專利名稱：一種固相多肽合成蛋白溶菌素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白溶菌素的制備方法，具體涉及蛋白溶菌素的固相多肽合成制備方法。
背景技術(shù)：
中文名蛋白溶菌素
胃文名Protegrin, Iseganan 結(jié)構(gòu)式
權(quán)利要求
1.本發(fā)明是一種固相多肽合成蛋白溶菌素的制備方法，包括如下步驟以Rink Amide MBHA樹脂為起始原料，HBTU/HOBt為縮合劑，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc-保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，最后一個(gè)氨基酸使用Boc-Arg-OH · HC1，獲得保護(hù)的十七肽樹脂，然后加入切肽試劑進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品；5-位和14-位Cys的-SH基用Trt保護(hù)，并在pH為8. 5 10. O的條件下用雙氧水氧化；7-位和12-位Cys的-SH基用Acm保護(hù)，并在甲醇溶液中用碘氧化，獲得雙二硫鍵Cys5—14 Cys7-12粗品，最后采用高效液相C8柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說(shuō)的依次連接具有Fmoc-保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)十七肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)的方法，包括如下步驟(1)Fmoc-Arg (Pbf)-樹脂的制備Rink Amide MBHA樹脂用DMF浸泡，使樹脂充分溶脹，抽干，加入六氫吡啶的DMF溶液， 22-24°C反應(yīng)30分鐘；抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Arg (Pbf) -OH, HBTU, ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,將混合物 22_24°C接肽反應(yīng) 70 分鐘；抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的 Rink Amide MBHA 樹脂取代量為0. 3-0. 6mmol/g ； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22- % ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(2)Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘； 抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU, HOBT, NMM，將混合物22_24°C接肽反應(yīng)70分鐘； 抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(3)Riioc-Val-Gly-Arg(Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘； 抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Val-OH，HBTU, HOBT, NMM，將混合物22_24°C接肽反應(yīng)70分鐘； 抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(4)Fmoc-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘； 抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Cys (Trt) -OH, HBTU, ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,將混合物 22_24°C 接肽反應(yīng) 70 分鐘；抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(5)Rnoc-Val-Cys CTrt)-Val-Gly-Arg(Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘；抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Val-OH，HBTU, HOBT, NMM，將混合物22_24°C反應(yīng)接肽70分鐘； 抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(6)Fmoc-Cys (Acm) -Val-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘；抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Cys (Acm) _0H、HBTU，ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,將混合物 22_24°C接肽反應(yīng) 70 分抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(7)Fmoc-Phe-Cys (Acm) -Val-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg(Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘；抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Phe-OH，HBTU, HOBT, NMM，將混合物22_24°C接肽反應(yīng)70分鐘； 抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(8)Fmoc-Arg (Pbf) -Phe-Cys (Acm) -Val-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘；抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Arg(Pbf) -OH,HBTU,ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,將混合物 22_24°C接肽反應(yīng) 70 分抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(9 ) Fmoc-Gly-Arg (Pbf) -Phe-Cys (Acm) -Val-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-樹脂的制加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘； 抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU, HOBT, NMM，將混合物22_24°C接肽反應(yīng)70分鐘； 抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ；六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(10)Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly-Arg(Pbf) -樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘； 抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Arg (Pbf) -OH, HBTU, ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,將混合物 22_24°C接肽反應(yīng) 70 分鐘；抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(11)Fmoc-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt)-Val-Gly -Arg (I^bf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘； 抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Cys (Acm) _0H、HBTU，ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,將混合物 22_24°C接肽反應(yīng) 70 分鐘；抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(12)Fmoc-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Val-Cys(Trt )-Val-Gly- Arg (Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘；抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于 DMF 的 Fmoc-Tyr (tBu) -OH, HBTU, ΗΟΒΤ,ΝΜΜ,將混合物 22_24°C 接肽反應(yīng) 70 分鐘；抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(13)Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys(Acm)-Va I-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘；抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Cys (Trt) -OH, HBTU, HOBT, NMM,將混合物22_24°C接肽反應(yīng)1小時(shí)；抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(14)Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys (Acm) -Val- Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘； 抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Leu-OH、HBTU, HOBT, NMM,將混合物22_24°C接肽反應(yīng)70分鐘； 抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(15)Fmoc-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys (Acm) -Val -Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘； 抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU, HOBT, NMM，將混合物22_24°C接肽反應(yīng)70分鐘； 抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(16)Fmoc-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe -Cys (Acm) -Val -Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘； 抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于DMF的Fmoc-Gly-OH，HBTU, HOBT, NMM，將混合物22_24°C接肽反應(yīng)70分鐘； 抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(17)Boc-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Phe-Cys (Acm) -Val-Cys (Trt) -Val-Gly-Arg (Pbf)-樹脂的制備加入六氫吡啶的DMF溶液，22-24°C反應(yīng)30分鐘； 抽干，分別用DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；加入溶于DMF的Boc-Arg-OH · HCl · H2O, DIC, Η0ΒΤ，將混合物20_22°C接肽反應(yīng)11小時(shí)；抽干，DMF、無(wú)水甲醇、DMF各洗滌三次，抽干；再用無(wú)水甲醇洗滌三次；抽干后，放入真空干燥器中干燥，稱重，得保護(hù)17肽樹脂； 所說(shuō)的六氫吡啶的DMF溶液的濃度為22-24% ； 六氫吡啶的反應(yīng)溫度為22-M°C ；(18)H-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys(H)-Tyr-Cys(Acm)-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys(Acm)-Val-Cy s (H) -Val -Gly -Arg-NH2 的制備保護(hù)的十七肽樹脂轉(zhuǎn)移到切肽瓶中，冷卻下，邊攪拌邊加入切肽試劑，15-18°C攪拌下進(jìn)行切肽反應(yīng)3. 5-4. 5小時(shí)；過(guò)濾，抽干，濾液加無(wú)水乙醚沉淀，得到還原型十七肽粗品；(19)
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(18)中，所說(shuō)的切肽試劑為TFA/ TIS/EDT/H20 = 3600ml/160ml/100ml/40ml ；反應(yīng)溫度為15 18°C ；反應(yīng)攪拌時(shí)間為 3. 5 4. 5小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(19)中，5-位和14-位Cys的-SH基用Trt保護(hù)，并在pH為8. 5 10. 0的條件下用雙氧水氧化。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(20)中，7-位和12-位Cys的-SH基用Acm保護(hù)，并在甲醇溶液中用碘氧化；攪拌約30-90分鐘，滴加10%硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)；減壓除去甲醇，用四氯化碳提取回收碘3-5次。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(21)中，所說(shuō)的流動(dòng)相中磷酸三乙胺水溶液的濃度為0. 08 0. 25mol/L ；磷酸三乙胺水溶液在乙腈中所占比例為14. 5 25. 0 ；檢測(cè)波長(zhǎng)為:260-280nm ；C8 填料為10μ，200Α。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)至步驟(16)中接肽反應(yīng)溫度為 20-22°C，接肽反應(yīng)時(shí)間60-80分鐘；步驟(17)中接肽反應(yīng)溫度為20_22°C，接肽反應(yīng)時(shí)間 10-12小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固相多肽合成蛋白溶菌素的制備方法，本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟以RinkAmideMBHA樹脂為起始原料，HBTU/HOBt為縮合劑，按照固相合成的方法依次連接具有Fmoc-保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，最后一個(gè)氨基酸使用Boc-Arg-OH·HCl，獲得保護(hù)的十七肽樹脂，然后加入切肽試劑進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀，獲得還原型粗品。5-位和14-位Cys的-SH基用Trt保護(hù)，并在pH為8.5～10.0的條件下用雙氧水氧化；7-位和12-位Cys的-SH基用Acm保護(hù)，并在甲醇溶液中用碘氧化，獲得雙二硫鍵Cys5-14Cys7-12粗品，最后采用C8高效液相柱進(jìn)行分離純化，獲得目標(biāo)產(chǎn)物，純度為99.21％，總收率為23.68%。本發(fā)明的方法，生產(chǎn)成本低，工藝簡(jiǎn)單，環(huán)境污染低，產(chǎn)率高，便于工業(yè)化實(shí)施。
文檔編號(hào)C07K1/20GK102336813SQ20111018331
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者周逸明, 崔頎, 蔡華成 申請(qǐng)人:上海蘇豪逸明制藥有限公司, 周逸明, 崔頎