專利名稱：HLA-Gα1多聚體及其藥學(xué)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎多聚體和其藥學(xué)用途。本發(fā)明更具體來說涉及HLA-G抗原的α 1多肽的多聚體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這種多聚體的方法、包含這種多聚體的藥物組合物，以及它們用于治療各種疾病、包括器官/組織排斥的用途。
背景技術(shù)：
主要組織相容性復(fù)合體(MHC)抗原分為三個主要類別，即I類抗原、II類抗原(HLA-DP、HLA-DQ 和 HLA-DR)禾Π III 類抗原。I類抗原包含典型抗原HLA-A、HLA-B和HLA-C，其具有與β 2微球蛋白締合的3個球狀結(jié)構(gòu)域(α 1、α 2和α 3)；以及非典型抗原HLA_E、HLA-F和HLA-G。HLA-G是由正常人胎盤上皮細胞的絨毛外滋養(yǎng)層和角膜表達的非典型HLA I類分子。HLA-G抗原基本上由胎盤的細胞滋養(yǎng)層細胞表達，并充當(dāng)胎兒防御母體免疫系統(tǒng)(無母體排斥)的免疫調(diào)節(jié)劑。HLA-G基因的序列已被描述(例如Geraghty等人，Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 1987，84，9145-9149 ；Ellis ；等人，J. Immunol.，1990，144,731-735)并包含4396個堿基對。該基因由8個外顯子、7個內(nèi)含子和3'未翻譯端構(gòu)成，分別對應(yīng)于以下結(jié)構(gòu)域外顯子1 信號序列；外顯子2 α 1胞外結(jié)構(gòu)域；外顯子3 α 2胞外結(jié)構(gòu)域；外顯子4 α 3胞外結(jié)構(gòu)域；外顯子5 跨膜區(qū)；外顯子6 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域I ；外顯子7 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域II (未翻譯)；外顯子8 胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域III (未翻譯)；和3'未翻譯區(qū)。已識別了 HLA-G的七個同種型，其中4個是膜結(jié)合的(HLA-G 1、HLA-G2、HLA-G3和HLA-G4)，3個是可溶解的(HLA-G5、HLA-G6和HLA-G7)(參見例如Carosella等人，Immunology Today, 1996 年，第 17 卷，第 407 頁)。成熟的HLA-Gl蛋白同種型包含三個外部結(jié)構(gòu)域(α 1至α 3)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。HLA-G2蛋白同種型不包含該α 2結(jié)構(gòu)域，即α 1和α 3結(jié)構(gòu)域直接連接，隨后連接跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。HLA-G3蛋白同種型缺乏α 2和α 3結(jié)構(gòu)域，即其包含與跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域直接連接的α 1結(jié)構(gòu)域。HLA-G4蛋白同種型缺乏α 3結(jié)構(gòu)域，即其包含α 1結(jié)構(gòu)域、α 2結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?？扇芙獾腍LA-G同種型均缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。更具體來說HLA-G5蛋白同種型含有α 、α 2和α 3結(jié)構(gòu)域，以及由內(nèi)含子4編碼的21個氨基酸殘基的額外C末端肽序列(作為在轉(zhuǎn)錄剪接和RNA成熟之后內(nèi)含子4保留的結(jié)果)。HLA-G6蛋白同種型相當(dāng)于無α 2的HLA-G5，即HLA-G6含有α 1禾Π α 3結(jié)構(gòu)域，以及由內(nèi)含子4編碼的21個氨基酸殘基的額外C末端肽序列(作為在轉(zhuǎn)錄剪接和RNA成熟之后內(nèi)含子4保留的結(jié)果)。HLA-G7蛋白同種型僅含有α 1結(jié)構(gòu)域，以及由內(nèi)含子2編碼的2個附加的C-末端氨基酸殘基(作為在轉(zhuǎn)錄剪接和RNA成熟之后內(nèi)含子2保留的結(jié)果)。所有這些同種型已描述在例如Kirszenbaum Μ.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994，91，4209-4213 ；歐洲申請 EP 0677582 ；Kirszenbaum M.等人，Human Immunol.，1995， 43,237-241 ；Moreau P.等人，Human Immunol.，1995，43，231—236 中。先前的研究已表明，HLA-G蛋白能夠抑制同種異體應(yīng)答，例如增殖性T淋巴細胞應(yīng)答、細胞毒性T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞溶解和NK細胞介導(dǎo)的細胞溶解(Rouas-Freiss N.等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，1997，94，5249-5254 ；Proc. Natl. Acad. Sci.，1997，94， 11520-11525 ；Semin Cancer Biol 1999，第 9 卷，第 3 頁)。因此，已提出基于 HLA-G 的程序用于治療在同種異體或異種器官/組織移植中的移植物排斥。還已提出HLA-G蛋白用于治療癌癥(EP1054688)、炎性病癥(EP1189627)和更一般地用于治療免疫相關(guān)疾病。還已提出將HLA-G蛋白與特定配體融合，以便使HLA-G靶向具體的細胞或組織(W02007091078)。然而，應(yīng)該注意，未提供結(jié)果或?qū)嶒灁?shù)據(jù)表明這種這種靶向性融合是有活性的。由于在兩個HLA-G分子的α 1結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基42之間形成分子間二硫橋， HLA-G抗原表現(xiàn)出在體內(nèi)采用二聚體構(gòu)象(Apps等人，Eur. J. Immunol. 2007，第37卷，第 1924頁；W02007/011044)。已提出HLA-G 二聚體的受體結(jié)合位點比對應(yīng)單體的受體結(jié)合位點更易接近，使得二聚體能比單體具有更高的親合力和更慢的解離速率。然而，尚不清楚哪種構(gòu)象對于藥物目的而言最具活性，哪種同種型最有效，或者可如何產(chǎn)生適當(dāng)?shù)腍LA-G 二聚體或低聚體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及HLA-Ga 1多肽的多聚體、包含所述多聚體的藥物組合物和它們的用途。意外地，本發(fā)明顯示出，當(dāng)適當(dāng)裝配時，HLA-Ga 1多肽可以產(chǎn)生有能力有效地抑制體內(nèi)器官排斥的多聚體。因此，這些多聚體表現(xiàn)為治療這種病癥、以及其它免疫相關(guān)疾病的很有價值的候選藥物。因此，本發(fā)明的目的在于一種包含HLA-G抗原的至少兩個α 1多肽的多聚體。如下文所將論述，α 1多肽可以用不同方式連接在一起，所述方式例如但不限于通過二硫橋形成、間隔基團和/或載體(carrier)。本發(fā)明的另一個目的在于一種產(chǎn)生如上文所定義的多聚體的方法，所述方法包含在允許多聚化的條件下使α 1多肽混合，以及任選將多聚體與游離多肽(即單體)分離。本發(fā)明還涉及SEQ ID NO 1的多肽，以及編碼這種多肽的分離核酸和對應(yīng)的載體 (vector)和重組細胞。本發(fā)明的另一個目的為一種包含如上文所定義的或可通過上述方法獲得的多聚體的藥物組合物。本發(fā)明的另一個目的為一種包含SEQ ID NO=I的多肽的藥物組合物。本發(fā)明還涉及如上文所定義的用于治療器官或組織排斥、炎性疾病或自身免疫疾病的多聚體、多肽或藥物組合物。本發(fā)明的另一目的還涉及一種治療器官/組織排斥的方法，該方法包含對需要它的對象施用有效量的本發(fā)明多聚體、多肽或組合物。更具體來說，該方法包含在組織/器官移植之前、期間和/或之后向?qū)ο笫┯枚嗑垠w、多肽或組合物。
本發(fā)明的另一目的為一種促進對象對移植物的耐受性的方法，該方法包含對需要它的對象施用有效量的如上文所定義的多聚體、多肽或組合物。本發(fā)明可以用于任何哺乳動物對象、優(yōu)選人類對象。如下文所進一步公開，本發(fā)明的多聚體能夠基本上抑制在移植后的體內(nèi)組織排斥。


圖1 在施用包含α 1多聚體的抗體介導(dǎo)型α 1包覆珠之后小鼠的移植物存活率。圖2 在施用包含α 1多聚體的α 1直接包覆珠之后小鼠的移植物存活率。圖3 在施用α 1多聚體之后小鼠的移植物存活率。藍色僅用珠子的對照組。橙色單次注射α 1直接包覆的珠。黃色單次注射抗體介導(dǎo)型α 1包覆珠。綠色兩次注射 α 1直接包覆珠。橙紅色兩次注射抗體介導(dǎo)型α 1包覆珠。圖4 移植心臟存活率分析。
具體實施例方式本發(fā)明涉及包含幾種HLA-Ga 1多肽的多聚體和其用途。本發(fā)明的多聚體已表明能有效抑制體內(nèi)移植物排斥。更具體來說，本發(fā)明人已意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在多聚體中正確裝配時，α 1多肽有能力在體內(nèi)誘導(dǎo)有效的免疫耐受性。如上文所論述，HLA-G抗原充當(dāng)胎兒防御母體免疫系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)劑。已報道了膜結(jié)合的或者可溶解的各種HLA-G同種型。這些同種型含有不同的功能域，所述功能域選自胞外球狀結(jié)構(gòu)域、指定的α 、α 2和α 3、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。雖然已證明了某些 HLA-G同種型(例如成熟HLA-G1)的生物活性和作用機制，但尚未詳細研究各結(jié)構(gòu)域、尤其以可溶解形式對免疫調(diào)節(jié)活性的相對貢獻。在這方面，已證明了 HLA-G抗原的抑制活性由與ILT抑制性受體ILT2或ILT4的結(jié)合來介導(dǎo)。更具體來說，已提出這種結(jié)合通過HLA-G的α 3結(jié)構(gòu)域發(fā)生(Shiroishi等人， PNAS 103^006) 16412)。Guillard 等人(Molecular Immunology 45(2008)419)也已提出 α 1結(jié)構(gòu)域在NFKB的活化中的作用。然而，這種效果是由與MR型受體的結(jié)合來介導(dǎo)，并且不同于由ILT2或ILT4受體介導(dǎo)的HLA-G的抑制活性，本發(fā)明人現(xiàn)已觀察到在多聚體中α 1多肽能夠防止體內(nèi)移植物排斥。在這種情況下，能夠與HLA-G相互作用的受體是鼠類抑制性受體PIRB(與人ILT-4同源)。然而，該受體已知能與HLA-G的α 3結(jié)構(gòu)域相互作用。類似地，在人的體外實驗中，所述效果不是由于與ILT-2或ILT-4的相互作用，因為這些受體與HLA-G的α 3結(jié)構(gòu)域相互作用。不受理論的約束，本發(fā)明人相信所得的意外結(jié)果可以解釋為存在未知的抑制性受體，其結(jié)合α 1多聚體并誘導(dǎo)免疫耐受性(根據(jù)體內(nèi)觀察)；或者事實上，α 1多聚體采用新穎和預(yù)料不到的四級結(jié)構(gòu)，該四級結(jié)構(gòu)允許其與ILT受體相互作用。所得結(jié)果表明，本發(fā)明的多聚體展現(xiàn)出高的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性，并因此表現(xiàn)為治療免疫相關(guān)病癥、特別是減少對象不期望或有害的免疫應(yīng)答的有效藥物。所得結(jié)果更具體來說表明，與安慰劑相比，本發(fā)明的多聚體可以引起移植物存活率增加100%或甚至更多。因此，本發(fā)明的第一目的在于一種包含至少兩個α 1多肽的多聚體。在本發(fā)明的文本內(nèi)，術(shù)語“ α 1多肽”是指包含HLA-G抗原的α 1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列或其功能性片段、并且基本上缺乏其它功能性HLA-G結(jié)構(gòu)域的多肽。更優(yōu)選，該α 多肽包含HLA-G抗原的α 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在本發(fā)明的多聚體中，優(yōu)選所有α 1單體具有相同氨基酸序列。然而，也設(shè)想到具有不同序列的α 1多肽存在于本發(fā)明的多聚體中。更優(yōu)選地，該α 1多肽包含HLA-G抗原的α 1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列、其功能性片段，并且缺乏HLA-G抗原的功能性α 2、α 3、TM和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。HLA-G的α 1結(jié)構(gòu)域是由外顯子2編碼的，并且對應(yīng)于成熟人HLA-G的氨基酸1至 90。因此，α 結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列可以直接得自下列出版物Geraghty等人，上文所引述的文章；或Ellis等人，J. Immunol.，1990，144，731-735。該序列也可從網(wǎng)上獲得(參見例如 Genebank numbers for HLA-G first cloning of genomic sequence :Geraghty 等人， PNAS 1987=PubMed ID :3480534, GeneID :3135 ；Firstcloning of HLA-G IcDNA=Ellis 等人 Journal of Immunology 1990. PubMed ID :2295808)。此外，HLA-G5、HLA_G6 和 HLA-G7 的序列也可得自舊5，856，442、舊6，291，65911 2，810，047，或？3111 等人，Hum. Immunol 2000 ； 61 :1138, α 1結(jié)構(gòu)域的序列可從其中直接獲得。甚至更優(yōu)選地，α 1多肽包含HLA-G抗原的α 1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列、或其功能性片段，并且含有小于20個、更優(yōu)選小于15個、甚至最優(yōu)選小于10個或5個附加氨基酸，所述附加氨基酸在天然HLA-G同種型中處于α 1結(jié)構(gòu)域側(cè)面。本發(fā)明的α 1多肽的具體實例是由HLA-G抗原的α 1結(jié)構(gòu)域的序列、或其功能性片段組成的多肽。在特定實施方式中，該α 1多肽基本上由成熟HLA-G抗原的氨基酸1至90、或其功能性片段組成。優(yōu)選的α 1多肽的序列提供在SEQ ID NO 1中，其代表本發(fā)明的一個具體目的。“功能性片段”是指在作為本發(fā)明的多聚體使用時保留了誘導(dǎo)體內(nèi)移植物耐受性的能力的片段。更優(yōu)選地，功能性片段包含α 結(jié)構(gòu)域的至少20個、更優(yōu)選至少30個、40 個或50個連續(xù)氨基酸。在典型的實施方式中，該功能性片段含有α 1結(jié)構(gòu)域的至少60個連續(xù)氨基酸。該片段的功能性可以按實驗部分中所公開的內(nèi)容加以驗證。具體來說，該功能性可以如下驗證制備該片段的多聚體，在器官/組織移植之前對動物模型施用該多聚體， 并驗證移植物存活率。在多聚體與空白對照劑相比，將移植物存活時間延長50 %的情況下， 可以認(rèn)為該片段是功能性的。在本發(fā)明的特定實施方式中，α 多肽是SEQ ID NO 1的多肽、或其包含SEQ ID NO 1的至少50個連續(xù)氨基酸的功能性片段。應(yīng)理解，例如由于多態(tài)現(xiàn)象，存在HLA-G抗原的天然變體，其包括在本申請中。同樣，含有一定(例如1至10個、優(yōu)選1至5個、最優(yōu)選1個、2個、3個、4個或5個)氨基酸取代或插入的上述序列的變體也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明的α 1多肽可以通過本領(lǐng)域本來已知的技術(shù)產(chǎn)生，例如重組技術(shù)、酶技術(shù)或人工合成。在優(yōu)選實施方式中，使用已知的化學(xué)和合成器通過人工合成來產(chǎn)生α 1多肽。 α 1多肽可以包含天然氨基酸、或非天然的或修飾的氨基酸殘基。它們可以呈L和/或D構(gòu)象。該多肽可以包含胺鍵和/或修飾的擬肽鍵(p^tidomimetic linkage)。同樣，例如，該多肽可以通過例如化學(xué)或物理改變側(cè)向功能而進行末端保護和/或修飾。如上文所示，本發(fā)明涉及α 1多肽的多聚體。
在本發(fā)明的文本內(nèi)，術(shù)語“多聚體”是指包含締合在一起的至少兩個如上文所定義的α 1多肽(單體)的分子(或組合物或產(chǎn)物)。因此術(shù)語多聚體包括二聚體，以及包含3 個、4個、5個、6個、7個或甚至更多個α 單體的分子。本發(fā)明的多聚體可以包含至多100 個、500個、1000個或甚至更多個α 單體。此外，除了所述至少兩個α 多肽之外，本發(fā)明的多聚體可以含有其它單體。具體來說，本發(fā)明的多聚體可以含有至少兩個α 單體和異源單體。在特定實施方式中，本發(fā)明的多聚體僅含有α 多肽。本發(fā)明的多聚體的具體實例是二聚體。在這方面，在特定實施方式中，本發(fā)明涉及 α 1 二聚體。在本發(fā)明的多聚體內(nèi)，各種單體可以用不同方式連接在一起，例如但不限于，通過形成二硫橋(尤其對于二聚體)，或通過間隔基團和/或載體(carrier)。在優(yōu)選實施方式中，α 1多肽共價連接或通過親合性相互作用連接。在具體實施方式
中，本發(fā)明涉及包含兩個α 1多肽通過二硫橋連接的α 1 二聚體。 更具體來說，所述兩個α 1多肽通過人HLA-G抗原中42位氨基酸處的半胱氨酸殘基之間的二硫橋來連接。在另一具體實施方式
中，α 1多肽(或單體)通過間隔區(qū)或載體來連接。在具體實施方式
中，單體與載體連接，從而產(chǎn)生多聚體。載體可以具有不同的性質(zhì)。其優(yōu)選是生物相容的，并最優(yōu)選是生物惰性的。載體可以是分子，例如蛋白，例如白蛋白(例如人血清白蛋白)，或者是惰性固體載體，例如珠。該珠可以由任何生物相容材料例如玻璃、金屬、聚合物、珊瑚等等制成(或覆蓋)。在具體實施方式
中，載體是平均直徑低于50μπκ更優(yōu)選低于 10 μ m、典型約5 μ m或更小的珠。單體可以通過不同類型的偶聯(lián)反應(yīng)例如親合作用或使用官能團與載體連接?？梢酝ㄟ^用結(jié)合α 1多肽的配體(例如抗體或其片段)包覆該載體來獲得親合作用。還可通過向α 1多肽和載體分別添加結(jié)合對的成員(例如抗生物素蛋白和生物素)來獲得親合作用。還可通過諸如馬來酰亞胺之類的雙官能團獲得偶聯(lián)。此外應(yīng)注意，多聚體可以含有與載體連接并還參與分子間二硫橋形成的單體。在具體實施方式
中，本發(fā)明的多聚體是包含與載體連接的兩個或更多個α 1多肽的分子。本發(fā)明的多聚體可以通過各種技術(shù)產(chǎn)生。如上文所論述，單體可以通過不同的偶聯(lián)技術(shù)、例如共價鍵(例如二硫化橋(difulfide bridge)、雙官能團等等)或親合反應(yīng)連接
在一起。為了通過二硫鍵產(chǎn)生多聚體，在允許形成二硫鍵的條件下，使包含側(cè)向SH基團的α 多肽在溶液中接觸，并優(yōu)選地，使二聚體或多聚體分離。例如，通過凝膠電泳(例如 PAGE)，基于它們的分子量，可以使多聚體與單體分離。還可對等份樣品使用這種方法來驗證多聚體的恰當(dāng)形成，以測量溶液中多聚體存在的相對量，并且如有必要，調(diào)節(jié)反應(yīng)條件。 允許形成二硫鍵的條件包括，例如，10至30°C的溫度下歷時2至M小時。為了通過使用載體來產(chǎn)生多聚體，一般在載體存在下，在允許單體附接在載體上的條件下溫育單體，并且優(yōu)選分離多聚體。載體可以是例如固體載體，例如珠，優(yōu)選微珠。 載體還可以是蛋白，例如血清白蛋白。為了有助于單體和載體之間的相互作用，載體可以被官能化以含有能夠與單體相互作用的反應(yīng)基團。例如，載體可以包覆有α 1多肽的配體，例如抗體或其片段(例如Fab片段、CDR片段、kFv等等)或化學(xué)偶聯(lián)試劑(例如，馬來酰亞胺)?；蛘?，可以通過能夠結(jié)合α 1多肽的配體的反應(yīng)物，使載體官能化。例如，載體可以包覆抗-人IgG Fc片段，并且配體可以是針對HLA-Gl抗原的人多克隆IgG。在這種情況下， 單體、載體和配體可以一起溫育，以便允許單體與珠的適當(dāng)締合。在其它實施方式中，載體和單體可以被修飾以含有交叉反應(yīng)基團(例如抗生物素蛋白和生物素)。在這種情況下，載體和單體的溫育會在載體上引起多聚化。形成的多聚體(即載體和α 1多肽之間的復(fù)合體)可以使用本領(lǐng)域本來已知的各種技術(shù)來分離，所述技術(shù)包括離心、沉淀、電磁分離等等。本發(fā)明的多聚體的特定實例是-通過二硫橋連接的SEQID NO :1的α 1多肽的二聚體；-與載體例如微珠連接的SEQID NO :1的α 1多肽的多聚體；和-通過上文公開方法獲得的SEQID NO :1的α 1多肽的多聚體。如實施例中所述，這些多聚體能夠促進體內(nèi)移植物耐受性。此外，SEQ ID NO=I的多肽，以及編碼SEQ ID NO=I的多肽的核酸分子也代表本發(fā)明的特定目的。本發(fā)明確實表明SEQ ID NO :1的多肽具有用于治療移植物排斥的顯著體內(nèi)活性，并且可以用于制備十分有活性的多聚體。編碼核酸可以是例如單鏈或雙鏈的RNA或DNA。其可以通過本領(lǐng)域本來已知的技術(shù)、例如基因工程、化學(xué)或酶合成等等產(chǎn)生。在具體實施方式
中，核酸還包含編碼用于分泌的肽的序列，其與編碼所述多肽的序列可操作地連接。因此，這種核酸的表達導(dǎo)致所選宿主細胞分泌所述多肽。允許分泌的肽可以來自各種起源，例如來自人或哺乳動物基因，例如 Β2Μ、白細胞介素、HLA-G等等。本發(fā)明的另一個目的還在于一種包含如上文所定義的核酸的載體(vector)。載體可以是克隆和/或表達載體，例如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒載體、人工染色體等等。這種載體的特定實例包括PFUSE質(zhì)粒、pUC質(zhì)粒、pcDNA質(zhì)粒、pBR質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體、λ噬菌體載體等等。載體可以包含調(diào)控序列，例如啟動子、終止子、復(fù)制起點等等。載體可以用于通過重組技術(shù)體外產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，或在基因治療法中直接體內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的另一個目的是一種包含核酸或如上文所定義的載體(vector)的重組宿主細胞。該宿主細胞可以是原核的或真核的。原核宿主的實例包括任何細菌，例如大腸桿菌(E.coli)。真核細胞的實例包括酵母菌、真菌、哺乳動物細胞、植物細胞或昆蟲細胞。本發(fā)明的重組細胞可以通過本領(lǐng)域本來已知的轉(zhuǎn)化技術(shù)例如轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、電穿孔、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等等制備。這些細胞可以在任何適宜的培養(yǎng)基中維持和培養(yǎng)。本發(fā)明的重組細胞可以用于，例如，體外或離體產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，或作為細胞治療產(chǎn)品，用于體內(nèi)產(chǎn)生多肽。在這方面，本發(fā)明的目的還在于一種產(chǎn)生SEQ ID NO :1的多肽的方法，該方法包含在允許表達所述核酸分子的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細胞，和回收所產(chǎn)生的多肽。多肽可以使用本領(lǐng)域本來已知的技術(shù)例如離心、過濾、色譜技術(shù)等等回收和/或純化。本發(fā)明的另一個目的是一種藥物組合物，其包含如上文所定義的或可通過如上文所公開的方法獲得的多聚體，以及優(yōu)選可藥用賦形劑或載體。本發(fā)明的另一個目的是一種藥物組合物，其包含SEQ ID NO 1的多肽，以及優(yōu)選可藥用的賦形劑或載體。適宜賦形劑或載體包括任何可藥用的介質(zhì)，例如緩沖劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、鹽、防腐劑、乳化劑、甜味劑等等。賦形劑一般包含等滲的水性或非水性溶液，其可以根據(jù)已知技術(shù)制備。適宜的溶液包括緩沖溶質(zhì)，例如磷酸鹽緩沖溶液、氯化物溶液、林格氏溶液(Ringer、 solution)等等。藥物制劑一般是注射組合物的形式，優(yōu)選液體注射組合物，但也可以設(shè)想其它形式，例如片劑、軟膠囊(gelules)、膠囊、糖漿等等。本發(fā)明的組合物可以通過許多不同途徑施用，例如全身、胃腸夕卜、口服、直腸、鼻內(nèi)或陰道途徑。它們優(yōu)選通過注射施用，例如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、或皮下注射。也設(shè)想了經(jīng)皮膚施用。具體劑量可以由有技術(shù)的專業(yè)人員根據(jù)病理條件、對象、治療持續(xù)時間、其它活性成分的存在等等來調(diào)節(jié)。一般而言，組合物包含在IOng和IOOmg多聚體之間的單位劑量，更優(yōu)選在1 μ g和50mg之間，甚至更優(yōu)選在100μ g和50mg之間。本發(fā)明的組合物優(yōu)選以有效量施用，所謂有效量即隨時間推移足以至少降低或防止疾病進展的量。就此而言，優(yōu)選以允許降低對象有害或不期望的免疫應(yīng)答的量來使用本發(fā)明的組合物。如上文提及，本發(fā)明的多聚體具有強免疫調(diào)控活性，并且可以用于治療與異常或不想要的免疫應(yīng)答相關(guān)的各種疾病病況。更具體來說，本發(fā)明的多聚體適于治療免疫相關(guān)病癥，例如具體來說，器官或組織排斥、炎性疾病或自身免疫疾病。如在實驗部分中公開的，本發(fā)明的多聚體可以基本上抑制體內(nèi)同種異體移植物排斥。因此，本發(fā)明的一個目的在于一種如上文所公開用于治療移植物排斥的多聚體、 多肽或組合物。本發(fā)明的另一目的在于一種在對象中治療移植物排斥的方法，該方法包含對需要它的對象施用有效量的如上文所公開的組合物。術(shù)語治療是指例如促進在接受對象內(nèi)的移植物耐受性。治療可以在移植之前、期間和/或之后實施，并且可以用作現(xiàn)有免疫抑制劑的替代性療法，或者用作與實際的免疫抑制劑的組合療法。本發(fā)明適用于同種異體的、半同種異體的或甚至異種的移植，并且可以用于任何類型的移植器官或組織，包括但不限于實體組織、液體組織或細胞，包括心臟、皮膚、腎臟、肝臟、肺、肝-腎等等。本發(fā)明的另一個目的是一種用于在對象中移植器官或組織的改進方法，改進之處包含在移植之前、期間和/或之后向?qū)ο笫┯糜行Я康娜缟衔乃_的組合物。本發(fā)明的另一個目的是一種用于在對象中促進移植物耐受性的方法，該方法包含在移植之前、期間和/或之后向?qū)ο笫┯糜行Я康娜缟衔乃_的組合物。本發(fā)明的另一個目的是一種用于在對象中減輕移植物排斥的方法，該方法包含在移植之前、期間和/或之后向?qū)ο笫┯糜行Я康娜缟衔乃_的組合物。在優(yōu)選實施方式中，至少兩次向?qū)ο笫┯媒M合物。的確，本申請中所示結(jié)果證實， 反復(fù)施用導(dǎo)致更為提高的有益效果，例如，導(dǎo)致更為顯著提高的體內(nèi)移植物耐受性。本發(fā)明特別適于治療心臟排斥，即提高對心臟移植物的耐受性。具體來說，所呈現(xiàn)的結(jié)果表明，本發(fā)明的α 1多聚體以劑量-響應(yīng)方式有效延長心臟的體內(nèi)移植物存活。雖然以低250倍的劑量使用，但該治療與參比化合物他克莫司(Tacrolimus)效力相同。此外， 心臟移植物排斥開始于他克莫司治療后第9天，而用本發(fā)明的α 1多聚體則被遲延到治療后第11天。本發(fā)明因此提供了一種用于提高心臟同種異體移植物移植的顯著改進方法。本發(fā)明的另一個目的在于一種如上文所公開用于治療自身免疫疾病的多聚體、多肽或組合物。本發(fā)明還在于一種在對象中治療自身免疫疾病的方法，該方法包含對需要它的對象施用有效量的如上文所公開的組合物。自身免疫疾病可以是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩氏病(Crohn' sdisease)或多發(fā)性硬化癥。在這樣的疾病病況中，本發(fā)明可以減少造成病變的有害免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另一個目的在于一種如上文所公開用于治療炎性疾病的多聚體、多肽或組合物。本發(fā)明的另一個目的在于一種在對象中治療炎性疾病的方法，該方法包含對需要它的對象施用有效量的如上文所公開的組合物。應(yīng)理解，組合物實際施用量應(yīng)該由醫(yī)師依據(jù)相關(guān)條件確定和修改，所述相關(guān)條件包括待治療的病況、所施用的確切組合物、個體患者的年齡、重量和應(yīng)答、患者癥狀的嚴(yán)重度以及所選施用途徑。因此，上述劑量范圍旨在提供對本文教導(dǎo)內(nèi)容的一般性指導(dǎo)和支持， 而并不旨在限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點在下面實施例中公開，應(yīng)認(rèn)為所示實施例是說明性的， 并不限制本申請的范圍。實施例實施例1:α1多肽的制備使用肽合成器合成SEQ ID NO :1的α 1多肽。實施例2 通過二硫鍵連接的α 1 二聚體將α 1多肽用含(“還原”)或不含(“非還原”)二硫蘇糖醇的樣品緩沖液溫育， 煮沸，在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并轉(zhuǎn)移到Hybond ECL硝化纖維素膜上。在用PBS IX中的脫脂牛奶溫育之后，該膜用抗HLA-G多克隆抗體溫育過夜，并用辣根過氧物酶接合的山羊抗小鼠二級抗體使其顯色。用ECL檢測系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biosciences)使膜顯色。在上述狀況下，α 1多肽形成二聚體，其可以例如通過電泳來識別。實施例3 使用載體產(chǎn)生α 1多聚體使用硫酸鹽膠乳珠w/v 5 μ m, Invitrogen)作為載體。將它們用α 1單體直接地或間接地包覆，所述間接包覆即使用抗HLA-G抗體4Η84 (0. 5mg/ml, BD Pharmingen)。為了間接包覆，將IO8硫酸鹽膠乳珠與20 μ g/ml純化的抗-人HLA-G抗體在37°C 下溫育2小時，隨后用BSA (2mg/ml)溫育2小時。在洗滌之后，將珠與1 μ g/ml的HLA-G α 1 肽(90聚體，實施例1中產(chǎn)生)在4°C下溫育16小時。為了產(chǎn)生HLA-G肽直接包覆珠，將IO8硫酸鹽膠乳珠用1 μ g/ml的HLA-G α 1肽在4°C下包覆16小時，隨后用BSA(2mg/ml)溫育2小時。隨后將所有珠用IxPBS洗滌2次。將5ml的HLA-G α 1肽(1 μ g/ml)用于5X IO6 硫酸鹽膠乳珠。將本發(fā)明的這種多聚體用于誘導(dǎo)或提高體內(nèi)移植物耐受性(參見實施例4)。實施例4 α 1多聚體對同種異體皮膚移植的效果為評估本發(fā)明的α -1多聚體的生物活性，進行若干體內(nèi)研究。
在整個研究中將特定的無病原體C57BL/6 (H_2b)小鼠(年齡8至10周)用作皮膚移植受體。受體小鼠接受α -結(jié)合珠。供體皮膚來自II類MHC截然不同的 B6.CH-2bml2(bml2，H-2b)小鼠。通過標(biāo)準(zhǔn)方法實施了同種異體皮膚移植。簡而言之，將來自供體小鼠(12至14周齡)的尾部的皮膚(1.0cm2)移植到麻醉的受體小鼠的側(cè)面上。移植物用紗布和石膏覆蓋，并在第10天移除。每天對移植物評分，直到排斥(定義為80%的移植組織變得壞死并且尺寸減小)。通過Kaplan Meier存活分析測試所有皮膚移植物存活數(shù)據(jù)。在第一系列的實驗中，在皮膚移植之前一天，將如實施例3中所公開制備的α 1肽包覆的硫酸鹽膠乳珠(5Χ IO6)腹膜內(nèi)注射。作為陰性對照，以相同方式制備硫酸鹽膠乳珠， 不同的是使用IxPBS或HeLa陰性對照，而不使用α 1多肽。這些實驗的結(jié)果示于圖1和圖2上。它們表明本發(fā)明的α 1多聚體能夠顯著改進體內(nèi)移植物耐受性。具體來說，它們表明所述多聚體能夠顯著改進平均存活，這是令人意外的。更具體來說，在未治療小鼠中平均存活22天，而在治療小鼠中為25天。同樣，與直接包覆珠相比，用通過抗體介導(dǎo)間接包覆制備的多聚體治療的小鼠顯示平均移植物存活時間提高了 4天。應(yīng)注意，該模型中移植物存活的每一天對應(yīng)于人類對象中移植物存活大約至少一個月，因此認(rèn)為本發(fā)明的組合物將在人類對象中的移植物存活提高至少若干個月。這些結(jié)果因此表明在同種異體移植(Β6. CH-2bml2(bml2, H_2b))之前用α 1多聚體治療一次的小鼠(C57BL/6(H2B))表現(xiàn)出提高的移植物存活。在野生型小鼠中體內(nèi)進行的附加研究表明，與單次施用相比，兩次注射本發(fā)明的多聚體(移植之前M小時，然后移植之后10天)將移植物存活提高6天。在圖3中，示出這些附加實驗的結(jié)果，證實了很強且令人吃驚的移植物耐受效果，導(dǎo)致移植物存活提高超過 100%。因此，這些結(jié)果清楚說明并支持所要求保護的α-l多聚體作為提高移植物存活的治療產(chǎn)品的用途。實施例5 : α 1多聚體對防止心臟同種異體移植物排斥的功效5.1材料和方法動物將雄性BALB/c(H-2d)小鼠(重量22至M克)用作供體，并將雄性C57BL/6 (H_2b) 小鼠(重量對-27克)用作受體。所有小鼠購自Charles River Canada (St. Constant, QC) 以受控的光/暗周期圈養(yǎng)小鼠，并容許其自由接近水和鼠食。小鼠心臟移植如Chen，H.等人，(The Journal of Immunology, 1996 ； 157 :4297-4308)所描述， 腹內(nèi)放置異位心臟移植物。簡而言之，用腹膜內(nèi)注射65mg/kg戊巴比妥麻醉供體和受體小鼠。通過在腔靜脈和肺靜脈結(jié)扎之前用冷鹽水灌注下腔靜脈將供體心臟激冷至4°C，使供體肺動脈和主動脈留下開口以便吻合。將移植物儲存于4°C鹽水中少于20分鐘。在使受體的腎內(nèi)腔靜脈和主動脈暴露之后，使用11-0尼龍縫線(AROSurgical ,Newport Beach, CA)進行供體肺動脈與受體腔靜脈以及供體主動脈與受體主動脈的端-側(cè)微血管吻合。每天通過腹部觸診評價心搏。將排斥的時間定義為可觸知的心肌收縮的最后日，并在剖腹術(shù)后確認(rèn)。
免疫抑制劑將經(jīng)二硫橋連接的α 1 二聚體在PBS中稀釋至終濃度150 μ g/ml，并經(jīng)由皮下施用。Π(506(他克莫司)治療組每天口服施用H(5065mg/kg。未接觸藥物的對照小鼠僅接受 PBS。實驗設(shè)計. 1組.未接觸藥物的對照N = 6PBS處理前皮下施用，然后每周施用一次
2組.HLA-G低劑量
N = 6 處理前皮下施用15μ g/小鼠，然后每周一次
3組.HLA-G低劑量
N = 3 處理前皮下施用15μ g/小鼠，然后每隔一天施用
4組.HLA-G低劑量
N = 3 處理前M小時及處理當(dāng)天皮下施用15yg/小鼠，然后每隔一天施用
5 組.FK506 N = 6 處理當(dāng)天口服施用n(5065mg/kg，然后每天施用直到手術(shù)后第14天
6組.HLA-G中等劑量 N = 6處理療前皮下施用30μ g/小鼠，然后每周施用一次. 7 組.HLA-G 高劑量 N = 6處理前皮下施用60μ g/小鼠，然后每周施用一次統(tǒng)計分析通過在SPSS軟件(13. 0版)中使用Kaplan-Meier存活分析(KMSA)[配對比較 (對數(shù)秩)]，進行心臟同種異體移植物存活數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。認(rèn)為結(jié)果在ρ < 0. 05處是顯著的。5. 2 結(jié)果移植心臟存活數(shù)據(jù)概括在圖4中和下表1中。這些結(jié)果表明，α 1 二聚體顯著延長小鼠同種異體移植物存活，具有劑量相關(guān)關(guān)系。治療是長效的，因為每周一次注射維持移植物存活。此外，移植物排斥僅在α 1治療11 之后開始，其優(yōu)于用參比化合物他克莫司的治療。因此，這些結(jié)果清楚地說明本發(fā)明的α 1多聚體對防止心臟移植排斥的功效。表1.存活分析
權(quán)利要求
1.一種多聚體，其包含HLA-G抗原的至少兩個α 1多肽，所述至少兩個α 1多肽中的每一個包含HLA-G抗原的α 1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列、或其功能性片段，并且基本上缺乏其它功能性HLA-G結(jié)構(gòu)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多聚體，其中所述至少兩個α1多肽通過二硫橋連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多聚體，其中所述至少兩個α1多肽通過載體或間隔基團連接。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多聚體，其包含至少三個α 多肽，優(yōu)選至少4個、5個、6個或7個α 1多肽。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多聚體，其中所述α 多肽包含HLA-G抗原的α 1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列、或其功能性片段，并且缺乏HLA-G抗原的功能性α 2、α 3、TM和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多聚體，其中所述α1多肽基本上由成熟HLA-G抗原的氨基酸1至90、或其包含至少50個氨基酸的功能性片段組成。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的多聚體，其中所述α1多肽是SEQ ID NO 1的多肽、或其包含SEQ ID NO 1的至少50個連續(xù)氨基酸的功能性片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多聚體，其中所述載體是多肽，例如人血清白蛋白，或是珠。
9.一種α 1多肽的二聚體。
10.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1至9中任一項所述的多聚體的方法，所述方法包含在允許α 1多肽多聚化的條件下使所述α 1多肽混合，并收集多聚體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中在載體、優(yōu)選微珠或人血清白蛋白存在下使所述多肽混合，并且分離所述多聚體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述載體是結(jié)合α1多肽的親合試劑包覆的微珠。
13.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至9中任一項所述的或者能通過權(quán)利要求10至12中任一項所述的方法獲得的多聚體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其用于治療器官或組織排斥。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其用于治療炎性疾病或自身免疫疾病。
16.SEQ ID NO 1 的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及α1多聚體和其用途。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這種多聚體的方法、包含這種多聚體的藥物組合物，以及它們用于治療各種疾病、包括器官/組織排斥的用途。
文檔編號C07K14/705GK102574905SQ201080034346
公開日2012年7月11日 申請日期2010年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月18日
發(fā)明者勞倫斯·呂洛, 雅克斯-弗朗索瓦·馬丁 申請人:Hla-G科技公司