專利名稱：新型糖基轉(zhuǎn)移酶、新型糖基轉(zhuǎn)移酶基因和新型糖供體化合物的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及新型糖基轉(zhuǎn)移酶、包括編碼所述糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA的糖基轉(zhuǎn)移酶基因和其用途。另外，本發(fā)明涉及用于糖基轉(zhuǎn)移反應的新型糖供體化合物。
背景技術(shù)：
通常，與相應的未糖基化的化合物相比，通過糖基化特定化合物獲得的糖基化化合物可能具有提高的穩(wěn)定性和溶解性。因此，已對用于糖基化多種化合物的糖基轉(zhuǎn)移反應進行了積極的研究。另外，糖基轉(zhuǎn)移反應可應用于糖鏈合成。因此，糖基轉(zhuǎn)移反應是突出的研究主題之一。在自然界中有觀察到的已知的糖基轉(zhuǎn)移反應，其參與了植物花瓣或果實的顏色形成。例如，專利文獻1描述了一種方法，其包括將來自牽?；ǖ幕蛘系讲煌闹参锷弦詫⑵咸烟寝D(zhuǎn)移到在3位具有糖的類黃酮的糖部分上，從而提供具有與天然植物不同的顏色的花瓣。有許多已知的糖基轉(zhuǎn)移反應，其中糖核苷酸例如UDP-葡萄糖用作糖供體。例如， 非專利文獻1描述了使用UDP-葡萄糖作為糖供體，來源于日本羅勒、馬鞭草或類似植物的 UDP-葡萄糖花色素5-糖基轉(zhuǎn)移酶催化將糖轉(zhuǎn)移至花色素的5位的羥基上的反應。非專利文獻2描述了使用UDP-葡萄糖作為糖供體，來自日本羅勒、玉米(Zea mays)、龍膽、葡萄或類似植物的UDP-葡萄糖類黃酮3-糖基轉(zhuǎn)移酶催化將糖轉(zhuǎn)移至類黃酮或花色素的 3位的羥基上的反應。專利文獻2描述了使用UDP-葡萄糖作為糖供體，來源于金魚草屬 (antirrhinum)的酶催化將糖轉(zhuǎn)移至查爾酮的4’位的羥基上的反應。另外，專利文獻1描述了使用UDP-葡萄糖作為糖供體，由其中整合的基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶催化轉(zhuǎn)移葡萄糖的反應(見專利文獻1中的實施例4)。引用列表專利文獻專利文獻1 日本專利公布(Kokai)號2003-289884A專利文獻2 :W02005/059141非專利文獻非專利文獻1 J.Biol. Chem.，第 274 卷，第 11 期(1999)7405-7411 頁非專利文獻2 J. Biol. Chem.，第 276 卷，第 6 期(2001)4338-4343 頁發(fā)明概述如上所述，有許多已知的用糖核苷酸作為糖供體的糖基轉(zhuǎn)移反應。然而，有很少已知的用除了糖核苷酸以外的化合物作為糖供體的糖基轉(zhuǎn)移反應。例如，在植物色素的研究中為檢驗糖基轉(zhuǎn)移酶的功能，將糖核苷酸用作糖供體是必要的。但是，糖核苷酸在化學上是不穩(wěn)定的且因此難以分離。所以，糖核苷酸是相對昂貴的試劑且在某些情況下難以獲得。由于這些原因，需要能起糖供體作用的除了糖核苷酸以外的化合物。
本發(fā)明人在研究康乃馨花瓣色素的過程中發(fā)現(xiàn)了在康乃馨中起糖供體作用的化合物。以前未知這種化合物是否會起糖供體作用。康乃馨花瓣包含多種色素。色素的主要實例是通過花色素(且特別是天竺葵色素或矢車菊色素)的3或5位的糖基化形成的花色苷。但是，本發(fā)明人聚焦在取決于康乃馨的品種，存在不具有其中花色素的5位被糖基化的花色苷的康乃馨的事實。本發(fā)明人預測到康乃馨具有將糖轉(zhuǎn)移到花色素的5位上的糖基轉(zhuǎn)移酶。進一步地，本發(fā)明人假設糖基轉(zhuǎn)移酶使用的糖供體積累在不具有其中花色素的5位被糖基化的花色苷的康乃馨中。因此， 本發(fā)明人研究了不具有在5位被糖基化的花色苷的康乃馨花瓣的提取物，并由此在提取物中發(fā)現(xiàn)了起糖供體作用的化合物。進一步地，本發(fā)明人在康乃馨花瓣提取物中和飛燕草花瓣提取物中發(fā)現(xiàn)了使用這種新型糖供體催化糖基轉(zhuǎn)移反應的新型糖基轉(zhuǎn)移酶，從而鑒定了包括編碼該糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。根據(jù)本發(fā)明，在以上發(fā)現(xiàn)的基礎上提供了新型糖基轉(zhuǎn)移酶、包括編碼該糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA的糖基轉(zhuǎn)移酶基因和其用途。進一步地，提供了包含新型糖供體化合物的糖供體試劑和使用所述糖供體試劑的用于糖基化多酚的新方法和多酚糖基化試劑盒。本發(fā)明概述如下。(1) 一種蛋白質(zhì)，是以下(a)或(b)(a)包含SEQ ID NO :1或3中提供的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)包含通過缺失、取代、插入或添加一個或多個氨基酸而來源于SEQ ID NO :1或 3中示出的氨基酸序列的氨基酸序列并具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。(2) 一種糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包含編碼根據(jù)⑴所述的蛋白質(zhì)的DNA。(3) 一種糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包含以下(c)至(e)之一的DNA (c)包含SEQ ID NO :2或4中示出的核苷酸序列的DNA ；(d)在嚴格條件下與包含與SEQ ID NO :2或4中提供的核苷酸序列互補的核苷酸序列的DNA雜交且編碼具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ；或(e)包含SEQ ID NO :2或4中提供的核苷酸序列的簡并異構(gòu)體的DNA。(4) 一種重組載體，包含根據(jù)( 或( 所述的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。(5) 一種轉(zhuǎn)化子，通過使用根據(jù)(4)所述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞獲得。(6) 一種轉(zhuǎn)染了根據(jù)(2)或(3)所述的糖基轉(zhuǎn)移酶基因的植物或具有與所述植物相同的特征的所述植物的后代。(7) 一種用于產(chǎn)生根據(jù)(1)所述的糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括培養(yǎng)根據(jù)( 所述的轉(zhuǎn)化子。(8) 一種包含式㈧化合物的糖供體試劑
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是以下(a)或(b)(a)包含SEQID NO :1或3中提供的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)包含通過缺失、取代、插入或添加一個或多個氨基酸而來源于SEQID NO :1或3中提供的氨基酸序列的氨基酸序列并具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。
2.一種糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的DNA。
3.一種糖基轉(zhuǎn)移酶基因，包含以下(c)至(e)之一的DNA:(c)包含SEQID NO :2或4中提供的核苷酸序列的DNA ；(d)在嚴格條件下與包含與SEQID NO :2或4中提供的核苷酸序列互補的核苷酸序列的DNA雜交且編碼具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ；或(e)包含SEQID NO :2或4中提供的核苷酸序列的簡并異構(gòu)體的DNA。
4.一種重組載體，包含根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
5.一種轉(zhuǎn)化子，通過使用根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞獲得。
6.一種轉(zhuǎn)染了根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的糖基轉(zhuǎn)移酶基因的植物或具有與所述植物相同的特征的所述植物的后代。
7.一種用于產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1所述的糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求5 所述的轉(zhuǎn)化子。
8.一種糖供體試劑，包含式(A)化合物
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的糖供體試劑，其中R1獨立地選自氫或未被取代或被選自0Η、 F、Cl、Br和I的一個或多個基團取代的Cp6烷基。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的糖供體試劑，其中X選自由葡萄糖、葡糖醛酸、半乳糖、 木糖、芹菜糖、阿洛糖、鼠李糖、阿拉伯呋喃糖和甘露糖組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的糖供體試劑，其中式㈧化合物為l-0-β-香蘭基葡萄糖、l-0-β-異香蘭基葡萄糖、l-0-β-對羥基苯甲酰葡萄糖、l-0-β-對香豆基葡萄糖、 1-0-β -咖啡基葡萄糖、1-0-β -阿魏酰葡萄糖、或1-0-β -芥子酰葡萄糖。
12.一種用于糖基化多酚的方法，包括將所述多酚與根據(jù)權(quán)利要求8至11任一項所述的糖供體試劑和糖基轉(zhuǎn)移酶反應。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的糖基化方法，其中所述多酚為類黃酮。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的糖基化方法，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶來源于具有非紅色花瓣的康乃馨或來源于飛燕草。
15.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的糖基化方法，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶是根據(jù)權(quán)利要求1 所述的蛋白質(zhì)。
16.一種多酚糖基化試劑盒，包括根據(jù)權(quán)利要求8至11任一項所述的糖供體試劑和根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供包含除了糖核苷酸以外的糖供體化合物的糖供體試劑和能夠使用除了糖核苷酸以外的糖供體化合物催化糖基轉(zhuǎn)移反應的酶。本發(fā)明提供了以下包含式(A)化合物的糖供體試劑其中，R1獨立地選自氫、或C1-6烷基、C2-6烯基和C2-6炔基，其中每一個基團是未取代的或被選自OH、F、Cl、Br、I、CN、NO2和SO2的一個或多個基團取代，n為0、1、2、3、4或5，m為0或1，且X代表由其異頭碳原子上的β-鍵結(jié)合的單糖；能夠使用所述糖供體催化糖基轉(zhuǎn)移反應的糖基轉(zhuǎn)移酶；和包含編碼所述糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
文檔編號C07H13/08GK102549155SQ201080043608
公開日2012年7月4日 申請日期2010年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日
發(fā)明者中村晴香, 佐佐木伸大, 寺正行, 小關良宏, 松葉由紀, 長澤和夫, 阿部裕 申請人:國立大學法人東京農(nóng)工大學