專利名稱：一種蛇蟾三肽的工業(yè)化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛇蟾三肽(R⑶肽)的制備方法，具體涉及蛇蟾三肽的固相多肽合成制備方法。
背景技術(shù)：
中文名蛇蟾三肽英文名為RDG
結(jié)構(gòu)式為 Arg-Gly-Asp-OH 分子式=C12H22N6O6 分子量346. 3 CAS 號(hào)99896-85-2
RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp-OH)的短肽，作為整合素和其配體相互作用的識(shí)別位點(diǎn)，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞之間的相互作用。蛇蟾三肽臨床用于免疫增強(qiáng)劑，艾滋病早期治療、慢性肝炎、惡性腫瘤、手術(shù)及嚴(yán)重感染，還可用于糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化等自身免疫性疾病，還具有抗衰老作用等。由于RGD肽在人體內(nèi)的半衰期較短，因此為了獲得滿意的治療效果，往往需要采用較大劑量。因此降低RGD肽的生產(chǎn)成本，就具有重要的意義。目前的文獻(xiàn)只有研究及應(yīng)用的報(bào)導(dǎo)，但是未見其生產(chǎn)制備的報(bào)導(dǎo)。如果參照《化工進(jìn)展》2003年第2期153-156，“固相合成胸腺五肽的研究進(jìn)展”所公開的技術(shù)，接肽收率低，生產(chǎn)成本高，工藝復(fù)雜，而且使用劇毒的氟化氫和三氟乙酸，三廢污染嚴(yán)重，難以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是公開一種蛇蟾三肽的工業(yè)化制備方法。本發(fā)明提出了一條較適當(dāng)?shù)穆肪€，使用固相法合成蛇蟾三肽，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，且收率較高。本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟
(1)以高取代的Wang樹脂為起始原料，以Fmoc和Boc保護(hù)相結(jié)合的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt為縮合劑，依次接上Fmoc-Asp (tBu) -0H、Fmoc-Gly-0H，最后一個(gè)氨基酸采用 Boc-Arg-OH · HCl ；
(2)將切肽試劑加入步驟(1)所得的產(chǎn)物中進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；
(3)將步驟(2)所得的粗品采用C18柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，以高取代的Wang樹脂為起始原料，以Fmoc和Boc 保護(hù)相結(jié)合的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt為縮合劑，依次接上Fmoc-Asp (OtBu)-0H、 Fmoc-Gly-OH，最后一個(gè)氨基酸采用Boc-Arg-OH · HCl的方法包括如下步驟
(1)制備 Fmoc-Asp (tBu)-樹脂
將Wang樹脂(1. 5-2. Ommol/g)用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，抽干；加入溶解于DMF中的Fmoc-Asp (tBu)-OH和TBTU/HOBt，25 27°C進(jìn)行接肽反應(yīng)1小時(shí)，抽干，分別用DMF、乙醇DMF分別洗滌，抽干，獲得Fmoc-Asp (tBu)-樹脂；
(2)制備Fmoc-Gly-Asp (tBu)-樹脂
在上述Fmoc-Asp (tBu)樹脂中，加入脫帽試劑，25 27°C脫帽反應(yīng)15 45分鐘，分別用 DMF、乙醇洗滌，抽干。加入溶解于DMF的Fmoc-Gly-OH、TBTU, HOBT和NMM，25 27°C進(jìn)行接肽反應(yīng)1小時(shí)，抽干，分別用DMF、乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Gly-Asp (tBu)-樹脂； 所說的脫帽試劑為六氫吡啶/ DMF=25-27/75-73，體積比；下同；
(3)制備Boc-Arg-Gly-Asp-樹脂
在上述Fmoc-Gly-Asp (tBu)-樹脂中，加入脫帽試劑，25 27°C反應(yīng)15 45分鐘，分別用 DMF、乙醇洗滌，抽干。加入溶解于DMF的Boc-Arg-OH · HC1.DIC和HOBT，25 27°C進(jìn)行接肽反應(yīng)8、小時(shí)，其余操作同(2)，獲得Boc-Arg- Gly-Asp (tBu)-樹脂； 按照本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，切肽包括如下步驟
將切肽試劑加入Boc-Arg-Gly-Asp (tBu)-樹脂，20 22°C進(jìn)行切肽反應(yīng)2. 5 4. O小時(shí)， 加入乙醚沉淀，過濾，收集沉淀物，用乙醚洗，I32O5真空干燥，得粗品； 所說的切肽試劑為TFA/H20/TIS = 700ml/150ml/150ml ； 按照本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，分離純化包括如下步驟
將粗品溶于水中，過濾，濾液經(jīng)C18柱純化，流動(dòng)相0. 15mol/L醋酸乙腈(95 5)；流速為400-650ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后，采用常規(guī)的方法脫鹽，凍干，獲得成品，總收率51%。由上述公開的技術(shù)方案可見，本發(fā)明采用Wang樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt為縮合劑，逐個(gè)接上氨基酸，最后一個(gè)氨基酸采用 Boc-Arg-OH · HCl的方法，降低了生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化工藝，切肽后乙醚沉淀粗品，避免使用劇毒的氟化氫，三廢污染少。采用C18柱進(jìn)行分離純化，避免使用三氟乙酸，減小三廢，純化收率在50%以上，每步接肽收率均在98%以上，切肽后收率為88%，分離純化收率為58%，總收率約為51%。本發(fā)明的方法便于工業(yè)化實(shí)施，具有較大的產(chǎn)業(yè)化前景。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例和前述過程中所采用的原料列表如下
權(quán)利要求
1.本發(fā)明是一種蛇蟾三肽的工業(yè)化制備方法，包括如下步驟(1)以高取代的Wang樹脂為起始原料，以Fmoc和Boc保護(hù)相結(jié)合的氨基酸為單體， 以TBTU/HOBt為縮合劑，依次接上Fmoc-Asp (tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH，最后一個(gè)氨基酸采用 Boc-Arg-OH · HCl ；(2)將切肽試劑加入步驟(1)所得的產(chǎn)物中進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，收集粗品；(3 )將步驟(2 )所得的粗品采用C18高效液相柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以高取代的Wang樹脂為起始原料，以Fmoc和Boc保護(hù)相結(jié)合的氨基酸為單體，以TBTU/HOBt為縮合劑，依次接上 Fmoc-Asp (OtBu)-0H、Fmoc-Gly-0H，最后一個(gè)氨基酸采用Boc-Arg-OH 'HCl的方法包括如下步驟(1)制備Fmoc-Asp (tBu)-樹脂將Wang樹脂用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，抽干；加入溶解于DMF中的 Fmoc-Asp (tBu)-OH和TBTU/HOBt,于25 27 °C進(jìn)行接肽反應(yīng)0. 5 1. 5小時(shí)，抽干，分別用 DMF、乙醇DMF分別洗滌，抽干，獲得Fmoc-Asp (tBu)-樹脂；其中Wang樹脂的取代度為 1. 3^2. Ommol/g ；接肽反應(yīng)溫度為25 27°C，接肽反應(yīng)時(shí)間為0. 5^1. 5小時(shí)；(2)制備Fmoc-Gly-Asp (tBu)-樹脂在上述Fmoc-Asp (tBu)樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，25 27°C反應(yīng)15 45分鐘，分別用DMF、乙醇洗滌，抽干；加入溶解于DMF的Fmoc-Gly-OH、TBTU、HOBT和NMM，于25 27°C進(jìn)行接肽反應(yīng)0. 5 1. 5 小時(shí)，抽干，分別用DMF、乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Gly-Asp (tBu)-樹脂；所說的六氫吡啶的DMF溶液濃度為25-27% ；六氫吡啶的反應(yīng)溫度為25 27°C ； 接肽反應(yīng)溫度為25 27°C，接肽反應(yīng)時(shí)間為0. 5^1. 5小時(shí)；(3)制備Boc-Arg-Gly-Asp (tBu)-樹脂在上述Fmoc-Gly-Asp (tBu)-樹脂中，加入六氫吡啶的DMF溶液，25^27°C反應(yīng)15 45分鐘，分別用DMF、乙醇洗滌，抽干；加入Boc-Arg-OH · HC1、DIC、H0BT，于25 27°C進(jìn)行接肽反應(yīng)10 12小時(shí)，抽干，分別用 DMF、乙醇洗滌，抽干，獲得Boc-Arg-Gly-Asp (tBu)-樹脂；所說的六氫吡啶的DMF溶液濃度為25-27% ；六氫吡啶的反應(yīng)溫度為25 27°C ； 接肽反應(yīng)溫度為25 27°C，接肽反應(yīng)時(shí)間為8、小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說的切肽包括如下步驟將切肽試劑加入Boc-Arg-Gly-Asp (tBu) -樹脂中，進(jìn)行切肽反應(yīng)，加入乙醚沉淀，過濾，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，得粗品；所說的切肽試劑為TFA/H20/TIS = 700ml/150ml/150ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，粗品經(jīng)HPLC分離純化的方法包括如下步驟將粗品溶于水中，過濾，濾液經(jīng)C18柱純化，流動(dòng)相約0. 1 mol/L醋酸乙腈=95 5 ； 流速為40(T650ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后，采用常規(guī)的方法脫鹽，凍干，獲得成品，總收率51% ；流動(dòng)相中，醋酸水溶液濃度為0. 05mol/廣0. 20 mol/L，醋酸水溶液在乙腈中所占比例為1% 10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求廣4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，六氫吡啶的反應(yīng)溫度為 25 27°C，反應(yīng)時(shí)間為15 45分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求廣4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，切肽反應(yīng)溫度為2(T22°C，切肽反應(yīng)時(shí)間為2. 5 4.0小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蛇蟾三肽的工業(yè)化制備方法，本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟以Wang樹脂為起始原料，TBTU/HOBt為縮合劑，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc-保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，最后一個(gè)氨基酸使用Boc-Arg-OH·HCl，獲得保護(hù)的三肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得粗品，粗品經(jīng)制備型C18高效液相柱進(jìn)行分離純化，凍干后，制得蛇蟾三肽精品。本發(fā)明的方法，降低了生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化了工藝流程。切肽后用乙醚沉淀粗品，避免使用劇毒的氟化氫，三廢污染少。采用C18柱進(jìn)行分離純化，避免使用三氟乙酸，減小三廢。純化收率在50%以上，每步接肽收率均在98%以上，切肽后收率為88%，分離純化收率為58%，總收率約為51%。本發(fā)明的方法便于工業(yè)化實(shí)施，具有較大的產(chǎn)業(yè)化前景。
文檔編號(hào)C07K1/20GK102336807SQ201110183429
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者周逸明, 崔頎, 蔡華成 申請(qǐng)人:上海蘇豪逸明制藥有限公司, 周逸明, 崔頎