專利名稱：病毒瓜氨酸肽和其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及來自愛潑斯坦ー巴爾ニ氏(Epstein Barr)病毒的新瓜氨酸合成肽，和其在診斷和治療自身免疫疾病，特別是類風濕性關節(jié)炎(RA)中的應用。
背景技術：
在廣泛的發(fā)炎性關節(jié)病范圍內(nèi)，類風濕性關節(jié)炎(RA)處于突出位置。通過在小和 大關節(jié)上產(chǎn)生系統(tǒng)性和破壞性炎癥，RA造成疼痛和關節(jié)損傷，最終導致畸形和殘疾。多種自體抗體的出現(xiàn)是RA的標記。最著名的是類風濕因子(RF)，這是針對免疫球蛋白IgG同種型Fe區(qū)的IgG或IgM類抗體。約70-80%類風濕性關節(jié)炎患者是RF血清陽性，但是RF也出現(xiàn)在慢性感染、淋巴增生疾病、其他風濕疾病和接近20%老年健康個體中。因此，鑒于對RA的RF特異性有限，要尋找其他更特異的抗體。APF (抗核周因子)抗體和AKA (抗角蛋白抗體)明確顯示具有高度疾病特異性。后來發(fā)現(xiàn)APF抗體和AKA識別的抗原是通過將精氨酸修飾為瓜氨酸殘基而在翻譯后產(chǎn)生的含瓜氨酸蛋白。開發(fā)出使用衍生自絲聚蛋白的合成瓜氨酸肽(CP)的ELISA[G. A. Schellekens 等· J. Clin. Invest. 1998，101,273]。為增加檢測的敏感性，將CP修飾成環(huán)瓜氨酸肽(CCP)結(jié)構，其中瓜氨酸部分最佳暴露用于抗體結(jié)合[國際申請?zhí)朩01998022503]。在所謂 CCPl 檢測中[G. A. Schellekens 等· Arthritis Rheum. 2000，43，155]，抗體在68%的RA患者血清中檢測到，特異性為單個CCP98%。近期研究表明第二代CCP 檢測 CCP2 [ J. Avouac 等.Ann. Rheum. Dis. 2006,65,845]的敏感性和特異性高，顯示68% (39-94%范圍)敏感性，95% (81-100%范圍)特異性。近來，INOVA開發(fā)出第三代檢測[L. Lutteri 等· Clin. Chim. Acta 2007，386，76]，并且聲稱是更加敏感的抗 CCP ELISA,保持98%的敏感性。這些ELISA檢測都市售可得(ED公司(Euro-Diagnostica)，荷蘭阿納姆；軸盾公司(Axis-Shield)，蘇格蘭敦提；IN0VA，美國圣地亞哥)。另外，提交了多個涉及基于瓜氨酸蛋白/肽檢測RA病人中抗體的方法的專利申請[US2OO2OH3H3, US20070087380, EP1946109, US20070148704, W02009007846,W02009000077, W02007017556, EP1456662, WO 1999028344，W02008132264]。多種瓜氨酸蛋白已在RA滑膜，即血管外瓜氨酸纖維蛋白[C.
等.J. Immunol. 2001,166,4177]、膠原蛋白 II [H. Burkhardt 等.Eur. J. Immunol. 2005, 35,1643]和巨噬細胞波形蛋白[E.R. Vossenaar 等· Arthritis Rheum. 2004，50，3485]中描述。盡管絲聚蛋白在滑膜不表達，其瓜氨酸衍生物用于檢測抗CP抗體[US20090028885，US7，445，903，US6, 890，720]。RA參與遺傳和環(huán)境影響，并且早就懷疑病毒促進RA的發(fā)生。作為RA中因果作用的可能候選物，病毒必須在體內(nèi)普遍持續(xù)存在，顯示直接或間接關節(jié)趨向，井能改變寄主免疫應答。愛潑斯坦ー巴爾ニ氏(Epstein Barr)病毒(EBV)顯示這些特性。因此，EBV和RA之間的潛在關聯(lián)是近三十年研究的焦點[K. H. Costenbader等· Arthritis Res. Ther. 2006,8，204]。已知RA患者對潛伏和復制的EBV蛋白并特別是EBNA-I (EB細胞核抗原I)有增高的抗體水平。并且，RA患者的外周血液EBV比對照要高。很多研究掲示EBV在RA滑膜炎中可能的病原作用[S. Sawada等.Autoimmun. Rev. 2005,4,106]。這些研究產(chǎn)生使用病毒來源CP探究RA患者免疫應答的想法。EBNA-I (35-58)序列(病毒瓜氨酸肽I，VCPl)相應肽的特異性抗體包括用瓜氨酸代替精氨酸，其在50%RA血清和低于5%的正常和疾病對照血清中檢測出來[F. Pratesi等.Arthritis Rheum. 2006, 54, 733]。另外，RA血清中親和純化的抗VCPl抗體與來源于絲聚蛋白的CP，脫亞胺纖維蛋白原和脫亞胺重組EBNA-I反應?？筕CPl抗體頻率用627例免疫血清樣品確定，300例來自RA患者且327例來自對照，包括結(jié)締組織疾病、慢性關節(jié)炎和健康供體?？筕CPl抗體在45%RA免疫血清中發(fā)現(xiàn)，相比之下少于 5% 的對照中發(fā)現(xiàn)所述抗體[C. Anzilotti 等 J. Rheumatol. 2006, 33,647]。Incaprera 等[Clin, and Exp. Rheum. 1998,16 (3), 289-294]揭不 EBV 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡自體免疫中的潛在作用。此文檔具體指出EBNA-2(354-373)識別抗SmDl IgG抗體?；诿搧啺稥BNA-I (35-58)的瓜氨酸肽是國際申請W02004087747的目標，描述其在RA免疫血清中檢測抗體的應用。所述應用也掲示使用多個抗原肽[MAP ；J. P. Tam PNASU. S. A. 1988，85，5409]能以95%特異性在45%RA免疫血清中檢測抗體，所述抗原肽包括至少4個拷貝的脫亞胺EBNA-I (35-58)作為檢測抗體的免疫分析的包被抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及源自EBV的新瓜氨酸合成肽和其在診斷和治療自體免疫疾病，特別是RA中的應用。具體地，這些序列來自EBV蛋白(例如EBNA-I，EBNA-2)。根據(jù)本發(fā)明的瓜氨酸肽具有某一氨基酸序列，其包含于EBV的EBNA-2蛋白的320-375氨基酸區(qū)域序列(Swiss-Prot P12978)。令人驚訝的是，本發(fā)明所述和具有許多大于ー個瓜氨酸殘基的瓜氨酸肽，顯示對RA的特異診斷非常合適。為了增加敏感性，保持分析特異性的完整性，本發(fā)明的作者檢索其他病毒來源的脫亞胺序列以建立RA診斷分析。為此，源自EBV蛋白的肽序列用不同程度精氨酸/瓜氨酸替換來合成并且檢測RA患者血清中的反應性(表I)。這其中，ー些序列從正常對照中區(qū)分出RA血清。最佳結(jié)果用源自脫亞胺肽EBNA-2 (338-358) (GQSRGQSRGRGRGRGRGRGK G)的瓜氨酸肽獲得。這些序列和其在診斷和治療自體免疫疾病中的應用是本發(fā)明的目標。具體地，本發(fā)明顯示非瓜氨酸化EBNA-2 (338-358)與RA免疫血清不反應。相反，發(fā)明的瓜氨酸肽顯示對RA血清的反應性增高。也顯示用本發(fā)明肽鑒定的IgG群有RA特異性抗CP IgG和非SLE特異性抗SmDl IgG的特性。本發(fā)明也鑒定兩個Gly-Cit重復和Gly-Gln-Ser-Cit重復表示的表位，位點Cit-341、Cit-345和Cit-349最具反應性。發(fā)明的肽源自EBNA-2 (320-375)區(qū)域。因此，本發(fā)明的一個目標是從氨基末端到羧基末端包括以下氨基酸序列的抗原有效肽或其功能片段GPPWWPPICDPPQPSKTQGQSX1GQSX2GX3GX4GX5GX6G X7 G K G K S X8 D K Q X9 K P G G P W Xltl P E P (式 I，SEQ ID No. 1)，其中，氨基酸 X1-Xio獨立選自精氨酸殘基或瓜氨酸殘基，且X1-Xltl中的至少ー個是瓜氨酸殘基。優(yōu)選地，所述肽或其功能片段包括氨基酸序列G Q S X1 G Q S X2 G X3 GX4 G X5 GX6 G X7 G K G (式II，SEQ ID No. I的氨基酸19到氨基酸39)，其中氨基酸X1-X7獨立選自精氨酸殘基或瓜氨酸殘基，并且X1-X7中的至少ー個是瓜氨酸殘基。仍然優(yōu)選地，所述肽包括氨基酸序列G Q S Cit G Q S Cit G X3 G Cit GX5 G X6G X7 G K G (SEQ ID No. 27)，其中氨基酸X3-X7獨立選自精氨酸殘基或瓜氨酸殘基。仍然優(yōu)選地，所述肽，其功能片段，包括選自下組的氨基酸序列GQSRGQSCitGRGRGRGRGRGKG (SEQ ID No. 4),GQSRGQSRGRGCitGRGRGRGKG (SEQ ID No. 6),GQSRGQSCitGRGCitGRGRGRGKG (SEQ ID No. 12)，GQSCitGQSCitGRGCitGRGRGRGKG (SEQ ID No. 22)或 G Q S Cit G Q SCit G CitG Cit G Cit G Cit G Cit G K G (SEQ ID No. 2)，其中，Cit 是瓜氨酸殘基。在優(yōu)選實施方式中，所述肽是線形形式。仍然優(yōu)選所述肽是多亞基分支肽或其他偶聯(lián)復合體形式?！ざ鄟喕种щ挠梢韵陆M成-MAP 核結(jié)構；-線形肽有式I，II和/或IV的氨基酸序列，通過脲基連接每ー個MAP核結(jié)構的氨基末端殘基來結(jié)合，其中線形肽彼此相同或不同。根據(jù)發(fā)明，MAP核結(jié)構是
權利要求
1.一種抗原有效肽，所述肽從氨基末端到羧基末端包括氨基酸序列G P P W W P P ICdppqpsktqgqsx1Gqsx2Gx3Gx4Gx5Gx6Gx7GkGksx8DkqX9 K P G G P W X10 P E PCSEQ ID No. I)，其中，氨基酸X1-Xltl獨立選自精氨酸殘基或瓜氨酸殘基，且X1-Xltl中的至少一個是瓜氨酸殘基，或其功能片段。
2.如權利要求I所述的肽或其功能片段，其特征在于，所述肽包括氨基酸序列GQ S X1G Q S X2 G X3 G X4 G X5 G X6 G X7 G K G (SEQ ID No. I 的氨基酸 19-氨基酸 39)，其中所述氨基酸X1-X7獨立選自精氨酸殘基或瓜氨酸殘基，并且X1-X7中的至少一個是瓜氨酸殘基。
3.如權利要求2所述的肽，其特征在于，所述肽包括氨基酸序列GQ S CitG Q S CitG X3 G Cit G X5 G X6 G X7 G K G(SEQ ID No. 27)，其中所述氨基酸X3-X7獨立選自精氨酸殘基或瓜氨酸殘基。
4.如權利要求2或3所述的肽及其功能片段，其特征在于，所述肽包括選自下組的序列GQSRGQSCitGRGRGRGRGRGKG (SEQ ID No. 4)，GQSRGQSRGRGCitGRGRGRGKG (SEQ ID No. 6)，GQSRGQSCitGRGCitGRGRGRGKG (SEQ ID No. 12),GQSCitGQSCitGRGCitGRGRGRGKGCSEQ ID No. 22)或 G Q S Cit G Q S CitG Cit G CitG Cit G Cit G Cit G K G (SEQ ID No. 2)，其中 Cit 是瓜氨酸殘基。
5.如上述權利要求中任一項所述的肽，其特征在于，所述肽是線形形式。
6.如權利要求1-4中任一項所述的肽，其特征在于，所述肽是多亞基分支肽的形式。
7.如權利要求6所述的肽，其特征在于，所述肽包括4個相同拷貝的權利要求1-4所述肽。
8.如權利要求7所述的肽，其特征在于，所述肽是(GQ S Cit G Q S Cit G CitG CitG Cit G Cit G Cit G K G) 4K2K beta-丙氨酸
9.如上述權利要求中任一項所述的肽，其特征在于，所述肽可用于醫(yī)學應用。
10.如權利要求9所述的肽，其特征在于，所述肽用作抗自體免疫疾病試劑。
11.一種診斷對象中自體免疫疾病的方法，所述方法包括在獲自對象的生物樣品中檢測自體免疫疾病特異性抗體的步驟，通過 -合適情況下所述樣品與權利要求1-7中任一項所述的至少一個肽反應以產(chǎn)生復合物； -檢測復合物。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于，所述生物樣品與權利要求1-7中任一項所述的至少一個肽和包含序列(G G D N H G Cit G Cit G Cit G CitG Cit G G G Cit P GAPG) 4K2K beta-丙氨酸的肽或其功能片段反應
13.如權利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述生物樣品與包含以下序列(GQS Cit G Q S Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G K G)4K2K beta-丙氨酸的肽或其功能片段和包含序列(G G D N H G Cit G Cit G Cit G Cit GCit G G G Cit P G A P G)4K2K beta-丙氨酸的肽或其功能片段反應，所述序列(G Q S Cit G Q S Cit G Cit G CitG Cit G Cit G Cit G K G) 4K2K beta-丙氨酸如下所示
14.如權利要求11-13中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法是免疫學分析。
15.—種自體免疫疾病的診斷試劑盒，所述試劑盒包括權利要求1-8中任一項所述的至少一個肽，或其功能片段。
16.如權利要求15所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括含有以下序列(GGD N H G Cit G Cit G Cit G Cit G Cit G G G Cit P G A P G)4K2K beta-丙氨酸的肽或其功能片段
17.如權利要求10所述的肽或權利要求11所述的方法或權利要求15所述的試劑盒，其特征在于，所述自體免疫疾病是風濕性關節(jié)炎。
18.—種藥學組合物，所述組合物包括藥學上可接受和有效量的權利要求1-10中任一項所述肽或其功能片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗原有效肽，其從氨基末端到羧基末端包括氨基酸序列G P P W W P P I C D P P Q P S K T Q G Q S X1 G Q S X2 G X3 G X4 G X5 G X6G X7 G K G K S X8 D K Q X9 K P G G P W X10 P E P(SEQ ID No.1)，其中，氨基酸X1-X10獨立選自精氨酸殘基或瓜氨酸殘基，且X1-X10中的至少一個是瓜氨酸殘基或其功能片段，以及涉及其應用。
文檔編號C07K14/05GK102666569SQ201080052960
公開日2012年9月12日 申請日期2010年11月22日 優(yōu)先權日2009年11月23日
發(fā)明者F·普拉泰西, P·米廖里尼 申請人:托斯卡納生物標志有限公司