內(nèi)的位置。以線框突出了顯示18R8與共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群結(jié)合的FACS繪圖區(qū)域，并且加粗了對(duì)應(yīng)于表現(xiàn)出顯著下降的18R8和18R5結(jié)合的氨基酸取代的線框。圖8 :各人類卷曲受體Fri結(jié)構(gòu)域序列的部分氨基酸序列間的比較。具有保守殘基的位點(diǎn)以黑色陰影標(biāo)出；具有相似氨基酸殘基的位點(diǎn)以灰色陰影標(biāo)出。18R8和18R5的FZD表位包含由下劃線標(biāo)出且標(biāo)記為“上邊緣”和“下邊緣”的區(qū)域?；趯?duì)Fri結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)的細(xì)查，可認(rèn)識(shí)到這些區(qū)域位于FZD蛋白表面上的裂縫兩側(cè)，術(shù)語(yǔ)“上邊緣”和“下邊緣”則反映了這種認(rèn)識(shí)。所述裂縫包含多個(gè)高度保守的殘基。構(gòu)成該裂縫的氨基酸由比對(duì)結(jié)果中每個(gè)對(duì)應(yīng)位置上的三角形狀符號(hào)突出顯示。之前并未認(rèn)識(shí)到該區(qū)域的特定功能。對(duì)與該區(qū)域結(jié)合的抗體的發(fā)現(xiàn)，對(duì)這些抗體抑制fct結(jié)合及Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)，以及本發(fā)明人對(duì)該裂縫的保守性的認(rèn)識(shí)，已使得本發(fā)明人能夠?qū)⒃搮^(qū)域鑒定為FZD蛋白的關(guān)鍵功能性部分。圖9 =FZD的生物學(xué)結(jié)合部位(BBS)。顯示了 Fzd Fri結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)圖像。該圖像基于對(duì)之前報(bào)導(dǎo)的小鼠FZD8晶體結(jié)構(gòu)的分析(Dann CE等，Nature 412(6842)86-90, 2001)和使用軟件程序Pymol完成的分析。在左上圖中顯示了 FZD Fri結(jié)構(gòu)域的表面視圖，其中Fzd蛋白區(qū)域包含以白色橢圓圈出的本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)結(jié)合部位(BBS)。該區(qū)域即抗體18R8和18R5所結(jié)合的區(qū)域。該區(qū)域包含被本發(fā)明人稱為“上邊緣”、“下邊緣”和“裂縫”的結(jié)構(gòu)元件。在該圖底部的分開的圖像中用較深的表面著色突出顯示了各所述結(jié)構(gòu)元件。右上圖用較深色表面突出顯示了在10個(gè)人類Fzd家族成員的9個(gè)或10個(gè)中保守的殘基，并且突出了以下認(rèn)識(shí)在兩側(cè)為與抑制Fzd功能的抗體結(jié)合的表位的“裂縫”區(qū)域的中心內(nèi)出現(xiàn)了這些殘基的明顯集群。圖10 :通過(guò)抗FZD的mAb防止Wnt依賴型腫瘤生長(zhǎng)。每周對(duì)注射有50，000個(gè)MMTVWNTl腫瘤來(lái)源細(xì)胞的N0D/SCID小鼠和腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行監(jiān)視，直至檢測(cè)到生長(zhǎng)，隨后每周對(duì)腫 瘤生長(zhǎng)進(jìn)行兩次測(cè)量。用18R8或作為對(duì)照的對(duì)照抗體對(duì)10只具有已建立腫瘤的小鼠進(jìn)行治療。與在用對(duì)照抗體治療的動(dòng)物中所觀察到的相比，在用18R8治療的動(dòng)物中，幾乎消除了腫瘤生長(zhǎng)。圖11 :通過(guò)18R5與依立替康的組合治療減少0MP-C28異種移植腫瘤的生長(zhǎng)。對(duì)N0D/SCID小鼠注射10，000個(gè)0MP-C28結(jié)腸腫瘤細(xì)胞，在第24天，將腫瘤平均體積為129mm3的小鼠隨機(jī)分組并開始進(jìn)行所示的治療。每周對(duì)腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行監(jiān)視。在用18R5治療的動(dòng)物中，腫瘤生長(zhǎng)明顯減少。此外，18R5與依立替康的組合與單獨(dú)使用其中任何一個(gè)藥劑進(jìn)行的治療相比顯示出明顯的減少。圖12 :通過(guò)18R5與吉西他濱的組合治療減少0MP-PN4異種移植腫瘤的生長(zhǎng)。對(duì)N0D/SCID小鼠注射50，000個(gè)0MP-PN4胰腺腫瘤細(xì)胞，在第38天，將腫瘤平均體積為約120mm3的小鼠隨機(jī)分組并在2天后開始進(jìn)行所示的治療。與單獨(dú)使用吉西他濱的治療相比，在用18R5與吉西他濱組合治療的動(dòng)物中腫瘤生長(zhǎng)明顯減少。圖13 :18R8和18R5的重鏈和輕鏈氨基酸序列，包括VH和VL序列。圖14 :編碼18R8和18R5的重鏈和VH序列的核苷酸序列。圖15 :編碼18R8和18R5的輕鏈和VL序列的核苷酸序列。圖16 :FZD7E⑶Fe蛋白的氨基酸序列及編碼該蛋白的核苷酸序列。圖17 :人類 FZDl (SEQ ID NO: 26)、FZDl 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD) (SEQ ID NO: 27，顯示為SEQ ID NO:26中帶下劃線的氨基酸I至321)和FZDl的Fri結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:28)的氨基酸序列。圖18 :人類 FZD2(SEQ ID N0:30)、FZD2 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD) (SEQ ID NO: 31，顯示為SEQ ID NO:30中帶下劃線的氨基酸I至250)和FZD2的Fri結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:32)的氨基酸序列。圖19 :編碼人類FZDl的核苷酸序列。圖20 :編碼人類FZD2的核苷酸序列。圖21 :人類 FZD3(SEQ ID N0:34)、FZD3 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD) (SEQ ID NO: 35，顯示為SEQ ID NO:34中帶下劃線的氨基酸I至204)和FZD3的Fri結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:36)的氨基酸序列。圖22 :人類 FZD4(SEQ ID N0:38)、FZD4 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD) (SEQ ID NO: 39，顯示為SEQ ID NO:38中帶下劃線的氨基酸I至224)和FZD4的Fri結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:40)的氨基酸序列。圖23 :編碼人類FZD3的核苷酸序列。圖24 :編碼人類FZD4的核苷酸序列。圖25 :人類 FZD5(SEQ ID N0:42)、FZD5 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD) (SEQ ID NO: 43，顯示為SEQ ID NO:42中帶下劃線的氨基酸I至233)和FZD5的Fri結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:44)的氨基酸序列。圖26 :人類 FZD6(SEQ ID N0:46)、FZD6 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD) (SEQ ID NO: 47，顯示為SEQ ID NO:46中帶下劃線的氨基酸I至207)和FZD6的Fri結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:48) 的氨基酸序列。圖27 :編碼人類FZD5的核苷酸序列。圖28 :編碼人類FZD6的核苷酸序列。圖29 :人類 FZD7(SEQ ID N0:50)、FZD7 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD) (SEQ ID NO: 51，顯示為SEQ ID NO:50中帶下劃線的氨基酸I至255)和FZD7的Fri結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:52)的氨基酸序列。圖30 :人類 FZD8(SEQ ID N0:54)、FZD8 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD) (SEQ ID NO: 55，顯示為SEQ ID NO:54中帶下劃線的氨基酸I至277)和FZD8的Fri結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:56)的氨基酸序列。圖31 :編碼人類FZD7的核苷酸序列。圖32 :編碼人類FZD8的核苷酸序列。圖33 :人類 FZD9(SEQ ID N0:58)、FZD9 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD) (SEQ ID NO: 59，顯示為SEQ ID NO:58中帶下劃線的氨基酸I至230)和FZD9的Fri結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO:60)的氨基酸序列。圖34 :人類 FZDlO (SEQ ID NO: 62)、FZD10 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD) (SEQ IDNO:63, M示為SEQ ID N0:62中帶下劃線的氨基酸I至227)和FZDlO的Fri結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:64)的氨基酸序列。圖35 :編碼人類FZD9的核苷酸序列。圖36 :編碼人類FZDlO的核苷酸序列。圖37 :用18R5抗體與紫杉醇的組合治療減少PE-13乳腺腫瘤的生長(zhǎng)。對(duì)N0D/SCID小鼠注射10，000個(gè)PE-13乳腺腫瘤細(xì)胞，在第22天，將腫瘤平均體積為約120mm3的小鼠隨機(jī)分組。隨后用對(duì)照抗體(“對(duì)照Ab”)、18R5抗體(“抗FZD”)、紫杉醇(“Taxol”)或18R5抗體與紫杉醇的組合(“抗FZD+Taxol”)對(duì)小鼠進(jìn)行治療。用18R5抗體與紫杉醇的組合進(jìn)行的治療具有抗腫瘤活性。圖38 :在用18R5抗體與紫杉醇進(jìn)行組合治療的個(gè)體動(dòng)物中的乳腺腫瘤生長(zhǎng)。用18R5抗體與紫杉醇進(jìn)行的組合治療導(dǎo)致已建立的乳腺腫瘤的衰退。圖39 :在用對(duì)照抗體、18R5抗體、依立替康或18R5抗體與依立替康的組合進(jìn)行治療后對(duì)結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。
圖40 :在植入30、90、270或810個(gè)腫瘤細(xì)胞后的小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)，所述腫瘤細(xì)胞從已經(jīng)用對(duì)照抗體(“對(duì)照”)、18R5抗體(“抗FZD”)、吉西他濱(“吉西他濱”)或18R5與吉西他濱的組合(“組合”)治療41天的小鼠中獲得。圖41 :在用對(duì)照抗體(“對(duì)照Ab”)、僅用18R5抗體(“抗FZD”)、僅用吉西他濱(“吉西他濱”)或18R5抗體與吉西他濱的組合(“組合”)進(jìn)行治療后通過(guò)有限稀釋分析確定的PN-4胰腺腫瘤中的癌干細(xì)胞(CSC)頻率。圖42 :在已用對(duì)照抗體(“LZ-1”)、僅用18R5抗體(“18R5”)、僅用吉西他濱(“吉西他濱”)或吉西他濱與18R5的組合(“組合”)進(jìn)行治療的胰腺腫瘤細(xì)胞中的嗜鉻粒蛋白(Chromatogram)基因表達(dá)。圖43 :用抗FZD抗體18R5進(jìn)行的治療促使腫瘤細(xì)胞分化為非增殖粘液性細(xì)胞。對(duì)N0D/SCID小鼠注射50，000個(gè)0MP-PN13胰腺腫瘤細(xì)胞，在第23天，將腫瘤平均體積為約107mm3的小鼠隨機(jī)分組并在4天后開始用對(duì)照抗體或18R5進(jìn)行治療。20天后收集腫瘤并 切片。來(lái)自經(jīng)18R5治療的小鼠或經(jīng)對(duì)照抗體治療的小鼠的腫瘤切片用阿爾新藍(lán)染料進(jìn)行染色以顯示粘液性細(xì)胞，并通過(guò)用ki67的抗體的免疫組化顯示增殖細(xì)胞。用箭頭突出顯示了示例性的粘液性細(xì)胞和增殖細(xì)胞。圖44 :單獨(dú)使用抗FZD抗體18R5或與Taxol (紫杉醇)組合使用的抗FZD抗體18R5抑制0MP-LU24異種移植腫瘤的生長(zhǎng)。用對(duì)照抗體(“對(duì)照Ab ”)、抗FZD的18R5( “18R5”)、Taxol ( “Taxol”)或 18R5 與Taxol 的組合(“ 18R5+Taxol”)對(duì)攜帶有0MP-LU24人類肺腫瘤的小鼠進(jìn)行治療。圖45 單獨(dú)使用抗FZD抗體18R5或與Avastin (貝伐單抗)組合使用的抗FZD抗體18R5抑制0MP-LU33異種移植腫瘤的生長(zhǎng)。用對(duì)照抗體(方形)、Avastin (指向上方的三角形)、抗FZD的18R5(指向下方的三角形)或18R5與Avastin 的組合(圓形)對(duì)攜帶有0MP-LU33人類肺腫瘤的小鼠進(jìn)行治療。圖46 :抗FZD抗體18R5與Herc印tin (曲妥單抗)的組合抑制T3異種移植腫瘤的生長(zhǎng)。用對(duì)照抗體(方形)、抗FZD的18R5 (三角形),Herceptin (實(shí)心圓)或18R5與Herc印tin 的組合(空心圓)對(duì)攜帶有T3人類乳腺腫瘤的小鼠進(jìn)行治療。圖47 :18R5和44R24的Fzd結(jié)合圖譜。表示每個(gè)mAb與Fzdl、2、5、7和8的結(jié)合的劑量響應(yīng)曲線(Dose-reponse curve) 圖48 18R5和44R24對(duì)STF細(xì)胞中Wnt3a所誘發(fā)的報(bào)告基因活性的抑制作用(劑量響應(yīng)曲線)。圖49 18R5和44R24對(duì)axin2基因表達(dá)的本底水平的抑制作用。圖50 :對(duì)經(jīng)18R5和44R24治療的0MP-PN13腫瘤中的Mucl6的IHC檢測(cè)。圖51 :對(duì)經(jīng)18R5治療的胰腺腫瘤中平滑肌肌動(dòng)蛋白的抑制作用。A.通過(guò)微陣列檢測(cè)到的ACTA2基因表達(dá)水平。B.對(duì)經(jīng)對(duì)照mAb (上圖)和18R5 (下圖)治療的0MP-PN4腫瘤的SMA檢測(cè)。圖52 :測(cè)試經(jīng)18R5誘導(dǎo)的Mucl6+0MP_PN13細(xì)胞的致瘤性。A.進(jìn)行Mucl6染色的Iin消減的(lin-cbpleted)0MP-PN13腫瘤細(xì)胞的FACS作圖。兩個(gè)分選的群用圓圈圈出。B.因注射Mucl6-(上圖)和Mucl6+(下圖)細(xì)胞而產(chǎn)生的腫瘤的代表圖。C.腫瘤生長(zhǎng)曲線。
圖53 :在PE13乳腺腫瘤異種移植物中抗FZD的mAb 18R5對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)的抑制作用。圖54 :抗FZD的mAb 18R5使乳腺的癌干細(xì)胞頻率降低。圖55 :在PM胰腺腫瘤異種移植物中抗FZD的mAb 18R5對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)的抑制作用。圖56 :在PM胰腺腫瘤異種移植物中抗FZD的mAb 44R24與吉西他濱的組合對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。圖57 :抗FZD的mAb 44R24與突變FZD8 (相對(duì)于野生型FZD8)的結(jié)合的FACS分析。用線框突出了顯示44R24與共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群結(jié)合的FACS圖區(qū)域。箭頭標(biāo)出了那些顯示出顯著下降的44R24結(jié)合的氨基酸取代的線框。圖58 :在C25結(jié)腸腫瘤異種移植物中抗FZD的抗體44R24和18R5的抗腫瘤活性。圖59 :在用抗FZD的抗體44R24或18R5治療過(guò)的C28結(jié)腸腫瘤異種移植物中的 細(xì)胞角蛋白7表達(dá)的誘導(dǎo)。圖60 0MP-18R5結(jié)合部位內(nèi)的殘基影響Wnt結(jié)合。A.顯示了 Fzd fri結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)圖。所述圖基于之前報(bào)道的小鼠FZD8的晶體結(jié)構(gòu)的分析(Dann CE等，Nature412 (6842) 86-90, 2001)和使用軟件程序Pymol完成的分析。該區(qū)域包含了我們稱之為“上邊緣”、“下邊緣”以及“裂縫”的結(jié)構(gòu)元件。左上圖像中顯示了 Fzd fri結(jié)構(gòu)域的表面視圖，其中Fzd蛋白的區(qū)域突出顯示了在人類卷曲受體中的9個(gè)或10個(gè)成員中保守的殘基。右上圖突出顯示了被18R5結(jié)合的一些殘基。B.所示的圖像通過(guò)灰色突出的顯示描述了在所述裂縫區(qū)域中的4個(gè)氨基酸取代的位置。列出了人類FZD8中的所述位置和氨基酸取代(單字母氨基酸代碼)。C.研究了在裂縫區(qū)域中包含氨基酸取代的變體的FZD-Fc融合蛋白作為水溶性誘餌分子與fct3A結(jié)合的能力。在穩(wěn)定表達(dá)8個(gè)拷貝的TCF啟動(dòng)子元件的STF293細(xì)胞中進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定。細(xì)胞暴露于含有fct3A的培養(yǎng)基以及包含F(xiàn)ZD-Fc變體的一系列稀釋培養(yǎng)基18小時(shí)，然后使用Dual-Glo熒光素酶檢測(cè)報(bào)告系統(tǒng)(Promega)來(lái)測(cè)定熒光素酶活性。結(jié)果表明具有所述裂縫區(qū)域的氨基酸取代的FZD-Fc的變體與Wnt 3A的結(jié)合能力較弱，因此抑制了其通過(guò)所述STF293細(xì)胞引發(fā)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的能力。圖61 :鑒定與FZD結(jié)合的肽。顯示了測(cè)試表達(dá)肽的單噬菌體克隆與FZD8-FC或陰性對(duì)照蛋白DLL4-FC的結(jié)合能力的ELISA數(shù)據(jù)。箭頭以示例的方式突出了一些陽(yáng)性克隆。圖62 :FZD結(jié)合肽序列的分析。顯示了被發(fā)現(xiàn)與FZD特異性地結(jié)合的肽序列。鑒定的既有環(huán)狀的肽序列也有線狀的肽序列。所述環(huán)狀肽顯示出能夠定義共有序列的明顯的序列相似性。由于所述肽文庫(kù)不可能含有與該共有序列相關(guān)的所有可能的氨基酸變體，因此在該共有序列之外的其他變體有可能也能與FZD結(jié)合。所述線狀的肽并沒(méi)有顯示較強(qiáng)的共有相似性。然而，這些序列中的一些序列(例如，2#克隆，DTLSALIERGLM(SEQ ID NO: 112))是與FZD的18R5結(jié)合區(qū)域結(jié)合的強(qiáng)有力的FZD結(jié)合劑(binders)，并且發(fā)現(xiàn)它們?cè)诮Y(jié)合對(duì)于Wnt-FZD相互作用比較重要的裂縫區(qū)域中結(jié)合。圖63 =FZD結(jié)合肽在18R5結(jié)合/Wnt結(jié)合區(qū)域中的“裂縫”中結(jié)合。為了研究所述FZD結(jié)合肽與18R5結(jié)合區(qū)域中的所述“裂縫”相互作用的能力，進(jìn)行ELISA來(lái)測(cè)試表達(dá)肽的單噬菌體克隆與FZD8-FC或含有在所述裂縫中的氨基酸取代的FZD8-FC變體(Mut 2)，或陰性對(duì)照蛋白DLL4-FC結(jié)合的能力。所述肽中有許多與FZD8-Mut 2蛋白的結(jié)合遠(yuǎn)不及與野生型FZD8的結(jié)合。一些如箭頭所突出的肽即使與FZD8-Mut 2的結(jié)合，也顯示出幾乎沒(méi)有的結(jié)合能力，表明它們特異性地在所述“裂縫”中結(jié)合。所述肽的實(shí)例2#克隆具有序列DTLSALIERGLM(SEQ ID NO:112)。圖64:與FZD結(jié)合的肽對(duì)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的抑制作用。顯示了 fct依賴的熒光素酶報(bào)告基因研究的結(jié)果，所述研究檢測(cè)兩條肽(2#和24#克隆)抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的能力。所述兩條肽通過(guò)化學(xué)合成產(chǎn)生。將所述肽溶解于二甲亞砜(DMSO)，然后在所述已報(bào)告的測(cè)定中將其以所示濃度稀釋。所述報(bào)告基因檢測(cè)利用HEK293細(xì)胞，所述HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染有含響應(yīng)Wnt的8個(gè)拷貝的熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒。細(xì)胞接觸于fct3A以及所示的肽，接著溫育16小時(shí)。使用雙突光素酶測(cè)定法(Dual-glo luciferaseassay,Promega)來(lái)確定Wnt的活性。圖65 :人類FZD1-5的最小Fri結(jié)構(gòu)域。圖66 :人類FZD6-10的最小Fri結(jié)構(gòu)域.圖67 =^iFZD抗體18R5抑制了一些Wnt誘導(dǎo)經(jīng)典的信號(hào)傳導(dǎo)的能力。 圖68:18R5與FZD的結(jié)合抑制了 WNT與FZD的相互作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供新型藥劑，包括但不限于與一種或多種人類卷曲受體(FZD)結(jié)合的多肽(例如抗體)。還提供了相關(guān)多肽和多核苷酸、含有FZD結(jié)合藥劑的組合物以及制備所述FZD結(jié)合藥劑的方法。另外提供了該新型FZD結(jié)合藥劑的使用方法，例如抑制腫瘤生長(zhǎng)和/或治療癌癥的方法。本發(fā)明在部分上基于對(duì)人類卷曲受體中的一個(gè)區(qū)域的鑒定，所述區(qū)域是結(jié)合FZD的抗癌藥劑的適合靶標(biāo)。發(fā)現(xiàn)兩種抗FZD抗體，18R8和18R5，與FZD7特異性地結(jié)合，還與FZD1、FZD2、FZD5和FZD8發(fā)生交叉反應(yīng)(下文實(shí)施例I和2)。用18R8抗體進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)表明該抗體能夠抑制fct信號(hào)傳導(dǎo)(下文實(shí)施例3)并抑制Wnt配體與FZD8的結(jié)合(下文實(shí)施例4)。在基于細(xì)胞的測(cè)定中，還已顯示18R5抗體同樣能夠抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)(下文實(shí)施例3和20)。用18R5抗體進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明該抗體能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)或復(fù)發(fā)(下文實(shí)施例7、17和23)。本發(fā)明人還展示了抗FZD抗體18R5能夠降低腫瘤中的癌干細(xì)胞頻率(下文實(shí)施例8和23)并誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的分化和/或降低腫瘤細(xì)胞致瘤性(下文實(shí)施例16、21、22和25)。用這些活性18R8和18R5抗體進(jìn)行的表位作圖實(shí)驗(yàn)表明這些抗體均可與FZD8中的序列GLEVHD(SEQ IDNO:25)的至少一部分和序列YGFA(SEQ ID NO:74)的至少一部分結(jié)合(下文實(shí)施例5)。根據(jù)所展示的這兩種抗體的生物活性，對(duì)小鼠卷曲蛋白8的晶體結(jié)構(gòu)(Dann等，Nature, 412:86-90 (2001))進(jìn)行了分析，并將包含這些此前并未認(rèn)為有任何特殊功能的序列的卷曲蛋白的細(xì)胞外區(qū)域首次鑒定為在FZD生物學(xué)和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)中起到重要功能性作用(實(shí)施例6)。人類卷曲受體的稱為生物學(xué)結(jié)合部位(BBS)的這一區(qū)域是抗癌治療的適合靶標(biāo)。此外，發(fā)現(xiàn)第三種抗體44R24特異性地結(jié)合人類FZD5和FZD8 (下文實(shí)施例19)。已另外顯示，該抗體能夠在基于細(xì)胞的測(cè)定中抑制fct信號(hào)傳導(dǎo)(下文實(shí)施例20)并在體內(nèi)具有抗腫瘤效用(下文實(shí)施例23和25)。和用抗FZD抗體18R8和18R5進(jìn)行的治療相同，用44R24對(duì)腫瘤進(jìn)行的治療致使該腫瘤中的分化標(biāo)記物水平升高(下文實(shí)施例25)。表位作圖還已顯示，抗FZD抗體44R24的表位與抗FZD抗體18R8和18R5的表位存在重疊。更具體而言，已顯示44R24與BBS中的區(qū)域YGFA (SEQ IDNO: 74)的至少一部分結(jié)合(下文實(shí)施例24)。I.定義為了便于理解本發(fā)明，下文定義了多個(gè)術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)。術(shù)語(yǔ)“抗體”指免疫球蛋白分子，其通過(guò)在該免疫球蛋白分子可變區(qū)內(nèi)的至少一個(gè)抗原識(shí)別部位識(shí)別并特異性地結(jié)合靶標(biāo)，例如蛋白、多肽、肽、糖類、多核苷酸、脂質(zhì)或其組合。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”涵蓋完整多克隆抗體、完整單克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段)、單鏈Fv(ScFv)突變物、從至少兩種完整抗體產(chǎn)生的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、含有抗體的抗原決定部位的融合蛋白以及含有抗原識(shí)別部位的任何其他經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子，只要這些抗體顯示出所需的生物活性即可。根據(jù)抗體的重鏈恒定域(分別稱為α、δ、ε、Y和μ)，抗體可以是5種主要類別的免疫球蛋白(IgA、IgD, IgE, IgG和IgM)或其亞類(同型)(例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)中的任何一種。不同類別的免疫球蛋白具有不同且公知的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造?？贵w可以是裸抗體，或者與諸如毒素、放射性同位素等其他分子偶聯(lián)。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”指完整抗體的一部分，和指完整抗體的抗原決定可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、線狀抗體、單鏈抗體以及由抗體片段形成的多特異性抗體?！皢慰寺】贵w”指參與高特異性地識(shí)別并結(jié)合單一抗原決定簇或表位的同源抗體群。與之相反的多克隆抗體則通常包括針對(duì)不同抗原決定簇的不同抗體。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”涵蓋完整全長(zhǎng)單克隆抗體和抗體片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、單鏈(scFv)突變物、含有抗體部分的融合蛋白以及含有抗原識(shí)別部位的任何其他經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子。另外，“單克隆抗體”指以包括但不限于雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的多種方式制成的此類抗體。術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”指含有最少的非人類(例如鼠類)序列的非人類(例如鼠類)抗體形式，所述形式有特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常，人源化抗體是人類免疫球蛋白，其中來(lái)自互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基被來(lái)自非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、倉(cāng)鼠)的CDR的具有所需的特異性、親和力和能力的殘基所替換(Jones等，1986，Nature, 321:522-525 ;Riechmann 等，1988，Nature, 332:323-327 ；Verhoeyen 等，1988，Science, 239:1534-1536)。在一些情況中，用來(lái)自非人類物種的具有所需的特異性、親和力和能力的抗體的殘基替換人類免疫球蛋白的Fv骨架區(qū)(FR)的相應(yīng)殘基。通過(guò)在Fv骨架區(qū)和/或已替換的非人類殘基中進(jìn)行附加殘基的取代，可以進(jìn)一步修飾人源化抗體，從而改進(jìn)和優(yōu)化抗體特異性、親和力和/或能力。一般而言，人源化抗體會(huì)基本上完整地包含至少一個(gè)、通常為兩個(gè)或三個(gè)可變區(qū)，所述可變區(qū)含有全部或基本上全部與非人類免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的CDR區(qū)，然而全部或基本上全部FR區(qū)都屬于人類免疫球蛋白共有序列。人源化抗體還可以包含免疫球蛋白(通常為人類免疫球蛋白)的恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fe)的至少一部分。在美國(guó)專利第5，225，539號(hào)中描述了用來(lái)產(chǎn)生人源化抗體的方法的實(shí)例。術(shù)語(yǔ)“人類抗體”指由人類產(chǎn)生的抗體，或者是用任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備的具有與人類所產(chǎn)生的抗體對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的抗體。人類抗體的這種定義包括完整或全長(zhǎng)抗體、其片段和/或包含至少一個(gè)人類重鏈和/或輕鏈多肽的抗體(例如包含鼠類輕鏈和人類重鏈多肽的抗體)。術(shù)語(yǔ)“嵌合抗體”指免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自兩種或更多種物種的抗體。通常，其輕鏈和重鏈的可變區(qū)對(duì)應(yīng)于源自一種哺乳動(dòng)物物種(例如小鼠、大鼠、兔等)的具有所需的特異性、親和力和能力的抗體的可變區(qū)，而恒定區(qū)則與源自另一物種(通常為人類)的抗體中的序列同源，從而避免在該物種中引起免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)“表位”或“抗原決定簇”在本文中可互換使用，指能夠被特定抗體識(shí)別并特異性地結(jié)合的抗原的部分。當(dāng)抗原是多肽時(shí)，表位能夠由連續(xù)氨基酸構(gòu)成，也能夠由通過(guò)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)折疊而并置的不連續(xù)氨基酸構(gòu)成。由連續(xù)氨基酸構(gòu)成的表位通常在蛋白變性時(shí)得以保留，然而通過(guò)三級(jí)結(jié)構(gòu)折疊形成的表位通常在蛋白變性時(shí)丟失。表位通常包括具有獨(dú)特空間構(gòu)象的至少3個(gè)、更常見(jiàn)為至少5個(gè)或8至10個(gè)氨基酸?？贵w“特異性地結(jié)合”表位或蛋白是指該抗體與表位或蛋白的反應(yīng)或聯(lián)結(jié)比替代 性物質(zhì)(包括無(wú)關(guān)蛋白)更頻繁、更快速、時(shí)間更長(zhǎng)、親和力更強(qiáng)或上述情況的某些組合。在某些實(shí)施方式中，“特異性地結(jié)合”是指，例如，抗體與蛋白結(jié)合的KD值為約O. ImM以下，但更常見(jiàn)為小于約ΙμΜ。在某些實(shí)施方式中，“特異性結(jié)合”指抗體與蛋白結(jié)合的KD有時(shí)為至少約O. I μ M以下，而在其他時(shí)候?yàn)橹辽偌sO. 01 μ M以下。由于不同物種中同源蛋白之間的序列同一性，特異性結(jié)合可以包括對(duì)多于一種的物種中的特定蛋白(例如卷曲受體)進(jìn)行識(shí)別的抗體。同樣，由于不同F(xiàn)ZD受體(例如，F(xiàn)ZD5和FZD8)之間在這些受體多肽序列的某些區(qū)域中存在同源性，特異性結(jié)合可以包括對(duì)多于一種的卷曲受體進(jìn)行識(shí)別的抗體(或其他多肽或藥劑)。應(yīng)了解的是，與第一靶標(biāo)特異性結(jié)合的抗體或結(jié)合部分，可以與或可以不與第二靶標(biāo)特異性結(jié)合。如此而言，“特異性結(jié)合”不必需要(雖然其可以包括)排他性結(jié)合，即與單一靶標(biāo)結(jié)合。因此，在某些實(shí)施方式中，抗體可以特異性結(jié)合多于一種的靶標(biāo)(例如人類FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8)。在某些實(shí)施方式中，抗體上的相同抗原結(jié)合部位可以結(jié)合多個(gè)靶標(biāo)。舉例而言，在某些情況中，抗體可以含有兩個(gè)相同的抗原結(jié)合部位，其中每個(gè)部位都特異性地結(jié)合兩種或更多種人類卷曲受體(例如人類FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8)。在某些替代性實(shí)施方式中，抗體可以是雙特異性的，并且含有特異性不同的至少兩個(gè)抗原結(jié)合部位。以非限制性的實(shí)例而言，雙特異性抗體可以具有一個(gè)識(shí)別一種卷曲受體(例如人類FZD5)上的表位的抗原結(jié)合部位，并且還具有識(shí)別第二種卷曲受體(例如人類FZD8)上的不同表位的另一不同的抗原結(jié)合部位。一般而言，但不必需，述及結(jié)合是指特異性結(jié)合?！耙逊蛛x的”多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物是指處于非自然發(fā)現(xiàn)形式的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物。已分離的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物包括經(jīng)純化達(dá)到不再處于其在自然中所發(fā)現(xiàn)形式的程度的多肽、抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物。在一些實(shí)施方式中，已分離的抗體、多核苷酸、載體、細(xì)胞或組合物基本純凈。本文所用的“基本純凈”指為至少50%純凈(即無(wú)雜質(zhì))、更優(yōu)選為至少90%純凈、再優(yōu)選為至少95%純凈、再更優(yōu)選為至少98%純凈、進(jìn)一步優(yōu)選為至少99%純凈的材料。術(shù)語(yǔ)“癌癥”和“癌癥的”是指或用于描述哺乳動(dòng)物的生理病癥，其中一群細(xì)胞的特征在于失調(diào)的細(xì)胞生長(zhǎng)。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌腫、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌癥更特定的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀上皮腫瘤、腹膜癌、肝細(xì)胞癌(h印atocellular cancer)、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜瘤或子宮瘤、唾液腺瘤、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝臟癌(hepaticcarcinoma)以及各類型的頭頸部癌癥?！澳[瘤”和“贅生物”是指因過(guò)度細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖而產(chǎn)生的任何良性(非癌性)或包括癌前病灶在內(nèi)的惡性(癌性)組織團(tuán)塊。術(shù)語(yǔ)“癌干細(xì)胞”、“腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cell) ”或“實(shí)體瘤干細(xì)胞(solidtumor stem cell) ”在本文中可互換使用，是指來(lái)自實(shí)體瘤的具有下述特征的細(xì)胞群(I)具有較強(qiáng)的增殖能力；(2)能夠進(jìn)行非對(duì)稱細(xì)胞分裂從而產(chǎn)生一種或多種具有減弱的增殖或發(fā)育潛能的分化的后代；和(3)能夠進(jìn)行對(duì)稱分裂用于自我更新或自我維持。在對(duì)免疫功能低下的小鼠進(jìn)行連續(xù)移植時(shí)，“癌干細(xì)胞”、“腫瘤干細(xì)胞”或“實(shí)體瘤干細(xì)胞”的這些性質(zhì)使這些癌干細(xì)胞與大多數(shù)不能形成腫瘤的腫瘤細(xì)胞相比能夠形成可觸知的腫瘤。相對(duì)于分 化，癌干細(xì)胞以無(wú)序的方式進(jìn)行自我更新，從而形成具有異常細(xì)胞類型的腫瘤，所述異常細(xì)胞類型在發(fā)生突變時(shí)能夠隨時(shí)間發(fā)生變化。術(shù)語(yǔ)“癌細(xì)胞”、“腫瘤細(xì)胞”和語(yǔ)法上等價(jià)的詞語(yǔ)是指源自腫瘤或癌前病灶的總細(xì)胞群，包括非致瘤性細(xì)胞(其包括大量的腫瘤細(xì)胞群)和致瘤干細(xì)胞(癌干細(xì)胞)。在僅述及缺少更新及分化能力的那些腫瘤細(xì)胞時(shí)，以術(shù)語(yǔ)“非致瘤”修飾本文所用的術(shù)語(yǔ)“腫瘤細(xì)胞”，從而將這些腫瘤細(xì)胞與癌干細(xì)胞區(qū)分開。術(shù)語(yǔ)“致瘤性”是指實(shí)體瘤干細(xì)胞的功能性特征，其包括自我更新性質(zhì)(產(chǎn)生額外的致瘤性癌干細(xì)胞)和增殖以產(chǎn)生使實(shí)體瘤干細(xì)胞形成腫瘤的全部其他腫瘤細(xì)胞(產(chǎn)生分化的因而不具有非致瘤性的腫瘤細(xì)胞)的性質(zhì)。在對(duì)免疫功能低下的小鼠進(jìn)行連續(xù)移植時(shí)，這些自我更新和增殖以產(chǎn)生全部其他腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)使得癌干細(xì)胞與非致瘤性腫瘤細(xì)胞相比能夠形成可觸知的腫瘤，所述非致瘤性腫瘤細(xì)胞在進(jìn)行連續(xù)移植時(shí)不能形成腫瘤。已觀察到，在從實(shí)體瘤獲得腫瘤細(xì)胞后對(duì)免疫功能低下的小鼠進(jìn)行初次移植時(shí)，非致瘤性腫瘤細(xì)胞可以形成腫瘤，但是進(jìn)行連續(xù)移植時(shí)，這些非致瘤性腫瘤細(xì)胞不產(chǎn)生腫瘤。術(shù)語(yǔ)“受試者”是指任何動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物)，包括但不限于人類、非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物等，其將是特定治療的接受者。通常，術(shù)語(yǔ)“受試者”和“患者”在述及人類受試者時(shí)可在本文中互換使用?！爸扑幧峡山邮艿柠}”是指在制藥上可接受的化合物的鹽，其具有母化合物的所需
藥理學(xué)活性?！爸扑幧峡山邮艿馁x形劑、運(yùn)載體(carrier)或佐劑”是指能夠與本發(fā)明的至少一種抗體一起對(duì)受試者進(jìn)行施用、不破壞其藥理學(xué)活性而且在以足以遞送治療量的化合物的劑量施用時(shí)無(wú)毒性的賦形劑、運(yùn)載體或佐劑。“制藥上可接受的載質(zhì)”是指與本發(fā)明的至少一種抗體一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運(yùn)載體。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指用來(lái)有效地“治療”受試者或哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的抗體、多肽、多核苷酸、有機(jī)小分子或其他藥物的量。對(duì)于癌癥，治療有效量的藥物能夠減少癌細(xì)胞數(shù)量；減小腫瘤尺寸；抑制或阻止癌細(xì)胞浸潤(rùn)至周邊器官，所述浸潤(rùn)包括例如癌擴(kuò)散至軟組織和骨中；抑制并阻止腫瘤轉(zhuǎn)移；抑制或阻止腫瘤生長(zhǎng)；一定程度上減輕與癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀；降低發(fā)病率和死亡率；提高生命質(zhì)量；降低腫瘤的致瘤性、致瘤率或致瘤能力；減少腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率；使致瘤性細(xì)胞分化為非致瘤狀態(tài)；或者這些效果的組合。對(duì)于藥物防止生長(zhǎng)和/或殺死已存在的癌細(xì)胞的情況，可稱之為細(xì)胞抑制和/或細(xì)胞毒性。諸如“治療，，(“treating，，或“treatment，，或“treat”)或“減輕，，(“alleviating”或“alleviate”)等術(shù)語(yǔ)是指I)治愈、緩解、減少已診斷出的病理狀態(tài)或病癥的癥狀和/或使所述病理狀態(tài)或病癥停止進(jìn)展的治療措施，和(2)預(yù)防和/或減緩目標(biāo)病理狀態(tài)或病癥的發(fā)展的預(yù)防性或防止性措施。因此，需要治療的對(duì)象包括已經(jīng)患有病癥的對(duì)象、易于患有病癥的對(duì)象和要防止病癥的對(duì)象。在某些實(shí)施方式中，如果患者顯示出一種或多種的下述現(xiàn)象，則根據(jù)本發(fā)明的方法對(duì)受試者成功地進(jìn)行了癌癥“治療”，所述現(xiàn)象為癌細(xì)胞數(shù)量 減少或完全消失；腫瘤尺寸減??；癌細(xì)胞向周邊器官的浸潤(rùn)受到了抑制或消失，所述浸潤(rùn)包括例如癌擴(kuò)散至軟組織和骨中；使腫瘤轉(zhuǎn)移受到了抑制或消失；使腫瘤生長(zhǎng)受到了抑制或消失；使與特定癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀減輕；發(fā)病率和死亡率降低；提聞生命質(zhì)量；腫瘤的致瘤性、致瘤率或致瘤能力降低；腫瘤中癌干細(xì)胞的數(shù)量或頻率減少；致瘤性細(xì)胞分化為非致瘤狀態(tài)；或者這些效果的某種組合。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互換使用，指任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或堿基和/或其類似物、或者能夠通過(guò)DNA聚合酶或RNA聚合酶引入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包括經(jīng)修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其類似物。如果存在對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾，其可以在聚合物裝配之前或之后進(jìn)行。非核苷酸成分可以中斷核苷酸序列。在聚合后可以進(jìn)一步對(duì)多核苷酸進(jìn)行修飾，例如通過(guò)與標(biāo)記成分偶聯(lián)。其他類型的修飾包括例如“封端”;用類似物取代一種或多種天然存在的核苷酸；核苷酸間修飾，例如具有無(wú)電荷鍵的修飾(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸酯等)和帶電鍵的修飾(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有懸突部分(pendant moiety)例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、多聚L-賴氨酸等)的修飾、以嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)進(jìn)行的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有烷化劑的修飾、帶有經(jīng)修飾鍵(例如α異頭核酸等)的修飾；以及多核苷酸的未修飾形式。另外，對(duì)于通常存在于糖中的任何羥基，可以將其置換為例如膦酸酯基團(tuán)、磷酸酯基團(tuán)，可以用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基對(duì)其進(jìn)行保護(hù)，或者可以將其激活從而制備與其他核苷酸的額外鍵，或者可以使其與固體支持物偶聯(lián)?？梢杂冒坊蚝蠭至20個(gè)碳原子的有機(jī)封端基團(tuán)部分來(lái)取代或磷酸化5’端和3’端0Η。還可以使其他羥基衍生為標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)性基團(tuán)。多核苷酸還可以包含本領(lǐng)域中公知的核糖或脫氧核糖的類似物形式，包括例如2’ -O-甲基核糖、2’ -O-烯丙基核糖、2’ -氟代核糖、2’ -疊氮基核糖、碳環(huán)糖類似物、α異頭糖、差向異構(gòu)糖(例如阿拉伯糖、木糖或來(lái)蘇糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無(wú)環(huán)類似物以及非堿基核苷類似物(例如甲基核糖苷)?？梢杂锰娲赃B接基團(tuán)來(lái)置換一個(gè)以上的磷酸二酯鍵。這些替代性連接基團(tuán)包括但不限于下述實(shí)施方式其中用P (O) S ( “硫代酯”)、P (S) S ( “二硫代酯”)、” (O) NR2 ( “酰胺化物”)、Ρ (O)R、P(0)0R’、C0*CH2( “甲乙縮醛”)置換磷酸酯，其中R或R’各自獨(dú)立地為H或者為具有取代基或不具有取代基的烷基(I至20C)并可選地包含醚(一0—)鍵、芳基、鏈烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。在一個(gè)多核苷酸中并不需要所有鍵都相同。以上描述對(duì)本文述及的所有多核苷酸(包括RNA和DNA)都適用?？贵w的“可變區(qū)”可以單獨(dú)指抗體輕鏈的可變區(qū)或抗體重鏈的可變區(qū)，也可以指其組合。重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自由4個(gè)框架區(qū)(FR)組成，所述4個(gè)框架區(qū)由三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(也稱高變區(qū))連接。FR使每個(gè)鏈中的CDR近距離地聚集在一起，所述CDR與另一條鏈的CDR—起促成抗體的抗原結(jié)合部位的形成。至少有兩種用于確定⑶R的技術(shù)(1)基于跨物種序列變異性的方法(即Kabat等，Sequences of ProteinsofImmunological Interest,(第 5 版，1991，National Institutes of Health, BethesdaMd.));和(2)基于對(duì)抗原-抗體復(fù)合體的晶體學(xué)研究的方法(ΑΙ-lazikani等，(1997)J. Molec. Biol. 273:927-948)。此外，在本領(lǐng)域中有時(shí)使用這兩種方法的組合來(lái)確定CDR。術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠在宿主細(xì)胞中傳遞、優(yōu)選表達(dá)一種或多種所感興趣的基因或 序列的構(gòu)建體。載體的實(shí)例包括但不限于病毒載體、裸DNA或RNA表達(dá)載體、質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體、與陽(yáng)離子凝縮劑(cationic condensing agent)聯(lián)結(jié)的DNA或RNA表達(dá)載體、包裹在脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達(dá)載體以及某些真核生物細(xì)胞(例如產(chǎn)病毒細(xì)胞(producercell))。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互換使用，用來(lái)指任何長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是鏈狀或分枝狀，可以包含經(jīng)修飾的氨基酸，并且可以由非氨基酸中斷。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋經(jīng)天然修飾或干預(yù)修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵的形成、糖基化、月旨化、乙酰化、磷酸化或任何其他操縱或修飾(例如與標(biāo)記成分偶聯(lián))。本定義還包括例如含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本領(lǐng)域中已知的其他修飾的多肽。應(yīng)了解的是，因?yàn)楸景l(fā)明的多肽以抗體為基礎(chǔ)，在某些實(shí)施方式中，該多肽可以作為單個(gè)的鏈或聯(lián)結(jié)的鏈出現(xiàn)。在述及兩個(gè)以上核酸或多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“同一的”或百分比“同一性”是指在進(jìn)行比較和比對(duì)(如有必要?jiǎng)t引入空位)以獲得最大對(duì)應(yīng)時(shí)，兩個(gè)以上的序列或子序列相同或具有特定比例的相同核苷酸或氨基酸殘基，且未將任何保守性氨基酸取代考慮為序列同一性的一部分。使用序列比較軟件或算法或者通過(guò)目視檢查，可以測(cè)量百分比同一性。可以用來(lái)獲得對(duì)氨基酸或核苷酸序列的比對(duì)的各種算法和軟件在本領(lǐng)域中是已知的。序列比對(duì)算法的一個(gè)這種非限制性實(shí)例是在Karlin等，1990, Proc.Natl. Acad. Sci, 87:2264-2268 中描述的算法，并在 Karlin 等，1993, Proc. Natl. Acad.Sci, 90:5873-5877中對(duì)其進(jìn)行了修改，且整合到了 NBLAST和XBLAST程序中(Altschul等，1991，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402)。在某些實(shí)施方式中，可以使用在 Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.，25:3389-3402 中所描述的空位 BLAST (Gapped BLAST)。BLAST-2、WU-BLAST-2 (Altschul 等，1996，Methods in Enzymology，266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California)或 Megalign (DNASTAR)是能夠用來(lái)進(jìn)行序列比對(duì)的其他公用軟件程序。在某些實(shí)施方式中，使用GCG軟件中的GAP程序(例如，使用NWSgapdna. CMP矩陣，且空位權(quán)重為40、50、60、70或90，長(zhǎng)度權(quán)重為1、2、3、4、5或6)來(lái)確定兩個(gè)核苷酸序列間的百分比同一性。在某些替代性實(shí)施方式中，可以使用整合有Needleman 和 Wnsch 的算法(J. Mol. Biol. (48) :444-453(1970))的 GCG 軟件包中的 GAP 程序來(lái)確定兩個(gè)氨基酸序列間的百分比同一'丨生(例如，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，且空位權(quán)重為16、14、12、10、8、6或4，長(zhǎng)度權(quán)重為1、2、3、4、5)。作為另一種選擇，在某些實(shí)施方式中，使用Myers和Miller算法(CABIOS，4:11-17 (1989))來(lái)確定核苷酸或氨基酸序列間的百分比同一性。舉例而言，可以使用ALIGN程序(2.0版)來(lái)確定百分比同一性，其中使用帶殘基表的PAM120，且空位長(zhǎng)度罰分為12，空位罰分為4。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定適合的參數(shù)來(lái)獲得特定比對(duì)軟件的最大比對(duì)。在某些實(shí)施方式中，使用比對(duì)軟件的缺省參數(shù)。在某些實(shí)施方式中，第一氨基酸序列相對(duì)于第二序列氨基酸的百分比同一性“X”用100X (Y/Z)計(jì)算，其中Y是在第一和第二序列的比對(duì)(通過(guò)目視檢查或特定序列比對(duì)程序所做的比對(duì))中評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，而Z是第二序列中的殘基總數(shù)。如果第一序列的長(zhǎng)度長(zhǎng)于第二序列，則第一序列相對(duì)于第二序列的百分比同一性將長(zhǎng)于第二序列相對(duì)于第一序列的百分比同一性。作為非限制性的實(shí)例，在某些實(shí)施方式中，使用Bestfit程序(WisconsinSequenceAnalysis Package,版本 8(用于 Unix 平臺(tái)),Genetics ComputerGroup, UniversityResearch Park, 575Science Drive, Madison, WI 53711)能夠確定任何 特定的多核苷酸是否具有相對(duì)于參照序列的某個(gè)百分比的序列同一性(例如，至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、以及在一些實(shí)施方式中至少95%、96%、97%、98%或 99% 同一性)。Bestf it 使用 Smith 和 Waterman, Advances in Applied Mathematics2:482489(1981)的局部同源性算法來(lái)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)序列間的最佳同源性片段。當(dāng)使用Bestfit或任何其他序列比對(duì)程序來(lái)確定特定序列與本發(fā)明的參照序列是否具有例如95%同一性時(shí)，對(duì)參數(shù)進(jìn)行設(shè)置從而使得基于參照核苷酸序列的全長(zhǎng)來(lái)計(jì)算同一性的百分比，并且允許同源性中的空位最多為參照序列中核苷酸總數(shù)的5%。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的兩種核酸或多肽基本一致，即在進(jìn)行比較和比對(duì)以獲得最大對(duì)應(yīng)時(shí)，通過(guò)用序列比較算法或目視檢查來(lái)測(cè)量的其核苷酸或氨基酸殘基同一性為至少70%、至少75%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、進(jìn)一步優(yōu)選至少90%以及在一些實(shí)施方式中為至少95%、96%、97%、98%、99%。優(yōu)選的是，同一性存在于長(zhǎng)度至少為約10個(gè)殘基、優(yōu)選為約20個(gè)殘基、更優(yōu)選為約40至60個(gè)殘基或其間任何整數(shù)值的序列區(qū)域，優(yōu)選存在于長(zhǎng)于60至80個(gè)殘基的區(qū)域，更優(yōu)選為至少約90至100個(gè)殘基的區(qū)域，并且最優(yōu)選為與所對(duì)比的序列全長(zhǎng)基本相同的序列(例如核苷酸序列的編碼區(qū))?！氨Ｊ匦园被崛〈笔怯镁哂邢嗨苽?cè)鏈的另一氨基酸殘基置換某個(gè)氨基酸殘基的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域已有界定，其包括堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、無(wú)電荷極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分枝側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。舉例而言，用苯丙氨酸取代酪氨酸是保守性取代。優(yōu)選的是，本發(fā)明的多肽和抗體序列中的保守性取代并不會(huì)使含有該氨基酸序列的多肽或抗體與抗原(即，該多肽或抗體所結(jié)合的一種或多種人類卷曲受體)的結(jié)合消失。鑒定不會(huì)消除抗原結(jié)合的核苷酸和氨基酸保守性取代的方法已為本領(lǐng)域所公知(參見(jiàn)例如Brummell等，Biochem. 32:1180-1187 (1993)；Kobayashi 等，Protein Eng. 12(10) : 879-884 (1999)；和 Burks 等，Proc. Natl. Acad. SciUSA 94:· 412-417(1997))。
如在本公開和權(quán)利要求中所用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“一種”包括復(fù)數(shù)形式。應(yīng)了解的是，在本文中用詞語(yǔ)“包括”來(lái)描述實(shí)施方式的任何情況下，還提供了用“由…組成”和/或“基本由…組成”描述的其他類似的實(shí)施方式。本文中在諸如“A和/或B”等短語(yǔ)中使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”意在包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同樣地，在諸如“A、B和/或C”等短語(yǔ)中使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”意在涵蓋每種下述實(shí)施方式:A、B和C ;A、B或C ;A或C ;A或B ;B或C ;A和C ;A和B ;B和C ;僅A ;僅B ;以及僅C?！案邍?yán)謹(jǐn)度條件”可以通過(guò)以下條件來(lái)確定(I)采用低離子強(qiáng)度和高溫度來(lái)洗滌，例如O. 015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸納/0. 1%十二烷基硫酸鈉，50°C ； (2)在雜交過(guò)程中采用變性劑(例如甲酰胺)，例如含O. 1%牛血清白蛋白的50% (體積/體積)甲酰胺/0. 1%聚蔗 糖(Ficoll)A). 1%聚乙烯吡咯烷酮/含750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉的50mM磷酸納緩沖液(pH6. 5)，42°C;或(3)于 42°C采用 50% 甲酰胺、5 X SSC (O. 75MNaCl，0. 075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸納(PH6. 8)、O. 1%焦磷酸鈉、5 X Denhardt溶液、經(jīng)超聲處理的鮭魚精子DNA (50 μ g/ml)、0. 1% SDS和10%硫酸葡聚糖，并且于42°C進(jìn)行洗滌，于55°C置于O. 2 X SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)和50%甲酰胺中，隨后于55 °C進(jìn)行由含有EDTA的O. IXSSC組成的高嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌。II. FZD結(jié)合藥劑本發(fā)明提供與一種或多種人類卷曲受體(FZD)特異性地結(jié)合的藥劑。在本文中將這些藥劑稱為“FZD結(jié)合藥劑”。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑特異性地結(jié)合兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或十種卷曲受體。所述藥劑所結(jié)合的人類卷曲受體可以選自由 FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9 和 FZDlO 組成的組。在某些實(shí)施方式中，所述一種或多種人類卷曲受體包括FZDI、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8。在某些實(shí)施方式中，所述一種或多種人類卷曲受體包括FZD7。在某些實(shí)施方式中，所述一種或多種人類卷曲受體包括FZD5和/或FZD8。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑特異性地結(jié)合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8。FZDl至FZDlO的全長(zhǎng)氨基酸(aa)和核苷酸(nt)序列在本領(lǐng)域中已知，并且還在本文中提供為SEQ ID NO: 26 (FZDI aa)、SEQ ID N0:30(FZD2aa), SEQ ID N0:34(FZD3 aa)、SEQ ID N0:38(FZD4 aa)、SEQ ID N0:42(FZD5 aa)、SEQ IDN0:46(FZD6aa)、SEQ ID N0:50(FZD7 aa)、SEQ ID N0:54(FZD8 aa)、SEQ ID N0:58(FZD9aa), SEQ ID N0:62(FZD10 aa)、SEQ ID NO: 29 (FZDI nt)、SEQ ID N0:33(FZD2 nt)、SEQIDN0:37(FZD3 nt)、SEQ ID N0:41(FZD4 nt)、SEQ ID N0:45(FZD5 nt)、SEQ IDNO :49 (FZD6nt),SEQ ID N0:53(FZD7 nt),SEQ ID N0:57(FZD8 nt),SEQ ID N0:61(FZD9 nt)和SEQ IDN0:65(FZD10 nt)。在某些實(shí)施方式中，本文所述的抗體或其他多肽或藥劑特異性地結(jié)合FZD7。在某些實(shí)施方式中，該抗體、多肽或藥劑還可以與一種或多種其他人類卷曲受體特異性地結(jié)合或發(fā)生交叉反應(yīng)。在某些實(shí)施方式中，本文所述的抗體或其他多肽或藥劑特異性地結(jié)合FZD5。在某些實(shí)施方式中，該抗體、多肽或藥劑還可以與一種或多種其他人類卷曲受體特異性地結(jié)合或發(fā)生交叉反應(yīng)。
在某些實(shí)施方式中，所述藥劑特異性地結(jié)合兩種或更多種人類卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述兩種或更多種人類卷曲受體選自由FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組。在某些實(shí)施方式中，所述兩種或更多種人類卷曲受體包括FZDl和選自由FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組的第二種人類卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述兩種或更多種人類卷曲受體包括FZD2和選自由FZD1、FZD5、FZD7和FZD8組成的組的第二種卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述兩種或更多種人類卷曲受體包括FZD5和選自由FZD1、FZD2、FZD7和FZD8組成的組的第二種卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述兩種或更多種人類卷曲受體包括FZD5和FZD8。在某些實(shí)施方式中，所述兩種或更多種人類卷曲受體包括FZD7和選自由FZD1、FZD2、FZD5和FZD8組成的組的第二種人類卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑特異性地結(jié)合三種或更多種人類卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述三種或更多種人類卷曲受體包括選自由FZDI、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組的三種或更多種卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑還特異性地結(jié)合一種或多種其他人類卷曲受體。 在某些實(shí)施方式中，所述藥劑或抗體特異性地與其所結(jié)合的一種或多種人類卷曲受體中的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)結(jié)合。每種人類卷曲受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的序列在本領(lǐng)域中已知，且還將其提供為 SEQ ID N0:27(FZD1ECD)、SEQ ID N0:31(FZD2 ECD)、SEQ IDN0:35(FZD3 ECD)、SEQ ID N0:39(FZD4 ECD)、SEQ ID NO:43(FZD5ECD)、SEQ ID N0:47(FZD6ECD)、SEQ ID N0:51(FZD7 ECD)、SEQ ID NO:55(FZD8ECD)、SEQ ID N0:59(FZD9 ECD)和SEQID N0:63(FZD10 ECD)。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑或抗體特異性地與其所結(jié)合的人類卷曲受體中的Fri結(jié)構(gòu)域(FRI)(亦稱富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD))結(jié)合。每種人類卷曲受體的Fri結(jié)構(gòu)域的序列在本領(lǐng)域中已知，且還將其提供為SEQ ID NO: 28 (FZD I FRI), SEQ IDN0:32(FZD2FRI),SEQ ID NO:36 (FZD3 FRI)、SEQ ID NO:40(FZD4 FRI),SEQ IDNO:44(FZD5 FRI)、SEQ IDNO:48(FZD6 FRI)、SEQ ID N0:52(FZD7 FRI),SEQ IDN0:56(FZD8 FRI)、SEQ ID N0:60(FZD9FRI)和 SEQ ID NO:64(FZD10 FRI)。在某些實(shí)施方式中，本文所述的FZD結(jié)合抗體或多肽的單個(gè)抗原結(jié)合部位結(jié)合或能夠結(jié)合一種、兩種、三種、四種或五種(或更多種)人類卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合抗體或多肽的單個(gè)抗原結(jié)合部位能夠特異性地結(jié)合選自由FZDl、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8組成的組一種、兩種、三種、四種或五種人類卷曲受體。在某些實(shí)施方式中，所述抗體或多肽的單個(gè)結(jié)合部位特異性地結(jié)合至少FZD5和FZD8。在某些實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合藥劑或抗體結(jié)合一種或多種(例如兩種或更多種、三種或更多種或四種或更多種)人類卷曲受體，且其解離常數(shù)(KD)為約IyM或更低、約IOOnM或更低、約40nM或更低、約20nM或更低或者約IOnM或更低。舉例而言，在某些實(shí)施方式中，本文所述的與一種或多種FZD結(jié)合的FZD結(jié)合藥劑或抗體，與這些FZD結(jié)合的KD為約IOOnM或更低、約20nM或更低或者約IOnM或更低。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑或抗體與FZDU FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一種或多種(例如，1、2、3、4或5種)的每一種結(jié)合的解離常數(shù)為約40nM或更低。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑或抗體與FZDl、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一種或多種的每一種結(jié)合的解離常數(shù)為約IOnM或更低。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑或抗體與FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的每一種結(jié)合的解離常數(shù)為約IOnM或更低。在某些實(shí)施方式中，所述藥劑或抗體與特定FZD結(jié)合的解離常數(shù)是通過(guò)使用固定在Biacore芯片上的FZD-Fc融合蛋白而確定的解離常數(shù),所述融合蛋白含有FZD細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或Fri結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合藥劑或抗體以約InM至約IOnM的解離常數(shù)結(jié)合下述FZD中的一種或多種中的每一種FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8。作為另一種選擇，所述FZD結(jié)合藥劑或抗體以約InM至約IOnM的解離常數(shù)結(jié)合下述FZD中的兩種或更多種(或三種或更多種)？201420242054207和？208。在某些其他實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合藥劑或抗體以約InM至約IOnM的解離常數(shù)結(jié)合FZD5和FZD8中的每一種。在某些實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合藥劑或抗體以至少約3nM的解離常數(shù)與FZD8結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合藥劑或抗體以約3nM至30nM的解離常數(shù)與FZD8結(jié)合。在某些替代性實(shí)施方式中，結(jié)合FZD8解離常數(shù)的可以約為3nM至ΙΟηΜ。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑或抗體結(jié)合一種或多種(例如兩種或更多種、三 種或更多種或四種或更多種)人類卷曲受體，且其EC5tl為約I μ M或更低、約IOOnM或更低、約40ηΜ或更低、約20ηΜ或更低、約IOnM或更低或者約InM或更低。舉例而言，在某些實(shí)施方式中，本文所述的與多于一種FZD結(jié)合的FZD結(jié)合藥劑或抗體相對(duì)于這些FZD的EC5tl為約40ηΜ或更低、約20ηΜ或更低或者約IOnM或更低。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑或抗體相對(duì)于FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一種或多種(例如，1、2、3、4或5種)的EC50為約20nM或更低。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑或抗體相對(duì)于FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8中的一種或多種(例如，1、2、3、4或5種)的EC50為約IOnM或更低。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑或抗體對(duì)于結(jié)合FZD5和/或FZD8的EC5tl為約40nM或更低或者20nM或更低。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑(例如抗體)與下述表位結(jié)合所述表位與具有包含SEQ ID NO: 10的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區(qū)的抗體(例如，18R5或18R8 IgG抗體)的表位相同或重疊。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑或抗體與下述表位結(jié)合所述表位與具有包含SEQ ID NO: 11的重鏈和包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15的輕鏈的抗體的表位相同或重疊。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑與下述表位結(jié)合所述表位與具有包含SEQ ID NO:85的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO:86的輕鏈可變區(qū)的抗體(例如,44R24 IgG抗體)的表位相同或重疊。在某些實(shí)施方式中，在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中FZD結(jié)合藥劑與抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人類卷曲受體的特異性結(jié)合，其中所述抗體具有包含SEQ ID NO: 10的重鏈可變區(qū)和包含SEQID NO: 12或SEQ ID NO: 14的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑與具有包含SEQ ID NO: 11的重鏈和包含SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15的輕鏈的抗體競(jìng)爭(zhēng)，以獲得與人類卷曲受體的特異性結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，與所述藥劑競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人類卷曲受體的特異性結(jié)合的抗體是18R5 IgG抗體。在某些替代性實(shí)施方式中，所述抗體是18R8 IgG抗體。在某些實(shí)施方式中，在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定中FZD結(jié)合藥劑與抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人類卷曲受體的特異性結(jié)合，其中所述抗體具有包含SEQ ID NO:85的重鏈可變區(qū)和包含SEQID NO:86的輕鏈可變區(qū)。在某些實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合藥劑直接競(jìng)爭(zhēng)Wnt對(duì)FZD的結(jié)合或直接抑制Wnt對(duì)FZD的結(jié)合。
在某些實(shí)施方式中，所述FZD結(jié)合藥劑或抗體與被本發(fā)明人命名為生物學(xué)結(jié)合部位(BBS)的人類卷曲受體的至少一部分區(qū)域結(jié)合(圖9，實(shí)施例6)。在人類FZD8(SEQIDNO :54)中，所述 BBS 由下述(a)、(b)和(c)組成(a)由氨基酸 72 (F)、74 至 75 (PL)、78 (I)、92 (Y)、121 至 122 (LM)和 129 至 132 (WPDR(SEQ ID NO:70))構(gòu)成的構(gòu)象表位(圖 8 和圖 9中所示的BBS的“裂縫”)；(b)由序列GLEVHQ(SEQ ID NO: 25)組成的FZD8的區(qū)域(圖8和圖9中所示的BBS的“上邊緣”)；和(c)由序列YGFA(SEQ ID NO:74)組成的FZD8的區(qū)域(圖8和圖9中所示的BBS的“下邊緣”)。位于FZDl至FZD7、FZD9和FZDlO上的BBS的相應(yīng)殘基在下表I和圖8中示出。在某些實(shí)施方式中，阻斷配體(例如Wnt)與FZD結(jié)合的藥劑抑制該配體與BBS的結(jié)合。應(yīng)了解的是，在某些實(shí)施方式中，與BBS的至少一部分結(jié)合的藥劑還結(jié)合人類卷曲受體上的一種或多種其他區(qū)域(即，在BBS之外)。換言之，在某些實(shí) 施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑或抗體所結(jié)合的表位是位于FZD受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中與BBS重疊但并不完全包含于BBS中的區(qū)域。在某些替代性實(shí)施方式中，F(xiàn)ZD結(jié)合藥劑或抗體所結(jié)合的表位完全包含于BBS中(即，BBS包含F(xiàn)ZD結(jié)合抗體或其他藥劑所結(jié)合的整個(gè)表位)。表I :FZD受體的生物學(xué)結(jié)合部位(BBS)。
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，所述多肽包含人類卷曲受體的Fri結(jié)構(gòu)域，其中，所述Fri結(jié)構(gòu)域與野生型Fri結(jié)構(gòu)域相比具有在生物學(xué)結(jié)合部位(BBS)中的一個(gè)或多個(gè)取代。
2.如權(quán)利要求I所述的多肽，所述多肽與包含所述卷曲受體的所述野生型Fri結(jié)構(gòu)域的多肽相比具有減弱的與fct的結(jié)合親和力。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其中，所述Wnt是Wnt3A。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，所述野生型Fri結(jié)構(gòu)域包括具有選自由SEQ ID NO. 117至SEQ ID NO. 126組成的組的序列的多肽。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，所述野生型Fri結(jié)構(gòu)域包括具有選自由 SEQ ID NO. 28、32、36、40、44、48、52、56、60 和 64 組成的組的序列的多肽。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，所述多肽包含在選自表16的裂縫殘基的部位處的取代。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，所述一個(gè)或多個(gè)取代包括在選自表17的部位處的一個(gè)或多個(gè)取代。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，所述一個(gè)或多個(gè)取代包括疏水性弱于在所述野生型FZD Fri結(jié)構(gòu)域序列的相應(yīng)位置處的氨基酸的疏水性的氨基酸殘基。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，所述多肽還包括Fe區(qū)域。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，所述人類FZD受體是FZD4、FZD5或FZD8。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽，其中，所述人類FZD受體是FZD8。
12.如權(quán)利要求11所述的多肽，其中，所述一個(gè)或多個(gè)取代包括在F72、L75、178或L121處的取代。
13.如權(quán)利要求12所述的多肽，其中，所述一個(gè)或多個(gè)取代包括在L75處的取代。
14.如權(quán)利要求12或13所述的多肽，其中，所述一個(gè)或多個(gè)取代包括F72Y、L75S、I78S或 L121S。
15.一種篩選具有作為fct信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的可能活性的化合物的方法，所述方法包括 確定化合物對(duì)于第一多肽的結(jié)合親和力，所述第一多肽是前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的多肽； 確定所述化合物對(duì)于包含所述野生型Fri結(jié)構(gòu)域的第二多肽的結(jié)合親和力； 將所述化合物對(duì)于所述第一多肽的結(jié)合親和力與所述化合物對(duì)于所述第二多肽的結(jié)合親和力進(jìn)行比較； 其中，如果所述化合物對(duì)于所述第二多肽的親和力大于其對(duì)于所述第一多肽的親和力，則將該化合物鑒定為fct信號(hào)傳導(dǎo)的可能抑制劑。
16.一種分離的多肽，所述多肽包含下述序列該序列與選自由SEQ ID NO:98至SEQID NO: 111和SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 116組成的組的序列具有至少為約80%的同一性。
17.一種分離的多肽，所述多肽包含選自由SEQ ID NO:98至SEQ ID NO:112組成的組的序列。
18.如權(quán)利要求17所述的多肽，所述多肽包含SEQID NO: 112。
19.如權(quán)利要求18所述的多肽，所述多肽包含SEQID NO: 108。
20.如權(quán)利要求17所述的多肽，所述多肽基本由選自由SEQID NO:98至SEQ IDNO: 112組成的組的環(huán)狀肽組成。
21.如權(quán)利要求20所述的多肽，所述多肽基本由環(huán)狀肽SEQID NO: 108組成。
22.—種分離的多肽，所述多肽包含選自由SEQ ID NO: 113至SEQ ID NO: 116組成的組的序列。
23.如權(quán)利要求22所述的多肽，所述多肽基本由選自由SEQID N0:113至SEQIDNO: 116組成的組的序列組成。
24.如權(quán)利要求16至19以及22中任一項(xiàng)所述的多肽，所述多肽長(zhǎng)度小于約100個(gè)氨基酸。
25.如權(quán)利要求24所述的多肽，所述多肽長(zhǎng)度為約5個(gè)氨基酸至約20個(gè)氨基酸。
26.如權(quán)利要求16至25所述的多肽，所述多肽是經(jīng)修飾的多肽。
27.如權(quán)利要求26所述的多肽，所述多肽帶有標(biāo)記。
28.如權(quán)利要求16至27中任一項(xiàng)所述的多肽，所述多肽是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑。
29.—種包含權(quán)利要求16至28中任一項(xiàng)所述多肽的藥劑。
30.一種篩選具有作為Wnt信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的可能活性的化合物的方法，所述方法包括 確定所述化合物是能否夠與權(quán)利要求16至28中任一項(xiàng)所述多肽競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人類FZD受體的結(jié)合，其中，所述化合物與所述多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的能力表明所述化合物具有作為fct信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的可能活性。
31.一種篩選具有作為fct信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的可能活性的化合物的方法，所述方法包括 確定所述化合物是否能夠?qū)?quán)利要求16至28中任一項(xiàng)所述的多肽從所述人類FZD受體的BBS中置換下來(lái)，其中所述化合物置換所述多肽的能力表明所述化合物具有作為Wnt信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的可能活性。
32.如權(quán)利要求30或31所述的方法，其中，所述人類FZD受體是FZD8。
33.如權(quán)利要求30至32中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述人類FZD受體是可溶性形式。
34.一種通過(guò)權(quán)利要求15和30至33中任一項(xiàng)所述的方法鑒定的藥劑。
35.一種與人類FZD受體結(jié)合的分離的藥劑，其中，所述藥劑對(duì)于權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)所述的多肽結(jié)合親和性與其對(duì)于包含人類FZD受體的野生型Fri結(jié)構(gòu)域的多肽的結(jié)合親和力下降。
36.一種分離的藥劑，所述藥劑與權(quán)利要求16至28中任一項(xiàng)所述的多肽競(jìng)爭(zhēng)對(duì)人類FZD受體結(jié)合。
37.如權(quán)利要求35至36中任一項(xiàng)所述的藥劑，其中，所述人類FZD受體是FZD8。
38.如權(quán)利要求34至37中任一項(xiàng)所述的藥劑，所述藥劑包括多肽。
39.如權(quán)利要求38所述的藥劑，所述藥劑包括抗體。
40.如權(quán)利要求38所述的藥劑，所述藥劑不是抗體。
41.如權(quán)利要求38所述的藥劑，其中，所述多肽長(zhǎng)度小于約100個(gè)氨基酸。
42.如權(quán)利要求41所述的藥劑，其中，所述多肽長(zhǎng)度為約5個(gè)氨基酸至20個(gè)氨基酸。
43.如權(quán)利要求38至42中任一項(xiàng)所述的藥劑，其中，所述多肽是經(jīng)修飾的多肽。
44.如權(quán)利要求34至37中任一項(xiàng)所述的藥劑，其中，所述藥劑包括脂質(zhì)。
45.如權(quán)利要求34至44中任一項(xiàng)所述的藥劑，所述藥劑具有小于約2000道爾頓的分子量。
46.如權(quán)利要求34至45中任一項(xiàng)所述的藥劑，所述藥劑抑制Wnt與人類FZD受體的結(jié)入口 ο
47.如權(quán)利要求46所述的藥劑，其中，所述Wnt是Wnt3a。
48.如權(quán)利要求34至47中任一項(xiàng)所述的藥劑，所述藥劑抑制經(jīng)典的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。
49.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求16至29和34至48中任一項(xiàng)所述的多肽或藥劑。
50.—種抑制細(xì)胞中Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的方法,所述方法包括用有效量的權(quán)利要求16至29和34至48中任一項(xiàng)所述的多肽或藥劑接觸所述細(xì)胞。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述Wnt信號(hào)傳導(dǎo)是經(jīng)典的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。
52.—種誘導(dǎo)細(xì)胞分化的方法，所述方法包括用有效量的權(quán)利要求16至29和34至48中任一項(xiàng)所述的多肽或藥劑接觸所述細(xì)胞。
53.如權(quán)利要求50至52中任一項(xiàng)所述的方法，所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
54.—種抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法，所述方法包括用有效量的權(quán)利要求16至29和34至48中任一項(xiàng)所述的多肽或藥劑接觸所述腫瘤。
55.一種治療與Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的活化有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的權(quán)利要求16至29和34至48任一項(xiàng)所述的多肽或藥劑。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中，所述疾病是癌癥。
57.如權(quán)利要求55所述的方法，其中，所述疾病是多囊腎病。
58.一種治療多囊腎病的方法，所述方法包括對(duì)受試者施用有效量的與人類FZD受體的BBS結(jié)合的藥劑。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中，所述藥劑是18R5。
60.一種降低腫瘤的致瘤性的方法，所述方法包括用有效量的如權(quán)利要求16至29和34至48中任一項(xiàng)所述的多肽或藥劑接觸所述腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明提供了與人類卷曲受體結(jié)合的新型抗癌藥劑，所述藥劑包括但不限于抗體和其他多肽。還鑒定了人類卷曲受體中的適合作為抗癌藥劑靶標(biāo)的新型表位。另外還提供了使用所述藥劑或抗體的方法，例如使用所述藥劑或抗體來(lái)抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和/或抑制腫瘤生長(zhǎng)的方法。還提供了篩選方法。
文檔編號(hào)C07K14/00GK102971337SQ201180024546
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月1日
發(fā)明者奧斯丁·L·格尼 申請(qǐng)人:昂考梅德藥品有限公司