專利名稱：T細(xì)胞受體的制作方法
T細(xì)胞受體本發(fā)明涉及結(jié)合EVDPIGHLY肽(源自MAGE-3蛋白)的T細(xì)胞受體(TCR)，所述肽以肽-HLA-Al復(fù)合體形式存在，所述TCR相對(duì)天然MAGE-A3 TCRa和/或0可變結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，且對(duì)所述復(fù)合體所具有的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期至少兩倍于參比MAGE-A3TCR。
背景技術(shù)：
所述EVDPIGHLY(SEQ ID No:1)肽對(duì)應(yīng)已知MAGE-3蛋白的氨基酸殘基168-176。所述MAGE-3蛋白在多種腫瘤類型中有表達(dá)，包括黑色素瘤，以及其他固體腫瘤如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、膀胱癌、胃癌和食道癌。所述MAGE-3肽EVDPIGHLY (SEQ ID No:1)是鑒定最充分的MAGE-3表位。它由HLA-Al和HLA-B35限制性T細(xì)胞識(shí)別。它能誘發(fā)細(xì)胞毒性抵御肽沖擊，HLA-Al陽性靶細(xì)胞和MAGE-3-表達(dá)型HLA-Al陽性黑色素瘤細(xì)胞系。所述肽用作疫苗已表明可在ー些患者中誘導(dǎo)腫瘤消退和誘發(fā)CTL反應(yīng)。因此，所述EVDPIGHLY HLA-Al復(fù)合體提供了本發(fā)明所述TCR可靶向的癌癥標(biāo)志物。比如，本發(fā)明的TCR可以轉(zhuǎn)入T細(xì)胞內(nèi)使其可以破壞呈遞該HLA復(fù)合體的腫瘤細(xì)胞，用于在稱作過繼治療的治療過程中施于患者。為此，需要所述TCR相比所述肽-HLA復(fù)合體的特異性天然TCR而言對(duì)該復(fù)合體具有更高的親和カ和/或更低的解離速率。親和カ顯著增加伴有TCR基因修飾的⑶8T細(xì)胞喪失抗原特異性，這會(huì)導(dǎo)致非特異性激活這些TCR轉(zhuǎn)染的CD8T細(xì)胞，因此過繼治療優(yōu)選的TCR相比所述肽-HLA復(fù)合體的特異性天然TCR而言對(duì)該復(fù)合體的親和カ稍高和/或解離速率稍低，而非對(duì)所述肽-HLA復(fù)合體的親和カ顯著高于和/或解離速率顯著低于天然TCR (見Zhao等(2007) J Tmmuno1.179:5845-54; Robbins等(2008) J Immunol.180:6116-31 ;也可見已公開的 W02008/038002)。TCR采用國(guó)際免疫遺傳學(xué)(IMGT) TCR命名法進(jìn)行表述，并與TCR序列的IMGT公開數(shù)據(jù)庫相鏈接。天然雜ニ聚體TCR 具有a鏈和0鏈。寬泛地，每個(gè)鏈包括可變區(qū)、連接區(qū)和恒定區(qū)，P鏈還通常在可變區(qū)和連接區(qū)之間含有短的多變區(qū)，不過該多變區(qū)常被視為連接區(qū)的一部分。每個(gè)可變區(qū)包括嵌于構(gòu)架序列中的三個(gè)CDR(互補(bǔ)決定區(qū))，ー個(gè)是名為CDR3的高變區(qū)。共有幾種類型的a鏈可變區(qū)(Va )和幾種類型的P鏈可變區(qū)(V3 )，通過它們的構(gòu)架，⑶Rl和⑶R2序列，以及部分限定的⑶R3序列進(jìn)行區(qū)分。V a類型在頂GT命名法中通過特有的TRAV數(shù)來定名。因此，“TRAV21”限定義的TCR Va區(qū)具有獨(dú)特的構(gòu)架、⑶Rl和⑶R2序列，以及部分由TCR相互之間保守的氨基酸序列限定但還包括TCR相互之間有變化的氨基酸序列的⑶R3序列。同樣地，“TRBV5-1”限定的TCR 區(qū)具有獨(dú)特的構(gòu)架、⑶Rl和⑶R2序列，以及僅部分限定的⑶R3序列。所述TCR的連接區(qū)類似地由特有的頂GT TRAJ和TRBJ命名法限定，而恒定區(qū)由IMGT TRAC和TRBC命名法限定。P鏈多變區(qū)在頂GT命名法中由縮略語TRBD定名，并如提到的，連接好的TRBD/TRBJ區(qū)常一起被視為連接區(qū)。一般認(rèn)為a P TCR的a和P鏈各自含有兩個(gè)“結(jié)構(gòu)域”，即可變和恒定結(jié)構(gòu)域?？勺兘Y(jié)構(gòu)域由可變區(qū)和連接區(qū)的連接體組成。因此，本發(fā)明說明書和權(quán)利要求中，術(shù)語“TCRa可變結(jié)構(gòu)域”指TRAV和TRAJ區(qū)的連接體，而術(shù)語TCR α恒定結(jié)構(gòu)域指胞外TRAC區(qū)，或指C端截短的TRAC序列。類似的，術(shù)語“TCRβ可變結(jié)構(gòu)域”指TRBV和TRBD/TRBJ區(qū)的連接體，而術(shù)語TCR β恒定結(jié)構(gòu)域指胞外TRBC區(qū)，或指C端截短的TRBC序列。由IMGT命名法限定的特有序列已為TCR領(lǐng)域相關(guān)人員熟知并可獲取。例如，可在IMGT公共數(shù)據(jù)庫中找到這些序列?！癟 cell Receptor Factsbook(《T細(xì)胞受體叢書》)” (2001)LeFranc 和 LeFranc,學(xué)術(shù)出版社(Acadamic Press), ISBN0-12-441352-8 也公開了由IMGT命名法定義的序列，不過因?yàn)樗陌l(fā)表日期和時(shí)間間隔，有時(shí)需要通過參考IMGT數(shù)據(jù)庫來確認(rèn)信息。

我們已證實(shí)天然的MAGE-3 TCR(來源于比利時(shí)布魯塞爾B-1200，希波克拉底斯大道74號(hào)UCL7459，魯汶大學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)部門Pierre G.Coulie博士的克隆EB81-103 ;另見Karanikas 等(2003)"Monoclonal ant1-MAGE-3 CTL responses in me Ianoma patientsdisplaying tumor regression after vaccination with a recombinant canarypoxvirus.(黑色素瘤患者中單克隆抗MAGE-3 CTL響應(yīng)接種重組金絲雀痘病毒后顯示腫瘤消退)〃J.1mmunol.171(9):4898-904))具有如下α鏈和β鏈可變、連接和恒定基因用法:α 鏈-TRAV21*01/TRAJ28/TRAC(SEQ ID No: 2 給出天然 MAGE-A3 TCRa 鏈的胞外序列)。β 鏈-TRBV5-1*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2(SEQ ID No: 3 給出天然 MAGE-A3TCR^鏈的胞外序列)。(需注意，TRBV5-1序列有兩個(gè)等位基因變體，IMGT命名法中分別稱作TRBV5-1*01和*02，上面所指的天然MAGE-A3TCR克隆具有*01變異。同樣地，TRBJ2-7序列有兩個(gè)已知變體，上面所指的TCR克隆中存在*01序列。另注意，沒有限定符意味著相關(guān)序列只有一個(gè)已知等位基因。)術(shù)語“野生型TCR”、“天然TCR”、“野生型MAGE-A3 TCR”和“天然MAGE-A3 TCR”在本文中同義使用，指天然產(chǎn)生的含有胞外α和β鏈SEQ ID Νο:2和3的TCR。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種T細(xì)胞受體(TCR)，其具有EVDPIGHLY(SEQ ID No:1)HLA-Al復(fù)合體結(jié)合特性且包含TCR α可變結(jié)構(gòu)域和TCRP可變結(jié)構(gòu)域，其特征在于:所述TCR α可變結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID No:2從Kl到Pl 14的氨基酸序列，但存在至少一種以下突變:501 突變?yōu)?50V;51Q 突變?yōu)?51R;52S 突變?yōu)?52P;53S突變?yōu)?3Y ;和/或所述TCRP可變結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID No:3從Kl到Tl 12的氨基酸序列，但存在至少一種以下突變:50F 突變?yōu)?50T;51S 突變?yōu)?51D;52E 突變?yōu)?52M;53T 突變?yōu)?53L ；
54Q 突變?yōu)?54L。本發(fā)明的TCR優(yōu)選對(duì)EVDPIGHLY HLA-Al復(fù)合體的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期至少兩倍于參比MAGE-A3 TCR，所述參比MAGE-A3 TCR具有胞外a鏈序列SEQ ID No:6和胞外^鏈序列SEQ ID No:7。需注意，SEQ ID No:6是天然a鏈胞外序列ID No:2但用C162替換后者的T162(即TRAC的T48)。同樣，SEQ ID No:7是天然P鏈胞外序列ID No:3但用C169替換后者的S169 (即TRBC2的S57)，用A187替換后者的C187以及用D201替換后者的N201。這些相對(duì)天然a和3鏈胞外序列的半胱氨酸取代使得能形成鏈間ニ硫鍵以穩(wěn)定重折疊的可溶性TCR，即所述TCR經(jīng)胞外a和0鏈重折疊形成。采用穩(wěn)定的ニ硫鍵連接的可溶性TCR作為參比TCR能更便捷地評(píng)估結(jié)合親和カ和結(jié)合半衰期。a鏈SEQ ID No:6和P鏈SEQID No: 7中相對(duì)天然a和0鏈SEQ ID No: 2和3的其他突變?yōu)椤俺聊汀?，就是說這些突變不會(huì)影響相對(duì)于天然序列的結(jié)合親和カ或結(jié)合半衰期。因此，若本發(fā)明的TCR對(duì)EVDPIGHLYHLA-Al復(fù)合體的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期至少兩倍于參比MAGE-A3 TCR,則意味著其相對(duì)于上面所指的天然MAGE-A3 TCR克隆也滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。“具有胞外a鏈序列SEQ ID No:6和胞外^鏈序列SEQ ID No: 7的參比MAGE-A3TCR”在下文中與“參比TCR”或“參比MAGE-A3 TCR”同義使用。結(jié)合親和力(與平衡常數(shù)Kd成反比)和結(jié)合半衰期(表述為T1/2)可用任何適當(dāng)?shù)姆椒▉泶_定。應(yīng)了解，TCR親和カ翻倍導(dǎo)致Kd減半。T1/2由ln2除以解離速率計(jì)算得到。因此T1/2翻倍使得U減半。TCR的Kd和U值通常針對(duì)可溶形式的TCR測(cè)定，即經(jīng)截短以除去疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域殘基的那些形式。因此可理解為，若給定TCR的可溶形式滿足針對(duì)EVDPIGHLY HLA-Al復(fù)合體的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期的要求，則該TCR即滿足這些要求。優(yōu)選使用相同檢測(cè)方 法多次，例如3次或更多次，測(cè)量給定TCR的結(jié)合親和力和半衰期并取結(jié)果的平均值。在優(yōu)選實(shí)施方式中，這些測(cè)量采用本文實(shí)施例3的表面等離子體共振(BIAcore)法進(jìn)行。用該方法測(cè)得參比MAGE-A3 TCR的Kd約為250 u M，koff約為0.2s—1 (即 T1/2 約為 3s)。本發(fā)明所述TCR對(duì)EVDPIGHLY HLA-Al復(fù)合體的結(jié)合親和力和/或結(jié)合半衰期至少兩倍于參比MAGE-A3 TCR，但保留可接受的EVDPIGHLY HLA-Al復(fù)合體特異性，例如與參比MAGE-A3 TCR相似。與參比MAGE-A3 TCR相比，過繼治療用T細(xì)胞轉(zhuǎn)染所需的TCR對(duì)所述EVDPIGHLY HLA-Al復(fù)合體具有稍高的親和カ和/或稍長(zhǎng)的結(jié)合半衰期(盡管仍分別至少兩倍于天然TCR)。例如，本發(fā)明所述TCR對(duì)所述復(fù)合體的Kd從約6 ii M到約70 y M，和/或?qū)λ鰪?fù)合體的結(jié)合半衰期(T1/2)從約I秒到約11秒。為達(dá)本發(fā)明的目的，TCR為具有至少ー個(gè)TCRa和/或TCR P可變結(jié)構(gòu)域的部分。它們一般包含TCRa可變結(jié)構(gòu)域和TCRP可變結(jié)構(gòu)域。它們可能是a ^雜ニ聚體或可能是單鏈形式。為了用于過繼治療，舉例而言，a ^雜ニ聚體TCR可能以含胞質(zhì)和跨膜結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)鏈來進(jìn)行轉(zhuǎn)染。如果需要，相應(yīng)恒定結(jié)構(gòu)域之間可能存在引入的ニ硫鍵(參見如W02006/000830)。無論何種形式，相對(duì)具有胞外a和0鏈SEQ ID No: 2和3的天然MAGE-A3 TCR,本發(fā)明所述TCR在其a可變結(jié)構(gòu)域(SEQ ID No: 2的Kl到Pl 14)和/或P可變結(jié)構(gòu)域(SEQ ID No:3的Kl到T112)中有突變。天然MAGE-A3或參比MAGE-A3 TCR可用作模板，弓丨入能導(dǎo)致本發(fā)明所述TCR與EVDPIGHLY HLA-Al復(fù)合體之間相互作用的高親和力和/或慢解離速率的多種突變。本發(fā)明的實(shí)施方式包括相對(duì)SEQ ID No:2的Kl到P114的α可變結(jié)構(gòu)域和/或SEQ ID Νο:3的Kl到Τ112的β可變結(jié)構(gòu)域在至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)和/或其可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)架區(qū)有突變的TCR。可采用任何適當(dāng)方法進(jìn)行突變，包括但不限于:基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、限制性酶基克隆，或不依賴連接反應(yīng)的克隆(LIC)過程的那些方法。這些方法在許多標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)文本中有詳細(xì)描述。關(guān)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)誘變和限制性酶基克隆的進(jìn)一步細(xì)節(jié)見Sambrook和Russell, (2001)Molecular Cloning-A Laboratory Manual (《分子克隆一實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)(第三版)CSHL出版社。LIC過程的進(jìn)一步信息可參見(Rashtchian，(1995)Curr Opin Biotechnol6(I):30-6)。產(chǎn)生本發(fā)明的高親和性MAGE-3 TCR的一種方法是從W02004/044004公開的展示此類TCR的噬菌體顆粒的多樣庫中進(jìn)行挑選。需注意的是，包含與天然MAGE-A3 TCR或參比MAGE-3 TCR相似的Va和νβ基因用法并因而具有相似的可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的任何a PTCR可作為便捷的模板TCR。隨后可以向編碼模板α β TCR的一個(gè)或兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的DNA中引入產(chǎn)生本發(fā)明的突變TCR所需的變化。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見地，必要的突變可用多種方法引入，如定點(diǎn)誘變。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所述TCR具有SEQ ID Νο:2的Kl到Ρ114的α鏈可變結(jié)構(gòu)域，但該序列中501，51Q，52S或53S —個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基發(fā)生突變，和/或具有SEQ ID No:3的Kl到T112的β鏈可變結(jié)構(gòu)域，但該序列中50F，51S，52Ε，53Τ或54Q —個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基發(fā)生突變。例如，本發(fā)明所述TCR可能具有按SEQ ID Νο:2中所示編號(hào)的α鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸 殘基50V，51R，52P或53Y中的一個(gè)或多個(gè)，和/或按SEQID No:3中所示編號(hào)的β鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基501'，510，5211，531^或5禮中的一個(gè)或多個(gè)。本發(fā)明的特定TCR包括含有α鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SEQ ID No:8和9之一，和/或β鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SEQ ID No: 10和11之一的那些TCR。因此具有野生型α鏈的可變結(jié)構(gòu)域序列(SEQ ID No:2的Kl到P114)的TCR可能與具有SEQ ID NoilO和11之一的β鏈關(guān)聯(lián)。替代地，具有SEQ ID Νο:8和9之一的α鏈可能與野生型β鏈的可變結(jié)構(gòu)域序列(SEQ ID Νο:3的Kl到Τ112)關(guān)聯(lián)。替代地，具有SEQ ID Νο:8和9之一的α鏈可能與具有SEQ ID No: 10和11之一的β鏈關(guān)聯(lián)。如上所述的TCR的表型沉默變體也是本發(fā)明的一部分。術(shù)語“表型沉默變體”是指與本發(fā)明所述TCR序列一致但在恒定和/或可變結(jié)構(gòu)域摻有不會(huì)改變與肽一 HLA復(fù)合體相互作用的親和力和/或解離速率的變化。此類變體的一種示例是本發(fā)明的TCR，所述TCR中TCRa恒定結(jié)構(gòu)域中按SEQ ID No:2中所示編號(hào)的135絲氨酸(S)氨基酸殘基替換成苯丙氨酸(F)氨基酸殘基。如上所述，本發(fā)明的α β雜二聚體TCR可在其恒定結(jié)構(gòu)域之間含有引入的二硫鍵。這種類型的優(yōu)選TCR包括具有TRAC恒定結(jié)構(gòu)域序列和TRBCl或TRBC2恒定結(jié)構(gòu)域序列但TRAC的Thr48和TRBCl或TRBC2的Ser57被替換成半胱氨酸殘基的TCR，所述半胱氨酸在TCR的TRAC恒定結(jié)構(gòu)域序列和TRBCl或TRBC2恒定結(jié)構(gòu)域序列之間形成ニ硫鍵。無論有或沒有上段中提到的引入的鏈間鍵，本發(fā)明的a ^雜ニ聚體TCR可具有TRAC恒定結(jié)構(gòu)域序列和TRBCl或TRBC2恒定結(jié)構(gòu)域序列，且TCR的TRAC恒定結(jié)構(gòu)域序列和TRBCl或TRBC2恒定結(jié)構(gòu)域序列可通過TRAC外顯子2的Cys4和TRBCl或TRBC2外顯子2的Cys2之間的天然ニ硫鍵連接。本發(fā)明的a ^雜ニ聚體TCR可用于過繼治療，因此本發(fā)明包括呈遞本發(fā)明所述TCR的分離細(xì)胞，特別是T細(xì)胞。許多方法適用于將編碼本發(fā)明所述TCR的DNA或RNA轉(zhuǎn)染入T細(xì)胞。(參見例如Robbins等，(2008) J.1mmunol.180:6116-6131)。表達(dá)本發(fā)明所述TCR的T細(xì)胞適用于基于過繼治療的MAGE-3+HLA-A1+癌癥治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知過繼治療可得以進(jìn)行的許多合適方法。(參見例如Rosenberg等，(2008) Nat RevCancer8 (4):299-308)。

為了用于過繼治療，本發(fā)明還包括攜帯TCR表達(dá)載體的細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含位于單ー開放讀碼框內(nèi)或兩個(gè)不同開放讀碼框內(nèi)的編碼本發(fā)明所述TCR的核酸。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括攜帯第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體的細(xì)胞，其第一表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明所述TCR的a鏈的核酸，其第二表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明所述TCR的P鏈的核酸。欲用于過繼治療的本發(fā)明TCR由經(jīng)轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞表達(dá)時(shí)是糖基化的。已熟知，轉(zhuǎn)染的TCR的糖基化模式可以通過所轉(zhuǎn)染基因的突變而改變。為了施用于患者，本發(fā)明所述TCR轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞可以在藥物組合物中與藥學(xué)可接受載體一同提供。本發(fā)明所述的細(xì)胞通常作為無菌藥物組合物的一部分進(jìn)行供應(yīng)，所述組合物一般包括藥學(xué)可接受的載體。該藥物組合物可為任何合適的形式(取決于將其施用于患者所需的方法)。其可按單位劑型提供，通常在密閉容器中提供，并可作為試劑盒的一部分來提供。此類試劑盒通常(但并非必須)包括使用說明。其可包括多種所述單位劑型。所述藥物組合物可適于通過靜脈內(nèi)途徑來施用。此類組合物可通過制藥領(lǐng)域任何已知方法制備，如將活性組分與載體或賦形劑在無菌狀態(tài)下混合。本發(fā)明所述物質(zhì)的劑量可大范圍變動(dòng)，取決于所治療的疾病或癥狀，待治療個(gè)體的年齡和狀況等，醫(yī)師可最終決定適當(dāng)?shù)氖褂脛┝俊?br> 實(shí)施例通過以下實(shí)施例進(jìn)ー步說明本發(fā)明，其中涉及以下附圖。

圖1A和 2A分別顯示具有TRAV21*01/TRAJ28/TRAC基因的天然MAGE-A3 TCRa 鏈，和具有 TRBV5-1*01/TRBD1/TRBJ2-7*01/TRBC2 基因的天然 MAGE-A3 TCRP 鏈(分別為 SEQID No:2和3)的胞外氨基酸序列。圖1B和2B分別顯示編碼可溶性野生型MAGE-A3 TCRa和0鏈即參比MAGE-A3TCRa和0鏈的DNA序列。這些序列包括形成非天然ニ硫鍵的附加半胱氨酸殘基。編碼附加半胱氨酸殘基的經(jīng)突變密碼子為粗體。NdeI和HindIII限制性酶識(shí)別序列帶下劃線。圖1C和2C分別顯示由圖1B和2B的DNA序列分別生成的可溶性野生型MAGE-A3TCR或參比MAGE-A3 TCR的a和0鏈胞外的氨基酸序列(分別為SEQ ID No:6和7)，不過不含用于細(xì)菌內(nèi)有效表達(dá)而插入的前導(dǎo)甲硫氨酸。所引入的半胱氨酸為粗體并帶下劃線。圖3A-B顯示本發(fā)明所述MAGE-A3 TCR變體的a鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。突變的殘基為粗體并帶下劃線。圖4A-B顯示本發(fā)明所述MAGE-A3 TCR變體的β鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列。突變的殘基為粗體并帶下劃線。圖5Α顯示用于轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的野生型MAGE-A3-特異性TCR基因的DNA序列(WT α鏈-2A-WTi3鏈構(gòu)建體，豬捷申病毒-12A序列為粗體并帶下劃線)。圖5B顯示由圖5的DNA序列生成的用于T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的野生型MAGE-A3-特異性TCR的氨基酸序列。豬捷申病毒-12A序列為粗體并帶下劃線。圖6顯示ELISP0T試驗(yàn)中酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)中MAGE-A3 TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞響應(yīng)一系列靶細(xì)胞的IFN-Y釋放。這些圖顯示較高親和力MAGE-A3 TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞相比天然MAGE-A3 TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞具有增強(qiáng)的特異性激活。圖7顯示的細(xì)胞毒性試驗(yàn)檢測(cè)由MAGE-A3 TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞系。實(shí)施例1克隆參比MAGE-A3TCRa和β鏈可變區(qū)序列至PGMT7表達(dá)質(zhì)粒中從提取自MAGE-3 T細(xì)胞克隆(來源于比利時(shí)魯汶大學(xué)Pierre Coulie的克隆ΕΒ81-103)的總cDNA中PCR擴(kuò)增得到參比MAGE-A3 TCR可變?chǔ)梁蚑CR可變?chǔ)陆Y(jié)構(gòu)域。就α鏈而言，利用α鏈可變區(qū)序列特異性寡核苷酸Al (ggaattccatatgaaacaagaagttactcaaattcc SEQ ID No: 14),和 α 鏈恒定區(qū)序列特異性寡核苷酸 Α2 (ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg SEQ ID No: 15)擴(kuò)增α鏈可變區(qū),其中Al編碼限制性位點(diǎn)NdeI和用于有效啟動(dòng)細(xì)菌內(nèi)表達(dá)而引入的甲硫氨酸，而Α2編碼限制性位點(diǎn)Sail。就β鏈而言，利用β 鏈可變區(qū)序列特異 性寡核苷酸 BI (gaattccatatgaaagctggagttactcaaactccaag SEQ IDNo: 16),和 β 鏈恒定區(qū)序列特異性寡核苷酸 Β2 (tagaaaccggtggccaggcacaccagtgtggc SEQID No: 17)擴(kuò)增β鏈可變區(qū)，其中BI編碼限制性位點(diǎn)NdeI和用于有效啟動(dòng)細(xì)菌內(nèi)表達(dá)而引入的甲硫氨酸，而Β2編碼限制性位點(diǎn)AgeI。米用Sambrook 和 Russell 的 Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》)第三版中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法，將α和β可變區(qū)克隆到含有Ca或Ci3的pGMT7表達(dá)質(zhì)粒中。利用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)的3730x1 DNA分析儀對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。將經(jīng)NdeI和SalI酶切的編碼TCR α鏈的DNA序列接入經(jīng)NdeI和XhoI酶切的PGMT7+C α載體中。將經(jīng)NdeI和AgeI酶切的編碼TCR β鏈的DNA序列接入同樣經(jīng)NdeI和AgeI酶切的另一 pGMT7+CP載體中。連接將已連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli)XLl_藍(lán)色細(xì)胞中，接種至含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB/瓊脂平板上。37° C培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落并在含100 μ g/ml氨芐青霉素的IOml LB中37° C振蕩生長(zhǎng)過夜。利用Minipr印試劑盒(凱杰公司)純化克隆質(zhì)粒，并利用應(yīng)用生物系統(tǒng)3730x1 DNA分析儀對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。圖1C和2C分別顯示由圖1B和2B的DNA序列分別生成的可溶性二硫鍵連接的參比MAGE-A3 TCRa和β鏈胞外氨基酸序列(分別為SEQ ID Νο:6和7)，不過不含用于細(xì)菌內(nèi)有效表達(dá)而插入的前導(dǎo)甲硫氨酸。注意，α和β鏈的恒定區(qū)中有半胱氨酸替換，以在重折疊形成雜二聚體TCR時(shí)提供人工鏈間二硫鍵。所引入的半胱氨酸為粗體并帶下劃線。圖1B和2Β的DNA序列中的限制性酶識(shí)別序列帶下劃線。
實(shí)施例2表達(dá)、重折疊和純化可溶性參比MAGE-A3 TCR將實(shí)施例1中制備的分別含TCRa鏈和P鏈的表達(dá)質(zhì)粒各自轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株Rosetta(DE3)pLysS中，氨節(jié)青霉素抗性的單菌落于TYP(氨節(jié)青霉素IOOii g/ml)培養(yǎng)基中37° C生長(zhǎng)至OD6tltl約為0.6-0.8后用0.5mM IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)3小時(shí)后于貝克曼(Beckman)J-6B中4000rpm離心30分鐘收集細(xì)胞。在MgCl2和DNA酶I存在下用25ml BugBuster (諾瓦基公司(NovaGen))裂解細(xì)胞團(tuán)塊。在貝克曼J2-21離心機(jī)中13000rpm離心30分鐘回收包涵體團(tuán)塊。然后進(jìn)行三次洗滌劑洗滌以去除細(xì)胞碎片和膜組分。每次將包涵體團(tuán)塊于曲通(Triton)緩沖液(50mM Tris-HCI pH8.0，0.5% 曲通-X100, 200mM NaCl, IOmMNaEDTA)中勻漿后，4000rpm離心15分鐘得團(tuán)塊。用如下緩沖液:50mMTris_HCl pH8.0, ImMNaEDTA，pH8.0，通過類似的洗滌除去洗滌劑和鹽。最后，將包涵體分成30mg等份并-70° C冷凍。用6M鹽酸胍溶解并在日立(Hitachi)U-2001分光光度計(jì)上測(cè)定OD來定量包涵體蛋白質(zhì)得率。由消光系數(shù)計(jì)算得到蛋白濃度。從凍存?zhèn)淞辖鈨龀?約15mg TCRP鏈和15mg TCRa鏈的已溶解包涵體，稀釋至IOml胍溶液(6M鹽酸胍，50mM Tris HCl pH8.1, IOOmM NaCl, IOmM EDTA, IOmMニ硫蘇糖醇)稀釋以確保鏈完全變性。接著將含完全還原和變性的TCR鏈的胍溶液注射到0.5L如下重折疊緩沖液中=IOOmM Tris pH8.1, 400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M尿素。先加入氧化還原對(duì)(半胱胺鹽酸鹽和胱胺ニ鹽酸鹽)至終濃度分別為6.6mM和3.7mM,約5分鐘后加入變性的TCR鏈。溶液靜置約30分鐘。將重折疊TCR用纖維素膜透析管(西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)，產(chǎn)品號(hào)D9402)在IOL水中于5° C±3° C透析18-20小時(shí)。隨后將透析緩沖液兩次換成新鮮的IOmM Tris pH8.1 (IOL)并于5° C±3° C繼續(xù)透析約8小時(shí)。將經(jīng)透析的重折疊液上載到POROS 50HQ陰離子交換柱上，利用Akta純化儀(GE醫(yī)療集團(tuán)(GE Healthcare))用IOmM Tris pH8.1以跨6倍柱體積的0_500mM NaCl梯度洗脫結(jié)合的蛋白，從而將可溶性TCR與錯(cuò)誤折疊物、降解產(chǎn)物和雜質(zhì)分離。將峰組分于4° C保存并用考馬斯藍(lán)染色的SDS-PAGE分析后，匯集并濃縮。最后，利用經(jīng)PBS緩沖液(西格瑪公司)預(yù)平衡的GE醫(yī)療集團(tuán)Superdex 75HR凝膠過濾柱純化和鑒定可溶性TCR。匯集和濃縮相對(duì)分子量約為50kDa處洗脫的峰，然后采用BIAcore表面等離子體共振分析進(jìn)行鑒定。實(shí)施例3結(jié)合特征BIAcore 分析表面等離子體共振生物感應(yīng)器(BIAcore 3000 )可用于分析可溶性TCR與其肽-MHC配體的結(jié)合。這受益于可溶性生物素化的肽-HLA (“pHLA”)復(fù)合體的生成，該復(fù)合體可固定化到包被有鏈霉親和素的結(jié)合表面(感應(yīng)器芯片)。所述感應(yīng)器芯片包括四個(gè)獨(dú)立的流動(dòng)池，可以同時(shí)測(cè)量T細(xì)胞受體與四個(gè)不同pHLA復(fù)合體的結(jié)合。手動(dòng)注射pHLA復(fù)合體使得固定化I類分子的精密水平易于操控。通過含有組成亞基蛋白和合成肽的細(xì)菌表達(dá)的包涵體的體外重折疊，再經(jīng)過純化和體外酶促生物素化得到生物素化I類HLA-A*01分子(O’ Callaghan等(1999)Anal.Biochem.266:9-15)。HLA_A*01重鏈表達(dá)時(shí)帶有C端生物素化標(biāo)簽，該標(biāo)簽以適當(dāng)構(gòu)建體中替代該蛋白的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。所得包涵體表達(dá)水平約為75mg/L細(xì)菌培養(yǎng)物。在大腸桿菌中也由適當(dāng)構(gòu)建體將MHC輕鏈或￠2-微球蛋白(0 2m)表達(dá)為包涵體，表達(dá)水平約為500mg/L細(xì)菌培養(yǎng)物。 裂解大腸桿菌細(xì)胞并純化包涵體至約80%純度。將合成肽(MAGE-A3EVDPIGHLY)溶解于DMSO中至終濃度4mg/ml。β 2m和重鏈的包涵體分別于6M鹽酸胍，50mM Tris pH8.1，IOOmM NaCl，IOmM 二硫蘇糖醇，IOmM EDTA中變性。制備的重折疊緩沖液含有0.4M L-精氨酸，IOOmM Tris pH8.1，3.7mM胱胺二鹽酸鹽，6.6mM半胱胺鹽酸鹽，并冷藏至低于5° C。優(yōu)選先將所述肽加入重折疊緩沖液中，然后加入變性的β 2m，再加入變性的重鏈。將MAGE-A3EVDPIGHLY肽加入重折疊緩沖液中至4mg/L (終濃度)。然后加入30mg/L β 2m,再是30mg/L重鏈(終濃度)。4° C重折疊至少I小時(shí)使其進(jìn)行完全。用10倍體積的IOmM Tris pH8.1透析以置換緩沖液。需要換兩次緩沖液以充分降低溶液的離子強(qiáng)度。此后，蛋白溶液經(jīng)1.5 μ m醋酸纖維素濾器過濾后上載到POROS 50HQ陰離子交換柱(8ml柱床體積)。利用Akta純化儀(GE醫(yī)療集團(tuán))用含Tris pH8.1以線性的0-500mM NaCl梯度 洗脫蛋白。HLA_A*01-肽復(fù)合體約在250mM NaCl處洗脫，收集峰組分，加入蛋白酶抑制劑混合物(卡巴開公司(Calbiochem))，并將組分于冰上冷卻。將生物素標(biāo)記的pHLA分子經(jīng)緩沖液置換入IOmM Tris pH8.1, 5mM NaCl，所述置換利用平衡于同一緩沖液的GE醫(yī)療集團(tuán)快速脫鹽柱。洗脫后立即將含蛋白的部分于冰上冷卻并加入蛋白酶抑制劑混合物(卡巴開公司)。然后加入生物素化試劑:lmM生物素，5mM ATP(緩沖至 ρΗ8)，7.5mM MgCl2 和 5 μ g/ml BirA 酶(按 0’Callaghan 等(1999) Anal.Biochem.266:9-15所述進(jìn)行純化)。然后將混合液于室溫孵育過夜。利用凝膠過濾層析純化所述生物素化pHLA_A*01分子。將GE醫(yī)療集團(tuán)的Superdex75 HR10/30柱用經(jīng)過濾PBS預(yù)平衡，上載Iml生物素化的反應(yīng)混合液，并將柱用Akta純化儀(GE醫(yī)療集團(tuán))用PBS以0.5ml/min展開。生物素化pHLA_A*01分子在約15ml時(shí)以單一峰洗脫。匯集含蛋白的部分，冰上冷卻并加入蛋白酶抑制劑混合物。利用考馬斯結(jié)合試驗(yàn)(PerBio)測(cè)定蛋白濃度，將等份的生物素化pHLA_A*01分子于-20° C冷凍保藏。這樣固定化的復(fù)合體能結(jié)合T細(xì)胞受體和共受體⑶8 α α，兩者均可注入可溶相?？扇苄訲CR在可溶或固定相中使用時(shí)，所觀察到的pHLA結(jié)合特性在定性和定量上均相似。這是對(duì)可溶物的部分活性的重要對(duì)照，也暗示了生物素化PHLA復(fù)合體與非生物素化復(fù)合體生物活性一樣。BIAcore3000 表面等離子體共振(SPR)生物感應(yīng)器測(cè)量小流動(dòng)池內(nèi)感應(yīng)器表面附近的折射率的變化，以響應(yīng)單位(RU)表示，此原理可用于檢測(cè)受體配體相互作用和用于分析它們的親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。BIAcore實(shí)驗(yàn)于25° C下進(jìn)行，使用PBS緩沖液(西格瑪公司，PH7.1-7.5)作為電泳緩沖液和用于制備蛋白樣品的稀釋液。采用標(biāo)準(zhǔn)胺類偶合法將鏈霉親和素固定于流動(dòng)池。PHLA復(fù)合體經(jīng)生物素標(biāo)簽固定。然后通過將可溶性TCR以恒定流速通過不同流動(dòng)池的表面進(jìn)行試驗(yàn)，從而測(cè)量SPR響應(yīng)。平衡結(jié)合常數(shù)上述BIAcore分析方法用于確定平衡結(jié)合常數(shù)。制備二硫鍵連接的可溶性雜二聚體形式的參比MAGE-A3TCR的連續(xù)稀釋液，以5微升/分鐘恒定流速注射流過兩個(gè)不同的流動(dòng)池；一個(gè)包被有約1000RU的特異性EVDPIGHLYHLA-A*01復(fù)合體，第二個(gè)包被有約1000RU的非特異性HLA-A2-肽(KIFGSLAFL (SEQ ID No:18))復(fù)合體。用對(duì)照池的測(cè)量來標(biāo)準(zhǔn)化每個(gè)濃度的響應(yīng)。將標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)響應(yīng)對(duì)TCR樣品濃度作圖，擬合至非線性曲線擬合模型，用以計(jì)算平衡結(jié)合常數(shù) Kd。(Price 和 Dwek, Principles and Problems in PhysicalChemistry for Biochemists (《針對(duì)生物化學(xué)家的物理化學(xué)原理和方法》,第二版)1979,Clarendon出版社，牛津)。ニ硫鍵連接的可溶形式的參比MAGE_A3TCR(實(shí)施例2)的Kd約為250 UM0相同BIAcore數(shù)據(jù)得到T1/2約為3s。動(dòng)力學(xué)參數(shù)上述BIAcore分析方法還用于確定平衡結(jié)合常數(shù)和解離速率。通過實(shí)驗(yàn)測(cè)量解離速率常數(shù)I^ff和結(jié)合速率常數(shù)匕確定TCR(見下述實(shí)施例4)的Kd。平衡常數(shù)Kd計(jì)算為kf/1^。TCR注射流過兩個(gè)不同的池，ー個(gè)包被有約300RU的特異性EVDPIGHLY HLA_A*01復(fù)合體，第二個(gè)包被有約300RU的非特異性HLA-Al-肽復(fù)合體。流速設(shè)定為50 u 1/min。通常注射250 u I濃度相當(dāng)于約10倍Kd的TCR。然后，緩沖液流過直至響應(yīng)回到基線或耗時(shí)大于2小時(shí)為止。利用BIAevaluation軟件計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。將解離相擬合成可計(jì)算半衰期的一次指數(shù)衰減方程。實(shí)施例4產(chǎn)生參比MAGE-A3 TCR的變體噬菌體展示是ー種手段，藉此產(chǎn)生MAGE-A3 TCR變體庫用以鑒定親和カ較高的突變體?？蓪?duì)實(shí)施例 2 的 MAGE-A3 TCR 施用(Li 等(2005) Nature Biotech23 (3): 349-354)中描述的TCR曬菌體展不和篩選方法。鑒定出親和カ和/或親和半衰期至少兩倍于參比MAGE-A3 TCR(因此意味著至少兩倍于天然TCR)的TCR，它們含有按SEQ ID No:2中所示編號(hào)的a鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基50V，51R，52P或53Y中的ー個(gè)或多個(gè)，和/或按SEQ ID No:3中所示編號(hào)的P鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基50T，51D，52M，53L或54L中的ー個(gè)或多個(gè)。
圖3A-B和4A-B分別顯示較高親和力TCR的a鏈(SEQ ID No:8和9)和@鏈(SEQ ID No: 10和11)的可變區(qū)氨基酸序列的特定示例。這些a鏈在⑶R2中突變，@鏈在CDR2中突變。利用上文實(shí)施例2的方法重折疊TCR雜ニ聚體(包括在恒定區(qū)引入半胱氨酸以提供人工的鏈間ニ硫鍵)。按該方式制備包括TCR，其組成為:(a)參比TCRP鏈與含有可變結(jié)構(gòu)域SEQ ID No:8和9的a鏈；(b)參比TCRa鏈與含有可變結(jié)構(gòu)域SEQ ID No: 10和11的P鏈；以及(C)含有突變可變結(jié)構(gòu)域的P和a鏈的多種組合。利用上述BIAcore方法分析這些可溶性ニ硫鍵連接的MAGE-A3 TCR與EVDPIGHLYHLA-A*01復(fù)合體之間的相互作用，結(jié)合數(shù)據(jù)如表I所示。表I
權(quán)利要求
1.一種T細(xì)胞受體(TCR)，其具有結(jié)合EVDPIGHLY(SEQ ID No:1) HLA-Al復(fù)合體的特性且包括TCR a可變結(jié)構(gòu)域和TCRP可變結(jié)構(gòu)域，其特征在于: 所述TCRa可變結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID No:2從Kl到Pl 14的氨基酸序列，但存在至少一種以下突變: 501突變?yōu)?0V ； 51Q突變?yōu)?1R ； 52S突變?yōu)?2P ； 53S突變?yōu)?3Y ;和/或 所述TCRP可變結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID No:3從Kl到Tl 12的氨基酸序列，但存在至少一種以下突變: 50F突變?yōu)?0T ； 51S突變?yōu)?1D ； 52E突變?yōu)?2M ； 53T突變?yōu)?3L ； 54Q突變?yōu)?4L。
2.按權(quán)利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含a鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SEQ ID No:8和9中 的一個(gè)。
3.按權(quán)利要求1或2所述的TCR，其特征在于，所述TCR包含P鏈可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列SEQ ID No: 10和11中的一個(gè)。前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的TCR，其特征在于，所述TCR還具有a鏈TRAC恒定結(jié)構(gòu)域和P鏈TRBCl或TRBC2恒定結(jié)構(gòu)域，或具有經(jīng)截短或替換修飾的a鏈TRAC和3鏈TRBCl或TRBC2恒定結(jié)構(gòu)域，所述修飾用以去除TRAC外顯子2的Cys4和TRBCl或TRBC2外顯子2的Cys2之間的天然二硫鍵。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的TCR，其特征在于，所述TCR為a^雜二聚體TCR，且具有a和P鏈恒定結(jié)構(gòu)域序列，其中TRAC的Thr48和TRBCl或TRBC2的Ser57被替換成半胱氨酸殘基，所述半胱氨酸在TCR的a和P恒定結(jié)構(gòu)域之間形成二硫鍵。
5.碼前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的TCR的核酸。
6.帶TCR表達(dá)載體的細(xì)胞，所述載體包含位于單一開放讀碼框或兩個(gè)不同開放讀碼框中的如權(quán)利要求5所述的核酸。
7.帶第一表達(dá)載體和第二表達(dá)載體的細(xì)胞，所述第一表達(dá)載體包含編碼權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的TCR的a鏈的核酸，所述第二表達(dá)載體包含編碼權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的TCR的P鏈的核酸。
8.一種細(xì)胞，所述細(xì)胞在其表面展示權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的TCR。
9 權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞呈遞具有SEQID No:8所示a鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID No:3所示P鏈的TCR。
10 權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞呈遞具有SEQID No:9所示a鏈可變結(jié)構(gòu)域和SEQ ID No:3所示P鏈的TCR。
11 權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞呈遞具有SEQID No:2所示a鏈和SEQ IDNo: 10所示P鏈可變結(jié)構(gòu)域的TCR。
12
13 略
14.按權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，所述細(xì)胞呈遞具有SEQID No:2所示a鏈和SEQ IDNo: 11所示P鏈可變結(jié)構(gòu)域的TCR。
15.一種藥物組合物，其包括多種如權(quán) 利要求6至14中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞和一種或多種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。
全文摘要
一種T細(xì)胞受體(TCR)，其具有EVDPIGHLY HLA-A1復(fù)合體結(jié)合特性并包含特定的野生型T細(xì)胞受體(TCR)，所述TCR在TCRα可變結(jié)構(gòu)域和/或TCRβ可變結(jié)構(gòu)域具有特定突變以增強(qiáng)親和力。所述TCR可用于過繼治療。
文檔編號(hào)C07K14/705GK103097407SQ201080068257
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者B·K·雅各布森, N·R·利迪 申請(qǐng)人:英美偌科有限公司