專利名稱：胸腺肽α1的固相合成工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽的合成和純化方法，尤其涉及胸腺肽α 1的固相合成工藝。
背景技術(shù)：
1977年，被稱為“胸腺之父”的Allen Goldstein博士從胸腺肽第5組分中提取出其中最具免疫活性的成分胸腺肽α 1。胸腺肽α 1是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)，由觀個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，氨基酸序列如下N-乙?；?L-絲氨酰-L-天冬氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-纈氨酰-L-天冬氨酰-L-蘇氨酰-L-絲氨酰-L-絲氨酰-L-谷氨酰-L-異亮氨酰-L-蘇氨酰-L-蘇氨酰-L-賴氨酰-L-天冬氨酰-L-亮氨酰-L-賴氨酰-L-谷氨酰-L-賴氨酰-L-賴氨酰-L-谷氨酰-L-纈氨酰-L-纈氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰-L-天冬酰胺。N末端被乙?；肿恿繛?108。主要存在于胸腺中，在脾、肺、腎、腦等其他組織中也有低水平存在。胸腺肽α 是一種免疫調(diào)節(jié)因子，在T淋巴細(xì)胞成熟和免疫功能方面有很大的作用，這些作用包括誘導(dǎo)分化的特異標(biāo)志；促進(jìn)干擾素Y (IFN-Y)、白介素 2(IL-2)及其受體表達(dá)；增強(qiáng)細(xì)胞在外源因子刺激時(shí)的生長；啟動T淋巴細(xì)胞的成熟、刺激分泌干擾素及各種淋巴介素，以及增強(qiáng)自然殺傷(NK)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；促使骨髓產(chǎn)生的干細(xì)胞成長為能夠特異識別抗原的功能T細(xì)胞，增加各種淋巴因子如α、β干擾素的分泌，從而有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能的作用。作為天然胸腺激肽的主要組分α 大致含量在整個(gè)胸腺肽組成中約占左右。胸腺肽α 與胸腺肽各單一組分間，或與胸腺肽整體比較，生物活性均為最高，其活性相當(dāng)于胸腺肽的2000倍，相當(dāng)于胸腺五肽的10到1000倍。胸腺肽α 1最早由意大利塞生公司(Sciclone)在1997年開發(fā)上市，藥品名“日達(dá)仙”(Zadaxin)。作為一種細(xì)胞免疫劑增強(qiáng)劑，胸腺肽α 1受到醫(yī)學(xué)界越來越多的重視。它對慢性乙型肝炎、重型病毒性肝炎、腫瘤、流行性乙型腦炎等疾病的治療效果明顯，副作用少，具有較高的臨床研究價(jià)值和應(yīng)用前景。在臨床上主要用于①治療慢性乙型肝炎；②在腫瘤治療中的應(yīng)用；③治療重癥肝炎；④治療流行性乙型腦炎；⑤治療外科感染性疾病。目前胸腺肽α 1的合成與制備的方法主要有兩種，基因工程方法和化學(xué)固相合成方法。專利CN02125^57. X公布了一種利用生物工程技術(shù)將胸腺肽基因進(jìn)行重組，在宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因獲得胸腺肽融合體，再利用化學(xué)技術(shù)將融合體裂解和修飾的到胸腺肽 α 1的方法。專利CN200410077749. 2采用的方法是將胸腺肽α 1定向克隆到原核融合表達(dá)載體pTRX上，構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pTRX-T α 1，該質(zhì)?？梢员磉_(dá)出硫氧還蛋白-胸腺肽α 1 融合蛋白，再經(jīng)過一系列后處理和純化可以得到胸腺肽α 。基因工程方法的缺點(diǎn)是表達(dá)量比較低，而且所需費(fèi)用較高，很難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化?！痘瘜W(xué)工業(yè)與工程》2001年18卷第6期 《胸腺素α 1的Fmoc固相合成法》描述了一種以王樹脂為載體，用對稱酸酐法和DCC-HOBt 縮合法合成胸腺肽α 1的方法?！痘W(xué)報(bào)》2004年第55卷第2期《胸腺素α 1的DIC固相化學(xué)合成與鑒定》描述了一種以王樹脂為載體，以DIC-HOBt為氨基酸激活試劑合成胸腺肽α 1的方法。《南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)》2004年第沈卷第2期《固相合成胸腺素α 1))中的合成方法也是采用王樹脂為起始原料，但氨基酸激活試劑采用的是TBTU-HOBt。這幾種化學(xué)固相合成方法采用的都是先進(jìn)的Fmoc方法，并且均以王樹脂為載體。不足之處是王樹脂與Fm0c-Asn(Trt)-OH的結(jié)合比較困難，還存在切割的時(shí)候linker被切除連接在肽鏈上的副反應(yīng)，會對收率有一定的影響。而且其方法中的氨基酸縮合劑TBTU-HOBt，DCC-HOBt, DIC-HOBt相對而言縮合效率不是很高，對于胸腺肽α 1這種比較長的肽，空間結(jié)構(gòu)影響較大，會對收率造成影響，導(dǎo)致成本升高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是對現(xiàn)有的固相合成技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，解決胸腺肽α 1合成工藝中存在的一些問題，提供一種收率更高、成本更低、有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的胸腺肽α 1的固相合成工藝以及一種胸腺肽α 1粗肽的純化方法。本發(fā)明提供一種胸腺肽α 1的固相合成方法，該方法包括下列步驟(1) NH2-Asn (Trt) -CTC 樹脂的制備；⑵AA(1-27)-Asn(Trt)28-CTC 樹脂的合成；⑶Ac-AA(1-27)-Asn28(Trt)-CTC 樹脂的制備；(4)用裂解劑制備胸腺肽α 1粗肽；(5)胸腺肽α 1粗肽的純化。上述步驟O)固相合成中使用用氨基酸激活試劑HATU和NMM。上述步驟(3)中乙酸酐和吡啶的摩爾用量均為樹脂取代摩爾數(shù)的20倍。上述步驟的裂解液，為三氟乙酸/ 二巰基乙醇/水的混合液，配制方法如下 三氟乙酸二巰基乙醇水=90 5 5的體積配制，然后在-10°C的條件下預(yù)冷12小時(shí)。裂解切肽是在室溫下反應(yīng)2. 5-3小時(shí)。沉降粗肽時(shí)用的乙醚體積是裂解試劑的10倍，沉降完成后用離心的方法對粗肽進(jìn)行洗滌濃縮。上述步驟( 純化采用兩次純化，所用色譜柱用不同的反相C18填料。優(yōu)選的本發(fā)明的固相合成方法，包括下列步驟(1) NH2-Asn (Trt) -CTC樹脂的制備Fmoc-Asn (Trt) -CTC樹脂加入至反應(yīng)器中，加入DMF，打開氮?dú)庾韵露先岷蜎_混液體和樹脂，除去液體，然后向反應(yīng)器中加入哌啶/DMF 溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完畢抽去液體，用DMF洗滌，再加入哌啶/DMF溶液，攪拌反應(yīng)后抽除，用 DMF洗滌，洗去脫下的Fmoc保護(hù)基。(2)AA(1_27)-Asn(Trt)28-CTC 樹脂的合成取 Fmoc-Glu(OtBu)_0H，HATU,溶于 DMF 中，加入冷卻的NMM，激活后加入到反應(yīng)器中反應(yīng)，以茚三酮顯色法檢測為準(zhǔn)，然后抽濾除去反應(yīng)液，加入DMF洗滌，重復(fù)以上的操作步驟，按照胸腺肽α 1氨基酸序列，把不同的氨基酸依次進(jìn)行偶聯(lián)直至最后Fmoc-Ser (tBu)-OH偶聯(lián)完畢，偶聯(lián)完畢之后，再用哌啶/DMF脫去 Fmoc 保護(hù)，得到 AAa-27)-Asn (Trt) 28_CTC 樹脂。⑶Ac-AA(1-27)-Asn28 (Trt)-CTC 樹脂的制備AA(1^)-Asn (Trt) 28_CTC，乙酸酐，口比啶，DMF混合均勻后加入至反應(yīng)器中反應(yīng)，抽濾除去溶液；依次加入DMF洗滌，DCM洗滌，MeOH 洗滌，轉(zhuǎn)出樹脂，減壓干燥，得到胸腺肽α 1肽樹脂。(4)樹脂肽裂解制備粗肽裂解液，肽樹脂冰浴下混合反應(yīng)；然后過濾除去樹脂，濾液加入到冰乙醚中沉降，分離制得胸腺肽α 1粗肽。(5)胸腺肽α 1粗肽的純化以TFA溶液為流動相Α，乙腈為流動相B ；色譜系統(tǒng)采用反相C18，采用梯度洗脫，分別收集峰前、峰頂、峰后三段，峰頂收集液純度大于90%。峰前及峰后的收集液濃縮至適量后，采用同樣的方法純化收集得純度大于90%純化液。合并所有含量在90 %以上的收集液，旋轉(zhuǎn)濃縮除去收集液中的乙腈，準(zhǔn)備二次純化。以磷酸溶液為流動相Α，乙腈為流動相B ；色譜系統(tǒng)采用反相C18采用梯度洗脫，分別收集峰前、峰頂、峰后三段，峰頂純度大于98.5%。峰前及峰后的收集液濃縮至適量后，采用同樣的方法純化收集得純度大于98. 5%純化液。合并所有含量在98. 5%以上的收集液，旋轉(zhuǎn)濃縮除去收集液中的乙腈，進(jìn)行下一步脫鹽純化。以注射用水為流動相Α，乙腈為流動相B ；色譜系統(tǒng)采用反相C18填料柱，取第二次純化得到的目的肽，采用梯度洗脫，主峰出現(xiàn)時(shí)開始收集至無峰出現(xiàn)時(shí)結(jié)束。合并收集液，旋轉(zhuǎn)濃縮除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α 1精制液用微孔濾膜精密過濾，凍干。本發(fā)明胸腺肽α 1的固相合成工藝已經(jīng)純化方法具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明采用了 Fmoc策略，此方法操作簡便，反應(yīng)條件更溫和，副反應(yīng)少，在合成過程中避免了劇毒、強(qiáng)腐蝕性的氟化氫，既提高了反應(yīng)的選擇性，又使操作簡單、安全，更易實(shí)現(xiàn)自動化，并且大大減輕了環(huán)保壓力。(2)以Fm0c-Asn(Trt)-CTC樹脂為合成其實(shí)原料，解決了王樹脂與 Fmoc-Asn(Trt)-OH結(jié)合困難，易發(fā)生副反應(yīng)的難題，提高了反應(yīng)收率，降低了生產(chǎn)成本，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。(3)氨基酸激活試劑采用的是縮合效率更高的HATU，HATU可有效地促進(jìn)有空間位阻的酰胺鍵的形成，對于胸腺肽α 1這種較長的肽可以減少空間結(jié)構(gòu)對反應(yīng)的影響，進(jìn)而提高收率。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 :AAa-27)-ASn (Trt) 28_CTC 樹脂的合成稱取替代度為0. 60mmol/g 的 Fmoc-Asn(Trt)-CTC 樹脂 66. 7g GOmmol)，加入至反應(yīng)器中，加入500ml DMF,打開氮?dú)庾韵露先岷蜎_混液體和樹脂，攪拌溶脹30分鐘后停止，抽濾除去液體。然后向反應(yīng)器中加入20%的哌啶/DMF溶液(脫帽液)500ml，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)5分鐘，抽去液體，用500ml DMF洗滌2次。再加入500ml脫帽液，攪拌反應(yīng) 10分鐘后抽除，用500ml DMF洗滌8次，洗去脫下的Fmoc保護(hù)基。稱取Fmoc-Glu (OtBu) -OH 68g，HATU 60. 8g，溶于500ml DMF中，冰浴下加入冷卻的NMM 26. 5ml，激活10分鐘后加入到反應(yīng)器中，在15°C 25°C下反應(yīng)2. 5-3小時(shí)，以茚三酮顯色法檢測為準(zhǔn)。然后抽濾除去反應(yīng)液，加入400ml DMF洗滌3次。遵循多肽固相合成方法的一般規(guī)律，重復(fù)以上的操作步驟，按照胸腺肽a 1氨基酸序列，依次把其余的26個(gè)氨基酸偶聯(lián)至CTC樹脂上，直至最后 Fmoc-Ser (tBu) -OH偶聯(lián)完畢。然后用脫帽液脫去Fmoc保護(hù)，得到kh^-ksn (Trt) 28_CTC 樹脂。實(shí)施例2 :Ac-AA(1"27)-Asn28 (Trt) -CTC 樹脂的制備配制乙酰化溶液乙酸酐76ml，吡啶65ml，DMFlOOOml，混合均勻后加入至反應(yīng)器中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)M小時(shí)，然后后抽濾除去乙酰化溶液。依次加入IOOOmlDMF洗滌6 次，1500ml DCM洗滌3次，1000ml MeOH洗滌3次，每次洗滌5分鐘。轉(zhuǎn)出樹脂，減壓干燥， 得到胸腺肽α 1肽樹脂Μ2. 2g。實(shí)施例3 樹脂肽裂解制備粗肽(1)配制三氟乙酸/ 二巰基乙醇/水=90 5 5(v/v)裂解液MOOml，在-10°C 下預(yù)凍1 1。(2)置對2.28肽樹脂于圓底燒瓶中，冰浴下冷卻，加入已經(jīng)預(yù)凍好的裂解液 MOOml，加入完成后撤除冰浴，室溫下攪拌反應(yīng)2. 5小時(shí)。然后過濾除去樹脂，濾液加入到 10倍體積冰乙醚中。沉降5小時(shí)。4000轉(zhuǎn)/分鐘離心洗滌8次。轉(zhuǎn)出沉淀，減壓干燥，制得胸腺肽α 1粗肽73. 5g。實(shí)施例4 胸腺肽α 1粗肽的溶解將73. 5g粗肽研磨至粉末狀，然后加入735ml純水?dāng)嚢?0分鐘。滴加氨水將溶液 PH值調(diào)至6. 5-7.0之間，用純水定容至4L，然后用0.45 μ m微孔濾膜過濾。濾液用1.0% TFA水溶液調(diào)pH值至2. 0-2. 5之間，再用0. 45 μ m微孔濾膜過濾。實(shí)施例5 胸腺肽α 1粗肽的純化(1) 一次純化以0. 1 % TFA溶液為流動相Α，乙腈為流動相B ；制備液相色譜系統(tǒng)采用10 μ m的反相C18 (41. 4X 250mm)填料，紫外檢測器設(shè)定220nm，調(diào)流速60ml/min，以5%的乙腈，平衡 15分鐘，進(jìn)樣。采用梯度洗脫0 2min，5% 5%;2 42min，17% 23%;42 48min， 50% 50%。出峰時(shí)間在37min左右。分別收集峰前、峰頂、峰后三段，峰頂收集液純度大于90%。峰前及峰后的收集液濃縮至適量后，采用同樣的方法純化收集得純度大于90%純化液。合并所有含量在90%以上的收集液，旋轉(zhuǎn)濃縮除去收集液中的乙腈，準(zhǔn)備二次純化。(2) 二次純化以0. 2%磷酸溶液(用氨水調(diào)pH至6. 5)為流動相A，乙腈為流動相B ；制備液相色譜系統(tǒng)采用5μπι的反相C1W41. 4X250mm)填料，紫外檢測器設(shè)定220nm，調(diào)流速60ml/ min,以5%的乙腈，平衡15分鐘。取第一次純化得到的目的肽收集液，進(jìn)樣。采用梯度洗脫 0 2min，5% 5%;2 32min，9% 15%;32 40min，40% 40%。出峰時(shí)間在 25min 左右。分別收集峰前、峰頂、峰后三段，峰頂純度大于98.5%。峰前及峰后的收集液濃縮至適量后，采用同樣的方法純化收集得純度大于98. 5%純化液。合并所有含量在98. 5%以上的收集液，旋轉(zhuǎn)濃縮除去收集液中的乙腈，準(zhǔn)備二次純化。(3)脫鹽以注射用水為流動相A，乙腈為流動相B ；準(zhǔn)備制備液相色譜系統(tǒng)，采用10 μ m的反相C18 01. 4X 250mm)填料柱，紫外檢測器設(shè)定220nm，調(diào)流速40ml/min，先以80%的乙腈， 平衡10分鐘，然后以2%的乙腈，平衡15分鐘。取第二次純化得到的目的肽收集液，進(jìn)樣。 采用梯度洗脫0 15min，5% 5% ;15 65min，5% 40%。主峰出現(xiàn)時(shí)開始收集至無峰出現(xiàn)時(shí)結(jié)束。合并收集液，旋轉(zhuǎn)濃縮除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α 精制液660ml。(4)凍干取脫鹽后的的胸腺肽α 1精制液，用0.22μπι微孔濾膜精密過濾，分裝不銹鋼盤凍干。制得胸腺肽α 1純品25. 3g，產(chǎn)品總收率20. 3%。和現(xiàn)有技術(shù)比較產(chǎn)品總收率達(dá)到20%以上，而現(xiàn)有制備方法得到的總收率為 10 15%。和現(xiàn)有技術(shù)比較經(jīng)過二次純化及脫鹽凍干的產(chǎn)品純度可以達(dá)到99%以上，大于用現(xiàn)有制備和純化方法得到的胸腺肽α 1的純度(98% )。本發(fā)明中，縮略語的解釋如下
權(quán)利要求
1.一種胸腺肽α 1的固相合成方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)NH2-Asn (Trt) -CTC 樹脂的制備；(2)AA(1-27)-Asn (Trt) 28_CTC 樹脂的合成；(3)Ac-AA(1"27)-Asn28(Trt) -CTC 樹脂的制備；(4)用裂解劑制備胸腺肽α1粗肽；(5)胸腺肽α1粗肽的純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的固相合成方法，其特征在于步驟(1)中載體采用的為與氨基酸結(jié)合副反應(yīng)少的CTC樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的固相合成方法，其特征在于步驟(2)中氨基酸激活試劑采用的是縮合效率更高的HATU和消旋化影響極低的ΝΜΜ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的固相合成方法，其特征在于步驟(3)乙酸酐和吡啶的摩爾用量均為樹脂取代摩爾數(shù)的20倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的固相合成方法，其特征在于步驟⑷的裂解劑是三氟乙酸/二巰基乙醇/水，按照90 5 5的體積配制而成，在-10°C預(yù)冷12小時(shí)，裂解切肽時(shí)將裂解液倒入預(yù)冷的乙醚中在室溫下反應(yīng)2. 5-3小時(shí)，沉降粗肽時(shí)乙醚體積用量是裂解試劑的10 倍，沉降完成后用離心的方法對粗肽進(jìn)行洗滌濃縮。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的固相合成方法，其特征在于步驟(5)中純化方法采用的是兩次純化用不同的反相C18填料。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的固相合成方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)NH2-Asn(Trt) -CTC樹脂的制備=Fm0c-Asn (Trt) -CTC樹脂加入至反應(yīng)器中，加入 DMF,打開氮?dú)庾韵露先岷蜎_混液體和樹脂，除去液體，然后向反應(yīng)器中加入哌啶/DMF溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完畢抽去液體，用DMF洗滌，再加入哌啶/DMF溶液，攪拌反應(yīng)后抽除，用 DMF洗滌，洗去脫下的Fmoc保護(hù)基，(2)AA(1^)-Asn(Trt)28-CTC樹脂的合成取 Fmoc-Glu(OtBu)-0H，HATU，溶于 DMF 中，加入冷卻的NMM，激活后加入到反應(yīng)器中反應(yīng)，以茚三酮顯色法檢測為準(zhǔn)，然后抽濾除去反應(yīng)液，加入DMF洗滌。按照胸腺肽α 氨基酸序列，重復(fù)以上的操作步驟，將其余沈個(gè)氨基酸依次偶聯(lián)到樹脂上，然后用哌啶/DMF脫去Fmoc保護(hù)，得到AA(1_27)-Asn(Trt)28_CTC樹脂，(3)Ac-AA(^7)-Asn28(Trt)-CTC 樹脂的制備AA(1-27)-Asn (Trt)28_CTC，乙酸酐，批啶，DMF 混合均勻后加入至反應(yīng)器中反應(yīng)，抽濾除去溶液；依次加入DMF洗滌，DCM洗滌，MeOH洗滌， 轉(zhuǎn)出樹脂，減壓干燥，得到胸腺肽α 1肽樹脂，(4)裂解制備粗肽裂解液，胸腺肽α1肽樹脂冰浴下混合反應(yīng)；然后過濾除去樹脂，濾液加入到冰乙醚中沉降，分離制得胸腺肽α 1粗肽，(5)胸腺肽α1粗肽的純化以TFA溶液為流動相Α，乙腈為流動相B ；色譜系統(tǒng)采用反相C18，采用梯度洗脫，分別收集峰前、峰頂、峰后三段，峰頂收集液純度大于90%，峰前及峰后的收集液濃縮至適量后，采用同樣的方法純化收集得純度大于90%純化液，合并所有含量在90%以上的收集液，旋轉(zhuǎn)濃縮除去收集液中的乙腈，準(zhǔn)備二次純化，以磷酸溶液為流動相Α，乙腈為流動相B ；色譜系統(tǒng)采用反相C18采用梯度洗脫，分別收集峰前、峰頂、峰后三段，峰頂純度大于98.5%，峰前及峰后的收集液濃縮至適量后，采用同樣的方法純化收集得純度大于98. 5%純化液，合并所有含量在98. 5%以上的收集液，旋轉(zhuǎn)濃縮除去收集液中的乙腈，進(jìn)行下一步脫鹽純化，以注射用水為流動相A，乙腈為流動相B ；色譜系統(tǒng)采用反相 C18填料柱，取第二次純化得到的目的肽，采用梯度洗脫，主峰出現(xiàn)時(shí)開始收集至無峰出現(xiàn)時(shí)結(jié)束，合并收集液，旋轉(zhuǎn)濃縮除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α 1精制液用微孔濾膜精密過濾，凍干。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的固相合成方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1) AA(1-27)-Asn (Trt) 28_CTC 樹脂的合成稱取替代度為0. 60mmol/g的Fmoc-Asn(Trt)-CTC樹脂66. 7g GOmmol)，加入至反應(yīng)器中，加入500ml DMF，打開氮?dú)庾韵露先岷蜎_混液體和樹脂，攪拌溶脹30分鐘后停止，抽濾除去液體，然后向反應(yīng)器中加入20%的哌啶/DMF溶液(脫帽液)500ml，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)5分鐘，抽去液體，用500ml DMF洗滌2次，再加入500ml脫帽液，攪拌反應(yīng)10分鐘后抽除，用500ml DMF洗滌8次，洗去脫下的Fmoc保護(hù)基，⑵ AA(1_27)-Asn (Trt) 28-CTC 樹脂的制備稱取 Fmoc-Glu (OtBu)-OH 68g,HATU 60. 8g，溶于 500ml DMF 中，冰浴下加入冷卻的 NMM 26. 5ml，激活10分鐘后加入到反應(yīng)器中，在15°C 25°C下反應(yīng)2. 5-3小時(shí)，以茚三酮顯色法檢測為準(zhǔn)，然后抽濾除去反應(yīng)液，加入400ml DMF洗滌3次。遵循多肽固相合成方法的一般規(guī)律，重復(fù)以上的操作步驟，按照胸腺肽α 1氨基酸序列，依次把其余的26個(gè)氨基酸偶聯(lián)至CTC樹脂上，直至最后Fmoc-Ser (tBu) -OH偶聯(lián)完畢。然后用脫帽液脫去Fmoc保護(hù)，得到 AA(1_27)-Asn (Trt) 28-CTC 樹脂，(3)Ac-AA(1"27)-Asn28(Trt) -CTC 樹脂的制備配制乙酰化溶液乙酸酐76ml，吡啶65ml，DMFlOOOml,混合均勻后加入至含有 AA(1-27)-Asn (Trt) 28-CTC樹脂的反應(yīng)器中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)M小時(shí)，然后抽濾除去乙?；芤?，依次加入1000ml DMF洗滌6次，1500ml DCM洗滌3次，1000ml MeOH洗滌3次，每次洗滌5分鐘，轉(zhuǎn)出樹脂，減壓干燥，得到胸腺肽α 1肽樹脂Μ2. 2g，(4)樹脂肽裂解制備粗肽配制三氟乙酸/ 二巰基乙醇/水=90 5 5 (ν/ν)裂解液MOOml，在-10°C下預(yù)凍 12h，將M2. 2g肽樹脂于圓底燒瓶中，冰浴下冷卻，加入已經(jīng)預(yù)凍好的裂解液MOOml，加入完成后撤除冰浴，室溫下攪拌反應(yīng)2. 5小時(shí)，然后過濾除去樹脂，濾液加入到10倍體積冰乙醚中，沉降5小時(shí)，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心洗滌8次，轉(zhuǎn)出沉淀，減壓干燥，制得胸腺肽α 1粗肽 73. 5g,(5)胸腺肽α1粗肽的溶解將73. 5g粗肽研磨至粉末狀，然后加入735ml純水?dāng)嚢?0分鐘，滴加氨水將溶液pH值調(diào)至6. 5-7. 0之間，用純水定容至4L，然后用0. 45 μ m微孔濾膜過濾，濾液用1. 0% TFA水溶液調(diào)PH值至2. 0-2. 5之間，再用0. 45 μ m微孔濾膜過濾，(6)胸腺肽α1粗肽的純化一次純化以0. TFA溶液為流動相Α，乙腈為流動相B ；制備液相色譜系統(tǒng)采用10 μ m的反相C18 (41. 4 X 250mm)填料，紫外檢測器設(shè)定220nm,調(diào)流速60ml/min,以5 %的乙腈，平衡 15分鐘，進(jìn)樣，采用梯度洗脫0 2min，5% 5% ；2 42min，17% 23% ；42 48min， 50% 50%，出峰時(shí)間在37min左右，分別收集峰前、峰頂、峰后三段，峰頂收集液純度大于90%，峰前及峰后的收集液濃縮至適量后，采用同樣的方法純化收集得純度大于90%純化液，合并所有含量在90%以上的收集液，旋轉(zhuǎn)濃縮除去收集液中的乙腈，準(zhǔn)備二次純化， 二次純化以0. 2%磷酸溶液(用氨水調(diào)pH至6. 5)為流動相A，乙腈為流動相B ；制備液相色譜系統(tǒng)采用5 μ m的反相C18 01. 4X 250mm)填料，紫外檢測器設(shè)定220nm，調(diào)流速60ml/min， 以5%的乙腈，平衡15分鐘，取第一次純化得到的目的肽收集液，進(jìn)樣，采用梯度洗脫0 2min，5% 5% ;2 32min，9% 15% ；32 40min，40 % 40%，出峰時(shí)間在 25min 左右，分別收集峰前、峰頂、峰后三段，峰頂純度大于98.5%，峰前及峰后的收集液濃縮至適量后，采用同樣的方法純化收集得純度大于98. 5%純化液，合并所有含量在98. 5%以上的收集液，旋轉(zhuǎn)濃縮除去收集液中的乙腈， 脫鹽以注射用水為流動相A，乙腈為流動相B ；準(zhǔn)備制備液相色譜系統(tǒng)，采用10 μ m的反相 C18 (41. 4 X 250mm)填料柱，紫外檢測器設(shè)定220nm，調(diào)流速40ml/min，先以80 %的乙腈，平衡10分鐘，然后以2%的乙腈，平衡15分鐘，取第二次純化得到的目的肽收集液，進(jìn)樣，采用梯度洗脫0 15min，5% 5%; 15 65min，5% 40%，主峰出現(xiàn)時(shí)開始收集至無峰出現(xiàn)時(shí)結(jié)束，合并收集液，旋轉(zhuǎn)濃縮除去收集液中的乙腈和大部分的水，制得胸腺肽α 1精制液 660ml, 凍干取脫鹽后的的胸腺肽α 1精制液，用0. 22 μ m微孔濾膜精密過濾，分裝不銹鋼盤凍干， 制得胸腺肽α 1純品25. 3g。
全文摘要
本發(fā)明涉及胸腺肽α1的固相合成工藝，該工藝步驟如下(1)NH2-Asn(Trt)-CTC樹脂的制備；(2)AA(1-27)-Asn(Trt)28-CTC樹脂的合成；(3)Ac-AA(1-27)-Asn28(Trt)-CTC樹脂的制備；(4)用裂解劑制備胸腺肽α1粗肽；(5)胸腺肽α1粗肽的純化。
文檔編號C07K14/575GK102286091SQ201110186259
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者張海濤, 徐巖, 曹翊婕, 李會成, 李鄭武, 王麗娜, 王孝文, 葛存慧, 陳玉軍, 高晶, 齊巖 申請人:哈藥集團(tuán)技術(shù)中心, 哈藥集團(tuán)生物工程有限公司