專利名稱：一種高效提取純化凝血因子ix和凝血因子x的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中血液制品的純化方法，確切地說是一種高效提取純化 凝血因子IX和凝血因子X的方法。
背景技術(shù)：
凝血因子IX(Coagulation factor IX，簡寫為 FIX)和凝血因子 X(Coagulation factor X，簡寫為FX)都是維生素K依賴因子，它們都是由肝細(xì)胞合成并分泌到血液中，并 在凝血反應(yīng)中發(fā)揮各自的活性[1]。FIX和FX都是糖蛋白，人源FIX的分子量為57，000，含 多糖17%左右[2]；人源FX的分子量為72，000，含多糖10%左右[3]。FIX和FX在凝血的瀑布反應(yīng)中，位于內(nèi)外源通路的交匯點(diǎn)，所以對凝血過程有著 非常重要的作用。FIX在血漿中的的含量一股認(rèn)為有5毫克/升左右，而FX在血漿中的的 含量為10毫克/升左右。FIX是一個非常重要的藥物，在臨床上被用作治療B型血友病。B型血友病(也稱 作Christmas病)是一種非常嚴(yán)重的疾病。B型血友病患者的血液在體內(nèi)和體外凝血活性 降低，而他們的一生都必須在嚴(yán)格的醫(yī)療監(jiān)控下度過。這些患者必須補(bǔ)充外源的正常血漿 中提取的FIX，才可以讓凝血時間恢復(fù)正常，且目前沒有其他任何替代品。FX雖然沒有作為藥物在臨床使用，但是FX是個使用范圍廣泛的科研試劑。FX作 為凝血通道上的重要環(huán)節(jié)，是一個很好的抗凝血藥物的設(shè)計靶標(biāo)。同時，F(xiàn)X也是一個選擇 性很高的精氨酸肽鍵水解酶，可以被設(shè)計成融合基因表達(dá)的融合蛋白的限制性內(nèi)切酶。因此，從血漿中高效率純化制備FIX和FX具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。自上個世紀(jì)七十年代，F(xiàn)IX、FX第一次被純化[4，5]發(fā)展到今天，國內(nèi)外現(xiàn)在已經(jīng) 有多種從血液中純化天然FIX、FX的方法。單純的多步離子交換層析，或是離子交換層析和 親和層析相結(jié)合的方法，是當(dāng)前普遍認(rèn)可的從血液中提取高純度FIX和FX的有效方法。多 步離子交換層析，步驟繁瑣，需要耗費(fèi)較長的時間W，7]。FIX、FX都是酶原，在長時間的純 化處理過程中，它們會被活化成活化狀態(tài)的FIX(FIXa)、活化狀態(tài)的FX(FXa)，所以，使用多 步離子交換層析很難得到純度較高的未被活化的FIX、FX。Fife和FXa是具有生物學(xué)活性 的水解酶，如果是臨床用FIX中含有部分Fife，則有可能在體內(nèi)觸發(fā)凝血反應(yīng)形成血栓；FX 雖然大部分情況是作為實(shí)驗(yàn)試劑被使用，但對純度的要求也是很高的。離子交換層析和親 和層析相結(jié)合的方法較單純的多步離子交換層析步驟簡化，可以很大程度上解決多步離子 交換層析費(fèi)時的問題，且親和配基對FIX或FX的特異性結(jié)合更有利于獲得高純度的FIX或 FX[8]。目前已有的技術(shù)中，親和效果最好的配基為Ca2+依賴型的單克隆抗體，其結(jié)合-解 離條件簡單溫和，在含有Ca2+的緩沖溶液中抗體可以和抗原特異性結(jié)合，將淋洗液換成含 有EDTA的緩沖溶液即可以洗脫下抗原。但是，單克隆抗體造價昂貴，且穩(wěn)定性較差，難以大 量應(yīng)用到工業(yè)大批量生產(chǎn)。肝素是另一種親和配基，它是一種帶負(fù)電荷的多聚物，是AT-III 的輔因子，又是許多凝血因子的抑制劑，可以通過靜電和親和相互作用可分離血漿中的很 多凝血因子。肝素價格較便宜，但是親和的特異性很差。
申請人長期從事蛇毒中FIX/FX結(jié)合蛋白家族的研究，徐小龍教授在2000年從皖 南尖吻蝮蛇蛇毒中純化了兩種FIX/FX結(jié)合蛋白(FIX/FX-bp)，分別命名為ACF I和ACF 11[9]。此后不僅對ACF I, ACF II進(jìn)行了深入的研究[10，11]，同時也對不同蛇毒來源的 FIX/FX-bp都進(jìn)行了深入的研究，如江浙蝮蛇的中的FIX/FX-bp AHP[12]，竹葉青中的FIX/ FX-bp等等。蛇毒中FIX/FX-bp屬于C型凝集素類似蛋白家族，所研究的幾個FIX/FX-bp，分 子量均為30kD左右，都有α和β兩條多肽鏈，都是α鏈和β鏈通過二硫鍵連接。FIX/ FX-bp大多具有兩個金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)，其在天然狀態(tài)下就結(jié)合兩個金屬離子，例如，AHP 在天然狀態(tài)下結(jié)合一個Ca2+，一個Zn2+[12]。FIX/FX-bp在Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+等離子存在 的條件下既可以結(jié)合FIX，也可以結(jié)合FX，在這些金屬離子不存在的條件下，會迅速和已經(jīng) 結(jié)合的FIX或FX發(fā)生解離[13]。FIX/FX-bp與IX、X都有很高的結(jié)合活性，且其特異性僅 限于FIX和FX。FIX/FX-bp作為爬行動物的外分泌蛋白，具有很好的穩(wěn)定性，且廉價易得。1. Furie,B. and B· C· Furie，Mechanisms of thrombus formation. N Engl J Med, 2008. 359(9) :p. 938-49.2.Thompson, A. R.，Structure，function，and molecular defects of factor IX. Blood，1986. 67(3) :p. 565-72.3. Mertens, K.and R. M. Bertina, Pathways in the activation of human coagulation factor X. Biochem J, 1980. 185(3) :p. 647-58.4. Fujikawa, K.，Μ. Ε. Legaz，and Ε. W. Davie, Bovine factors X 1 and X 2 (Stuart factor). Isolation andcharacterization. Biochemistry,1972. 11 (26) p. 4882-91.5. Fujikawa, K.，et al.，Isolation and characterization of bovine factor IX (Christmas factor). Biochemistry,1973. 12(24) :p.4938-45.6. Howard, J. B. and G. L. Nelsestuen, Isolation and characterization of vitamin K—dependent region of bovineblood clotting factor X. Proc Natl Acad Sci USA, 1975. 72(4) :p. 1281-5.7. Esnouf，M. P.，P. H. Lloyd, and J. Jesty, A method for the simultaneous isolation of factor X and prothrombinfrom bovine plasma. Biochem J,1973. 131 (4) p. 781-9.8. Liebman, H. A.，et al.，Immunoaffinity purification of factor IX(Christmas factor)by usingconformation-specific antibodies directed against the factor IX—metal complex. Proc Natl Acad Sci USA,1985. 82(11) :p. 3879—83.9. Xu,X. L. ,et al. , Purification and characterization of anticoagulation factors from the venom of Agkistrodonacutus. Toxicon,2000. 38(11) :p.1517-1528.10. Xu, X.，et al.，Effect of metal ion substitutions in anticoagulation factor I from the venom of Agkistrodon acutuson the binding of activated coagulation factor. X and on structural stability. J Biol Inorg Chem,2009. 14(4) p. 559-71.ll.Xu，X.L，et al. , Metal ions-and pH-induced conformational changes of acutolysin a from Agkistrodon acutusvenom probed by fluorescent spectroscopy.Biopolymers,2007. 85(1) :ρ·81-90.12. Wu, H. , et al. , Mg(II)-induced binding of factor IX-binding protein from the venom of Agkistrodon Halys Pallaswith factor Xa. Toxicon,2010. 55(7) p. 1358-64.13. Shen, D. , et al. , Identification of a nitric oxide-dependent hypotensive effect of anticoagulation factor II fromthe venom of Agkistrodon acutus. Biochem Pharmacol,2010. 79(3) :p.498-506.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述現(xiàn)有離子交換層析和親和層析相結(jié)合的純化方法的缺陷，旨在提 供一種改進(jìn)的兩者結(jié)合純化FIX/FX的方法，所要解決的技術(shù)問題是改進(jìn)親和層析填料基 質(zhì)的配基，使之不僅對人源的、而且對其他來源的IX、X均有特異性的高親和力。本發(fā)明遴選的配基就是存在于皖南尖吻蝮蛇、江浙蝮蛇、竹葉青等蛇毒中存在的 結(jié)合蛋白ACF I,ACF II、AHP。這些原料均由市場上購買的粗蛇毒凍干粉純化制得，具體純 化方法見文獻(xiàn)(2000年Toxicon，第11期，第1517到15 頁)；色譜柱填料基質(zhì)原料為瓊 脂糖，我們使用的型號為CNBr-actived Sepharose 4B。本發(fā)明將配基ACF I, ACF II, AHP 分別與基質(zhì)kpharose 4B樹脂通過肽鍵偶聯(lián)，制備得到幾種FIX/FX-bp-kpharose 4B。本發(fā)明的技術(shù)方案也是離子交換層析和親和層析相結(jié)合的方法，包括收集血液， 并加入常規(guī)的抗凝劑和酶抑制劑，取血漿，自血漿中提取IX和X并純化，所述的提取就是 利用離子交換層析分離出IX粗提物和X粗提物，與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別是IX粗提物和X粗提 物分別用FIX/FX-bp-kpharose 4B進(jìn)行親和層析純化，首先IX粗提物和X粗提物分別在 親和緩沖液中攪拌混合，然后用洗脫液分別洗脫得到純化的FIX或純化的FX ；所述的親和 緩沖液為 0. 02mol/L Tris-HCl，pH 7. 4,5mmol/L CaCl2,所述的洗脫緩沖液為 0. 02mol/L Tris-HCl,pH 7.4,5mmol/L EDTA。純化后IX可直接作為藥物應(yīng)用，純化后X可直接作為試 劑使用。比較幾種FIX/FX-bp-kpharose 4B的回收率。使用電泳測定FIX、FX的純度，使 用酶解肽段-質(zhì)譜鑒定電泳條帶，用酶底物法檢測FIX、FX的活力。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，在親和色譜純化FIX、FX的方法中，改進(jìn)使用了新型的高 效配基FIX/FX-bp，這種配基蛋白在特定金屬離子存在的條件下對FIX、FX有著特異性的高 親和力，而在沒有特定金屬離子存在的條件下與FIX、FX則不發(fā)生結(jié)合，且它的穩(wěn)定性較目 前親和技術(shù)中使用的配基-單克隆抗體更好。使用單克隆抗體作為配基，只能和一個抗原 發(fā)生特異性親和反應(yīng)，如anti-humanFIX只能和人源的FIX特異性結(jié)合。而本發(fā)明使用的新 型的高效配基FIX/FX-bp，與任何來源的FIX和FX都有很高的特異性親和力，并且這種親和 力受到特定金屬離子的調(diào)控，故新型的高效配基FIX/FX-bp可以具有非常廣泛的用途。在 使用FIX/FX-bp作為親和配基時，只需要改變金屬離子濃度就可以完成親和-解離洗脫的 過程，洗脫條件溫和，目標(biāo)蛋白和配基蛋白發(fā)生變性而導(dǎo)致?lián)p失的量極少。
四

圖 1 是 FIX (左)、FX (右)的 SDS—PAGE 圖。
圖2是FIX的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。圖3是FX的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。
五具體實(shí)施例方式(1) FIX/FX-bp-Sepharose 4B 的制備稱取所需量的CNBr活化kphar0Se-4B粉末，然后將其緩慢倒入10倍體積的 lmmol/LHCl溶液中，輕微攪拌、分散凝膠顆粒。待凝膠溶脹后，用偶聯(lián)緩沖液(0. 2M硼酸-硼 砂緩沖液PH = 8. 0)清洗凝膠。將1體積FIX/FX-bp溶液加到1體積平衡好的活化瓊脂 糖中，低速攪拌偶聯(lián)16 20h。隨后加入過量乙醇胺反應(yīng)，然后依次用高和低pH的緩沖液 (含 0. 5mol/LNaCl 的 pH = 4. 0,0. lmol/L 醋酸鈉緩沖液；含 0. 5mol/L NaCl 的 pH = 8. 3， 0. lmol/L硼酸-硼砂緩沖液)交替清洗凝膠三次，再用親和緩沖液(0.02mol/L Tris-HCl, pH 7. 4,5mmol/L CaCl2)和洗脫緩沖液(0. 02mol/L Tris-HCl，pH 7. 4,5mmol/L EDTA)交替 清洗，最后將其浸泡在含0. 疊氮鈉的平衡緩沖液中，4°C保存。(2)凝血因子IX粗提物、凝血因子X粗提物的獲得將含有抗凝劑的血漿(含0. 2mol/L檸檬酸三鈉，17000unit/L肝素，0. 2mol/L苯 甲脒，1OOOOimits/L大豆胰蛋白酶抑制劑)冷凍，然后在0°C條件下緩慢解凍，離心去除沉 淀獲得上清血漿。在4°C條件下，向上清血漿中加入DEAE-S^hadex A-50陰離子交換樹 脂，并溫和攪拌。隨后用平衡緩沖液(0. 2mol/L氯化鈉，0. 0lmol/L檸檬酸三鈉，0. 02mol/L Tris-HCl, pH 7. 4，和40imit/L肝素)清洗已吸附了蛋白的A-50樹脂。清洗完成后，采用 0-2. 0mol/L氯化鈉直線梯度洗脫A-50樹脂，分別得到FIX和FX的粗提物。(3)FIX/FX-bp-Sepharose 4B 親和色譜純化凝血因子 IX取FIX 粗提物，在親和緩沖液(0.02mol/L Tris-HCl, pH 7. 4,5mmol/L CaCl2)環(huán) 境下，加入FIX/FX-bp-kpharose 4B并溫和攪拌。隨后用親和緩沖液徹底清洗親和著FIX 的FIX/FX-bp-kpharose 4B，大約需要10倍床體積的親和緩沖液。接著使用洗脫緩沖液 (0. 02mol/LTris-HCl, pH 7. 4, 5mmol/LEDTA)洗脫 FIX/FX-bp-S印harose 4B 的結(jié)合蛋白， 大約需要2倍床體積即可完成洗脫。該洗脫下的蛋白，即為純化的FIX，收集并脫鹽濃縮，最 后冷凍干燥。用美國American Diagnostica Inc.的酶底物SPECTROZYME 檢測FIX的 特異性酶活力為143，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測FIX的純度為一個條帶。(4) FIX/FX-bp-Sepharose 4B 親和色譜純化凝血因子 X取FX 粗提物，在親和緩沖液(0. 02mol/L Tris-HCl, pH 7. 4,5mmol/L CaC12)環(huán) 境下，加入FIX/FX-bp-kpharose 4B并溫和攪拌。隨后用親和緩沖液徹底清洗親和著FX 的FIX/FX-bp-kpharose 4B，大約需要10倍床體積的親和緩沖液。接著使用洗脫緩沖液 (0. 02mol/L Tris-HCl,pH 7. 4, 5mmol/LEDTA)洗脫 FIX/FX-bp-S印harose 4B 的結(jié)合蛋白， 大約需要2倍床體積即可完成洗脫。該洗脫下的蛋白，即為純化的FX，收集并脫鹽濃縮，最 后冷凍干燥。用美國American Diagnostica Inc.的酶底物SPECTROZYME 檢測FX的 特異性酶活力為239，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測FX的純度為一個條帶。
權(quán)利要求
1.一種高效提取純化凝血因子IX和凝血因子X的方法，包括血液的收集、處理、取血 漿以及自血漿中提取IX粗提物和X粗提物及其純化，其特征在于所述的純化是凝血因子 IX粗提物和凝血因子X粗提物分別用FIX/FX-bp-kpharose 4B進(jìn)行親和層析純化，首先 IX粗提物和X粗提物分別在親和緩沖液中攪拌混合，然后用洗脫緩沖液分別洗脫得到純化 的凝血因子IX或純化的凝血因子X，所述的親和緩沖液為0. 02mol/L Tris-HCl, pH 7. 4， 5mmol/LCaC12，所述的洗脫緩沖液為 0. 02mol/L Tris-HCl, pH 7. 4,5mmol/L EDTA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于親和配基FIX/FX-bp選自ACFI, ACF II 或 ΑΗΡ。
全文摘要
一種高效提取純化凝血因子IX和凝血因子X的方法，包括血液的收集、處理、取血漿以及自血漿中提取IX粗提物和X粗提物及其純化，其特征在于所述的純化是凝血因子IX粗提物和X粗提物分別用FIX/FX-bp-Sepharose 4B進(jìn)行親和層析純化，所述的親和配基FIX/FX-bp選自ACF I、ACF II或AHP。純化后凝血因子IX可直接作為藥物應(yīng)用，純化后凝血因子X可直接作為試劑使用。
文檔編號C07K1/22GK102146134SQ20111000148
公開日2011年8月10日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者徐小龍, 沈登科 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)