專利名稱：一種集胞藻蛋白的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種集胞藻蛋白的新用途。
背景技術(shù)：
全球溫室氣體的急劇增加導(dǎo)致的氣候變化和環(huán)境惡化，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量，對世界范圍的糧食供給造成的威脅日益增大。近年來，由于能源短缺發(fā)展以糧食為基礎(chǔ)的替代能源也加劇了糧食緊缺。2008年末，世界谷物庫存已降至4. 05億噸，是近25年來的最低水平。在我國，農(nóng)業(yè)資源人均占有量很低，2006年全國可耕地面積已減至接近18億畝的紅線。在可耕地面積的日益減少的背景下，提高主要農(nóng)作物單位面積產(chǎn)量，是解決我國糧食問題最現(xiàn)實(shí)、最有效、最根本的途徑。由于作物中90%以上的干物質(zhì)來源于光合作用，因此，作物產(chǎn)量的高低很大程度上取決于其光合效率。 藍(lán)藻是一種古老的光合生物，其細(xì)胞具有二氧化碳濃縮機(jī)制(CCM)。通過該機(jī)制藍(lán)藻能夠提高CO2同化的關(guān)鍵酶Rubisco活性部位周圍的CO2濃度，克服自身Rubisco對CO2的低親和力，有效的同化CO2，從而提高的高光合作用效率。新近的研究發(fā)現(xiàn)，將與CCM有關(guān)的藍(lán)藻基因轉(zhuǎn)入高等植物擬南芥，能夠通過改善養(yǎng)分水分利用效率提高其光合效率，這一作用機(jī)制在以水稻為代表的單子葉植物中是否有效仍不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供序列表中序列2所示的蛋白在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了序列表中序列2所示的蛋白在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。本發(fā)明的另一個目的是提供序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用；所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與I)所不的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。本發(fā)明的又一個目的是提供含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了含有序列表中序列2所不蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在提聞植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。
所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻；所述重組表達(dá)載體為在pH7WG2D，l載體的att R位點(diǎn)插入了序列表中序列2所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏校玫睫D(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物與目的植物相比葉綠素含量提高和/或旗葉長度增加。所述序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因是通過含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中的。所述含有序列表中序列2所不蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體為在pH7WG2D, I載體的att R位點(diǎn)插入了序列表中序列2所示蛋白的編碼基因得到的重組表達(dá)載體。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。本發(fā)明從集胞藻(Synechocystis PCC 6803)中克隆了基因slll594。將該基因?qū)胨镜霓D(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明，轉(zhuǎn)入S111594基因的水稻葉綠素含量明顯提高，旗葉長度明顯增加，說明S111594基因及其編碼產(chǎn)物對于培育葉綠素含量提高和旗葉長度增長的作物新品種具有重要的理論及實(shí)際意義，可用于農(nóng)業(yè)高產(chǎn)植物品種的培育。


圖I為重組表達(dá)載體pH7WG2D，l_slll594的示意圖。圖2為TO代轉(zhuǎn)Si 11594基因水稻植株的PCR檢測結(jié)果。圖3為TO代轉(zhuǎn)S111594基因水稻植株的Western blot分析。圖4為轉(zhuǎn)基因Tl代萌發(fā)種子的GFP熒光檢測。圖5為轉(zhuǎn)Si 11594基因水稻Tl代葉綠素含量和旗葉長度分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、過表達(dá)S111594基因提高轉(zhuǎn)基因水稻的葉綠素含量和增加轉(zhuǎn)基因水稻的旗葉長度一、si 11594表達(dá)水稻植株的獲得和鑒定I、過表達(dá)S111594基因載體的構(gòu)建提取對數(shù)生長期的集胞藻(Synechocystis PCC 6803)(公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是Zhang LF et al. Proteomic analysis ofplasma membranes of cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803 in responseto high pH stress. J Proteome Res. 2009)細(xì)胞的DNA,以其為模板,通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增基因S111594，在轉(zhuǎn)基因受體植物水稻中未發(fā)現(xiàn)高同源性基因。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離回收后，連接到基因克隆載體PMD18并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對獲得的單克隆菌落的質(zhì)粒測序分析。擴(kuò)增引物上游引物F : 5 ’ -ATGCAAGCAACCTTACACC-3，，下游引物 R : 5 ’ -TTAAAGAACTAACTTCACAGGGGTTTG-3’。反應(yīng)體系DNA(ly g/μ I) I. O μ 1，上游引物F和下游引物R(10 μ Μ)各 I. Ομ 1，dNTP(2. 5mM)4. Ομ 1，ddH20 37. 5 μ 1，rTaqO. 5 μ I (Takara 公司)，IOXPCRbuffer (Mg2+Plus) 5 μ I。反應(yīng)程序94°C 4min, (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)30 個循環(huán)，72°C IOrnin0 PCR 產(chǎn)物純化回收(TIANgen Midi Purification Kit 瓊脂糖凝膠 DNA 回收試
劑盒)。將上述回收產(chǎn)物與克隆載體pMD18 (Takara pMD18_T VECTOR試劑盒)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明該P(yáng)CR產(chǎn)物與NCBI數(shù)據(jù)庫中S111594基因(Gene ID 954586)序列相同。slll594基因的核昔酸序列為序列表中序列I所不,該基因的編碼區(qū)為序列表中序列I自5’末端第1-951位核苷酸，該序列所編碼的S111594蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。將回收得到的PCR產(chǎn)物連接到PCR8/GW/T0P0載體(購自Invitrogen公司，目錄號K252002)attL位點(diǎn)上，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，在PCR8/GW/T0P0載體的attL位點(diǎn)上插入了序列表中序列I所示的核苷酸序列。利用LR Clonase II (購自Invitrogen公司，目錄號11791-020),通過位點(diǎn)特異重組將目的基因整合到表達(dá)載體 PH7WG2D，I (公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是=ZhuboDai et al, Cloning and characterization of a noveI3-hydroxy-3-methylglutaryIcoenzyme A reductase gene from Salvia miltiorrhiza involved in diterpenoidtanshinone accumulation. Journal of Plant Physiology[J]. 2011)的 att R 位點(diǎn)，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(上游引物F:5’ -TACCCAGCCGACCGTTTC-3’，下游引物 R :5’ -GCACCCGCACATCCACATA-3’)，獲得了 569bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物。同時，將陽性克隆進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序結(jié)果表明在載體pH7WG2D，l的att R位點(diǎn)插入了序列表中序列I所示的slll594基因片段，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確，將重組載體命名為pH7WG2D，l-slll594(圖1，p35S :啟動子，T35S :終止子，HygB :潮霉素抗性基因，Sm/SpR :壯觀霉素抗性基因，EgfpER :綠色熒光蛋白基因，prolD :來自農(nóng)桿菌的根表達(dá)啟動子)。重組載體pH7WG2D，1-sl11594是以組成性表達(dá)的35S為啟動子，增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因，具有潮霉素和壯觀霉素抗性基因，可通過潮霉素和壯觀霉素進(jìn)行篩選。2、含目的基因的農(nóng)桿菌的獲得提取驗(yàn)證正確的克隆中的重組質(zhì)粒pH7WG2D，l_slll594，通過電擊轉(zhuǎn)化法，把重組質(zhì)粒pH7WG2D，l-slll594轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)菌株EHA105 (公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是Y.-M. Bi et al. Resistance to Botrytiscinerea in scented geranium transformed with a gene encoding the antimicrobialprotein Ace-AMPl. Plant Cell Reports [J]. 1999)。具體方法如下取2mL農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)ΕΗΑ105菌液轉(zhuǎn)接于IOOml LB液體培養(yǎng)基(含50 μ g/ml鏈霉素)中，281、2501^111振蕩培養(yǎng)至0D600在O. 5到I之間。將農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)入無菌50ml離心管中，AUOOOrpm離心5min，去上清液。用20mL預(yù)冷的HEPES (lmM，pH7. 0)重懸，4°C、4000rpm離心5min，去上清液，重復(fù)2 3次。用2mL預(yù)冷的10%甘油重懸。每管100 μ I分裝于I. 5ml無菌Eppendorf管中。加入2 μ I重組載體pH7WG2D，l_slll594質(zhì)粒于上述Eppendorf管中，用槍頭輕輕攪拌混勻。取出細(xì)胞與質(zhì)粒的混合物轉(zhuǎn)入電擊杯中(_20°C預(yù)冷)，在2500V 5ms下電擊。取出電擊杯，加入500 μ I預(yù)冷的LB培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，吸出菌液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，28°C，200rpm培養(yǎng)2h。將菌液涂布與平板上(鏈霉素50 μ g/mL、潮霉素50 μ g/mL、壯觀霉素50 μ g/mL) 28 V 2天，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(上游引物 F :5’ -TACCCAGCCGACCGTTTC-3’，下游引物 R :5’ -GCACCCGCACATCCACATA-3’)。將正確的菌株(即獲得了 569bp的擴(kuò)增產(chǎn)物)用于水稻的轉(zhuǎn)化。3、轉(zhuǎn)基因水稻的獲得 水稻(中花11)(公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得，記載過該材料的非專利文獻(xiàn)是朱旭東.水稻中花11輻射突變體的分離與鑒定.中國水稻科學(xué)[J].2003)種子去殼用30% NaClO浸15min，用Iml槍將殘留的溶液吸干凈。重復(fù)該步驟，無菌水沖洗3_5次。用Iml槍將殘留的水吸干凈。將滅菌后的種子接種于N6D培養(yǎng)基上，32°C持續(xù)光照培養(yǎng)一周左右。去除芽和殘留胚乳繼代培養(yǎng)的很小的顆粒愈傷(10-20天)用于轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)入 pH7WG2D, 1-S111594 載體的農(nóng)桿菌 EHA105 菌株，在 YEB+Rif (25_50mg/L)+Kan(50mg/L)培養(yǎng)基上28°C暗培養(yǎng)2 3天。挑單菌落于3 5mLYEB+Kan+Rif培養(yǎng)基中，28°C暗培養(yǎng)約24hrs。取500 μ L接于50mL AAM培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)至0D600約O. I。將上述去除芽和殘留胚乳進(jìn)行繼代培養(yǎng)的愈傷組織浸于農(nóng)桿菌菌液中，立即用鑷子取出置于無菌濾紙上吸去多余菌液，吹干。愈傷接于N6D-As培養(yǎng)基(N6D培養(yǎng)基中含有10mg/mL乙酰丁香酮)，培養(yǎng)基上預(yù)先墊一層浸有AAM(O. 5毫升即可)的無菌濾紙。用保鮮膜將培養(yǎng)皿包好置于25°C暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)后的愈傷先用無菌水沖洗2-3次，再用含500mg/L羧芐的無菌水沖洗2_3次，并用之浸泡30分鐘左右(若浸染愈傷的菌液濃度0D600 > O. 1，可將浸泡時間增加到I小時左右，30分鐘左右更換一次)。無菌濾紙上吸去水分，并吹干。接種于含50mg/L潮霉素B和400mg/L羧芐的N6DS培養(yǎng)基(用于選擇陽性克隆，N6D培養(yǎng)基中加入50mg/L潮霉素B和400mg/L羧芐)上32°C持續(xù)光照培養(yǎng)兩周。將生長旺盛的愈傷轉(zhuǎn)移到含50mg/L潮霉素B和250mg/L羧芐的再生培養(yǎng)基上32°C持續(xù)光照培養(yǎng)誘導(dǎo)分化。轉(zhuǎn)移分化出的幼苗至含50mg/L潮霉素B和200mg/L羧芐的MS-HF培養(yǎng)基(在MS培養(yǎng)基中加入30g/L蔗糖)上誘導(dǎo)生根，從而得到Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻株系。共侵染270個愈傷組織，得到了 164個帶有報(bào)告基因的愈傷組織。按照獲得轉(zhuǎn)S111594基因水稻的方法，用空載體pH7WG2D，I轉(zhuǎn)化水稻植株，得到轉(zhuǎn)空載體對照水稻Ttl代植株。同時，設(shè)水稻(中花11)為野生型對照。提取TO代轉(zhuǎn)基因水稻株系的基因組DNA并通過PCR對外源基因進(jìn)行分子檢測(上游引物 F :5’ -TACCCAGCCGACCGTTTC-3’，下游引物 R :5’ -GCACCCGCACATCCACATA-3’ )，檢測結(jié)果見圖2(圖2中，泳道M :D2000，泳道CK :轉(zhuǎn)空載體水稻，泳道wt :中花11，泳道I-泳道33 :轉(zhuǎn)基因水稻株系)，從圖2中可見，與轉(zhuǎn)空載體對照水稻Ttl代植株和野生型對照水稻相t匕，TO代轉(zhuǎn)基因水稻植株中均獲得了 569bp的目的基因片段，說明泳道I-泳道33均為陽性轉(zhuǎn)基因植株，共獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株33株。對其中11株轉(zhuǎn)S111594基因陽性植株進(jìn)行免疫印跡雜交反應(yīng)檢測(所用抗體序列如序列表中序列3所示,購自Abmart Bioinformatics center公司)，結(jié)果如圖3所示(圖3中泳道M :分子量marker，泳道CK :轉(zhuǎn)空載體水稻，泳道wt :中花11，泳道2-泳道29 轉(zhuǎn)基因水稻株系)，由圖3可見，在9株TO代轉(zhuǎn)基因株系(2、11、14、15、17、23、24、25、29)中檢測到大小為35. 7kD的外源基因S111594編碼的蛋白。將上述9株TO代轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行自交獲得其種子(即T1代轉(zhuǎn)基因水稻)。對5個株系T1代幼苗的報(bào)告基因GFP進(jìn)行檢測，檢測方法如下將Ttl代種子(即1\代)置于30°C，黑暗條件下萌發(fā)后，用400nm激發(fā)波激發(fā)并在470nm發(fā)射波下，觀察是否有綠色熒光。結(jié)果如圖4所示(圖4中，A :轉(zhuǎn)入基因水稻，B :中花11)，在轉(zhuǎn)基因水稻中觀察到綠色熒光蛋白所發(fā)出的綠色，而野生型對照水稻中花11中未觀察到綠色。選取遺傳性狀分離比為3 I的株系(表I)，并將該株系中有報(bào)告基因GFP表型的Tl代轉(zhuǎn)基因水稻苗的成活幼苗移至溫室培養(yǎng)。結(jié)果共獲得了 5株T1代轉(zhuǎn)si 11594基因陽性株系。表I轉(zhuǎn)基因T1代分離比及拷貝數(shù)分析
權(quán)利要求
1.序列表中序列2所示的蛋白在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。
3.序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用；所述蛋白的編碼基因?yàn)槿缦?)-3)中任一所述的基因 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)在嚴(yán)格條件下與I)所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 3)與I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。
5.含有序列表中序列2所不蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體在提聞植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。
7.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物與目的植物相比葉綠素含量提高和/或旗葉長度增加。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因是通過含有序列表中序列2所示蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中的。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種集胞藻蛋白的新用途。本發(fā)明提供了序列表中序列2所示的蛋白在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了序列表中序列2所示的蛋白的編碼基因在提高植物葉綠素含量和/或增加植物旗葉長度中的應(yīng)用。本發(fā)明將sll1594基因?qū)胨镜霓D(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明，轉(zhuǎn)入sll1594基因的水稻葉綠素含量和旗葉長度明顯提高，說明sll1594基因及其編碼產(chǎn)物對于培育光合作用增強(qiáng)的作物新品種具有重要的理論及實(shí)際意義，可用于農(nóng)業(yè)高產(chǎn)植物品種的培育。
文檔編號C07K14/405GK102977198SQ201110258388
公開日2013年3月20日 申請日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者黃芳, 楊浩萌, 趙樂, 薛哲勇, 周荷益, 漆小泉 申請人:中國科學(xué)院植物研究所