專利名稱：一種暹羅鱷血液提取物及其提取方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種鱷魚血液提取物及其提取方法和用途，屬醫(yī)藥技術領域。
背景技術：
鱷魚血富含多種生物活性成分，是寶貴的生物資源，蘊藏著巨大的開發(fā)潛力和利用價值。我國古代稱鱷魚為“鼉龍”，又名鉈魚(《神農本草經》)、土龍(《續(xù)博物志》)。暹羅鱷魚是鱷魚的一種，主要分布于泰國中部、柬埔寨、馬來西亞、印度尼西亞婆羅洲(舊稱加里曼丹)東部等地?，F(xiàn)代對鱷魚的深入研究從未停止，鱷魚血的研究在全球是廣泛共識的。目前主要被用于三個方面的研究利用中1、抗菌、抗病毒，2、抗腫瘤，3運動醫(yī)學。研究結果表明，鱷魚是地球上唯一不患癌癥的動物，是目前爬行動物中最長壽的一種。它具有超強的生命力和‘長生不老’的生命特征。鱷魚血具有殺菌、抗輻射、抗衰老的作用，同時，它還是一種全新的、強力的、唯一的對人體無任何傷害的超級補體。它在本世紀必定會為人類的健康做出重大的貢獻。因此如何利用現(xiàn)有的資源開發(fā)鱷魚血，是一項值得研究的項目。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種暹羅鱷血液提取物；本發(fā)明的第二個目的是提供一種暹羅鱷血液提取物的提取方法；本發(fā)明的第三個目的是提供一種暹羅鱷血液提取物在藥物制備中的新用途。本發(fā)明目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明所述暹羅鱷血液提取物是以新鮮鱷魚動脈血為原料，通過如下步驟提取的a.將鱷魚血進行抗凝處理，分離血漿；b.飽和硫酸銨法粗提免疫球蛋白；c. DEAE-52陰離子交換層析純化免疫球蛋白，即得。所述步驟a可按如下方法操作取經檢驗合格的新鮮鱷魚動脈血，用3. 5% 4%的檸檬酸鈉溶液與血液按體積比1 8 10混合抗凝，靜置0. 5 1. 5h，將抗凝血置于冷凍離心機，在2 10°C轉速 3000r/min下，離心8 15min，收集上清液，得到血漿。所述步驟b可按如下方法操作1)取血漿，加0. Olmol/L、pH值7. 0的PBS緩沖溶液，再逐滴加入(NH4) 2S04飽和溶液，邊加邊攪拌，使成為30% (NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4°C下靜置0. 5 1.釙；2)在2 10°C轉速10000r/min下，離心15 25min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白原，得到上清液；3)在上清液中再加(NH4) 2S04飽和溶液，使(NH4) 2S04終濃度為50%，充分混合，靜置 1. 5 2. 5h ；
4)在2 10°C轉速10000r/min下，離心15 25min，得到蛋白沉淀；5)于蛋白沉淀中加0. 01mol/L、pH值7. O的PBS緩沖溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4 飽和溶液，使成33% (NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4°C下靜置1. 5 2. 5h ；6)在2 10°C轉速10000r/min下，離心15 25min，分別取蛋白沉淀，上清液；7)重復步驟5)和6)2 3次，收集末次沉淀物即為免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除鹽，_20°C保存。所述步驟c可按如下方法操作將溶解的免疫球蛋白粗提物經DEAE_52(中文名稱二乙氨基乙基纖維素)進行純化，柱長15cm，直徑1cm，鹽梯度洗脫，緩沖液為pH7. 2的buffer A(50mMPB+2M NaCL) (MPB 代表醋酸鹽緩沖液乙睛=5 95)，洗脫時NaCl濃度由O至l.Omol ·Ι^，洗脫流速為 0. 3mL · mirT1，每管1. 5mL，收集蛋白峰，即得。本發(fā)明所述暹羅鱷血液提取物優(yōu)選如下方法提取a.將鱷魚血進行抗凝處理，分離血漿取經檢驗合格的新鮮鱷魚動脈血，用3. 8%的檸檬酸鈉溶液與血液按體積比1 9 混合抗凝，靜置lh，將抗凝血置于冷凍離心機，在6°C轉速3000r/min下，離心lOmin，收集上清液，得到血漿；b.飽和硫酸銨法粗提免疫球蛋白1)取血漿，加0. Olmol/L、pH值7. O的PBS緩沖溶液，再逐滴加入(NH4)2SCM飽和溶液，邊加邊攪拌，使成為30% (NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4°C下靜置Ih ；2)在6°C轉速lOOOOr/min下，離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白原，得到上清液；3)在上清液中再加(NH4) 2S04飽和溶液，使(NH4) 2S04終濃度為50%，充分混合，靜置2h ；4)在6°C轉速10000r/min下，離心20min，得到蛋白沉淀；5)于蛋白沉淀中加0. 01mol/L、pH值7. O的PBS緩沖溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4 飽和溶液，使成33% (NH4)#04溶液，充分混合后，于4°C下靜置池；6)在6°C轉速lOOOOr/min下，離心20min，分別取蛋白沉淀，上清液；7)重復步驟5)和6) 2次，收集末次沉淀物即為免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除鹽，-20°C保存。c. DEAE-52陰離子交換層析純化免疫球蛋白將溶解的免疫球蛋白粗提物經DEAE_52( 二乙氨基乙基纖維素)進行純化，柱長 15cm，直徑1cm，鹽梯度洗脫，緩沖液為pH7. 2的buffer A(50mMPB+2M NaCL)，洗脫時NaCl 濃度由O至1. Omol · L—1，洗脫流速為0. 3mL · mirT1，每管1. 5mL，收集蛋白峰，即得。本發(fā)明所述飽和硫酸銨溶液和0. Olml/L、pH值7. O的磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS) 可按常規(guī)的方法配制，也可按本發(fā)明提供的如下方法配制飽和硫酸銨溶液的配制稱(NH4) 2S04 (AR級別)400 425重量份，以50 80°C 蒸餾水500體積份溶解，攪拌20min，趁熱過濾；冷卻后以15N NH4OH的濃氨水調PH至7. 4。 配制好的飽和硫酸銨，瓶底應有結晶析出。0. 01ml/L、pH值7. O的磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制稱7. 9重量份NaCl，0. 2重量份KCl，0. 24重量份KH2PO4和1. 8重量份K2HPO4,溶于800體積份蒸餾水中，用HCl調節(jié)溶液的PH值至7. 0，最后加蒸餾水定容至10000體積份，4°C保存即可。0. 24重量份KH2PO4可用1. 44重量份Na2HPO4代替。本發(fā)明所述重量份/體積份的單位對應關系為g/ml。本發(fā)明所述鱷魚指暹羅鱷。本發(fā)明所述暹羅鱷血液提取物可制備成注射制劑肌肉注射劑、靜脈注射劑、凍干粉針劑等。本發(fā)明所述暹羅鱷血液提取物采用飽和硫酸銨法提取，并用DEAE-52陰離子交換層析純化，所提取得的免疫蛋白提取物與HIV-I整合酶結合具有特異性，實驗證明具有抗 HIV-I活性和抗甲型Hmi流感病毒活性的作用，可用于治療艾滋病和甲型Hmi流感。


圖Ie樣品結合Hiv-I整合酶蛋白比較圖譜(注整合酶蛋白(全長)BIA結合值為 9808. 9RU。)圖2DEAE-52陰離子交換層析純化免疫球蛋白所得蛋白峰下述實驗例和實施例用于進一步說明但不限于本發(fā)明。實驗例1利用BIAcore技術對本發(fā)明鱷魚血提取物與HIV-I整合酶的結合進行研究1.樣品的制備(1)95% 乙醇分別提取樣品 el、e2、e3、e7、e8①鱷魚血的抗凝處理、紅細胞和血漿的分離取經檢驗合格的新鮮鱷魚動脈血，用3. 8%的檸檬酸鈉溶液與血液按體積比1 9 混合抗凝，靜置lh，將抗凝血置于冷凍離心機，在2 10°C轉速3000r/min下，離心lOmin， 收集上清液，得到血漿el。②95%乙醇提取取血漿el，加入95 %乙醇，在O 4°C，攪拌，2h，轉速3000r/min下，離心lOmin， 分別得到上清液為e2，沉淀為e3。沉淀e3再加入95%乙醇，攪拌離心得到e7，重復一次， 得到e8。(2)飽和硫酸銨法提取按實施例1所述方法分別提取樣品e4、e5、e6。2.實驗方法(1)整合酶靶蛋白與芯片表面耦聯(lián)①活化將NHS與EDC混合離心后上樣，活化芯片表面的葡聚糖。②耦聯(lián)蛋白將靶蛋白上樣與芯片耦聯(lián)。③封閉將封閉液離心后上樣，以封閉芯片表面未與蛋白結合的部位。(2) SPR分析將準備好的樣品上樣進行SPR檢測。一個SPR循環(huán)包括待檢樣品的注入(結合期)，緩沖液流經芯片表面(解離期)，洗脫與芯片表面靶蛋白結合的樣品(再生期)。每一時期的響應值RU(1RU的響應值等價于芯片表面結合物質的濃度改變了 Ipg/ mm2)實時檢測，經Sra分析最終得出各種樣品與靶蛋白結合值的大小及圖譜。
3、實驗結果結果見表1、圖1。表1鱷魚血提取物與HIV-I整合酶蛋白結合的RU值
權利要求
1.一種暹羅鱷血液提取物，其特征在于該提取物是以新鮮鱷魚動脈血為原料，通過如下步驟提取a.將鱷魚血進行抗凝處理，分離血漿；b.飽和硫酸銨法粗提免疫球蛋白；c.DEAE-52陰離子交換層析純化免疫球蛋白，即得。
2.如權利要求1所述的暹羅鱷血液提取物，其特征在于所述步驟a按如下方法操作 取經檢驗合格的新鮮鱷魚動脈血，用3. 5% 4%的檸檬酸鈉溶液與血液按體積比1 8-10混合抗凝，靜置0. 5 1. 5h，將抗凝血置于冷凍離心機，在2 10°C轉速3000r/ min下，離心8 15min，收集上清液，得到血漿。
3.如權利要求1所述的暹羅鱷血液提取物，其特征在于所述步驟b按如下方法操作1)取血漿，加0.01mol/L、pH值7. 0的PBS緩沖溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液， 邊加邊攪拌，使成為30% (NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4°C下靜置0. 5 1.釙；2)在2 10°C轉速lOOOOr/min下，離心15 25min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白原，得到上清液；3)在上清液中再加(NH4)2SO4飽和溶液，使(NH4)2SO4終濃度為50%，充分混合，靜置 1. 5 2. 5h ；4)在2 10°C轉速10000r/min下，離心15 25min，得到蛋白沉淀；5)于蛋白沉淀中加0.Olmol/L、pH值7. 0的PBS緩沖溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4飽和溶液，使成33% (NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4°C下靜置1. 5 2. a ；6)在2 10°C轉速10000r/min下，離心15 25min，分別取蛋白沉淀，上清液；7)重復步驟幻和6)2 3次，收集末次沉淀物即為免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除鹽，-20°C保存。
4.如權利要求1所述的暹羅鱷血液提取物，其特征在于所述步驟c按如下方法操作 將溶解的免疫球蛋白粗提物經DEAE-52進行純化，柱長15cm，直徑1cm，鹽梯度洗脫，緩沖液為ρΗ7· 2的buffer A，洗脫時NaCl濃度由0至1. Omol化―1，洗脫流速為0. 3mL -min"1, 每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
5.如權利要求1所述的暹羅鱷血液提取物，其特征在于該提取物是以新鮮鱷魚動脈血為原料，通過如下步驟提取a.將鱷魚血進行抗凝處理，分離血漿取經檢驗合格的新鮮鱷魚動脈血，用3. 8%的檸檬酸鈉溶液與血液按體積比1 9混合抗凝，靜置lh，將抗凝血置于冷凍離心機，在6°C轉速3000r/min下，離心lOmin，收集上清液，得到血漿；b.飽和硫酸銨法粗提免疫球蛋白1)取血漿，加0.Olmol/L、pH值7. 0的PBS緩沖溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液， 邊加邊攪拌，使成為30% (NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4°C下靜置Ih ；2)在6°C轉速lOOOOr/min下，離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白原，得到上清液；3)在上清液中再加(NH4)2SO4飽和溶液，使(NH4)2SO4終濃度為50%，充分混合，靜置2h ；4)在6°C轉速10000r/min下，離心20min，得到蛋白沉淀；5)于蛋白沉淀中加0.Olmol/L、pH值7. 0的PBS緩沖溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4飽和溶液，使成33% (NH4)#04溶液，充分混合后，于4°C下靜置濁；6)在6°C轉速lOOOOr/min下，離心20min，分別取蛋白沉淀，上清液；7)重復步驟幻和6)2次，收集末次沉淀物即為免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除鹽，_20°C保存；c. DEAE-52陰離子交換層析純化免疫球蛋白將溶解的免疫球蛋白粗提物經DEAE-52進行純化，柱長15cm，直徑1cm，鹽梯度洗脫，緩沖液為ρΗ7· 2的buffer A，洗脫時NaCl濃度由0至1. Omol化―1，洗脫流速為0. 3mL .mirT1, 每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
6.一種暹羅鱷血液提取物的提取方法，其特征在于該方法是以新鮮鱷魚動脈血為原料，通過如下步驟提取a.將鱷魚血進行抗凝處理，分離血漿；b.飽和硫酸銨法粗提免疫球蛋白；c.DEAE-52陰離子交換層析純化免疫球蛋白，即得。
7.如權利要求6所述的提取方法，其特征在于所述步驟a按如下方法操作取經檢驗合格的新鮮鱷魚動脈血，用3. 5% 4%的檸檬酸鈉溶液與血液按體積比 1 8-10混合抗凝，靜置0. 5 1. 5h，將抗凝血置于冷凍離心機，在2 10°C轉速3000r/ min下，離心8 15min，收集上清液，得到血漿。
8.如權利要求6所述的提取方法，其特征在于所述步驟b按如下方法操作1)取血漿，加0.Olmol/L、pH值7. 0的PBS緩沖溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液， 邊加邊攪拌，使成為30% (NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4°C下靜置0. 5 1.釙；2)在2 10°C轉速lOOOOr/min下，離心15 25min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白原，得到上清液；3)在上清液中再加(NH4)2SO4飽和溶液，使(NH4)2SO4終濃度為50%，充分混合，靜置 1. 5 2. 5h ；4)在2 10°C轉速10000r/min下，離心15 25min，得到蛋白沉淀；5)于蛋白沉淀中加0.Olmol/L、pH值7. 0的PBS緩沖溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4飽和溶液，使成33% (NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4°C下靜置1. 5 2. a ；6)在2 10°C轉速10000r/min下，離心15 25min，分別取蛋白沉淀，上清液；7)重復步驟幻和6)2 3次，收集末次沉淀物即為免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除鹽，-20°C保存。
9.如權利要求6所述的提取方法，其特征在于所述步驟c按如下方法操作將溶解的免疫球蛋白粗提物經DEAE-52進行純化，柱長15cm，直徑1cm，鹽梯度洗脫，緩沖液為ρΗ7· 2的buffer A，洗脫時NaCl濃度由0至1. Omol化―1，洗脫流速為0. 3mL -min"1, 每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
10.如權利要求6所述的提取方法，其特征在于是以新鮮鱷魚動脈血為原料，通過如下步驟提取a.將鱷魚血進行抗凝處理，分離血漿取經檢驗合格的新鮮鱷魚動脈血，用3. 8%的檸檬酸鈉溶液與血液按體積比1 9混合抗凝，靜置lh，將抗凝血置于冷凍離心機，在6°C轉速3000r/min下，離心lOmin，收集上清液，得到血漿；b.飽和硫酸銨法粗提免疫球蛋白1)取血漿，加0.01mol/L、pH值7. O的PBS緩沖溶液，再逐滴加入(NH4)2SO4飽和溶液， 邊加邊攪拌，使成為30% (NH4)2SO4溶液，充分混合后，于4°C下靜置Ih ；2)在6°C轉速lOOOOr/min下，離心20min，棄去沉淀，以除去纖維蛋白原，得到上清液；3)在上清液中再加(NH4)2SO4飽和溶液，使(NH4)2SO4終濃度為50%，充分混合，靜置2h ；4)在6°C轉速10000r/min下，離心20min，得到蛋白沉淀；5)于蛋白沉淀中加0.Olmol/L、pH值7. O的PBS緩沖溶液使之溶解，再加(NH4)2SO4飽和溶液，使成33% (NH4)#04溶液，充分混合后，于4°C下靜置濁；6)在6°C轉速lOOOOr/min下，離心20min，分別取蛋白沉淀，上清液；7)重復步驟幻和6)2次，收集末次沉淀物即為免疫球蛋白粗提物，以PBS透析除鹽，_20°C保存；c.DEAE-52陰離子交換層析純化免疫球蛋白將溶解的免疫球蛋白粗提物經DEAE-52進行純化，柱長15cm，直徑1cm，鹽梯度洗脫，緩沖液為ρΗ7· 2的buffer A，洗脫時NaCl濃度由O至1. Omol化―1，洗脫流速為0. 3mL .mirT1, 每管1.5mL，收集蛋白峰，即得。
11.如權利要求1-5所述任意一種暹羅鱷血液提取物在制備治療艾滋病或甲型Hmi流感藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種暹羅鱷魚血液提取物及其提取方法，該提取物是以新鮮鱷魚動脈血為原料，通過如下步驟提取a.將鱷魚血進行抗凝處理，分離血漿；b.飽和硫酸銨法粗提免疫球蛋白；c.DEAE-52陰離子交換層析純化免疫球蛋白，即得。所提取得的暹羅鱷血液提取物與HIV-1整合酶結合具有特異性，實驗證明具有抗HIV-1活性和抗甲型H1N1流感病毒活性的作用，可用于治療艾滋病和甲型H1N1流感。
文檔編號C07K16/10GK102268090SQ20111019587
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月13日 優(yōu)先權日2011年7月13日
發(fā)明者張博 申請人:北京洪源澳達生物技術發(fā)展有限公司