專利名稱：Tlr3 結(jié)合劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特異性地結(jié)合TLR3的并且任選地進(jìn)一步調(diào)節(jié)例如抑制信號傳送的抗體(例如單克隆抗體)、抗體片段、以及它們的衍生物。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這類抗體的細(xì)胞；制造這類抗體的方法；這類抗體的片段、變異體、以及衍生物；包括以上物質(zhì)的藥用組合物；使用這類抗體來診斷、治療或預(yù)防疾病例如自身免疫性疾病、炎性疾病等的方法。
曲旦冃足果蠅toll蛋白控制著背腹模式形成，并且被認(rèn)為代表一種古老的宿主防御機(jī)制。 在人體中，TLR被認(rèn)為是先天免疫性的一種重要的組成部分。在蛋白鏈的全部長度內(nèi)，人類和果蠅Toll蛋白序列顯示出同源性。人類Toll樣受體的家族包括10個高度保守的受體蛋白，TLR1-TLR10。與果蠅toll類似，人類TLR是I型跨膜蛋白，該跨膜蛋白具有一個由富含亮氨酸重復(fù)體(LRR)結(jié)構(gòu)域組成的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域識別病原體相關(guān)分子模式 (PAMP)；以及一個胞質(zhì)域，該胞質(zhì)域與人類白細(xì)胞介素-I(IL-I)受體的胞質(zhì)域同源。類似于果蠅toll和IL-I受體這兩者的信號傳導(dǎo)途徑，人類Toll樣受體通過NF-K B傳導(dǎo)途徑傳送信號。盡管不同哺乳動物的TLR共有許多特征以及信號傳導(dǎo)機(jī)理，它們的生物學(xué)功能是非常不同的。部分原因是由于以下事實，即四種不同接合體分子(MyD88，TIRAP, TRIF和 TRAF)以不同的組合與TLR相結(jié)合并且介導(dǎo)不同的信號傳導(dǎo)途徑。此外，同一個TLR的不同配體可以優(yōu)選地激活不同信號傳導(dǎo)途徑。而且，TLR差異性地表達(dá)于不同的造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞中。因此，對TLR配體的應(yīng)答不僅取決于被TLR激活的信號傳導(dǎo)途徑，而且還取決于表達(dá)單獨TLR的細(xì)胞的性質(zhì)。由于Tol 1樣受體3 (TLR3)信號傳送已經(jīng)牽涉炎性以及自身免疫性病癥，所以TLR3 作為治療目標(biāo)物已經(jīng)受到顯著關(guān)注。專利申請W098/50547提供了 hTLR3蛋白的核苷酸和氨基酸序列。LeBouteiller 等人在(2005) J. Biol. Chem. 280(46) :38133-38145)披露了一種抗TLR3抗體結(jié)合細(xì)胞表面TLR3的用途?？贵wC1130據(jù)稱對TLR3具有激活性，并且已經(jīng)在TO 2007/051164 中進(jìn)行了說明。在 Cavassani 等人在 Q008) J. Exp. Med. 205 :2609-2621 中說明了抑制TLR3的多克隆抗體。WO 03/106499和松本(Matsumoto)等人在Q003) J. Immunol. 171 :3154-3162 說明了相應(yīng)于抗體克隆 TLR3. 7 的一種抗體(eBioScience 公司，圣地亞哥)，據(jù)報告該抗體結(jié)合并且抑制細(xì)胞表面的TLR3而不是細(xì)胞區(qū)域的TLR3或髓系DC中的TLR3。WO 06/060513說明了一種抗體C1068，該抗體據(jù)報告在上皮細(xì)胞中抑制了細(xì)胞因子產(chǎn)生，這些上皮細(xì)胞據(jù)報告在細(xì)胞表面上表達(dá)了 TLR3。C1068據(jù)稱與抗體TLR3. 7 競爭結(jié)合到TLR3上(參見W02010/051470)。PCT專利申請W02010/051470提供了抗TLR3 抗體。這類抗體據(jù)稱阻斷了 dsRNA并且被提出可以防止dsRNA結(jié)合到TLR3上。用于研究用途的其他抗TLR3抗體包括來自研發(fā)系統(tǒng)(R&DSystems)公司的多克隆抗TLR3抗體，來自 Abcam 的抗體 40C1285 以及抗體 619F7、713E4、716G10、IMG-5631 以及-IMG-5348 (都來自 Imgenex 公司)。然而，盡管至今已經(jīng)產(chǎn)生了數(shù)種抗-TLR3抗體，這些抗體通常僅旨在用于研究目的，而不是用于治療用途。如在此進(jìn)一步所說明，本披露顯示目前可獲得的抗TLR3抗體，盡管它們在一些研究環(huán)境中可以用于進(jìn)行實驗觀察，但它們并非最適合用作治療劑例如調(diào)節(jié) TLR3。因此存在提供定向到TLR3上的改進(jìn)抗體的一種需要。 發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了包括多種單克隆抗體的新穎組合物，以及使用這些化合物的方法，這些單克隆抗體包括但不限于特異性地結(jié)合人類TLR3的抗體片段、以及衍生物。 一方面，這些抗體抑制TLR3信號傳送而不阻斷TLR3配體結(jié)合到TLR多肽上。一方面，在酸性調(diào)節(jié)下并且具體地是細(xì)胞酸化亞細(xì)胞區(qū)室中所面對條件的代表性條件下(例如，細(xì)胞內(nèi)吞途徑內(nèi)體的區(qū)室、溶酶體的區(qū)室)，這些抗體結(jié)合人類TLR3。這類酸性條件總體上特征為 PH低于約pH 6. 5、或在約pH 4. 5至6. 5之間、或約pH 5.6。在此任何一個實施方案的一個方面中，在細(xì)胞酸化亞細(xì)胞的區(qū)室中(例如，細(xì)胞內(nèi)吞途徑內(nèi)體的、溶酶體的區(qū)室)這些抗體調(diào)節(jié)，任選地抑制TLR3信號傳送。在此任何一個實施方案的一個方面中，在一種樹突細(xì)胞(DC)(例如，一種髓樣DC， 單核細(xì)胞衍生的DC)中這些抗體調(diào)節(jié)，任選地抑制TLR3信號傳送。在此任何一個實施方案的一個方面中，這些抗體可以任選地被表征為與中性條件相比，在酸性條件下對于結(jié)合人類TLR3不具有實質(zhì)性更低的親和性(例如，其中結(jié)合到 TLR3上的Kd降低不超過0. 2-,0. 3_、-0. 4,0. 5-,1. 0_、或1. 5-log10)。這些中性條件總體上的特征為pH在6. 6至7. 4之間，例如在胞質(zhì)溶膠中發(fā)現(xiàn)的稍微堿性的pH 7. 2。任選地， 與中性條件下相比，這些抗體在酸性條件下對于結(jié)合人類TLR3不具有實質(zhì)性不同(更低或更高)的親和性(例如，其中在中興和酸性條件下結(jié)合到TLR3上的Kd的差異不超過0. 2_、 0. 3-、0· 4、0· 5-、1· 0-、或 1. 5-log10)。在此任何一個實施方案的其他方面中，在酸性條件下這些抗體的TLR3 二價結(jié)合親和性任選的特征可以是平均Kd為不大于約(即，親和性大于)100、50、10、5、或1納摩爾， 優(yōu)選地亞納摩爾或任選地不大于約300、200、100或10皮摩爾。在此任何一個實施方案的其他方面中，這些抗體抑制TLR3信號傳送，而不阻斷 TLR3配體結(jié)合到TLR3多肽上。TLR3配體總體上將是一種配體而不是一個抗TLR3抗體，并且可以是一個天然發(fā)生的或非天然發(fā)生的TLR3配體，任選地是一個dsRNA基配體，例如聚 AU(聚腺苷酸聚尿苷酸)或聚IC(聚肌苷酸聚肌胞苷酸)。具體而言，諸位發(fā)明人已經(jīng)證實即使當(dāng)TLR3配體例如dsRNA已經(jīng)結(jié)合到TLR3多肽上時，根據(jù)本發(fā)明的抗體還能夠抑制TLR3信號傳送。即使在預(yù)激活條件下(例如在IFNa存在下)，根據(jù)本發(fā)明的抗體還能夠抑制TLR3信號傳送。根據(jù)本發(fā)明的抗體據(jù)信對于治療患有一種確診的自身免疫性疾病 (例如天然發(fā)生的TLR3配體例如dsRNA和/或患病細(xì)胞中存在IFN α，并且特別是當(dāng)IFN α 水平高時)的病人是有效的。即使TLR3配體結(jié)合位點被dsRNA分子占據(jù)，這些抗體還可以具有結(jié)合TLR3的優(yōu)點，從而潛在地允許更寬范圍的總體結(jié)合。本披露顯示了在酸性條件下結(jié)合人類TLR3的抗體在細(xì)胞(髓樣樹突細(xì)胞(MdDC)； 單核細(xì)胞衍生的DC(MoDC))中具有較強(qiáng)的能力來調(diào)節(jié)、具體地是抑制TLR3信號傳送，這些細(xì)胞僅表達(dá)TLR3或TLR3的表達(dá)主要在它們的胞質(zhì)區(qū)室中3，并且主要在細(xì)胞內(nèi)吞途徑的區(qū)室(例如內(nèi)體)中。這些抗體結(jié)合到TLR3中的一個區(qū)域上，該區(qū)域不涉及結(jié)合到dsRNA上， 并且在酸性條件下這些抗體不阻止dsRNA結(jié)合到TLR3上。這些組合物和方法對于多數(shù)應(yīng)用是有用的，并且尤其非常適合調(diào)節(jié)TLR3信號傳送(例如，體內(nèi))，其中胞質(zhì)溶膠的(例如定位于細(xì)胞內(nèi)吞途徑區(qū)室的)TLR3被靶向。調(diào)節(jié)胞質(zhì)溶膠TLR3信號傳送對于治療和預(yù)防一種疾病可能是有用的，對于該疾病而言在酸性胞質(zhì)溶膠區(qū)室(例如，在內(nèi)體中)中在表達(dá)TLR3 的DC或其他細(xì)胞中調(diào)節(jié)TLR3信號傳送是有益的。例如，在DC中抑制TLR3信號傳送(例如通過由DC抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生而觀察到)可以用來治療或預(yù)防炎癥或自身免疫性障礙，因為DC具有一種良好證明的能力，可以從凋亡或壞死細(xì)胞中吸收抗體(艾伯特(Albert)在 (2004)Nat. Rev. Immunol. 4 :223-231)，包括在組織壞死期間急性炎癥期間(Cavassani等人于2008年)。任選地，這些抗體抑制TLR3信號傳送，例如抑制通過TLR3配體刺激TLR3 受體而誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生(例如IP10)。內(nèi)體和溶酶體是細(xì)胞內(nèi)部的膜結(jié)合區(qū)室，形成了細(xì)胞內(nèi)吞途徑的一部分，并且由于內(nèi)體膜泵送質(zhì)子的ATP酶的作用通常是酸性的。在巨噬細(xì)胞中對原位溶酶體pH最早期的測量發(fā)現(xiàn)PH為4. 7-4. 8;涉及受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用的成纖維細(xì)胞內(nèi)體的pH經(jīng)確定為約5. 5。TLR3的早期研究確認(rèn)它表達(dá)于單核細(xì)胞衍生的DC中的胞質(zhì)溶膠中，并且它可能將其配體結(jié)合到該細(xì)胞內(nèi)吞途徑的亞細(xì)胞區(qū)室中(松本(Matsumoto)等人在Q003) J. Immunol. 171 :3154-3162)。到目前為止TLR3已報道表達(dá)于樹突細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及肝細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)體區(qū)室中，盡管在細(xì)胞表面上，具體地是在上皮細(xì)胞上并且在一些炎癥情況下也在巨噬細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了 TLR3(CaVassani 等人于2008年，同上)已經(jīng)顯示內(nèi)體酸化作用在TLR3信號傳送方面發(fā)揮作用，因為在DC 中用氯喹(一種內(nèi)體酸化抑制劑)處理抑制了 TLR3信號傳送。與在酸性條件下失去親和性的抗體相比，在此提供的相應(yīng)于酸化內(nèi)體區(qū)室的酸性條件下(例如PH約5. 6，或小于約 6. 5)結(jié)合TLR3的抗體具有一種優(yōu)點，該優(yōu)點允許有效地高親和性結(jié)合到內(nèi)體區(qū)室中TLR3 上、并且任選地對其進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)節(jié)，并且因此可以將它們的作用更多地施加到細(xì)胞表面 TLR3上。舉例說明的這些抗體在DC中的TLR3上具有強(qiáng)抑制活性，這些DC已知主要在胞質(zhì)體區(qū)室中表達(dá)TLR3。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了多種單克隆抗體，這些單克隆抗體特異性地結(jié)合人類TLR3并且抑制TLR3信號傳送，例如抑制通過TLR3配體刺激TLR3受體而誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，而不阻斷TLR3的一個配體(例如，TLR3的一種天然或合成的配體、一種基于核苷酸的配體、一種dsRNA、病毒dsRNA、聚IC、聚AU)結(jié)合到TLR3多肽上。當(dāng)這類抗體結(jié)合 TLR3多肽時，dsRNA仍然可以結(jié)合這些TLR3多肽，減少了可用于結(jié)合到剩余未結(jié)合抗體的 TLR3上的dsRNA和/或其它dsRNA受體(即RIG-I、MDA-5、TLR7等)，由此潛在地降低了不希望的副作用例如毒性增加、不適當(dāng)?shù)男盘柤壜?lián)放大激活等，并且導(dǎo)致了由dsRNA誘導(dǎo)信號傳送而引起的多種病癥，例如慢性炎癥。這類抗體組合物和方法對于多種應(yīng)用，具體地是對于治療或預(yù)防與TLR3信號傳送相關(guān)的疾病是有用的，并且就它們的作用機(jī)理來看，本發(fā)明的這些抗體可以用于使TLR3多肽無應(yīng)答或?qū)ζ溥M(jìn)行抑制。任選地，該抗體可以表征為不可檢出地降低TLR3的雙鏈RNA配體結(jié)合到TLR3多肽上。在酸性條件下，例如在酸化內(nèi)體區(qū)室中所面對條件的代表性條件下，該抗體還可能或不可能以高親和性結(jié)合到人類TLR3 上。在一個實施方案中，其中尋找一種可以被TLR3抑制信號傳送的抗體，有利的是正如在此說明的酸性條件下，并且具體地在細(xì)胞酸化內(nèi)體區(qū)室中所面對條件的代表性條件下，特異性地結(jié)合TLR3并且抑制TLR3信號傳送、而不阻斷TLR3的雙鏈RNA配體結(jié)合到TLR3多肽上的抗體能夠額外地結(jié)合并抑制人類TLR3。在本發(fā)明的任何一個實施方案的一個方面中，任選地在酸性和/或中性條件下該抗體與單克隆抗體31C3、29H3、23C8、28F11或34A3中的任何一項或其任何組合競爭結(jié)合到 TLR3多肽上。在一個實施方案中，任選地在酸性和/或中性條件下，本發(fā)明的一種抗體與選自下組的一種抗體競爭結(jié)合到TLR3多肽上，該組的組成為
(a)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS 2以及3(31C3)的一個VH區(qū)和一個VL
區(qū)，
(b)—種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS 10以及11 Q9H3)的一個VH區(qū)和一個 VL區(qū)，
(c)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS 18以及19(28F11)的一個VH區(qū)和一個 VL區(qū)，
(d)—種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS沈以及27 Q3C8)的一個VH區(qū)和一個 VL區(qū)，以及
(e)一種對應(yīng)地具有SEQ ID NOS 34以及35(34A3)的一個VH區(qū)和一個VL區(qū)的抗體。在一個實施方案中，該抗體與抗體31C3和競爭結(jié)合到TLR3多肽上；在一個實施方案中，該抗體與抗體31C3和23C8競爭結(jié)合到TLR3多肽上；在一個實施方案中，該抗體與抗體31C3和28F11競爭結(jié)合到TLR3多肽上；在一個實施方案中該抗體與抗體31C3和 34A3競爭結(jié)合到TLR3多肽上。在一個實施方案中，該抗體與抗體和23C8競爭結(jié)合到TLR3多肽上；在一個實施方案中該抗體與抗體和^Fll競爭結(jié)合到TLR3多肽上； 在一個實施方案中，該抗體與抗體和34A3競爭結(jié)合到TLR3多肽上。在一個實施方案中，該抗體與抗體23C8和^Fll競爭結(jié)合到TLR3多肽上；在一個實施方案中，該抗體與抗體23C8和34A31競爭結(jié)合到TLR3多肽上。在一個實施方案中，該抗體與抗體28F11和 34A3競爭結(jié)合到TLR3多肽上。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包括一個輕鏈，該輕鏈包括
(a)一種選自SEQ ID NOS :61、64以及65的輕鏈CDRl (LCDRl)氨基酸序列；
(b)一種選自SEQ ID NOS :62、66以及67的輕鏈CDR2 (LCDR2)氨基酸序列；和/或
(c)一種選自SEQ ID NOS :63、68、69以及70的輕鏈CDR3 (LCDR3)氨基酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包括一個重鏈，該重鏈包括
(a)一種選自SEQ ID NOS 71至76的重鏈CDRl (HCDRl)氨基酸序列；
(b)一種選自SEQ ID NOS 77至81的重鏈CDR2 (HCDR2)氨基酸序列；和/或
(c)一種選自SEQ ID NOS 82至85的重鏈CDR3 (HCDR3)氨基酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是選自下組，該組的組成為
(a)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有(i)如SEQ ID N0:4、5以及6中所示的重鏈⑶R 1、 2以及3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如SEQ ID NO :7、8以及9中所示的輕鏈CDR 1、2以及3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；
(b)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有⑴如SEQ ID NO 12,13以及14中所示的重鏈⑶R 1、2 以及 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如 SEQ ID NO :15、16 以及 17 中所示的輕鏈⑶R 1、2以及3(IXDR1、IXDR2、IXDR;3)氨基酸序列；
(c)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有⑴如SEQ ID NO 20,21以及22中所示的重鏈⑶R
91、2 以及 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如 SEQ ID NO :23、24 以及 25 中所示的輕鏈⑶R 1、2以及3(IXDR1、IXDR2、IXDR;3)氨基酸序列；
(d)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有⑴如SEQ ID NO 28,29以及30中所示的重鏈⑶R 1、2 以及 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如 SEQ ID NO :31、32 以及 33 中所示的輕鏈⑶R 1、2以及3(IXDR1、IXDR2、IXDR;3)氨基酸序列；以及
(e)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有(i)如SEQ ID NO 36,37以及38中所示的重鏈⑶R 1、2 以及 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如 SEQ ID NO :39、40 以及 41 中所示的輕鏈⑶R 1、2以及3(IXDR1、IXDR2、IXDR;3)氨基酸序列；
任選地，其中在所述序列的任何一項中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代。在本發(fā)明的一個實施方案中，該抗體結(jié)合到與單克隆抗體31C3、29H3、23C^8F11 或34A3中任何一個或其任何組合相同的TLR3表位上。在另一個實施方案中，該抗體包括抗體31C3的一個抗原結(jié)合區(qū)。在另一個實施方案中，該抗體包括抗體的一個抗原結(jié)合區(qū)。在另一個實施方案中，該抗體包括抗體23C8的一個抗原結(jié)合區(qū)。在另一個實施方案中，該抗體包括抗體^Fll的一個抗原結(jié)合區(qū)。在另一個實施方案中，該抗體包括抗體34A3 的一個抗原結(jié)合區(qū)。在另一個實施方案中，該抗體包括一個輕鏈，該輕鏈包括該31C3、29H3、 23C8、28F11或34A3輕鏈可變區(qū)序列中的一個、兩個或全部三個⑶R，和/或一個重鏈，該重鏈包括該31C3、29H3、23C8、28F11或34A3重鏈可變區(qū)序列中的一個，兩個或全部三個CDR。 在另一個實施方案中，該抗體是31C3J9H3、3C8、28F11或34A3或它們的一個片段或衍生物，任選地融合到一個人類Fc區(qū)上?？贵w7和31C3. 1已經(jīng)于2009年7月3日保存在法國巴黎F-75724 Docteur路25號巴斯德研究所國家微生物菌種保藏中心(CNCM)，對應(yīng)的編號為 CNCM 1-4187 和 CNCM 1-4186。抗體 31C3J9H3、23C8J8F11 或 34A3 的抗原結(jié)合區(qū)也披露于SEQ ID NOS 2至41中。在本發(fā)明的一個方面中，根據(jù)本發(fā)明的一種抗體的輕鏈得自一種核酸序列或由其編碼，該核酸序列源自選自針對V基因的VK 19-14、VK aq4、VK 12-41以及VK 12-44以及針對J基因的JK2的一個VL基因重排。在本發(fā)明的一個方面中，根據(jù)本發(fā)明的一種抗體的重鏈得自一種核酸序列或由其編碼，該核酸序列源自選自針對V基因的VH36-60.al.85、VHL558. 1以及VH J558. 2以及針對J基因的JH4或JH2的一個VH基因重排。在本發(fā)明的另一個方面中，該抗體具有由自下組的序列中的一個或多個⑶R，該組的組成為SEQ ID NOS :4至9、12至17、20至25、觀至33、36至41、其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個抗原可被一種不同的氨基酸取代。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體特異性地結(jié)合TLR3，其中該抗體具有以下特性中的一項或多項
a.在酸性pH下對于TLR3多肽具有亞納摩爾的親和性，例如pH小于約6.5，或在約4. 5 至6. 5之間或約pH 5.6 ；或
b.在一種TLR3配體的存在下能夠抑制TLR3信號傳送；或
c.在炎癥背景下(例如在炎性細(xì)胞因子例如IFNα的存在下)能夠抑制TLR3信號傳送；或d.與31C3、29H3、28F11、23C8 或 34A3 競爭結(jié)合到 TLR3 多肽上；
e.不與dsRNA競爭結(jié)合到TLR3多肽上。在一個實施方案中，該抗體具有上述特性(a)和(b) ； (a)、(b)和(c) ； (a)、(b)、 (c)和(d)；或(a)、(b)、(c)、(d)和(e)。在一個實施方案中，該抗體具有特性(a)和(c)； (a)、(c)和(d)；或(a)、(c)、(d)和(e)。在一個實施方案中，該抗體具有特性(a)和(d)； (a)和(e)；或(a)、(d)和(e)。在一個實施方案中，該抗體具有特性(b)和(c) ； (b)、(c) 和(d)；或(b)，(c)，(d)和(e)。在一個實施方案中，該抗體具有特性(b)和(d) ； (b)和 (e)；或(b)、(d)和(e)。在一個實施方案中，該抗體具有特性(c)和(d) ； (c)和(e)；或 (c)、(d)和(e)。在一個實施方案中，該抗體具有特性(d)和(e)。在另一個實施方案中， 該抗體額外地具有在此說明的抗TLR3抗體的任何一種特性。在另一個實施方案中，在此任何一個實施方案的抗體能夠被在其表面上表達(dá)TLR3 多肽的細(xì)胞內(nèi)化。在本發(fā)明的任何一個方面的一個實施方案中，列于SEQ ID中的這些氨基酸序列包括一個、兩個、三個或更多個氨基酸取代。在另一個實施方案中，在本發(fā)明的任何一個實施方案中，該實施方案可以涵蓋一種氨基酸序列，該氨基酸序列與一個具體的SEQ ID NO中的氨基酸序列具有至少95 %、97 %、98 %、或99 %的一致性。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種單克隆抗-TLR3抗體，該抗體具有與選自下組的一種抗體相同的表位特異性，該組的組成為31C3J9H3、28F11、23C8以及34A3。在一個實施方案中，該抗體是嵌合體，例如含有一個非鼠類的，任選地一個人類的恒定區(qū)。在一個實施方案中，該抗體是人的或人源化的。在另一個實施方案中，該抗體是一種小鼠抗體。在另一個實施方案中，該抗體基本上不能結(jié)合到其他人類TLR(例如TLR4)上。在本發(fā)明的任何一個實施方案的一個方面中，該抗體的同種型是IgG，任選地是 IgGl或IgG3。在一個實施方案中，該抗體包括一個Fc結(jié)構(gòu)域或是被Fc γ R結(jié)合的一個同種型。在本發(fā)明的任何一個實施方案的一個方面中，該抗體是選自以下各項的一種抗體片段Fab、Fab' ,Fab' _SH、F(ab' ) 2、Fv、雙抗體、單鏈抗體片段、或包括多種不同抗體片段的一種多特異性的抗體。在本發(fā)明的任何一個實施方案的一個方面中，該抗體不包括一個Fc結(jié)構(gòu)域或是一種基本上不被Fc γ R結(jié)合的同種型。在一個實施方案中，該抗體是一種 IgG4或IgG2同種型。如實例中所證明的，本發(fā)明的抗體的F(ab' )2片段保留了它們在DC 中調(diào)節(jié)TLR3信號傳送的能力，并且因此被DC吸收(盡管它們?nèi)鄙貴c結(jié)構(gòu)域)。之前通常認(rèn)為，抗體可以至少部分地通過Fc受體介導(dǎo)的攝入(人類DC表達(dá)數(shù)種Fc γ受體(FcyR)， 包括I型(FcyRI、CD64)和II型(Fe YRII、CD32))進(jìn)入DC中內(nèi)體通道。不結(jié)合FCYR的同種型和形式可以調(diào)節(jié)DC中TLR3的發(fā)現(xiàn)使得開發(fā)抗體成為可能，這些抗體保留著所希望的特征、而沒有誘導(dǎo)不希望的去除表達(dá)TLR3的細(xì)胞的風(fēng)險(例如通過Fc γ R-介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒性)。例如，經(jīng)修飾以降低其Fc γ R結(jié)合的IgG4同種型或其他IgG同種型可以使用其有利的藥理特性，例如血清半衰期，同時在例如DC中調(diào)節(jié)TLR3信號傳送、而不誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在本發(fā)明的任何一個實施方案的一個方面中，抗TLR3抗體抑制了 TLR3信號傳送并且包括IgG4或IgG2同種型的一個恒定區(qū)。在本發(fā)明的任何一個實施方案的一個方面中，抗TLR3抗體抑制了 TLR3信號傳送并且包括基本上不結(jié)合Fc γ R的的一個恒定區(qū)。
在另一個實施方案中，該抗體連接或共價結(jié)合到一個可檢出的或毒性的部分上。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明的抗TLR3抗體的細(xì)胞，例如一種雜交瘤或重組體宿主細(xì)胞。在一個實施方案中，該細(xì)胞是克隆31C3、29H3、23C8、28F11或 34A3。在一個相關(guān)聯(lián)的方面中，本發(fā)明提供了一種雜交瘤，該雜交瘤包括a) —種來自非人類哺乳動物宿主的B細(xì)胞，該宿主已經(jīng)用一種抗原進(jìn)行了免疫，該抗原包括被31C3、29H3、 23C8、28F11或34A3抗體特異性識別的TLR3表位，融合到b) —種無限增殖化細(xì)胞上，其中該雜交瘤產(chǎn)生一種單克隆抗體，該單克隆抗體特異性結(jié)合到該表位上。在這些方面的一個實施方案中，該單克隆抗體結(jié)合到與抗體31C3、29H3、23C8、28F11或34A3相同的表位上。 任選地，該細(xì)胞產(chǎn)生一種抗體，該抗體具有抗體31C3、29H3、23C8、28F11或34A3的抗原結(jié)合區(qū)。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種測試抗體的方法，該方法包括以下步驟對抗體進(jìn)行測試以確定它是否
a)抑制了TLR3信號傳送，任選地不阻斷TLR3配體(例如dsRNA)結(jié)合到TLR3多肽上， 和/或
b)與31C3、29H3、23C8、28F11或34A3抗體競爭結(jié)合到TLR3多肽上，和/或
c)在酸性條件下、并且具體地是在細(xì)胞酸化亞細(xì)胞區(qū)室中所面對條件的代表性條件下 (例如約PH 5. 6，在約pH 4. 5至約6. 5之間)結(jié)合人類TLR3 ；任選地其中與中性條件下的結(jié)合相比，在酸性條件下對于TLR3的親和性并非顯著不同(例如減少)。任選地，該方法包括根據(jù)子步驟(a)和(b)、子步驟(a)和(C)、子步驟(b)和(C) 或子步驟(a)、(b)和(c)對抗體進(jìn)行測試。任選地，該方法進(jìn)一步包括在酸性條件下和/或與中性條件相比在親和性方面沒有降低時在以下情況下選擇抗體的一個步驟如果確定該抗體抑制TLR3信號傳送、如果確定該抗體與抗體31C3、29H3、23C8、28F11或34A3競爭結(jié)合到TLR3多肽上，和/或如果確定該抗體結(jié)合人類TLR3。任選地，對該抗體進(jìn)一步測試它在樹突細(xì)胞中調(diào)節(jié)例如抑制TLR3信號傳送的能力，并且如果確定在DC中該抗體調(diào)節(jié)TLR3信號傳送將其選出。任選地，對如此選出的抗體進(jìn)行選擇以用于治療或預(yù)防疾病(例如，抑制TLR3信號傳送的抗體可以用于炎性和自身免疫性障礙中)。任選地，產(chǎn)生了一定數(shù)量的如此選出的抗體(例如，在一種重組體宿主細(xì)胞中)。在另一個方面，本發(fā)明提供了在哺乳動物受試者體內(nèi)、具體是在人類受試者體內(nèi)產(chǎn)生一種特異性地結(jié)合到TLR3上的抗體的方法，所述方法包括以下步驟產(chǎn)生多種抗體 (例如，通過用包括TLR3多肽的免疫原來免疫一種非人類哺乳動物)；并且從所述多種抗體中選擇一種抗體，該抗體
a)抑制了TLR3信號傳送，任選地不阻斷TLR3配體(例如dsRNA)結(jié)合到TLR3多肽上， 和/或
b)與31C3、29H3、23C8、28F11或34A3抗體競爭結(jié)合到TLR3多肽上，和/或
c)在酸性條件下，并且具體地在細(xì)胞酸化亞細(xì)胞區(qū)室中所面對條件的代表性條件下 (例如約PH 5. 6，在約pH 4. 5至約6. 5之間)結(jié)合人類TLR3 ；任選地其中與在中性條件下的結(jié)合相比較，在酸性條件下對于TLR3的親和性并非顯著不同的(例如減少)。任選地，該方法包括根據(jù)子步驟(a)和(b)、子步驟(a)和(C)、子步驟(b)和(C)或子步驟(a)、(b)和(c)來選擇抗體。任選地，該方法進(jìn)一步包括選擇一種有能力在樹突細(xì)胞中調(diào)節(jié)例如抑制TLR3信號傳送的抗體，并且如果確定在DC中該抗體調(diào)節(jié)TLR3信號傳送則將其選出。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種對抗體進(jìn)行測試的方法，包括a)提供一種測試抗體；并且b)對所述測試抗體是否誘導(dǎo)細(xì)胞表面上TLR3的表達(dá)量降低進(jìn)行評估，c)如果所述抗體未誘導(dǎo)細(xì)胞表面上TLR3的表達(dá)量降低，選擇所述測試抗體作為用于治療一種疾病的候選物(例如在此披露的任何一種疾病)。在另一個方面，本發(fā)明提供了對抗體進(jìn)行測試的一種方法，包括a)提供一種測試抗體；b)在酸性條件下(例如在pH 5. 6下)對所述測試抗體的結(jié)合親和性進(jìn)行評估；并且c)如果在酸性條件下所述抗體具有結(jié)合親和性(例如，亞納摩爾親和性，與中性條件下相比親和性并未顯著降低等)，選擇所述測試抗體作為用于治療一種疾病的候選物。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種對抗體進(jìn)行測試的方法，包括a)提供一種測試抗體；b)對于在TLR3配體例如dsRNA的存在下所述測試抗體是否能夠結(jié)合TLR3蛋白進(jìn)行評估；并且c)如果在TLR3配體的存在下所述抗體能夠結(jié)合TLR3蛋白，則選擇所述測試抗體作為用于治療一種疾病的候選物。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種對抗體進(jìn)行選擇的方法，包括a)提供一種測試抗體；b)對于在炎性細(xì)胞因子例如IFNa的存在下所述測試抗體是否能夠結(jié)合TLR3蛋白進(jìn)行評估；并且c)選擇所述測試抗體作為用于治療一種疾病的候選物。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種對抗體進(jìn)行測試的方法，包括a)提供一種測試抗體；b)對所述測試抗體是否能夠被例如表達(dá)TLR3的細(xì)胞內(nèi)化進(jìn)行評估；并且c)如果所述抗體能夠被內(nèi)化，優(yōu)選地其中該抗體能夠例如在2小時內(nèi)迅速內(nèi)化，則選擇所述測試抗體作為用于治療一種疾病的候選物。在一個實施方案中，該疾病是一種炎性紊亂。在一個實施方案中，該疾病是一種癌癥。在一個實施方案中，所制備的這些抗體是單克隆抗體。在另一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括一個步驟，其中對所述抗體特異性地結(jié)合到人類TLR3多肽上的能力進(jìn)行評估。在一個實施方案中，對抗體結(jié)合到其他TLR家族成員上的能力進(jìn)行了評估。在另一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括制造所選的單克隆抗體片段或衍生物的步驟。在一個實施方案中，這些片段或衍生物選自下組，該組的組成為Fab、Fab' ,Fab' _SH、F(ab' )2、 Fv、雙抗體、單鏈抗體片段、包括多種不同抗體片段的多特異性的抗體、人源化抗體、以及嵌合體抗體。在另一個實施方案中，該非人類哺乳動物是一種小鼠。在另一個方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防病人體內(nèi)疾病的一種方法，包括將本發(fā)明的一種TLR3抗體給予該病人。在另一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括將一種適當(dāng)?shù)念~外的治療劑(例如具體是當(dāng)該TLR3抗體抑制TLR3信號傳送時)給予病人的步驟，可以從下組中選擇一種額外的試劑，該組的組成為免疫調(diào)節(jié)劑、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗生素、 抗炎劑等。特別是當(dāng)TLR3抗體被表達(dá)TLR3的細(xì)胞內(nèi)化和/或連接到一種毒素或細(xì)胞毒性藥物上以去除表達(dá)TLR3的細(xì)胞(例如，一種癌細(xì)胞)時，可以從下組中選出一種額外的試齊U，該組的組成為一種抗癌劑、一種細(xì)胞毒性試劑等。一方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防選自下組的一種疾病的方法，該組的組成為自身免疫性疾病、炎癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、感染、骨質(zhì)疏松癥、硬化(肝硬化，cirrhosis)以及膿毒癥，癌癥或在此考慮的其他疾病，該方法包括向需要它的病人給予一個治療有效量的抑制性TLR3抗體。將該抗體使用持續(xù)長以治療或預(yù)防所述疾病。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體可以用于診斷測定或更通常地用于體外檢測 TLR3多肽的任何測定。一方面，本發(fā)明提供了檢測TLR3多肽的一種體外方法(例如在生物樣品中)，包括使一種TLR3多肽(例如，表達(dá)TLR3多肽的一種細(xì)胞，一種純化的TLR3多肽、一種生物樣品等)與本發(fā)明的一種單克隆抗體相接觸，并且對該抗體結(jié)合到該TLR3多肽上進(jìn)行檢測?？梢栽诖说钠渌胤竭M(jìn)一步說明本發(fā)明的這些和額外的有利方面和特征。 附圖簡要說明

圖1顯示了髓樣DC上TLR3激活標(biāo)志物的抑制作用，圖IA ⑶86表達(dá)水平，圖IB IL-6分泌，圖Figure IC =IP-IO分泌。與對照相比較，所有圖都顯示抗體31C3抑制了 TLR3 配體誘導(dǎo)的應(yīng)答。圖2顯示了 MdDC上TLR3激活標(biāo)志物的抑制作用，圖2A ⑶86表達(dá)水平，圖2B IP-10分泌。與對照相比較，所有圖都顯示抗體抑制了 TLR3配體誘導(dǎo)的應(yīng)答。圖3顯示了將抗體31C3的F(ab)，2片段與純化的全31C3抗體(由“Pur”指示) 相比較，TLR3激活標(biāo)志物對髓樣DC的抑制作用。圖3A ⑶86表達(dá)水平，圖=IP-IO分泌。 這些圖顯示抗體31C3的F(ab) ’ 2片段抑制TLR3配體誘導(dǎo)應(yīng)答的效果與純化的全31C3抗體一樣好。圖4顯示了將抗體的F(ab)，2片段與純化的全抗體(由“Pur”指示) 相比較，TLR3激活標(biāo)志物對MdDC的抑制作用。圖4A ⑶86表達(dá)水平，圖4B =IP-IO分泌。 這些圖顯示抗體的F(ab)，2片段抑制TLR3配體誘導(dǎo)應(yīng)答的效果與純化的全抗
體一樣好。圖5顯示了結(jié)合親和性的比較，即與可商購的抗體相比較，根據(jù)本發(fā)明的抗體對 TLR3芯片具有更強(qiáng)的結(jié)合。圖6顯示在聚AU(—種針對TLR3受體的配體)存在或不存在下根據(jù)本發(fā)明的抗體結(jié)合到TLR3芯片上。該圖顯示本發(fā)明的抗體的結(jié)合并不阻斷dsRNA結(jié)合到TLR3 dsRNA 固定位點上。圖7顯示在TLR3芯片上的存在阻斷了 31C3的結(jié)合，并且反之亦然。這些結(jié)果往往顯示這兩種抗體競爭一個重疊的或高度相似的表位。圖8顯示人類TLR3蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的分子表面圖形(通過計算機(jī)模型設(shè)計而
產(chǎn)生)。圖9顯示在基于熒光素酶的報告基因活性093T-TLR3-ISRE)中針對TLR3信號傳送抑制作用的一個測定結(jié)果，其中熒光素酶的倍數(shù)增加指示為聚AU劑量的一個函數(shù)。簡言之，在報告基因測定中在抗TLR3抗體31C3存在下使用dsRNA TLR3促效劑來誘導(dǎo)TLR3信號傳送，并且對TLR3信號傳送進(jìn)行評估。與不具有TLR3抑制活性的對照性抗TLR3抗體相比較，抗體31C3以劑量依賴方式強(qiáng)烈地抑制TLR3信號傳送。圖IOA顯示了與對照物(無Ab 空心圓點)相比較，使用293T-TLR3熒光素酶測定法，用根據(jù)本發(fā)明的商品化TLR3. 7抗體(黑色圓點)、28F11 (空心三角形)、23C8 (空心正方形)以及31C3(黑色正方形)抗體對TLR3信號傳送的劑量依賴性抑制。圖IOB顯示了在一個測定中與31C3 (黑色正方形s)、23C8和34A3 (黑色三角形)抗體相比較得到的相
同結(jié)果。圖11顯示與無抗體(黑色圓點)的情況相比較，在不同條件下31C3(空心正方形)或23C8 (黑色正方形)抗TLR3抗體的作用。IP-10分泌作用在坐標(biāo)軸上以ng/ml指示，添加的dsRNA的劑量在軸線上以yg/ml指示。圖IlA表示在標(biāo)準(zhǔn)條件下(無預(yù)激活) TLR3信號傳送的抑制作用。圖IlB表示用聚AU進(jìn)行預(yù)刺激的TLR3信號傳送的抑制作用。 圖IlC表示用IFNa進(jìn)行預(yù)刺激的TLR3信號傳送的抑制作用。圖12顯示了動力學(xué)測定的結(jié)果。圖12A以ng/ml表示針對31C3抗體的IP-10分泌作用(取決于聚AU劑量)，圖12B表示23C8抗體的結(jié)果。在dsRNA之前1小時30分鐘 (黑色交叉)、同時(黑色加號“ + ”)、或在dsRNA之后1小時30分鐘(空心方形)將TLR3 mAb加入介質(zhì)中，dsRNA單獨(黑色圓點)提供作為陽性對照。圖13顯示了在體外表達(dá)TLR3的細(xì)胞中通過31C3 mAb特異性識別人類TLR3。對于HEK 對照細(xì)胞以及用人類TLR3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示了用31C1 mAb進(jìn)行細(xì)胞內(nèi) FACS染色的直方圖。未染色代表用對照同種型IgGl得到的熒光強(qiáng)度范圍。圖14顯示了在髓樣DC上TLR3誘導(dǎo)的激活標(biāo)志物以及細(xì)胞因子分泌的抑制作用， 圖14A IP-10分泌作用，圖Figure 14B ⑶86表達(dá)水平。所有圖形都顯示與對照物相比較， 抗體31C3(黑色圓點)、28F11 (黑色三角形)以及23C8(黑色方形)(在此以50 μ g/ml劑量顯示)抑制了 TLR3配體誘導(dǎo)的應(yīng)答。圖15A和15B顯示了根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合親和性。圖15A顯示了與可商購的 (即TLR3. 7)抗體相比較，根據(jù)本發(fā)明的抗體對于TLR3芯片具有更強(qiáng)的結(jié)合。圖15B顯示當(dāng)所述芯片之前已經(jīng)用31C3抗體飽和時，根據(jù)本發(fā)明的抗體結(jié)合到TLR3芯片上。組圖15A 和15B中給出的結(jié)合水平比較說明了當(dāng)該芯片之前已經(jīng)用31C3抗體飽和時，根據(jù)本發(fā)明的抗體與hTLR3的結(jié)合受到破壞，相反地，在31C3抗體存在或不存在下商品化的TLR3. 7抗體保持相同的結(jié)合水平。圖16A和16B顯示在聚AU (—種用于TLR3受體的配體)存在或不存在下根據(jù)本發(fā)明的^F11、34A3和23C8抗體結(jié)合到TLR3芯片上。這些圖形顯示本發(fā)明的抗體結(jié)合并不阻斷dsRNA結(jié)合到TLR3 dsRNA固定位點上。圖17顯示34A3抗體單獨結(jié)合到rhTLR3上(實線)或結(jié)合到用31C3飽和的芯片上(虛線)。該圖顯示了這兩個抗體與31C3競爭結(jié)合到hTLR3上。圖18顯示了根據(jù)本發(fā)明的抗體的⑶R的系統(tǒng)樹。圖18A顯示用于輕鏈⑶R的系統(tǒng)樹，并且圖18B顯示了用于重鏈⑶R的系統(tǒng)樹。這些圖形顯示在抗體^Fll ( . 2)、 31C3(31)和2308 之間存在著高度CDR同源性，并且表示在氨基酸序列方面23H3 Q9) 和34A3(34)具有更多差異。圖19A和B顯示了在髓樣DC上由!34A3抗體抑制了 TLR3激活標(biāo)志物。圖19A IP-10分泌作用，圖19B JL-6分泌作用。所有圖都顯示與對照物(無Ab-空心圓點)和 31C3(黑色方形，作為陽性對照)相比較，抗體34A3(黑色三角形)抑制了 TLR3配體誘導(dǎo)的應(yīng)答。圖20顯示了如實例8中說明的內(nèi)化作用測定的FACS分析。圖20A表示陰性對照，表示在缺少連接TLR3蛋白的抗體下^3T-ISRE/TLR3細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)熒光。圖20B是陽性
15對照，指示在^3T-ISRE/TLR3細(xì)胞系中TLR3的表達(dá)水平。圖20C和D對應(yīng)地表示在M小時和2小時孵育之后與31C3偶聯(lián)的TLR3蛋白的比例。圖20D和20F顯示了與圖20B相比較類似的熒光，證實了 TLR3被抗體31C3結(jié)合并未下調(diào)TLR3在^3T_ISRE/TLR3細(xì)胞系上的表達(dá)。圖2IA和2IB顯示在聚AU (—種用于TLR3受體的配體)存在或不存在下根據(jù)本發(fā)明的^F11、34A3和23C8抗體結(jié)合到TLR3芯片上。這些圖形顯示本發(fā)明的抗體的結(jié)合并不阻斷dsRNA結(jié)合到TLR3dsRNA固定位點上。
發(fā)明詳細(xì)說明介紹本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生和使用抗體并且特別是適合用于預(yù)防和治療多種紊亂 (例如自身免疫障礙、炎癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、硬化、骨質(zhì)疏松癥、感染、癌癥以及膿毒癥)的調(diào)節(jié)TLR3的抗體的新方法?？贵w、抗體衍生物、抗體片段、以及產(chǎn)生它們的細(xì)胞也涵蓋在內(nèi)，同樣也涵蓋了產(chǎn)生以上物質(zhì)的方法以及使用這些抗體和化合物來治療或診斷病人的方法。盡管在抗體中高親和性是令人希望的，但通常據(jù)報告親和性在高皮摩爾至低納摩爾范圍內(nèi)的全部抗體在體外已經(jīng)是親和性成熟的?？茖W(xué)文獻(xiàn)已經(jīng)提出存在著IOOpM的體內(nèi)親和性上限，并且提出其出現(xiàn)可能是因為在正常免疫應(yīng)答期間產(chǎn)生對抗原具有超過所估計上限的親和性的抗體的B細(xì)胞將不具有選擇性優(yōu)勢。然而，存在著高親和性抗體的實例，包括抗-TNF-α抗體“TSK114”，它以約5.3pM結(jié)合親和性(K(D))結(jié)合到人類TNF-α上，據(jù)稱它比臨床上相關(guān)的英利昔單抗(Remicade)和阿達(dá)木單抗(Humira)mAbs的結(jié)合親和性高約 1000 倍和 100 倍(宋(Song)等人在(2008) Exp. Mol. Med. 40(1) :35-42)。有可能的是高親和性抗體的獲得取決于抗原，而現(xiàn)今可得到的TLR3抗體最多顯示納摩爾親和性。然而本發(fā)明的抗-TLR3抗體證明了非常高的親和性(高至10皮摩爾，并且大于100皮摩爾，包括在中性和酸性條件下保持這類親和性的兩種抗體)。本發(fā)明至少部分是基于以下發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)于酸化內(nèi)體區(qū)室中所面對條件對應(yīng)的酸性條件下單克隆抗體特異性地并且有效地結(jié)合TLR3。在所評估的多種抗體中，存在著某些抗體在酸性條件下以高親和性保持結(jié)合到TLR3上，而其他抗體例如可商購的那些抗體以及針對TLR3結(jié)合或TLR3調(diào)節(jié)而選擇的其他抗體失去了親和性(盡管最初展示對TLR3較高(例如，高出2-1Μ1(ι)的親和性)，和/或甚至在中性條件下具有低親和性。所使用的酸性條件是PH 5. 6，這類似于在酸化內(nèi)體區(qū)室中觀察到的情況，相應(yīng)于據(jù)信在炎性病癥中發(fā)生TLR3信號傳送的條件。通常，已知酸性條件影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并且影響蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。例如， 已知的是在內(nèi)體的酸性條件下未結(jié)合到其他肽上的MHC II類肽被迅速降解。然而，在本文中，抗體在PH 5. 6的酸性條件下失去其與固定的TLR3的高結(jié)合親和性之前已經(jīng)在酸性條件下(PH 3)進(jìn)行了純化。不希望被理論束縛，這表明失去結(jié)合親和性并不是由于酸性條件下抗體的內(nèi)在不穩(wěn)定性(降解)，而是因為抗體與它們的靶抗原之間相互作用的改變。據(jù)信由于ρΗ改變而引起的抗體-TLR3相互作用的改變影響了 dsRNA與TLR3的相互作用，因為僅在酸性PH下TLR3配體poly (I-C)結(jié)合并且激活TLR3。多項研究已報告 poly(I-C)(以及其他dsRNA)在中性ρΗ下在正靜電勢的TLR3區(qū)域中結(jié)合TLR3，在酸性條件下(S卩，在PH 4. 5至6. 5的范圍內(nèi)，或約5. 6的酸性條件)可能經(jīng)歷靜電勢的改變。然而， 本發(fā)明的抗體據(jù)信結(jié)合了一個表位，當(dāng)環(huán)境被酸化時該表位未經(jīng)歷靜電勢的顯著改變(或經(jīng)歷比例如正靜電勢的區(qū)域更小的改變)，這樣使得這些抗體的結(jié)合親和性基本上保持不變。一方面，其自身就可以顯示針對TLR3的抗體親和性，因為與在中性條件下相比較，在酸性條件下這些抗體不沒有顯著不同(更低和/或更高)的結(jié)合人類TLR3的親和性(例如， 其中結(jié)合到TLR3上的Kd相差不超過0. 2-,0. 3-,0. 4-,0. 5-,1. 0_、或1. 5-log10)。對于抗體31C3和而言，在酸性和中性條件下結(jié)合到TLR3上的Kd相差小于0. 5-log1(1。據(jù)信在中性PH下本發(fā)明的抗體所結(jié)合的表位具有負(fù)靜電勢。TLR3蛋白表面上的負(fù)性、正性或中性的靜電勢區(qū)域示于圖8中或也示于Choe et al. (2005) kience309 :581-585的圖OT中， 其披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。通過干擾dsRNA配體結(jié)合到TLR3上而抑制TLR3的抗體將有可能結(jié)合到TLR3未糖基化表面上C端附近的正性或中性的靜電勢區(qū)域上，并且因此結(jié)合在TLR3的一個區(qū)域中，該區(qū)域經(jīng)歷了靜電勢的較大改變，與此同時本發(fā)明的抗體似乎結(jié)合到不涉及結(jié)合dsRNA配體的TLR3的一個區(qū)域上，盡管如此例如通過抑制TLR3采取最終傳導(dǎo)信號所需要的一種構(gòu)象而保留了抑制TLR3蛋白信號傳送的能力。本發(fā)明至少部分地還基于高親和性的單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)，這些抗體特異性地并且有效地抑制TLR3信號傳導(dǎo)途徑。諸位發(fā)明人已經(jīng)鑒別出存在于人類TLR3上的表位，包括由抗體31C3、29H3、23C8、28F11或34A3識別的表位，這些抗體在抑制TLR3信號傳送方面、 并且在抑制響應(yīng)于用TLR3配體刺激而所致的細(xì)胞因子釋放方面是特別有效的。本發(fā)明中抑制TLR3信號傳送的抗體在治療和/或抑制自身免疫性疾病、炎性疾病以及其他抑制TLR3信號傳送有益的疾病方面將是特別有用的。自身免疫性疾病和炎性疾病是由于對抗通常存在于體內(nèi)的物質(zhì)和組織的身體過度激活的免疫應(yīng)答。在自身免疫性疾病和炎性疾病這兩方面，這些病癥通過人體適應(yīng)性或先天免疫系統(tǒng)的異常反應(yīng)而產(chǎn)生。在自身免疫性疾病方面，病人的免疫系統(tǒng)被激活對抗機(jī)體自身的蛋白。在炎性疾病方面(包括可以導(dǎo)致炎性病癥的感染)，它是免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng)，以及其隨后的下游信號傳送(TNF，IFN等)，這引發(fā)了很多問題。這些自身免疫性疾病是由于識別自身抗原并且介導(dǎo)組織破壞的T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖。很長時間以來，病毒感染被懷疑激發(fā)或明顯地參與了自身免疫性疾病。在蘭(Lang)等人在(J. Clin. Invest. 116 =2456-2463,2006)中，已經(jīng)證明這些病毒可以通過另一種機(jī)制啟動自身免疫損傷。近來已經(jīng)確認(rèn)dsRNA 是 TLR3 的配體(Alexoupoulou 等人在 Q001) ,Nature 413 732-738)，并且最近還已經(jīng)更多地顯示出從損傷組織或多種組織中釋放的RNA還可能作為 TLR3配體來起作用(Kariko等人在^)04) J. Biol. Chem.)。通過免疫復(fù)合物內(nèi)TLR內(nèi)源性RNA配體不適當(dāng)?shù)丶せ頣LR幾乎確定地是造成多種炎性疾病和自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)理的一個重要因素。近期的文章表明了 TLR3對炎性疾病(Cavassani等人于2008年)的作用，因為在膿毒癥或自身免疫性疾病期間觀察到TLR3配體放大了高炎性應(yīng)答、這些自身免疫性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Bokarewa等人在Q008)Eur J. Immunol.)、全身性紅斑狼瘡(Rahman 等人在(2006) Springer Sem. inlmmunopathol)以及糖尿病(自然雜志(Nature 皿6(1)，2005年)。還已經(jīng)報道TLR3可以在病毒感染方面(例如^festern Reserve牛痘苗病毒)出現(xiàn)有害作用，其中TLR3有助于病毒復(fù)制、有害的肺部炎癥、以及白細(xì)胞募集到肺中， 造成死亡率增加；或在西尼羅病毒(WNV)方面出現(xiàn)有害作用，其中TLR3允許病毒越過血腦屏障(BBB)并且引起致命性腦炎。在相應(yīng)于內(nèi)體(例如，像在髓樣DC中)中條件的pH條件下抑制TLR3的本發(fā)明的抗體在治療和預(yù)防這些病癥方面將是有用的，包括但不限于病毒感染其本身以及由病毒感染所引起或增強(qiáng)的病癥(例如自身免疫性病癥或炎性病癥)。Zorde-Khvalevsky等人在Q009)H印atology 49報道了在缺少TLR3時在肝部分切除之后肝細(xì)胞細(xì)胞增殖加速，而IL-6和可溶性白細(xì)胞介素-6受體(SIL-6R)的水平顯著地降低，并且進(jìn)一步地在肝部分切除之后在肝細(xì)胞中誘導(dǎo)TLR3信號傳送，導(dǎo)致了 NF-kB的激活，并且在枯否(Kupffer)細(xì)胞中激活的TLR3的存在抑制了 NF_kB的激活。因此，發(fā)現(xiàn) TLR3信號傳送減弱了肝再生的啟動；因此本發(fā)明的抗TLR3抗體可以用于誘導(dǎo)肝再生的方法中，具體地是用于治療和預(yù)防涉及肝損傷的疾病(例如硬化)或已知引起諸如酒精中毒、 乙型肝炎或丙型肝炎感染或脂肪肝疾病的肝損傷疾病。金姆(Kim)等人在Q009) Immunol. Lett中報道了 TLR3在RA滑膜中通過刺激人類單核細(xì)胞直接促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、以及通過在RA-FLS中間接地誘導(dǎo)RANKL表達(dá)，以直接和間接的方式促進(jìn)破骨細(xì)胞形成。在RA滑膜中RANKL的表達(dá)促進(jìn)了破骨細(xì)胞的分化，并且 RANKL抗體在治療骨質(zhì)疏松癥方面抗(狄諾塞麥(denosumab)，安進(jìn)(Amgen)公司)是有效的。因此，本發(fā)明的抗-TLR3抗體可以用來治療和預(yù)防炎性骨組織破壞，例如骨質(zhì)疏松癥 (特別地是在RA病人體內(nèi))。Wen等人在Q004)J. Immunol. 172 :3172-3180表明可以通過一種病毒樣刺激物來誘導(dǎo)自身免疫性疾病，并且鑒別TLR3能夠介導(dǎo)治療這樣的誘導(dǎo)作用。這些結(jié)果表明聚IC與胰島素一起、而并非單獨使用胰島素或其他TLR配體(CpG、LPS、PGN)在小鼠模型中能夠誘導(dǎo)自身免疫性糖尿病以及胰島的凋亡。此外，與其他TLR相比較，在所有個體體內(nèi)TLR3顯示出最高的表達(dá)水平。因此，本發(fā)明的抗-TLR3抗體可以用來治療和預(yù)防糖尿病以及胰島素自身免疫性疾病。在酸性條件下結(jié)合TLR3的本發(fā)明的抗體通常會以高親和性結(jié)合細(xì)胞表面TLR3以及內(nèi)體TLR3，這樣使得這些抗體在任何靶向TLR3(例如調(diào)節(jié))有用的情況下(例如，治療或預(yù)防疾病)將是有用的。在一些炎癥病例中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TLR3位于巨噬細(xì)胞表面并且當(dāng)氯喹中和內(nèi)體酸化作用時阻斷了 TLR3，盡管如此TLR3還是展示了一定的抗炎活性(Cavassani 等人于2008年，同上)。然而，本發(fā)明的抗體在治療或預(yù)防疾病方面與其他抗體相比將具有最大的優(yōu)點，對于這些疾病在細(xì)胞溶膠(例如內(nèi)體)區(qū)室中調(diào)節(jié)(例如，抑制)TLR3信號傳送是有用的或需要的，并且調(diào)節(jié)這些區(qū)室的TLR3信號傳送的相對重要程度可以取決于疾病情況。這種疾病的一個實例是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；內(nèi)體區(qū)室表達(dá)的TLR3據(jù)信在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中起重要作用，因為用氯喹(一種內(nèi)體酸化作用的抑制劑)治療抑制了 TLR3信號傳送并且抑制了從來自患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人的滑液培養(yǎng)物中生成炎性細(xì)胞因子(圣心 (Sacre)等人在O008) J. Immunol. 181 =8002-8009)。內(nèi)體區(qū)室表達(dá)的TLR3據(jù)信在多種其他疾病中起重要作用，在這些疾病中DC (例如髓樣DC)涉及疾病惡化，因為mDC具有良好證明的從凋亡或壞死細(xì)胞中吸收抗原的能力(包括組織壞死期間急性炎癥期間)。因為本發(fā)明的抗體對于TLR3是特異性的，它們還可以用于其他目的，包括純化 TLR3或表達(dá)TLR3的細(xì)胞，在體外、離體或體內(nèi)調(diào)節(jié)(例如，激活或抑制)TLR3受體，靶向表達(dá)TLR3的細(xì)胞以進(jìn)行體內(nèi)破壞，或在體內(nèi)、離體或體外地特異性地標(biāo)記/結(jié)合TLR3，包括用于多種方法，例如免疫印跡法、IHC分析、即在冰凍活檢、FACS分析、以及免疫沉淀作用上。定義如在此使用的，“TLR3配體”是指可以在體外、離體或體內(nèi)特異性地結(jié)合到TLR3上并且改變其活性的任何化合物。該化合物可以是一種天然發(fā)生的配體(例如通常是dsRNA 或病毒dsRNA)或一種合成的配體(例如聚IC或聚AU)。該化合物可以是任何類型的分子， 包括無機(jī)或有機(jī)的化合物或元素，例如蛋白質(zhì)(例如抗體)、核酸、碳水化合物、脂類、或任何其他分子實體。另外，這類化合物能夠以任何方式(包括激活或抑制)、并且通過任何機(jī)理(包括以類似于一種天然發(fā)生的配體的方式通過結(jié)合到受體上并且觸發(fā)或關(guān)閉活性、或通過結(jié)合到受體上并且阻斷與其他配體接觸)來調(diào)節(jié)TLR3受體。優(yōu)選地，該配體激活該受體，并且以此狀態(tài)可以用于誘導(dǎo)表達(dá)TLR3的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。如在此使用的術(shù)語“抗體”是指多克隆抗體和單克隆抗體。取決于重鏈中恒定區(qū)的類型，抗體可以指定為以下五個大類中的一種IgA、IgD、IgE、IgG，以及IgM。這些中有幾個被進(jìn)一步分成亞類或同種型，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等。一種示例性的免疫球蛋白 (抗體)結(jié)構(gòu)單元包括一種四聚物。每個四聚體是由兩個相同對的多肽鏈組成的，每一對具有一個“輕鏈”(約25kDa)和一個“重”鏈(約50-70kDa)。每個鏈的N端定義了具有約 100至110個或更多個氨基酸的一個可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識別。術(shù)語可變的輕鏈和可變的重鏈(Vh)對應(yīng)地是指這些輕鏈和重鏈。對應(yīng)于不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)被對應(yīng)地稱為“ α ”、“ δ ”、“ ε ”、“ Y ”以及“ μ ”。不同類別的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。IgG和/或IgM是本發(fā)明中所采用的優(yōu)選類別的抗體，其中IgG是特別優(yōu)選的，因為它們是在生理狀況下最常見的抗體，并且因為它們在實驗室條件下最易于制備。 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體是一種單克隆抗體。特別優(yōu)選地是人源化的、嵌合體的、人類的、或在其他方面人類適合的抗體。“抗體”還包括在此說明的任何一種抗體的任何一種片段或衍生物。術(shù)語“特異地結(jié)合到”是指優(yōu)選地在一種競爭性結(jié)合測定法中一種抗體可以結(jié)合到結(jié)合配偶體上(例如TLR3)，正如使用重組體形式的蛋白、其中的表位、或存在于分離的靶細(xì)胞的表面上的天然蛋白所評估。用于確定特異性結(jié)合的競爭性結(jié)合測定法以及其他方法在以下進(jìn)行進(jìn)一步說明，并且在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。當(dāng)一種抗體據(jù)稱與一種特定的單克隆抗體(例如31C3、29H3、23C8、28F11或 34A3) “競爭”時，這是指在一個結(jié)合測定法中該抗體使用重組體TLR3分子或表面表達(dá)的 TLR3分子與該單克隆抗體競爭。例如，如果在一個結(jié)合測定中一種測試抗體降低了 31C3、 29H3、23C8、28F11或34A3結(jié)合到TLR3多肽或表達(dá)TLR3的細(xì)胞上，則該抗體被稱對應(yīng)地與 31C3、29H3、23C8、28F11 或 34A3 “競爭”。如在此使用的術(shù)語“親和性”是指一種抗體結(jié)合到一個表位上的強(qiáng)度。一種抗體的親和性通過解離常數(shù)Kd (定義為[Ab] χ [Ag]/[Ab-Ag])給出，其中[Ab-Ag]是抗體-抗原復(fù)合體的摩爾濃度，[Ab]是未結(jié)合的抗體的摩爾濃度，并且[Ag]是未結(jié)合的抗原的摩爾濃度。親和常數(shù)Ka被定義為Ι/Kd。用于確定mAb親和性的優(yōu)選的方法可以在以下文獻(xiàn)中找至丨J 哈洛(Harlow)等人，抗體(Antibodies)實驗指南(A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(ColdSpring Harbor)，紐約(N. Y.)，1988年)，Coligan等人編輯，CurrentProtocols in Immunology，格林(Greene) 出版聯(lián)合和威力出版公司(WileyInterscience)，紐約(N. Y.), (1992年，1993年)以及
19Muller,Meth. Enzymo 1. 92 :589-601 (1983)，這些參考文獻(xiàn)通過引用將其整體結(jié)合在此。本領(lǐng)域所熟知的用于確定mAb親和性的一種優(yōu)選并且標(biāo)準(zhǔn)的方法是使用Biacore (生物分子相互作用分析儀)儀器。在本發(fā)明的上下文中，“決定簇”指明多肽上相互作用或結(jié)合的一個位點。術(shù)語“表位”被定義為一種抗原決定簇，并且是結(jié)合了抗體的抗原上的區(qū)或區(qū)域。 一個蛋白表位可以包括直接涉及結(jié)合的氨基酸殘基以及被特異性抗原結(jié)合抗體或肽有效地阻斷的氨基酸殘基(即抗體“足跡”內(nèi)的氨基酸殘基)。只有復(fù)合抗原分子上最簡單的形式或最小的結(jié)構(gòu)區(qū)域可以與例如一種抗體或一種受體結(jié)合。表位可以是直鏈或構(gòu)象性的/ 結(jié)構(gòu)性的。術(shù)語“直鏈的表位”被定義為由多個氨基酸殘基組成的一個表位，這些氨基酸殘基在氨基酸的線性順序上(一級結(jié)構(gòu))是連續(xù)的。術(shù)語“構(gòu)象性表位或結(jié)構(gòu)性表位”被定義為由氨基酸殘基構(gòu)成的一個表位，這些氨基酸殘基不全是連續(xù)性的，并且因此表示了通過分子折疊(二級、三級和/或四級結(jié)構(gòu))而彼此鄰近的氨基酸線性序列的分離的部分。構(gòu)象性表位取決于三維結(jié)構(gòu)。因此，術(shù)語“構(gòu)象性”通常與“結(jié)構(gòu)性”可互換地使用。提及“免疫原片段”，在此它是指能夠引發(fā)例如以下免疫應(yīng)答的任何一種多肽片段或肽片段(i)產(chǎn)生結(jié)合所述片段的抗體和/或結(jié)合包括所述片段的任何形式的分子的抗體，這些分子包括膜結(jié)合的受體以及從中衍生的突變體，( )刺激T細(xì)胞應(yīng)答，該應(yīng)答涉及 T細(xì)胞與包括任何一種MHC分子以及從所述片段衍生的一種肽的雙分子復(fù)合體反應(yīng)，(iii) 結(jié)合轉(zhuǎn)化的載體，例如噬菌體或表達(dá)對哺乳動物免疫球蛋白進(jìn)行編碼的基因的細(xì)菌。可替代地，免疫原片段還指能夠引發(fā)如以上定義的免疫應(yīng)答的任何一種結(jié)構(gòu)，例如通過共價連接而連接到一種載體蛋白上的肽片段、氨基酸序列中包括所述肽片段的一種嵌合體重組體多肽構(gòu)建體，并且尤其地包括用一種cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，該cDNA序列包括對所述片段進(jìn)行編碼的一個部分?！岸拘浴被颉凹?xì)胞毒性”肽或小分子涵蓋了可以減慢、停止或逆轉(zhuǎn)細(xì)胞增殖、以任何可檢出的方式降低其活性、或直接或間接地將其殺死的的任何一種化合物。優(yōu)選地，毒性或細(xì)胞毒性化合物通過直接地殺死這些細(xì)胞、通過引起凋亡或其他方式來起作用。如在此使用的，毒性“肽”可以包括任何一種肽、多肽、或這類物質(zhì)的衍生物，包括具有非天然氨基酸或修飾連接的肽衍生物或多肽衍生物。毒性“小分子”可以包括任何一種毒性化合物或元素,優(yōu)選地其大小為小于 1 OkD、5kD、1 kD、750D、600D、500D、400D、300D、或更小?！叭祟愡m用的”抗體是指可以安全地用于人體、用于例如在此說明的治療方法的任何一種抗體、衍生的抗體、或抗體片段。人類適用的抗體包括所有類型的人源化的、嵌合體的、或完全人類抗體，或以下任何抗體，在這些抗體中至少有一部分抗體是從人類衍生的或通過其他方式進(jìn)行了修飾，從而避免了當(dāng)使用天然的非人類抗體而經(jīng)常引起的免疫應(yīng)答。為了本發(fā)明的目的，“人源化”或“人類的”抗體是指一種抗體，其中一種或多種人類免疫球蛋白的恒定和可變框架區(qū)與一種動物免疫球蛋白的結(jié)合區(qū)(例如CDR)相融合。 這類抗體被設(shè)計成保持衍生出這些結(jié)合區(qū)的非人類抗體的結(jié)合特異性，但是卻要避免對抗非人類抗體的免疫反應(yīng)。這類抗體可以從轉(zhuǎn)基因小鼠或其他動物體內(nèi)得到，這些小鼠或動物已經(jīng)被“工程化”從而產(chǎn)生響應(yīng)于抗原激發(fā)的特異性人類抗體(參見，例如，Green等人在(1994) Nature Genet 7 :13 ；郎博格(Lonberg)等人在(1994)《自然》(Nature) 368 856 ;Taylor等人在(1994Πη Immun 6 :579，其全部傳授內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。還可以通過遺傳學(xué)或染色體轉(zhuǎn)染方法、以及噬菌體展示技術(shù)來構(gòu)建完全人類抗體，所有這些在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的(參見，例如，McCafferty等人(1990)《自然》(Nature) 348 :552-553)。 還可以通過體外刺激的B細(xì)胞來產(chǎn)生人類抗體(參見，例如，美國專利號5，567,610以及 5，229，275，它們通過引用以其全部內(nèi)容結(jié)合在此)?！扒逗象w抗體”是一種抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或它的一個部分被改變、替換或交換，這樣使得該抗原結(jié)合位點(可變區(qū))連接到一個不同的或改變的類別、效應(yīng)物功能和 /或種類的恒定區(qū)上或為該嵌合體抗體提供新特性的一種完全不同的分子上，例如一種酶、 毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區(qū)或它的一個部分用具有一種不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)來改變、替換或交換。術(shù)語“Fe結(jié)構(gòu)域“、” "Fe部分”以及“Fe區(qū)”是指一條抗體重鏈的C端片段，例如從氨基酸約(aa)230至約aa 450的人類、重鏈或它在其他類型的抗體重鏈中(例如針對人類抗體的α、δ、ε以及μ)的對應(yīng)物序列，或它的一種天然發(fā)生的同種異型。除非另外說明，否則貫穿本披露使用了針對免疫球蛋白通常所接受的Kabat氨基酸編號(參見卡巴特(Kabat)等人在(1991) Sequences of Protein of Immunological Interest，第 5 片反，美國公共衛(wèi)生署，國立衛(wèi)生研究院，貝塞斯達(dá)市，馬里蘭州)。術(shù)語“分離的”、“純化的，，或“生物純的，，是指基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含有如在其天然狀態(tài)下所發(fā)現(xiàn)的通常伴隨它的組分的材料。典型地使用分析化學(xué)技術(shù)例如聚丙烯酰胺凝膠電泳法或高效液相色譜法來確定純度和均勻性。制劑中存在的主要類型的蛋白基本上是純的。術(shù)語“多肽”、“肽”以及“蛋白”在此可以互換地使用，指多個氨基酸殘基的聚合物。 這些術(shù)語應(yīng)用到氨基酸聚合物上，其中一個或多個氨基酸殘基是對應(yīng)的天然發(fā)生氨基酸的一種人工化學(xué)模擬物，并且應(yīng)用到天然發(fā)生的氨基酸聚合物以及非天然發(fā)生的氨基酸聚合物上。當(dāng)涉及例如細(xì)胞、或核酸、蛋白、或載體使用時，術(shù)語“重組體”指示該細(xì)胞、核酸、 蛋白或載體已經(jīng)通過引入一種異源核酸或蛋白，或改變一種天然核酸或蛋白而進(jìn)行修飾， 或指示該細(xì)胞是從這樣修飾的一種細(xì)胞衍生的。因此，例如，這些重組體細(xì)胞表達(dá)在細(xì)胞的天然形式(非重組體)中未發(fā)現(xiàn)的基因或表達(dá)以其他方式異常表達(dá)的、低表達(dá)的或根本不表達(dá)的天然基因。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“結(jié)合”一種共同決定簇的抗體表明一種抗體，該抗體以特異性和/或親和性結(jié)合所述決定簇。
產(chǎn)生抗-TLR3抗體本發(fā)明的抗體特異性地結(jié)合TLR3。此外，在相應(yīng)于酸化內(nèi)體區(qū)室中所要面對的條件的酸性條件下本發(fā)明的抗體結(jié)合TLR3。此外，本發(fā)明的抗體能夠抑制TLR3信號傳導(dǎo)途徑。抑制性抗體特異性地抑制TLR3信號傳導(dǎo)途徑的能力使它們用于多種應(yīng)用，具體地是用于治療或預(yù)防抑制TLR3信號傳導(dǎo)途徑是令人希望的疾病，即避免如在此說明的進(jìn)一步的細(xì)胞因子和趨化因子分泌以及細(xì)胞激活。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體結(jié)合人類TLR3，并且與單克隆抗體31C3、29H3、23C8、28F11或!34A3競爭結(jié)合到人類TLR3上。通過于2009年7月3日保存在法國巴黎F-75724D0cteur路25號巴斯德研究所國家微生物菌種保藏中心(CNCM)，編號CNCM 1-4187下的31C3. 1的細(xì)胞產(chǎn)生抗體31C3。通過于2009年7月3日保存在法國巴黎F-75724 Docteur路25號巴斯德研究所國家微生物菌種保藏中心(CNCM)，編號CNCM 1-4187下的7的細(xì)胞產(chǎn)生抗體^H3?！癟LR3”、“TLR3多肽”以及“TLR3受體”，可互換使用，在此用來指Toll樣受體 3 (Toll樣受體(TLR)家族的一個成員)。人類TLR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO :1中 (NCBI登錄號NP_003256，其披露的內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。在NCBI登錄號NM_003265中說明了人類TLR3mRNA序列。在PCT專利公開號WO 98/50547中也說明了人類TLR3序列， 其披露的內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。一方面，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與單克隆抗體31C3、29H3、23C8、28F11或 34A3競爭，并且識別與單克隆抗體31C3、29H3、23C8、28F11或34A3基本上或?qū)嵸|(zhì)上相同或相同的TLR3分子上的表位或“表位位點”，結(jié)合到它們上，或針對它們具有免疫特異性。在其他實施方案中，該單克隆抗體由抗體31C3、29H3、23C8、28F11或34A3組成或是它的一種衍生物或片段。應(yīng)當(dāng)理解的是，盡管優(yōu)選的抗體結(jié)合到與抗體31C3、29H3、23C8、28F11或34A3相同表位上，本發(fā)明的抗體可以識別TLR3多肽的任何一個部分并且對抗它而產(chǎn)生。例如， TLR3的任何一個片段(優(yōu)選地但并非專一指人類TLR3，或TLR3片段的任何組合)可以用作抗原來產(chǎn)生抗體，并且本發(fā)明的抗體可以識別TLR3多肽內(nèi)任何一個位置處的表位，只要它們能夠在表達(dá)TLR3的細(xì)胞上(例如如在此說明的MdDC或MoDC)這樣作用即可。在一個實施方案中，所識別的表位存在于細(xì)胞表面上，即它們可以接近存在于細(xì)胞之外面的抗體。 最優(yōu)選地，該表位是被抗體31C3、29H3、23C8、28F11或34A3特異性識別的表位。另外，識別TLR3內(nèi)獨特表位的抗體可以組合地用于例如以不同個體之間最大效能以及寬度結(jié)合到 TLR3多肽上?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)來產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。典型地，它們可以通過用一種免疫原來免疫一種非人類動物(優(yōu)選小鼠)，該免疫原包括一種TLR3多肽，優(yōu)選一種人類TLR3多肽。T這種LR3多肽可以包括一種人類TLR3多肽的全長序列，或它的一個片段或衍生物，典型地是一種免疫原片段，即包括暴露于表達(dá)TLR3多肽的細(xì)胞表面上的一個表位 (優(yōu)選地被31C3、29H3、23C8、28F11或34A3抗體識別的表位)的多肽的一部分。這類片段典型地包含至少約7個連續(xù)氨基酸的成熟多肽序列，甚至更優(yōu)選地是至少約10個連續(xù)氨基酸的成熟多肽序列。片段典型地基本上是從受體的胞外結(jié)構(gòu)域衍生的。在一個優(yōu)選的實施方案中，在質(zhì)膜中，典型地在細(xì)胞表面上該免疫原包括一種野生型人類TLR3多肽。在一個具體實施方案中，該免疫原包括完整的細(xì)胞，具體是完整的人類細(xì)胞(任選被處理的或裂解)。在另一個優(yōu)選實施方案中，該多肽是一種重組TLR3多肽。用抗原來免疫非人類哺乳動物的步驟能夠以本領(lǐng)域熟知的、用于在小鼠體內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生的任何方式來實現(xiàn)(參見，例如，E.Harlow(哈洛)和D. Lane (萊恩)，抗體 (Antibodies)實驗指南(A Laboratory Manual)，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(ColdSpring Harbor)，紐約(NY (1988)，1988 年)，其全部披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。該免疫原任選地用一種佐劑(例如完全的或不完全的弗氏佐劑)懸浮或溶于一種緩沖劑中。確定免疫原量值、緩沖劑類型以及佐劑量質(zhì)的方法對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是熟知的，并且在本發(fā)明內(nèi)不以任何形式進(jìn)行限制。對于不同的免疫原而言，這些參數(shù)是不同的，但是易于說明。類似地，足以刺激產(chǎn)生抗體的免疫作用的位置和頻率在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的。在一個典型的免疫實驗方案中，在第1天用抗原腹膜內(nèi)注射非人類動物并且在約1周之后再次注射。隨后在約第20天進(jìn)行該抗原的記憶注射，任選使用一種佐劑(例如不完全弗氏佐劑)。記憶注射是以靜脈內(nèi)方式進(jìn)行的并且可以重復(fù)連續(xù)好幾天。隨后在第40天以靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)方式進(jìn)行加強(qiáng)注射，典型地不使用佐劑。這種實驗方案導(dǎo)致在約40天后產(chǎn)生抗原特異的產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞。還可以使用其他實驗方案，只要它們導(dǎo)致生成表達(dá)一種抗體的 B細(xì)胞，該抗體針對免疫中所使用的抗原。對于多克隆抗體制劑而言，從一種經(jīng)免疫的非人類動物得到血清，并且通過熟知的技術(shù)分離在此提出的抗體。血清可以使用以上提出的連接到固體載體上的免疫原中的任何一項來親和純化，從而得到與TLR3多肽進(jìn)行反應(yīng)的抗體。在一個替代的實施方案中，分離了來自一種非人類哺乳動物的淋巴細(xì)胞，使其體外生長，并且然后暴露于經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的抗原。然后收集這些淋巴細(xì)胞，并且執(zhí)行以下說明的融合步驟。對于優(yōu)選的單克隆抗體而言，下一步是從經(jīng)免疫的非人類哺乳動物體內(nèi)分離脾細(xì)胞，并且隨后將這些脾細(xì)胞與一種無限增殖化細(xì)胞融合從而形成一種產(chǎn)生抗體的雜交瘤。 從一種非人類哺乳動物體內(nèi)分離脾細(xì)胞在本領(lǐng)域內(nèi)史熟知的，并且典型地涉及從一種已麻醉的非人類哺乳動物體內(nèi)取出脾，將它切成小塊，并將脾膜中的脾細(xì)胞擠壓通過細(xì)胞過濾網(wǎng)的尼龍網(wǎng)而進(jìn)入一種適當(dāng)?shù)木彌_液中，從而產(chǎn)生一種單細(xì)胞懸浮液。將這些細(xì)胞洗滌、離心并且再懸浮于一種裂解任何紅細(xì)胞的緩沖液中。將該溶液再次離心，并且將球粒中剩余的淋巴細(xì)胞最終再懸浮于新鮮的緩沖液中。一旦在單細(xì)胞懸浮液中分離并且存在，這些淋巴細(xì)胞可以融合到一種無限增殖細(xì)胞系中。典型地這是一種小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，盡管在本領(lǐng)域中用于產(chǎn)生雜交瘤的多種其他無限增殖細(xì)胞系是已知的。優(yōu)選的鼠類骨髓瘤系包括但不限于從M0PC-21和MPC-Il小鼠腫瘤(可以從美國圣地亞哥市薩克研究院細(xì)胞分配中心得到)、X63 Ag8653以及SP-2細(xì)胞 (可以從美國馬里蘭州羅克韋爾市美國種質(zhì)保存中心得到)衍生的骨髓瘤系。使用聚乙二醇或類似物進(jìn)行融合。然后，將得到的雜交瘤在選擇性培養(yǎng)基中生長，這些選擇性培養(yǎng)基包含抑制未融合的親代骨髓瘤細(xì)胞生長或生存的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親代骨髓瘤細(xì)胞缺少酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型地應(yīng)當(dāng)包括次黃嘌呤、氨蝶呤、以及胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷型細(xì)胞的生長。雜交瘤典型地生長于巨噬細(xì)胞的滋養(yǎng)層上。這些巨噬細(xì)胞優(yōu)選地是來自用于分離脾細(xì)胞的非人類哺乳動物的同窩動物，并且典型地在將雜交瘤鋪板之前用不完全弗氏佐劑或類似物予頁處理數(shù)天 ° 在 Goding, "MonoclonalAntibodies :Principles and Practice,，， 第59頁-103頁(美國學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，1986年)中說明了融合方法，其披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。允許這些細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中生長足夠時間用于形成克隆以及產(chǎn)生抗體。這通常是在約7天至約14天之間。然后，針對抗體的產(chǎn)生對雜交瘤克隆進(jìn)行測定，這些抗體特異性地結(jié)合到TLR3多肽基因產(chǎn)物上，任選地被抗體31C3、29H3、23C8、28F11或34A3特異性地識別的表位上。該測定法典型地是一種比色ELISA型測定法，盡管可以使用可適用于雜交瘤生長的這些孔的任何一種測定法。其他測定法包括放射性免疫測定或熒光激活細(xì)胞分選。對所希望的抗體產(chǎn)生呈陽性的孔進(jìn)行檢查以確定是否存在一種或多種不同的克隆。如果存在一種以上克隆， 可以將這些細(xì)胞再克隆并且生長以確保僅有一種單細(xì)胞產(chǎn)生生成所希望抗體的克隆。典型地，還可以針對結(jié)合TLR3多肽(例如，如以下說明的、包埋于石蠟中的組織切片中的、表達(dá) TLR3的細(xì)胞)的能力對這些抗體進(jìn)行測試。被證實產(chǎn)生本發(fā)明的一種單克隆抗體的雜交瘤可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中(例如 DMEM或RPMI-1640)較大量地生長。可替代地，這些雜交瘤制備可以作為動物體內(nèi)的腹水腫瘤在體內(nèi)生長。在充分生長以產(chǎn)生所希望的單克隆抗體之后，將包含單克隆抗體(或腹水流體) 的生長培養(yǎng)基與細(xì)胞分開，并且對其中存在的單克隆抗體進(jìn)行純化。純化典型地是通過凝膠電泳法、透析、使用蛋白A或蛋白G-瓊脂糖的色譜法，或連接到固體載體(例如瓊脂糖或瓊脂糖凝膠珠粒(例如，在 Antibody Purification Handbook，Biosciences (生物科學(xué))， 出版號18-1037-46，Edition AC中所說明的全部，其披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)上的抗小鼠Ig來實現(xiàn)的。典型地，所結(jié)合的抗體通過使用低PH緩沖液(pH 3.0或更低的甘氨酸或乙酸鹽緩沖液)從蛋白A/蛋白G柱上洗脫，其中含抗體的餾分被立即中和。根據(jù)需要將這些餾分收集、透析并且濃縮。典型地將具有單個清楚克隆的陽性孔再克隆并且再測定，以確保僅檢測并且產(chǎn)生一種單克隆抗體。正如例如在Ward等人在Nature (《自然》)，341 (1989)，第544頁中披露的(其全部披露內(nèi)容通過弓I用結(jié)合在此)，還可以通過選擇免疫球蛋白的組合文庫來產(chǎn)生抗體。可以使用多種免疫篩選測定法中任何一種容易地確定結(jié)合到TLR3上，具體地是與單克隆抗體31C3、29H3、23C8、28F11或34A3基本上或?qū)嵸|(zhì)上相同表位上的一種或多種抗體的身份，在這些免疫篩選測定法中可以對抗體競爭進(jìn)行評估。許多這類測定是常規(guī)地進(jìn)行的，并且是本領(lǐng)域熟知的(參見例如于1997年8月沈日發(fā)布的美國專利號5，660，827， 具體地其內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。應(yīng)當(dāng)理解的是，實際上不再以任何方式要求對在此說明的抗體所結(jié)合的表位進(jìn)行確定以便鑒別結(jié)合到與在此說明的單克隆抗體相同的或基本上相同的表位上的抗體。例如，當(dāng)有待檢查的測試抗體獲自不同來源的動物時，或甚至具有不同的Ig同種型時，可以使用一種簡單的競爭測定法，其中將對照(例如，3比3、四!13、2308、觀？11或34八) 和測試抗體混合(或預(yù)吸附)并且應(yīng)用到含有TLR3多肽的樣品上。基于蛋白質(zhì)印跡法的實驗方案和使用BIAC0RE分析適合用于這類競爭研究。在某些實施方案中，在應(yīng)用到TLR3抗原樣品上之前人們將對照抗體(例如31C3、 29H3、23C8、28F11或34A3)與不同量值的測試抗體預(yù)先混合(例如約1 10或約1 100) 持續(xù)一段時間。在其他實施方案中，可以在暴露于TLR3抗原樣品期間將對照與不同量值的測試抗體簡單地混合。只要人們可以將已結(jié)合的抗體與游離的抗體區(qū)別開來(例如，通過使用分離技術(shù)或洗滌技術(shù)來去除未結(jié)合的抗體)，并且將31C3、29H3、23C8、28F11或34A3與測試抗體區(qū)別開來(例如，通過使用種屬特異性或同種型特異性的二抗、或通過用一種可檢出的標(biāo)記物來特異性地標(biāo)記31C3、29H3、23C8、28F11或34A!3)，人們可以確定這些測試抗體是否降低了3比3、29!13、2308、28 11或3443結(jié)合到抗原上，指示該測試抗體識別與31C3、 29H3、23C8、28F11或34A3基本上相同的表位。在缺少完全不相關(guān)的抗體時(標(biāo)記的)對照抗體的結(jié)合可被用作對照高值?？梢酝ㄟ^將標(biāo)記的(31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)抗體與完全相同類型的(31C3，29H3，23C8，28F11或34A3)未標(biāo)記的抗體一起孵育得到對照低值，其中會發(fā)生競爭并且降低已標(biāo)記的抗體的結(jié)合。在一個測試測定中，在測試抗體的存在時經(jīng)標(biāo)記的抗體反應(yīng)性出現(xiàn)顯著降低表明一種識別基本上相同的表位的測試抗體，即該抗體與經(jīng)標(biāo)記的(31C3、29H3、23C8、28F11或;34A3)抗體“交叉反應(yīng)”或與之競爭。當(dāng)31C3、 29H3、23C8、28F11或34A3 測試抗體的比例在約1 10至約1 100之間時將31C3、 29H3、23C8、28F11或34A3與TLR3抗原的結(jié)合減低至少約50 %，例如至少約60 %，或更優(yōu)選地至少約80%或90% (例如，約65% -100% )的任何何測試抗體被認(rèn)為是結(jié)合到與31C3、 29H3、23C8、28F11或34A3基本上相同表位或決定簇的抗體。優(yōu)選地，這樣的測試抗體可以將31C3、29H3、23C8、28F11或34A3與TLR3抗原的結(jié)合降低至少約90% (例如，約95% )。還可以通過例如流式細(xì)胞計量測試對競爭作用進(jìn)行評估。在這種測試中，可以將帶有給定TLR3多肽的細(xì)胞首先與例如31C3、29H3、23C8、28F11或34A3 —起孵育，并且然后與標(biāo)有一種熒光染料或生物素的測試抗體一起孵育。如果當(dāng)與飽和量的31C3J9H3、23C8、 28F11或34A3預(yù)孵育時得到的結(jié)合是不用31C3J9H3、23C8J8F11或34A3預(yù)孵育抗體所得到的結(jié)合(如通過熒光所測量)的約80%，優(yōu)選地是約50%，約40%或更少(例如，約 30%，20%或10% )，則可以說該抗體與31C3、29H3、23C8、28F11或;34A3競爭?？商娲兀?如果在用飽和量的測試抗體來預(yù)孵育帶有經(jīng)標(biāo)記的(通過一種熒光染料或生物素)31C3、 29H3.23C8.28F11或34A3抗體的細(xì)胞時得到的結(jié)合是未經(jīng)該測試抗體預(yù)孵育所得到的結(jié)合的約80 %，優(yōu)選地約50 %，約40 %，或更低(例如，約30 %，20 %或10 % )，則可以說抗體與 31C3、29H3、23C8、28F11 或 34A3 競爭。還可以使用一種簡單競爭測定，其中測試抗體被預(yù)吸附并且以飽和濃度施用到固定著TLR3抗原的表面上。在這種簡單的競爭測定中，該表面優(yōu)選地是一種BIAC0RE芯片 (或適合用于表面等離子共振分析的其他介質(zhì))。然后在TLR3飽和濃度下將對照抗體(例如，31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)與該表面接觸，并且測量對照抗體的TLR3和表面結(jié)合。 將對照抗體的結(jié)合與在缺少測試抗體時對照抗體與包含TLR3的表面的結(jié)合進(jìn)行比較。在一個測試測定中，在測試抗體的存在下包含TLR3的表面被對照抗體結(jié)合的顯著降低表明該測試抗體識別與對照抗體基本上相同的表位，這樣使得該測試抗體與對照抗體進(jìn)行“交叉反應(yīng)”。將對照(例如31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)抗體與TLR3抗原的結(jié)合降低至少約30%或更多，優(yōu)選地約40%的任何測試抗體抗原被認(rèn)為是結(jié)合到與對照(例如，31C3、 29H3、23C8、28F11或34A;3)基本上相同表位或決定簇上的抗體。優(yōu)選地，這樣的測試抗體可以將對照抗體(例如31C3、29H3、23C8、28F11或34A3)與TLR3抗原的結(jié)合降低至少約50% (例如，至少約60%，至少約70%，或更多)。應(yīng)當(dāng)理解的是對照和測試抗體的順序可以逆轉(zhuǎn)。即，在一個競爭測定中可以首先將對照抗體結(jié)合到表面上并且之后將測試抗體與該表面接觸。優(yōu)選地，首先將對TLR3抗原具有較高親和性的抗體結(jié)合到該表面上，正如所預(yù)期的二抗結(jié)合的降低(假設(shè)這些抗體是交叉反應(yīng)的)將是較大規(guī)模的。這類測定的另外的實例提供于例如Saunal (1995) J. Immunol. Methodsl83 :33-41中，其披露的內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。能夠以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種方式來確定抗體是否結(jié)合在表位區(qū)域中。作為這類作圖/表征方法的一個實例，可以使用化學(xué)修飾TLR3蛋白中暴露的胺/羧基、通過表位“足跡法”確定抗TLR3抗體的表位區(qū)。這種足跡法技術(shù)的一個具體實例是使用HXMS (通過質(zhì)譜法檢測氫-氘交換)，其中發(fā)生受體和配體蛋白酰胺質(zhì)子的氫/氘交換、 結(jié)合、以及反向交換，其中保護(hù)參與蛋白結(jié)合的主鏈酰胺基團(tuán)免受反向交換并且因此將保持被氘化?？梢栽谶@一點上通過胃蛋白酶水解作用、快速微孔高效液相色譜分離、和/或電噴霧離子化質(zhì)譜法來鑒別相關(guān)區(qū)域。參見，例如Hiring H，AnalyticalBiochemistry, Vol. 267 (2)pp. 252-259 (1999)Engen, J. R.禾口 Smith, D. L. (2001)Anal. Chem. 73， 256A-265A。適當(dāng)?shù)谋砦昏b別技術(shù)的另一個實例是核磁共振表位作圖(NMR)，其中典型地將游離抗原和與結(jié)合抗原肽復(fù)合的抗原的二維NMR譜圖中信號的位置進(jìn)行比較。典型地用 15N對該抗原進(jìn)行選擇性核素標(biāo)記，這樣使得在NMR譜圖中可以看到僅相應(yīng)于抗原的信號以及沒有來自該抗原結(jié)合肽的信號。與游離抗原的譜圖相比較，在復(fù)合物譜圖中由涉及與抗原結(jié)合肽相互作用的氨基酸所產(chǎn)生的抗原信號典型地將移動位置，并且用這種方法可以鑒別涉及該結(jié)合的氨基酸。參見，例如，Ernst Schering Res Foundfforkshop. 2004 ； (44) 149-67 ；黃(Huang)等人在 Journal of Molecular Biology，Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998)； 以及 Saito 禾口 Patterson，Methods. 1996 Jun ；9 (3) :516_24。還可以使用質(zhì)譜法進(jìn)行表位作圖/表征。參見，例如，Downward，JMass Spectrom. 2000 Apr (2000 年 4 月)；35 (4) :493-503 以及 Kiselar 和 Downard，Anal Chem. 1999 May 1 (1999年5月1日)；71 (9) :1792_801。在表位作圖以及鑒別時，蛋白酶消化技術(shù)也可能是有用的?？梢酝ㄟ^蛋白酶消化(例如通過以相當(dāng)于TLR3約1 50的比率使用胰蛋白酶或在PH 7-8下進(jìn)行ο/η消化)，隨后針對蛋白身份進(jìn)行質(zhì)譜(MQ分析來確定抗原決定簇相關(guān)區(qū)域/序列。被抗TLR3粘合劑保護(hù)而免受胰蛋白酶切割的肽可以隨后通過將經(jīng)歷胰蛋白酶消化的樣品與用抗體孵育的、并且之后經(jīng)歷例如通過胰蛋白酶來消化的樣品進(jìn)行比較來鑒別(由此顯示粘合劑的足跡)。在類似的表位表征方法中還可以或可替代地可以使用其他酶像胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等。而且，酶消化可以提供一種快速方法來用于分析一種潛在的抗原決定簇序列是否在TLR3多肽的一個區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域不是表面暴露的，并且因此就免疫原性/抗原性而言最可能的是不相關(guān)的。關(guān)于類似技術(shù)的討論參見例如 Manca, Ann 1st Super Sanita. 1991 ；27 :15_9。定點誘變是用于說明結(jié)合表位的另一種技術(shù)。例如，在“丙氨酸掃描”中，蛋白片段中每個殘基都用一個丙氨酸殘基替換，并且測量結(jié)合親和性的結(jié)果。如果該突變導(dǎo)致結(jié)合親和性顯著降低，它最可能涉及結(jié)合?？梢允褂脤Y(jié)構(gòu)性表位具有特異性的單克隆抗體 (即不結(jié)合未折疊蛋白的抗體)來證實該丙氨酸取代不影響蛋白的整體折疊。參見，例如， Clackson 和 Wells，Science (科學(xué))1995 ;267 :383-386 ；以及 Wells，Proc Natl Acad Sci USA 1996 ；93 :1_6。還可以將電鏡法用于表位“足跡法”。例如王(Wang)等人，Nature (《自然》)1992(年)；355 :275-278使用冷凍電子顯微鏡術(shù)、三維圖像重建、以及X射線晶體法的協(xié)同應(yīng)用來確定天然錫蘭豇豆花葉病毒的衣殼表面上的一個Fab片段的物理足跡。用于表位評估的其他形式的“無標(biāo)記”測定包括表面等離振子共振(sra，BIAC0RE)以及反射干涉光譜法(RifS)。參見，例如，F(xiàn)agerstam等人，JournaI Of Molecular Recognition 1990 ；3 :208-14 ；Nice等人，J. Chroma-togr. 1993 ；646 :159-168 ； Leipert 等人，Angew. Chem. Int. Ed. 1998 ；37 :3308-3311 ； Kroger 等人，Biosensors and Bioelectronics (生物傳感器與生物電子學(xué))2002 ；17 :937_944。還應(yīng)當(dāng)注意的是可以在此說明的示例性競爭測定的一項或多項中鑒別出結(jié)合與本發(fā)明抗體相同的或基本上相同表位的抗體。一旦鑒定出抗體能夠結(jié)合TLR3和/或具有其他所希望的特性，典型地還可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法(包括在此說明的那些方法)針對它們結(jié)合其他多肽(包括不相關(guān)的多肽以及其他TLR家族成員(例如人類TLR1，2，或4-10))的能力對它們進(jìn)行評估。理想地是，這些抗體僅以顯著的親和性結(jié)合到TLR3上(例如人類TLR3)，不以顯著水平結(jié)合到不相關(guān)的多肽上或其他TLR家族成員上(例如，TLR2或TLR4 ；在NCBI登錄號NP_612564中發(fā)現(xiàn)在氨基酸殘基1-23處包括一個信號肽的人類前體TLR4的氨基酸序列，其披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，只要與針對其他TLR家族成員(或其他不相關(guān)多肽)的親和性相比較，對于TLR3的親和性是顯著地更大的(例如5x、10x、50x、100x、500x、1000x、10，000x、 或更大)，則這些抗體適合用于本方法中。還可以在非人類靈長類動物體內(nèi)(例如，食蟹猴、或其他哺乳動物，例如小鼠)對抗體結(jié)合到表達(dá)TLR3的細(xì)胞上進(jìn)行評估。因此本發(fā)明提供了一種抗體，以及它們的片段和衍生物，其中所述抗體、片段或衍生物特異性地結(jié)合TLR3，并且此外它們結(jié)合來自非人類靈長類動物的TLR3 (例如，食蟹猴)。任選地，對細(xì)胞攝入或定位，任選地在亞細(xì)胞區(qū)室中的定位(例如內(nèi)吞途徑)進(jìn)行評估以選擇易于攝入細(xì)胞中和/或攝入細(xì)胞區(qū)室中的一種抗體 (其中表達(dá)TLR3)。通常在細(xì)胞中測量細(xì)胞攝入或定位，在這些中尋找到抗體或抗體據(jù)信例如在DC中發(fā)揮其活性?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)方法(例如通過使用標(biāo)記有可檢出部分(例如熒光部分)的抗體的共聚焦染色)對細(xì)胞攝入或定位進(jìn)行評估。當(dāng)在脊椎動物或細(xì)胞中免疫并且產(chǎn)生抗體時，可以執(zhí)行特定的選擇來分離所要求的抗體。在此方面，在一個具體的實施方案中，本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這類抗體的方法，包括 (a)用一種包括TLR3多肽的免疫原來免疫一種非人類哺乳動物；以及(b)從所述免疫的動物體內(nèi)制備抗體；以及(c)從步驟(b)中選擇能夠結(jié)合TLR3的抗體?？梢栽谙鄳?yīng)于細(xì)胞溶膠區(qū)室(例如，內(nèi)體區(qū)室)中那些情況的酸性條件下(例如PH在約5. 5至6. 5之間)對結(jié)合到TLR3上對這些抗體進(jìn)行測試?？梢源_定在酸性條件下這些抗體針對人類TLR3的二價結(jié)合親和性?？梢岳缤ㄟ^不大于約(例如親和性好于)100、60、10、5、或1納摩爾，優(yōu)選地亞納摩爾或任選地不大于約300、200，100或10皮摩爾的平均Kd對抗體進(jìn)行表征。例如可以通過將重組產(chǎn)生的人類 TLR3蛋白固定在芯片表面上，隨后使用溶液中有待測試的抗體來確定Kd(例如，如在本發(fā)明實例中所示)。為了選擇在酸性和中性條件下保持類似結(jié)合性的抗體，人們可以設(shè)法將觀察到的、在中性PH(例如7. 2)和酸性pH(例如，在4. 5-6-5范圍內(nèi)的pH)下結(jié)合性之間的差異降至最低，例如其中在酸性PH下結(jié)合親和性并非顯著低于在非酸性pH下觀察到的情況 (例如，其中結(jié)合到TLR3上的Kd降低不大于0. 2-,0. 3-,0. 5-,1. 0_、或1. 5-log10)。在一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括一個步驟(d)，從(b)中選擇能夠與抗體31C3、29H3、23C8、 28F11或34A3競爭結(jié)合到TLR3上的抗體。
27
在任何一個實施方案的一個方面中，根據(jù)本發(fā)明制備的抗體是單克隆抗體。在另一個方面，根據(jù)本發(fā)明的方法用于產(chǎn)生抗體的非人類動物是一種哺乳動物，例如一種嚙齒動物、牛、豬、家禽、馬、兔、山羊、或綿羊。本發(fā)明的抗體涵蓋31C3、29H3、23C8、28F11或 34A3。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是可以使用在此說明的方法得到其他抗體，并且因此本發(fā)明的抗體可以是除了 31C3、29H3、23C8、28F11或34A3之外的抗體。另外，本發(fā)明的抗體可以任選地被特化為除了抗體TLR3. 7(eBioScience公司，圣地亞哥)、W006/060513的抗體C1068、WO 2007/051164的抗體C1130中任何一項，W02010/051470披露的抗體中任何一項(例如抗體 1-19 和 F17-F19,抗體 40C1285 (Abeam)，或抗體 619F7、713E4、716G10、IMG-5631、IMG-315 或IMG-5348 (都來自Imgenex公司))或上述各項的衍生物(例如這些衍生物全部地或部分地包括抗原結(jié)合區(qū))之外的抗體。根據(jù)一個替代的實施方案，編碼結(jié)合TLR3多肽上存在的一個表位的DNA從本發(fā)明的雜交瘤中分離出，并且被置于一種適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中用于轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)乃拗髦?。然后該宿主用于重組產(chǎn)生該抗體、或其變異體，例如該單克隆抗體的一種人源化形式、該抗體的活性片段，嵌合體抗體(包括該抗體的抗原識別部分)、或包括一個可檢出部分的形式。使用常規(guī)步驟可以很容易對編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA(例如抗體31C3、29H3、 23C8、28F11或34A;3)進(jìn)行分離和測序(例如，通過使用寡核苷酸探針，這些探針能夠特異性地結(jié)合到對鼠類抗體的重鏈和輕鏈進(jìn)行編碼的基因上)。一旦分離，該DNA被置于表達(dá)載體中，然后將這些載體被轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，例如大腸桿菌細(xì)胞、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、或骨髓瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞不另外產(chǎn)生免疫球蛋白，從而在重組體宿主細(xì)胞中得到單克隆抗體的合成。如在本說明書的其他地方所說明，可以出于多個目的中任何一項(例如，用于人源化抗體、產(chǎn)生片段或衍生物、或用于修飾抗體的序列)而例如在抗原結(jié)合位點中對這類DNA序列進(jìn)行修飾，從而優(yōu)化該抗體的結(jié)合特異性。在細(xì)菌中對編碼該抗體的DNA進(jìn)行重組體表達(dá)是本領(lǐng)域熟知的(參見，例如， Skerra 等人，Curr. Opinion in Immunol. ,5, pp. 256(1993)；禾口 Pluckthun, Immunol. 130, p. 151(1992))。
對抗體調(diào)節(jié)TLR3信號傳送的能力進(jìn)行評估在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體能夠調(diào)節(jié)，例如抑制TLR3多肽的信號傳送，并且因而調(diào)節(jié)了表達(dá)TLR3的細(xì)胞的活性或行為。例如，這些抗體可以抑制表達(dá)TLR3的細(xì)胞的激活(例如，它們可以抑制TLR3信號傳導(dǎo)途徑)，任選地不阻斷結(jié)合到天然的或內(nèi)源配體的TLR3上(例如dsRNA)；任選地它們可以在TLR3配體的存在下阻斷TLR3蛋白形成同型二聚體的能力，因此阻斷引信號傳送級聯(lián)放大。因此，這些抗體稱為“中和化”或“抑制性” 或“阻斷性”抗體。除了其他用途之外，這類抗體用于降低表達(dá)TLR3的免疫細(xì)胞的活性，例如用于治療或預(yù)防涉及表達(dá)TLR3的細(xì)胞過量活性或數(shù)量的病癥，或其中降低表達(dá)TLR3的細(xì)胞的活性可以改善、防止、消除、或以任何方式改進(jìn)該病癥或其任何癥狀?？梢允褂靡幌盗屑?xì)胞測定法來對抗體調(diào)節(jié)TLR3信號傳送的能力進(jìn)行評估?？梢允褂么罅繙y定法中任何一項(包括分子的、基于細(xì)胞的、以及基于動物的模型)來對抗TLR3 抗體調(diào)節(jié)表達(dá)TLR3的細(xì)胞活性的能力進(jìn)行評估。例如，可以使用基于細(xì)胞的測定法，其中將表達(dá)TLR3的細(xì)胞暴露于dsRNA、病毒dsRNA、聚IC、或聚AU、或另一種TLR3配體，并且對該抗體破壞配體的結(jié)合或刺激受體的能力進(jìn)行評估(正如所確定的，例如通過檢查在此提出的TLR3細(xì)胞活性的任何一項，例如干擾素表達(dá)、NFkB活性、NK細(xì)胞激活等)。用于這些測定法中的TLR3配體可以是處于任何適當(dāng)形式，包括但不限于作為一種純化的配體組合物、 以與多種非TLR3配體一起的混合物形式、以天然發(fā)生的組合物形式、在細(xì)胞中或在細(xì)胞表面上、或由細(xì)胞分泌(例如，在該測定法中使用產(chǎn)生配體的細(xì)胞)、在溶液中或在固體載體上。還可以在缺少配體下通過將細(xì)胞暴露于抗體本身、并且對它在細(xì)胞活性或行為的任何一個方面上的作用進(jìn)行評估而對表達(dá)TLR3的細(xì)胞的活性進(jìn)行評估。在這類測定中， 在缺少配體下得到表達(dá)TLR3的細(xì)胞其活性的基線水平(參見以下，例如細(xì)胞因子產(chǎn)生、增殖)，并且對抗體或化合物改變基線活性水平的能力進(jìn)行檢測。在一個這樣的實施方案中， 使用一種高通量篩選方法來鑒別能夠影響受體激活的化合物。可以使用影響TLR3活性的任何適當(dāng)?shù)纳韺W(xué)改變來對測試抗體或抗體衍生物進(jìn)行評估。例如，人們可以測量多種作用，例如基因表達(dá)的改變(例如，NFkB應(yīng)答基因)、蛋白質(zhì)分泌(例如，干擾素)、細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖、PH、細(xì)胞內(nèi)第二信使(例如Ca2+、IP3、cGMP、 或cAMP)，或活性(例如激活NK細(xì)胞的能力)。在一個實施方案中，通過檢測細(xì)胞因子(例如響應(yīng)TLR3的細(xì)胞因子、促炎細(xì)胞因子)的產(chǎn)生對受體的活性進(jìn)行評估。可以使用多種可讀出系統(tǒng)中的任何一種對TLR3調(diào)節(jié)進(jìn)行評估，主要基于TLR/ IL-IR信號傳導(dǎo)途徑，涉及例如MyD88獨立型/TRIF依賴型信號傳導(dǎo)途徑，涉及例如IRF3、 IRF7, IKK ε 和 / 或 TBKl (Akira 和 iTakeda U004) Nature Review Immunol. 4 :499-511)信號傳導(dǎo)途徑。這些途徑激活了激酶，包括KB激酶復(fù)合物?？梢酝ㄟ^對TLR信號傳送的任何一個方面進(jìn)行檢查而對TLR3激活進(jìn)行評估。例如，TLR信號傳送的激活在以下方法觸發(fā)了改變蛋白-蛋白相互結(jié)合(例如，TRIF與TBK和/或IKKO、蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位(例如 NK-kB移動進(jìn)入細(xì)胞核中)、以及基因表達(dá)(例如在NK-kB敏感性基因的表達(dá)方面)、以及細(xì)胞因子產(chǎn)生(例如，IFN-IFN- y , IL-6、IP10、MCP_1、IL-6、IP10、MCP_1 的產(chǎn)生和分泌)。 任何一種這樣的改變可以被檢測并且用于檢測TLR3激活。在一個實施方案中，通過在培養(yǎng) 18-20小時之后收集上清液并且通過夾心ELISA測量IFN- y、IL_6、IP-IO和/或MCP-I來檢測TLR3刺激作用。在另一個實施方案中，通過在培養(yǎng)18-20小時之后收集上清液并且通過夾心ELISA測量IFN- y、IL-6、IP-10和/或MCP-I來檢測TLR3刺激作用。在一個實施方案中，使用天然表達(dá)TLR3的細(xì)胞，例如DC (例如髓樣DC或單核細(xì)胞衍生的DC)。在另一個實施方案中，使用包含一種報告基因構(gòu)建體的細(xì)胞，當(dāng)TLR3刺激時該構(gòu)建體引起一種可檢出基因產(chǎn)物的表達(dá)以及隨之而來信號傳導(dǎo)途徑的激活。對于這些測定法而言特別有用的報告基因和報告基因構(gòu)建體包括例如可操作地連接到一個啟動子上的報告基因，該啟動子對NF-kB或?qū)唧w地由TRIF、IRF3、IRF7、IKK ε ,TBKl介導(dǎo)的信號敏感。 這類啟動子的實例包括但不限于用于IL-α、IL-6、IL-8、IL_12p40、IP-10、CD80、CD86、以及TNF-α的那些啟動子?？刹僮鞯剡B接到TLR敏感的啟動子上的報告基因可以包括但不限于一種酶(例如，熒光素酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)等)、一種生物發(fā)光標(biāo)志物(例如，綠色熒光蛋白(GFP，例如，美國專利號5，491，084)、藍(lán)色熒光蛋白(BFP，例如美國專利號6，486，382等)、一種表面表達(dá)的分子(例如，⑶25、⑶80、⑶86)， 以及一種分泌的分子(例如，IL-l、IL-6、IL-8、IL-12p40、TNF-a)。參見，例如Hcker H等人在(1999)EMBO J. 18 :6973-82 ；Murphy TL等人在(1995)Mol Cell Biol 15 :5258-67, 們披露的內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。適合使用的報告基因質(zhì)粒是可商購的(加利福尼亞州圣地亞哥市hvivoGen)。在一個實施方案中，該測定法包括在制造用來表達(dá)人類TLR3多肽的宿主細(xì)胞中確定在對TLR3信號傳導(dǎo)(例如ISRE，即IFN-刺激的應(yīng)答元件)應(yīng)答的啟動子的控制下測試組合物是否誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)(或其他報告基因)。在依賴于酶活性讀數(shù)的測定中，底物可以作為該測定的一部分來供應(yīng)，并且檢測可以涉及以下方面的測量化學(xué)發(fā)光、熒光、顯色、放射性標(biāo)記物的結(jié)合、耐藥性、光密度或酶活性的其他標(biāo)志物。對于依賴于分子的表面表達(dá)的測定而言，可以使用流式細(xì)胞計數(shù)法 (FACS)分析或功能性測定來實現(xiàn)檢測?？梢允褂妹嘎?lián)免疫吸附測定(ELISA)或生物測定法來測定分泌的分子。在本領(lǐng)域中許多這些和其他適當(dāng)?shù)淖x出系統(tǒng)是熟知的并且是可商購的。優(yōu)選地，該報告基因系統(tǒng)(無論使用哪一種)是可定量的。在另一個實施方案中，在非人類靈長類動物體內(nèi)評估了這些抗體對表達(dá)TLR3的細(xì)胞的作用。例如，將包括本發(fā)明的一種抗TLR3抗體的藥用組合物給予一個非人類靈長類動物體，該動物或者是健康的亦或患有一種病癥，例如一種自身免疫性疾病或炎癥，并且評估了這種給藥對例如該靈長類動物體內(nèi)表達(dá)TLR3的細(xì)胞的數(shù)量或活性、細(xì)胞因子的存在和/或水平方面，或在病癥進(jìn)展方面的作用。在這些TLR3相關(guān)參數(shù)中任何一項中產(chǎn)生可檢出改變的任何一種抗體或抗體衍生物或片段是用于在此說明的方法中的候選物。在此說明的任何一項測定中，細(xì)胞中TLR3刺激的活性的任何可檢出測量值增加或降低 5%、10%、20%、優(yōu)選地30%、40%、50%、最優(yōu)選地60%、70%、80%、90%、95%、或更大表明該測試抗體適合用于本發(fā)明的方法。當(dāng)對抑制性抗TLR3抗體進(jìn)行評估時，可以有利地選擇抗體以改變與炎癥或自身免疫性相關(guān)的任何參數(shù)。例如，可以選擇抗體來降低細(xì)胞中的激活作用，特別是促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。例如這些細(xì)胞可以獲自患有炎性或自身免疫性疾病的個體。
抗體CDR序列在本發(fā)明的任何一個實施方案的一個方面中，抗體可以包括具有根據(jù)選自式(I) 至(XX)對應(yīng)式的⑶Rl、2和/或3序列的一個重鏈和/或輕鏈。在此的任何一個實施方案中，具體的HCDR1-3或IXDR-1-3可以被限定為具有式(I)至(XX)的一個序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，該抗體包括包含這三個LCDR的一個輕鏈以及包含這三個HCDR的一個重鏈。任選地，提供了一種抗體，其中這些輕鏈和/或重鏈可變區(qū)中任何一項被融合到IgG型的一個免疫球蛋白恒定區(qū)上，任選是一個人類恒定區(qū)，任選是一個IgGl或IgG4同種型。在一個實施方案中，IXDRl具有式(I) R-A-S-E-N-I-Y-S-Xaa1-L-A (I) (SEQ ID NO 61),
其中，Xm1可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中敘 可以是 kr、Tyr 或 Asn。在一個實施方案中，IXDR2具有式(II) Xaa2-A-K-T-L-A-E(II) (SEQ ID NO 62),
其中，Xm2可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中)(皿2可以是Asn或Tyr。在一個實施方案中，IXDR3具有式(III) Q-H-H-Y-G-T-P-Xaa3-T(III) (SEQ ID NO 63),其中，Xm3可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中)(皿3可以是 Tyr、Phe、Pro。在一個實施方案中，IXDRl具有式(IV) Xaa4-A-S-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12 (IV) (SEQ ID NO :64),其中 Xaa4
至)(皿12可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中)(皿4可以是 Arg,Ser或Lys，和/或Xagi5可以是Glu、Ser或Gin、和/或Xagi6可以是Asn或kr、和/或 Xaa7可以是Ile或Val，和/或) 可以是一個缺失，Tyr或Arg，和/或) 可以是kr 或Thrjn /或Xaaltl可以是Tyr、Asn或kr、和/或Xaa11可以是Leu、Met或Val、和/或 Xaa12可以是Ala或Phe0在一個實施方案中，IXDRl具有式(V) Xaa13-Xaa14-Xaa15-Xaa16-L-A-Xaa17(V) (SEQ ID NO 65)
其中& 13至)(脅17可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中 Xaa13可以是Leu、Asn或Tyr、禾口 /或Xaa14可以是Ala或Thr,禾口 /或Xaa15可以是Lys或 Ser,和/或Xaa16可以是Asn或Thr，和/或Xaa17可以是Glu或kr。在一個實施方案中，IXDR2具有式(VI) Xaa18-A-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23(VI) (SEQ ID NO 66)其中 Xaa19 至 Xaa23 可以是
一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中)(aa18可以是Tyr，ASn或Leu， 禾口 /或Xaa19可以是Ser或Lys,禾口 /或Xaa20可以是Asn或Thr,禾口 /或Xaa21可以是Leu或 ArgJP /或Xaa^可以是Ala或His，和/或XaaM可以是Thr或Glu。在一個實施方案中，IXDR2具有式(VII) L-Xaa24-S-N-Xaa25-Xaa26-Xaa27 (VII) (SEQ ID NO 67)
其中至)(脅27可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中 Xaa24可以是Thr或Ala,禾口 /或Xaa25可以是Leu或Arg,禾口 /或 Xaaffi可以是Ala或His，和/或Xaa27可以是Ser或Thr。在一個實施方案中，IXDR3具有式(VIII) Q-Xaa28-Xaa29-Xaa30-G-Xaa31-P-Xaa32-T (VI11) (SEQ ID NO 68)
其中敘 8至& 32可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中 XaEi28可以是His或Gln，和/或Xa^i29可以是His或Trp，和/或Xa^i30可以是Tyr或Thr，和 /或Xaa^可以是Thr或Asn，和/或Xaa32可以是Tyr，Phe或Pro。在一個實施方案中，IXDR3具有式(IX) Xaa33-Xaa34-H-Xaa35-Xaa36-Xaa37-P-Xaa38-T (IX) (SEQ ID NO 69)
其中^^⑵至敘^^可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中 Xaa^可以是Gln或Leu，和/或)(aa34可以是His或Gln，和/或)(ai%可以是Trp或Tyr，和 /或XaEi36可以是Asn或Gly, ^P /或Xa^i37可以是Tyr或Thr，禾口 /或Xa^i38可以是Tyr，Phe 或 Pro。在一個實施方案中，IXDR3具有式(X) Xaa39-Q-Xaa4o_Xaa41-Xaa42_Xaa43_P_Xaa44_T (X) (SEQ ID NO :70)
其中至)(脅44可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中 Xaa39可以是Gln或Leu,和/或Xaa40可以是Trp或His，和/或Xaa41可以是Thr或Trp,禾口 /或)(aa42可以是Gly或Asn，和/或) 可以是Asn或Tyr，和/或)(aa44可以是Pro或 Tyr0在一個實施方案中，HCDRl具有式(XI) G-Y-S-F-T-G-Y-Xaa45-Xaa46-H(XI) (SEQ ID NO 71)
其中& 45至)(脅46可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中 XaEi45可以是Phe或Tyr，和/或XaEi46可以是Met或lie。在一個實施方案中，HCDRl具有式(XII) G-Y-S-F-T-Xaa47-Y-Xaa48-M-H (XII) (SEQ ID NO 72)
其中& 47至)(脅48可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中 )(aa47可以是Gly或Ala，和/或)(aa48可以是Phe或Tyr。在一個實施方案中，HCDRl具有式(XIII) G-Y-S-F-T-Xaa49-Y-Y-Xaa50-H (XI11) (SEQ ID NO 73)
其中)(脅49至)(脅5(|可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中 Xaa49可以是Gly或Ala，禾口 /或Xaa50可以是Ile或Met。在一個實施方案中，HCDRl具有式(XIV) G-Y-Xa￡i5「F-T-Xa￡i52-Y-Xa￡i53-Xa￡i54-Xa￡i55 (XIV) (SEQ ID NO :74)其中 Xaa51 至 Xaa55 可
以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中可以是Val或kr， 和/或Xaa52可以是Thr,Gly或Ala和/或Xaa53可以是kr，Tyr或Phe，和/或Xaa54可以是Ile或Met，和/或Xaa55可以是Tyr或His。在一個實施方案中，HCDRl具有式(XV) G-Y-S-Xaa56-T-Xaa57-G-Y-Xaa58-Xaa59-H(XV) (SEQ ID NO 75)
其中敘^；至敘^^可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中 Xaa56可以是Ile或Phe，和/或)(aa57可以是一個缺失或kr，和/或)(aa58可以是kr、Tyr 或Phe，和/或可以是Trp，Ile或Met。在一個實施方案中，HCDRl具有式(XVI) G-Y-Xaa60-Xaa61-T-Xaa62-Xaa63-Y-S-Xaa64-Xaa65 (XVI) (SEQ ID NO 76)其中 Xaa60 至可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中^Caa6tl可以是Val
或kr，和/或Xaa61可以是Phe或Ile，和/或Xaa62可以是Thr或kr，和/或Xaa63可以是缺失或GlyJP /或Xaa64可以是Ile或TrpJn /或)(aa65可以是Tyr或His。在一個實施方案中，HCDR2具有式(XVII) R-I-N-P-Y-Xaa66-G-A-T-S-Xaa67-N-Xaa68-N-F-K-D (XVII) (SEQ ID NO 77)
其中& 66至)(脅68可以是一個保守的或不保守的取代或一起缺失或插入，優(yōu)選地，其中 Xaa66可以是Asn或Tyr，和/或^ia67可以是缺失或Tyr，和/或^ia68可以是Arg或Gln.。在一個實施方案中，HCDR2具有式(XVIII) R-I-N-P-Y-Xaa66-G-A-T-S-Y-N-Q-N-F-K-D(XVIII)(SEQ ID NO 78)
其中可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中)(皿66可以是Asn或Tyr。在一個實施方案中，HCDR2具有式(XIX) R-I-N-P-Y-N-G-A-T-S-Y-N-Xaa68-N-F-K-D(XIX)(SEQ ID NO 79)其中可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中)(皿68可以是Arg或Gin。在一個實施方案中，HCDR2具有式(XX)
(XX)(SEQ
ID NO 80)
其中至) 可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中)(aa69可以是Asp或His，和/或)(aa7(1可以是一個缺失或Pro，和/或)(aa71可以是Ser或 Asn,禾口 /或Xaa72可以是Ile或Asp,禾口 /或Xaa73可以是Ser或Asn,禾口 /或Xaa74可以是 Gln或ftx)，和/或Xaa75可以是Lys或kr，和/或Xaa76可以是Phe或Leu，和/或Xaa77可以是Lys或Arg，和/或)(ειει78可以是Gly或kr。在一個實施方案中，HCDR2具有式(XXI)
XI)(SEQ ID NO 81)
其中& 79至)(脅9(|可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中 Xaa79可以是Arg或Tyr，和/或)(aa8(1可以是Asn、Asp或His，和/或)(aa81可以是一個缺失或Pro,禾口 /或Xaa82可以是Tyr> Asn或Ser,禾口 /或Xaa83可以是lie、Asp或Ala,禾口 /或 Xaa84可以是Ser或Asn，和/或^m85可以是一個缺失或Tyr，和/或^m86可以是ftO、Arg 或Gln,禾口 /或Xaa87可以是Ser> Lys或Asn,禾口 /或Xaa88可以是Phe或Leu,禾口 /或Xaa89 可以是Lys或Arg，和/或Xaa9tl可以是Asp或Gly。在一個實施方案中，HCDR3具有式(XXII) Xaa91-Xaa92-G-Xaa93-Xaa94-Y-Xaa95-F-D-Y (XXII) (SEQ ID NO 82)
其中& 91至)(脅95可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中 Xaa91可以是Asp或Ser,禾口 /或Xaa92可以是Asp或Gly,禾口 /或Xaa93可以是Gly或Asn,禾口 /或)(a￡i94可以是Asn或Thr，和/或) 可以是Pro或一個缺失。在一個實施方案中，HCDR3具有式(XXIII) Xaa96-Xaa97-Xaa98-Xaa99-Xaa100-Y-Xaa101-Xaa102-D-Y (XXIII) (SEQ ID NO 83)
其中至Xaaltl2可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中) 可以是S或D，和/或)(aa97可以是G、T D，和/或^m98可以是G、K或一個缺失，和 /或)(aa99可以是G、L、N或一個缺失，和/或Xaaltltl可以是Y、T、G、N，和/或Xaaltll可以是 P、G或一個缺失，和/或Xaaltl2可以是M、F或L。在一個實施方案中，HCDR3具有式(XXIV) Xaa103-Xaa104-Xaa105-Xaa106-Xaa107-Xaa108-Xaa109-F-D-Y (XXIV) (SEQ ID NO 84)
其中Xaaltl3至Xaaltl9可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中Xaa103可以是A sp、kr、Glu，和/或Xaa104可以是Asp或Gly，和/或Xaa105可以是Gly 或Asn，和/或Xaaltl6可以是Asn、Tyr或Gly，和/或Xaaltl7可以是Asn、Thr或Tyr，和/或 Xaaltl8可以是Tyr或Gly，和/或Xaaltl9可以是Tyr、Pro或一個缺失。在一個實施方案中，HCDR3具有式(XXV) Xaa110-G-Xaa111-Xaa112-Y-Xaa113-Xaan4-Xaa115-D-Y(XXV) (SEQ ID NO 85)
其中Xaalltl至Xaa115可以是一個保守的或不保守的取代或一個缺失或插入，優(yōu)選地，其中Xaalltl可以是Glu或Asp，和/或Xaa111可以是Asn或一個缺失，和/或Xaa112可以是Tyr 或一個缺失，和/或Xaa113可以是Tyr或Gly，和/或Xaa114可以是Tyr或Gly，和/或^ia115 可以是Met或Phe。在一個實施方案中，本發(fā)明的一種抗體可以包括一個輕鏈，該輕鏈包括
a種選自SEQ ID NOS :61、64以及65的輕鏈⑶Rl (IXDRl)氨基酸序列；和/或 b種選自SEQ ID NOS :62、66以及67的輕鏈CDR2 (LCDR2)氨基酸序列；和/或 c種選自SEQ ID NOS :63、68、69以及70的輕鏈CDR3 (LCDR3)氨基酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的一種抗體可以包括一個重鏈，該重鏈包括 a種選自SEQ ID NOS :71至76的重鏈CDRl (HCDRl)氨基酸序列；和/或
b種選自SEQ ID NOS :77至81的重鏈CDR2 (HCDR2)氨基酸序列；和/或 c種選自SEQ ID NOS 82至85的重鏈CDR3 (HCDR3)氨基酸序列。 抗體已經(jīng)將產(chǎn)生抗體的細(xì)胞存放在CNCM，登錄號為1-4187 ；也已經(jīng)對抗體進(jìn)行了測序。重鏈可變區(qū)的氨基酸序列列出為SEQ IDNO :10，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列列出為SEQ ID NO: 11。對該重鏈和輕鏈可變區(qū)進(jìn)行編碼的核酸序列對應(yīng)地列于SEQ ID NOS 53以及M中。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體結(jié)合與單克隆抗體四冊基本上相同的表位或決定簇；任選地該抗體包括一種抗體四冊的抗原結(jié)合區(qū)。在此的任何一個實施方案中，抗體^H可以通過其氨基酸序列和/或?qū)ζ溥M(jìn)行編碼的核酸序列來表征。 在一個優(yōu)選的實施方案中，該單克隆抗體包括的Fab或F(ab' )2部分。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體包括的重鏈可變區(qū)。根據(jù)一個實施方案，該單克隆抗體包括重鏈可變區(qū)的三個⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該抗體進(jìn)一步包括的可變的輕鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的一個、兩個或三個CDR。任選地任何一個或多個所述輕鏈或重鏈CDR可以包括一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸修飾(例如，取代、插入或缺失)。任選地，提供了一種抗體，其中包括部分或全部的抗體的抗原結(jié)合區(qū)的這些輕鏈和/或重鏈可變區(qū)中任何一項被融合到一個IgG型免疫球蛋白恒定區(qū)上，任選是一個人類恒定區(qū)，任選地一個IgGl或IgG4同種型。在另一個優(yōu)選實施方案中，該抗體是^H3。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種純化的多肽，該多肽編碼一種抗體，其中該抗體包括一個VHCDRl區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 12中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VHCDR2區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 13中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VHCDR3區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 14中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VLCDRl區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO :15中所給出的氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VLCDR2區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 16中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；和/或一個VLCDR3區(qū)，該區(qū)包括如 SEQ ID NO :17中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代。在又另一個方面中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體包括各自具有至少三個CDR 的一個重鏈和/或一個輕鏈，其中該至少三個CDR中的一個、兩個或三個具有針對對應(yīng)的重
34鏈和輕鏈的序列SEQ ID NO :12至14以及15至17，并且在酸性條件下它們的抗體特異性地結(jié)合到TLR3上。在另一個方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類TLR3的一種抗體，該抗體包括
a SEQ ID NO :10的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
b SEQ ID NO :11的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
c SEQ ID NO :10的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；以及SEQ ID NO 11的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
c^nSEQ ID N0:12、13 和 14 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3 (HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
e對應(yīng)地如SEQ ID NO :15、16和17中所示的輕鏈(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列， 其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
f 如 SEQ ID NO 12,13 禾口 14 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3 (HCDR、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；以及如SEQ ID NO 15,16和17中所示的輕鏈CDR 1、2和3 (LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列， 其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
g與具有SEQ ID NO :10的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、90%或 95%—致的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
h與具有SEQ ID NO :11的氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、90%或 95%—致的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代。在此任何一個實施方案的另一個方面中，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2以及3的任何一項可以表征為具有一個氨基酸序列，該序列與對應(yīng)SEQ ID NO中所列的特定⑶R或⑶R組享有至少50 %、60 %、70 %、80 %、85 %、90 %或95 %的序列一致性。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與上述(a)至(h)的一種單克隆抗體競爭TLR3結(jié)合。
抗體3IC已經(jīng)將產(chǎn)生抗體31C3的細(xì)胞存放在CNCM，登錄號為1-4186 ；也已經(jīng)對抗體31C3 進(jìn)行了測序。重鏈可變區(qū)的氨基酸序列列出為SEQ ID NO :2，并且輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列列出為SEQ ID NO :3。對該重鏈和輕鏈可變區(qū)進(jìn)行編碼的核酸序列對應(yīng)地列于SEQ ID NOS 51以及52中。在一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體結(jié)合與單克隆抗體 31C3基本上相同的表位或決定簇；任選地該抗體包括一種抗體31C3的抗原結(jié)合區(qū)。在此任何一個實施方案中，抗體31C3可以通過其氨基酸序列和/或?qū)ζ溥M(jìn)行編碼的核酸序列來表征。在一個優(yōu)選的實施方案中，該單克隆抗體包括31C3的Fab或F(ab' )2部分。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體包括31C3的重鏈可變區(qū)。根據(jù)一個實施方案，該單克隆抗體包括31C3的重鏈可變區(qū)的三個⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該抗體進(jìn)一步包括31C3的可變的輕鏈可變區(qū)或31C3輕鏈可變區(qū)的一個、兩個或三個CDR。任選地任何一個或多個所述輕鏈或重鏈CDR可以包括一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸修飾(例如，取代、 插入或缺失)。任選地，提供了一種抗體，其中包括部分的或全部的抗體31C3的抗原結(jié)合區(qū)的這些輕鏈和/或重鏈可變區(qū)中任何一項被融合到一個IgG型免疫球蛋白恒定區(qū)上，任選是一個人類恒定區(qū)，任選是一個人類IgGl或IgG4同種型。在另一個優(yōu)選實施方案中，該抗體是31C3。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種純化的多肽，該多肽編碼一種抗體，其中該抗體包括一個VHCDRl區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO :4中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VHCDR2區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO: 5中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VHCDR3區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO :6中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VIXDRl區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 7中列出的氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代； 一個VIXDR2區(qū)，該區(qū)包括如SEQID NO :8中列出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VIXDR3區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 9中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代。在又另一個方面中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體包括各自具有至少三個CDR 的一個重鏈和/或一個輕鏈，其中該至少三個CDR中的一個、兩個或三個具有針對對應(yīng)的重鏈和輕鏈的序列SEQ ID NO :4至6以及7至9，并且在酸性條件下它們的抗體特異性地結(jié)合到TLR3上。在另一個方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類TLR3的一種抗體，該抗體包括
a SEQ ID NO :2的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
b SEQ ID NO :3的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
cSEQ ID NO :2的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；以及SEQ ID NO 3的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
d如SEQ ID NO :4和5中所示的重鏈⑶R 1和2 (HCDR1、HCDR2)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；任選地其中該重鏈包括如SEQ ID NO :4、5禾口 6中所示的CDR 1、2和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
e 如 SEQ ID NO :7、8 禾口 9 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
f 如 SEQ ID NO :4、5 和 6 中所示的重鏈 CDR 1、2 禾口 3 (HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；以及如SEQ ID NO 7, 8和9中所示的輕鏈⑶R 1、2和3(IXDR1、IXDR2、IXDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
g與具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、90%或95%一致的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
h與具有SEQ ID NO 3氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、90%或95% 一致的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代。在此任何一個實施方案的另一個方面中，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2以及3的任何一項可以表征為具有一種氨基酸序列，該序列與對應(yīng)SEQ ID NO中所列的特定⑶R或⑶R組享有至少50 %、60 %、70 %、80 %、85 %、90 %或95 %的序列一致性。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與上述(a)至(h)的一種單克隆抗體競爭TLR3結(jié)合。
抗體23C8已經(jīng)對抗體23C8進(jìn)行了測序。重鏈可變區(qū)的氨基酸序列列出為SEQID NO :26，并且輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列列出為SEQ ID NO :27。對該重鏈和輕鏈可變區(qū)進(jìn)行編碼的核酸序列對應(yīng)地列于SEQ ID NOS 57以及58中。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體結(jié)合與單克隆抗體23C8基本上相同的表位或決定簇；任選地該抗體包括抗體 23C8的一個抗原結(jié)合區(qū)。在此任何一個實施方案中，抗體23C8可以通過其氨基酸序列和/ 或?qū)ζ溥M(jìn)行編碼的核酸序列來表征。在一個優(yōu)選的實施方案中，該單克隆抗體包括23C8的 Fab或F(ab' )2部分。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體包括23C8的重鏈可變區(qū)。 根據(jù)一個實施方案，該單克隆抗體包括23C8的重鏈可變區(qū)的三個⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該抗體進(jìn)一步包括23C8的可變的輕鏈可變區(qū)或23C8的輕鏈可變區(qū)的一個、兩個或三個⑶R。任選地任何一個或多個所述輕鏈或重鏈⑶R可以包括一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸修飾(例如，取代、插入或缺失)。任選地，提供了一種抗體，其中包括部分或全部的抗體23C8的抗原結(jié)合區(qū)的這些輕鏈和/或重鏈可變區(qū)中任何一項被融合到IgG型的一個免疫球蛋白恒定區(qū)上，任選是一個人類恒定區(qū)，任選是一個人類IgGl或IgG4同種型。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該抗體是23C8。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種純化的多肽，該多肽編碼一種抗體，其中該抗體包括一個VHCDRl區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 28中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VHCDR2區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 29中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VHCDR3區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 30中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VLCDRl區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID N0:31中所給出的氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VIXDR2區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 32中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VLCDR3區(qū)，該區(qū)包括如SEQ IDNO 33中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代。在又另一個方面中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體包括各自具有至少三個CDR 的一個重鏈和/或一個輕鏈，其中該至少三個CDR中的一個、兩個或三個具有針對對應(yīng)的重鏈和輕鏈的序列SEQ ID NO 28至30以及31至33，并且在酸性條件下它們的抗體特異性地結(jié)合到TLR3上。在另一個方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類TLR3的一種抗體，該抗體包括
a SEQ ID NO J6的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
b SEQ ID NO :27的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
c SEQ ID NO J6的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；以及SEQ ID NO ,21的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
d如SEQ ID NO 觀和四中所示的重鏈⑶R 1和2 (HCDR1、HCDR2)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；任選地其中該重鏈包括如SEQ ID NO 28,29和30中所示的CDR 1、2和3 (HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列， 其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
e 如 SEQ ID N0:31、32 和 33 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3 (LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
f 如 SEQ ID NO 28,29 和 30 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3 (HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；以及如SEQ ID NO 31,32和33中所示的輕鏈CDR 1、2和3 (LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列， 其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
g與具有SEQ ID NO :26氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、90%或95% 一致的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
h與具有SEQ ID NO 27氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、90%或95% 一致的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代。在此任何一個實施方案的另一個方面中，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2以及3的任何一項可以表征為具有一種氨基酸序列，該序列與對應(yīng)的SEQ IDNO中所列的特定⑶R或⑶R組享有至少50 %、60 %、70 %、80 %、85 %、90 %或95 %的序列一致性。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與上述(a)至(h)的一種單克隆抗體競爭TLR3結(jié)合。
抗體^Fl經(jīng)對抗體^Fll進(jìn)行了測序。重鏈可變區(qū)的氨基酸序列列出為SEQ IDNO :18，并且輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列列出為SEQ ID N0:19。對該重鏈和輕鏈可變區(qū)進(jìn)行編碼的核酸序列對應(yīng)地列于SEQ ID NOS 55以及56中。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體結(jié)合與單克隆抗體28F11基本上相同的表位或決定簇；任選地該抗體包括抗體^Fll的一種抗原結(jié)合區(qū)。在此任何一個實施方案中，抗體^Fll可以通過其氨基酸序列和/或?qū)ζ溥M(jìn)行編碼的核酸序列來表征。在一個優(yōu)選的實施方案中，該單克隆抗體包括觀？11的Fab或F(ab' )2部分。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體包括^Fll的重鏈可變區(qū)。根據(jù)一個實施方案，該單克隆抗體包括觀Fll的重鏈可變區(qū)的三個⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該抗體進(jìn)一步包括^Fll的可變的輕鏈可變區(qū)或^Fll的輕鏈可變區(qū)的一個、兩個或三個⑶R。任選地任何一個或多個所述輕鏈或重鏈⑶R可以包括一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸修飾(例如，取代、插入或缺失)。任選地，提供了一種抗體，其中包括部分或全部的抗體^Fll的抗原結(jié)合區(qū)的這些輕鏈和/或重鏈可變區(qū)中任何一項被融合到IgG型的一個免疫球蛋白恒定區(qū)上，任選是一個人類恒定區(qū)，任選是一個人類IgGl 或IgG4同種型。在另一個優(yōu)選實施方案中，該抗體是觀？11。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種純化的多肽，該多肽編碼一種抗體，其中該抗體包括一個VHCDRl區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 20中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VHCDR2區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 21中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VHCDR3區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 22中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VLCDRl區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO :23中所給出的氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VLCDR2區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 24中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VIXDR3區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 25中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代。在又另一個方面中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體包括各自具有至少三個CDR 的一個重鏈和/或一個輕鏈，其中該至少三個CDR中的一個、兩個或三個具有針對對應(yīng)的重鏈和輕鏈的序列SEQ ID NO 20至22以及23至25，并且在酸性條件下它們的抗體特異性地結(jié)合到TLR3上。在另一個方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類TLR3的一種抗體，該抗體包括
a SEQ ID NO :18的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
b SEQ ID NO :19的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
c SEQ ID NO :18的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；以及SEQ ID NO 19的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
d如SEQ ID N0:20禾口 21中所示的重鏈⑶R 1和2 (HCDR1，HCDR2)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；任選地其中該重鏈包括如SEQ ID NO :20、21和22中所示的CDR 1、2和3 (HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列， 其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
e 如 SEQ ID NO -.23,24 和 25 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3 (LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
f 如 SEQ ID NO 20,21 和 22 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3 (HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；以及如SEQ ID NO :23、對和25中所示的輕鏈CDR 1、2和3 (LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列， 其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或g與具有SEQ ID NO :18氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、90%或95% 一致的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
h與具有SEQ ID NO :19氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、90%或95% 一致的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代。在此任何一個實施方案的另一個方面中，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2以及3的任何一項可以表征為一種氨基酸序列，該序列具有與對應(yīng)的SEQ IDNO中所列的特定⑶R或⑶R組享有至少50 %、60 %、70 %、80 %、85 %、90 %或95 %的序列一致性。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與上述(a)至(h)的一種單克隆抗體競爭TLR3結(jié)合。
抗體34A3已經(jīng)對抗體34A3進(jìn)行了測序。重鏈可變區(qū)的氨基酸序列列出為SEQID NO :34，并且輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列列出為SEQ ID NO :35。對該重鏈和輕鏈可變區(qū)進(jìn)行編碼的核酸序列對應(yīng)地列于SEQ ID NOS 59以及60中。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體結(jié)合與單克隆抗體34A3基本上相同的表位或決定簇；任選地該抗體包括抗體 34A3的一種抗原結(jié)合區(qū)。在此任何一個實施方案中，抗體34A3可以通過其氨基酸序列和/ 或?qū)ζ溥M(jìn)行編碼的核酸序列來表征。在一個優(yōu)選的實施方案中，該單克隆抗體包括34A3的 Fab或F(ab' )2部分。還提供了一種單克隆抗體，該單克隆抗體包括34A3的重鏈可變區(qū)。 根據(jù)一個實施方案，該單克隆抗體包括34A3的重鏈可變區(qū)的三個⑶R。還提供了一種單克隆抗體，該抗體進(jìn)一步包括34A3的可變的輕鏈可變區(qū)或34A3的輕鏈可變區(qū)的一個、兩個或三個⑶R。任選地任何一個或多個所述輕鏈或重鏈⑶R可以包括一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸修飾(例如，取代、插入或缺失)。任選地，提供了一種抗體，其中包括部分的或全部的抗體34A3的抗原結(jié)合區(qū)的這些輕鏈和/或重鏈可變區(qū)中任何一項被融合到IgG型的一個免疫球蛋白恒定區(qū)上，任選是一個人類恒定區(qū)，任選是一個人類IgGl或IgG4同種型。 在另一個優(yōu)選實施方案中，該抗體是34A3。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種純化的多肽，該多肽編碼一種抗體，其中該抗體包括一個VHCDRl區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 36中列出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VHCDR2區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO: 37中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VHCDR3區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 38中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VIXDRl區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 39中所給出的氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VLCDR2區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID NO 40中所給出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；一個VIXDR3區(qū)，該區(qū)包括如SEQ ID N0:41中列出的一種氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代。在又另一個方面中，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體包括各自具有至少三個⑶R 的一個重鏈和/或一個輕鏈，其中該至少三個CDR中的一個、兩個或三個具有針對對應(yīng)的重鏈和輕鏈的序列SEQ ID NO 36至38以及四至41，并且在酸性條件下它們的抗體特異性地結(jié)合到TLR3上。另一個方面，本發(fā)明提供了結(jié)合人類TLR3的一種抗體，該抗體包括
a SEQ ID NO :34的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
b SEQ ID NO :35的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
c SEQ ID NO :34的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；以及SEQ ID NO 35的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
d 如 SEQ ID NO 36,37 和 38 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3 (HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
e 如 SEQ ID NO :39、40 和 41 中所示的輕鏈 CDR 1、2 和 3 (LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個或多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
f 如 SEQ ID NO 36,37 和 38 中所示的重鏈 CDR 1、2 和 3 (HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；以及如SEQ ID NO 39,40和41中所示的輕鏈CDR 1、2和3 (LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列， 其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
g與具有SEQ ID NO :34氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、90%或95% 一致的重鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代；或
h與具有SEQ ID NO 35氨基酸序列的可變區(qū)至少60%、70%、80%、85%、90%或95% 一致的輕鏈可變區(qū)，其中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一種不同的氨基酸取代。在此任何一個實施方案的另一個方面，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2以及3的任何一項可以表征為一種氨基酸序列，該序列具有與對應(yīng)的SEQ ID NO中所列的特定⑶R或⑶R組享有至少50 %、60 %、70 %、80 %、85 %、90 %或95 %的序列一致性。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種抗體，該抗體與上述(a)至(h)的一種單克隆抗體競爭TLR3結(jié)合。在本發(fā)明的任何一個抗體中，例如31C3、29H3、23C8、28F11或34A3，所指定的可變區(qū)以及⑶R序列可以包括保守的序列修飾。保守的序列修飾是指未顯著地影響或改變包含該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征的氨基酸修飾。這類保守修飾包括氨基酸取代、添加以及缺失?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如定點誘變以及PCR介導(dǎo)的誘變)將多種修飾引入本發(fā)明的抗體中。保守氨基酸的取代典型地是以下取代，其中用具有類似理化特性的側(cè)鏈的一個氨基酸殘基來替換一個氨基酸殘基。所指定的可變區(qū)以及CDR序列可以包括一個、兩個、三個、四個或更多個氨基酸插入、缺失或取代。當(dāng)進(jìn)行取代時，優(yōu)選的取代應(yīng)當(dāng)是保守修飾。在本領(lǐng)域中已經(jīng)確定了具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，本發(fā)明抗體的CDR區(qū)域內(nèi)的一個或多個氨基酸殘基可以用來自相同側(cè)鏈家族的其他氨基酸殘基替換，并且經(jīng)改變的抗體可以使用在此說明的測定法來測試所保留的功能(即，在此給出的特性)。術(shù)語“一致性”或“一致的”當(dāng)用于兩種或更多種多肽的序列之間的關(guān)系時，是指多肽之間序列關(guān)聯(lián)性程度，正如通過兩個或更多個氨基酸殘基鏈之間匹配數(shù)量所確定?！耙恢滦浴庇猛ㄟ^一種特定的數(shù)學(xué)模型或計算機(jī)程序(即“算法”)來解決的間隙比對(如果存在話)測量了兩個或更多個序列中較小者之間一致性匹配的百分比?？梢酝ㄟ^已知的方法容易地計算相關(guān)多肽的一致性。這類方法包括但不限于在以下文獻(xiàn)中所說明的方法 Computational Molecular Biology (計算分子生物學(xué))，Lesk, A.M.，ed.， OxfordUniversity Press (牛津大學(xué)出版社)，New York (紐約)，1988 ；Biocomputing (生物計算):Informatics and Genome Projects, Smith,D. W. , ed. ,AcademicPress (美國學(xué)術(shù)出 IK ± )，New York( )，1993 ；Computer Analysis ofSequence Data, Part 1，Griffin, A. M.，and Griffin, H. G.，eds.，Humana Press (美國胡馬納出版社)，New Jersey (新澤西州)，1994 ；Sequence Analysis inMolecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press (美國學(xué)術(shù)出版社)，1987 ;Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. ,eds.，M. Stockton Press (斯托克頓出版社)，New York (紐約)，1991 ；以及 Carillo 等人，SIAM J. Applied Math. 48 1073 (1988)。用于確定一致性的優(yōu)選的方法經(jīng)設(shè)計以給出所測試序列之間的最大匹配。在公開地可得到的計算機(jī)程序中說明了確定一致性的方法。用于確定兩個序列之間一致性的優(yōu)選的計算機(jī)程序方法包括GCG程序包，該程序包包括GAP (Devereux等人，Nucl. Acid. Res. 12, 387(1984) ；Genetics Computer Group，威斯康辛大學(xué)，麥迪遜市，威斯康辛州。)、BLASTP、 BLASTN、以及 FASTA (Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215,403-410 (1990))。BLASTX 程序可以公開地從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)以及其他來源(BLAST手冊，Altschul等人，NCB/ NLM/NIH Bethesda,Md. 20894 ；Altschul 等人，同上)得到。熟知的 Smith Waterman (史密斯特曼)算法還可以使用來確定一致性。根據(jù)AbM (Oxford Molecular的AbM抗體模擬軟件定義)、Kabat以及Chothia定義系統(tǒng)，已經(jīng)將根據(jù)本發(fā)明的抗體的CDR的序列匯總于以下表A中。將在此說明的氨基酸序列根據(jù)Abm、Kabat以及Chothia編號系統(tǒng)編號。盡管可以將任何適當(dāng)?shù)木幪栂到y(tǒng)用于指定的 ⑶R區(qū)上，在無任何其他說明時在此使用的編號是Abm。使用以下的指示已經(jīng)建立起這種編號⑶R-Ll 起始大致殘基M，殘基之前通常是一個Cys，殘基之后通常是一個Trp (典型地是 Trp-Tyr-Gln，但也可以是 Trp-Leu-Gln、Trp-Phe-Gln、Trp-Tyr-Leu)，長度10 至 17 個殘基；⑶R-L2 起始在Ll的末端之后通常16個氨基酸，殘基之前通常是Ile-Tyr (但也可以是Val-Tyr、Ile-Lys、Ile-Phe)，長度通常是7個殘基；CDR-L3，起始通常在L2末端之后33個殘基，殘基之前通常是Cys，殘基之后通常是Wie-Gly-Xaa-Gly，長度7至11 殘基；⑶R-H1，起始大致殘基沈(通常是在一個Cys之后4個殘基)(Chothia/AbM定義， Kabat定義是在5個殘基之后起始)，殘基之前通常是Cys-Xaa-Xaa-Xaa，殘基之后通常是一個Trp (典型地是Trp-Val，但也可以是Trp-Ile，Trp-Ala)，長度10至12個殘基(AbM 定義，Chothia定義排除了最后4個殘基)；CDR-H2，起始通常在CDR-Hl的Kabat/AbM定義的末端之后15個殘基，殘基之前通常是Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (但有很多變化，殘基之后Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala)，長度Kabat 定義為 16 至 19 個殘基；AbM(以及Chothia)定義為提前7個殘基結(jié)束；⑶R-H3，起始通常是⑶R-H2末端之后的33個殘基(通常在一個Cys之后2個殘基)，殘基之前通常是Cys-Xaa-Xaa(典型地Cys-Ala-Arg)，殘基之后通常是Trp-Gly-Xaa-Gly，長度3至25個殘基。根據(jù)本發(fā)明的這些抗體的可變鏈的序列列于以下表B中，信號肽序列用斜體字表示，并且CDR以粗體字提供。術(shù)語χ/χ指示兩個所指氨基酸中任何一個可以存在于特定的氨基酸殘基上，例如術(shù)語F/S是指在給定位置上該氨基酸可以是苯丙氨酸亦或絲氨酸。在此任何一個實施方案中，一個VL或VH序列可以被指定或編號從而包含或缺少該信號肽或其任何一個部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是人類或小鼠IgGl同種型。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是人類IgG4同種型。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是保留其結(jié)合和 /或功能特性的抗體片段。
表A
權(quán)利要求
1.一種特異性地結(jié)合TLR3多肽的單克隆抗體，其中所述抗體抑制由該TLR3多肽的信號傳送而不阻斷dsRNA TLR3配體結(jié)合到該TLR3多肽上。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其中任選地在酸性和/或中性條件下所述抗體與選自下組的一種抗體競爭結(jié)合到一個TLR3多肽上，該組的組成為(a)—種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS 34以及35 (34A3)的一個VH區(qū)和一個 VL區(qū)，(b)—種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS 10以及11 (29H3)的一個VH區(qū)和一個 VL區(qū)，(c)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS 18以及19Q8F11)的一個VH區(qū)和一個 VL區(qū)，(d)—種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS沈以及27 Q3C8)的一個VH區(qū)和一個 VL區(qū)，以及(e)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS 2以及3(31C3)的一個VH區(qū)和一個VL區(qū)。
3.如權(quán)利要求1-2所述的抗體，其中所述抗體包括一個輕鏈，該輕鏈包括(a)一種選自SEQ ID NOS :61、64以及65的輕鏈CDRl (LCDRl)氨基酸序列；(b)一種選自SEQ ID NOS :62、66以及67的輕鏈CDR2 (LCDR2)氨基酸序列；以及(c)一種選自SEQ ID NOS :63、68、69以及70的輕鏈CDR3 (LCDR3)氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1-3所述的抗體，其中所述抗體包括一個重鏈，該重鏈包括(a)一種選自SEQ ID NOS 71至76的重鏈CDRl (HCDRl)氨基酸序列；(b)一種選自SEQ ID NOS 77至81的重鏈CDR2 (HCDR2)氨基酸序列；以及(c)一種選自SEQ ID NOS 82至85的重鏈CDR3 (HCDR3)氨基酸序列。
5.一種特異性地結(jié)合人類TLR3多肽的單克隆抗體，其中在酸性條件下所述抗體以針對其二價結(jié)合親和性亞納摩爾Kd特異性地結(jié)合到該TLR3多肽上。
6 如權(quán)利要求5所述的抗體，其中所述抗體調(diào)節(jié)TLR3信號傳送而不阻斷一個dsRNA TLR3配體結(jié)合到該TLR3多肽上。
7.如權(quán)利要求5至6所述的抗體，其中所述抗體抑制TLR3信號傳送。
8.如權(quán)利要求1-7所述的抗體，其中所述抗體在樹突細(xì)胞中調(diào)節(jié)TLR3信號傳送。
9.如權(quán)利要求1-4以及6-8所述的抗體，其中在酸性條件下所述抗體以針對其二價結(jié)合親和性亞納摩爾的Kd特異性地結(jié)合到該TLR3多肽上。
10.如權(quán)利要求5-9所述的抗體，其中所述酸性條件包括在4.5至6. 5之間的pH。
11.如權(quán)利要求1-10所述的抗體，其中在中性條件下所述抗體以針對二價結(jié)合親和性亞納摩爾的Kd特異性地結(jié)合到一個TLR3多肽上。
12.如權(quán)利要求11所述的抗體，其中所述中性條件包括在6.6至7. 4之間的pH。
13.—種任選地在酸性和/或中性條件下與選自下組的一種抗體競爭結(jié)合到TLR3多肽上的抗體，該組的組成為(a)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS 34以及35(34A3)的一個VH區(qū)和一個 VL區(qū)，(b)—種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS 10以及11 Q9H3)的一個VH區(qū)和一個VL區(qū)，(c)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS 18以及19Q8F11)的一個VH區(qū)和一個 VL區(qū)，(d)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS沈以及27 Q3C8)的一個VH區(qū)和一個 VL區(qū)，以及(e)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有SEQ ID NOS 2以及3(31C3)的一個VH區(qū)和一個VL區(qū)。
14.如權(quán)利要求1-13所述的抗體，其中該抗體是選自下組，該組的組成為(a)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有(i)如SEQ ID NO 4,5以及6中所示的重鏈⑶R 1、 2以及3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如SEQ ID NO :7、8以及9中所示的輕鏈CDR 1、2以及3(LCDR1、LCDR2、LCDR3)氨基酸序列；(b)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有⑴如SEQ ID NO 12,13以及14中所示的重鏈⑶R 1、2 以及 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如 SEQ ID NO :15、16 以及 17 中所示的輕鏈⑶R 1、2以及3(IXDR1、IXDR2、IXDR;3)氨基酸序列；(c)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有(i)如SEQ ID NO 20,21以及22中所示的重鏈⑶R 1、2 以及 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如 SEQ ID NO :23、24 以及 25 中所示的輕鏈⑶R 1、2以及3(IXDR1、IXDR2、IXDR;3)氨基酸序列；(d)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有⑴如SEQ ID NO 28,29以及30中所示的重鏈⑶R 1、2 以及 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如 SEQ ID NO :31、32 以及 33 中所示的輕鏈⑶R 1、2以及3(IXDR1、IXDR2、IXDR;3)氨基酸序列；以及(e)一種抗體，該抗體對應(yīng)地具有(i)如SEQ ID NO 36,37以及38中所示的重鏈⑶R 1、2 以及 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)氨基酸序列，以及(ii)如 SEQ ID NO :39、40 以及 41 中所示的輕鏈⑶R 1、2以及3 0XDR1、IXDR2、IXDR； )氨基酸序列；并且其中在任何一個所述序列中這些氨基酸中的一個、兩個、三個或更多個可以被一個不同的氨基酸取代。
15.如權(quán)利要求1至14所述的抗體，其中所述抗體是一種小鼠抗體。
16.如權(quán)利要求1至14所述的抗體，其中所述抗體是一種嵌合體、人類或人源化抗體。
17.如權(quán)利要求1至16所述的抗體，其中所述抗體是一種IgG同種型。
18.如權(quán)利要求17所述的載體，其中所述抗體的同種型是一種IgG4。
19.如權(quán)利要求1至18所述的抗體，其中該抗體包括一個Fc區(qū)，該Fc區(qū)基本上不結(jié)合 Fc y R0
20.如權(quán)利要求1至19所述的抗體，其中所述抗體是選自以下各項的一種抗體片段 Fab, Fab' ,Fab' _SH、F(ab' ) 2、Fv、雙抗體、單鏈抗體片段、或包括多種不同抗體片段的一種多特異性的抗體。
21.如權(quán)利要求1至20所述的抗體，其中所述抗體連接或共價結(jié)合到一個毒性部分上。
22.如權(quán)利要求1至21所述的抗體，其中所述抗體能夠被一種表達(dá)TLR3的細(xì)胞內(nèi)化， 任選被一種癌細(xì)胞內(nèi)化。
23.如權(quán)利要求1至20所述的抗體，其中所述抗體被連接或共價結(jié)合到一個可檢出的部分上。
24.通過嵌合化或人源化如權(quán)利要求1至23所述的抗體而得到的一種抗體。
25.—種包括以上權(quán)利要求中任何一項所述的抗體的試劑盒，該試劑盒任選地進(jìn)一步包括一種標(biāo)記的二抗，該二抗特異性地識別以上權(quán)利要求中任何一項所述的抗體。
26.一種產(chǎn)生如權(quán)利要求1至M所述抗體的雜交瘤或重組體宿主細(xì)胞。
27.如權(quán)利要求沈所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生如權(quán)利要求13或14所述的一種抗體。
28.如權(quán)利要求沈所述的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞產(chǎn)生抗體31C3或抗體^H3。
29.一種在哺乳動物受試者體內(nèi)產(chǎn)生特異性地結(jié)合TLR3多肽的抗體的方法，所述方法包括以下步驟a)用包括人類TLR3多肽的一種免疫原來免疫一種非人類哺乳動物；以及 b)從所述免疫的動物體內(nèi)選擇一種抗體，在酸性以及中性條件下該抗體以高親和性結(jié)合到該TLR3多肽上并且調(diào)節(jié)TLR3信號傳送。
30.如權(quán)利要求四所述的方法，其中與中性條件相比較，所選出的抗體在酸性條件下基本上沒有失去對TLR3多肽的結(jié)合親和性。
31.如權(quán)利要求四所述的方法，其中選擇該抗體來抑制TLR3信號傳送而不阻斷TLR3 配體結(jié)合到TLR3多肽上。
32.—種在哺乳動物受試者體內(nèi)產(chǎn)生特異性地結(jié)合TLR3多肽的抗體的方法，所述方法包括以下步驟a)用包括人類TLR3多肽的一種免疫原來免疫一種非人類哺乳動物；以及 b)從所述免疫的動物體內(nèi)選擇一種抗體，該抗體抑制TLR3信號傳送而不阻斷TLR3配體結(jié)合到TLR3多肽上。
33.如權(quán)利要求四至32所述的方法，其中在步驟(b)中制備的抗體是單克隆抗體。
34.如權(quán)利要求四至33所述的方法，進(jìn)一步包括一個步驟，其中對所述抗體特異性結(jié)合到人類TLR3多肽上的能力進(jìn)行評價。
35.如權(quán)利要求四至34所述的方法，進(jìn)一步包括一個步驟，其中對所述抗體與抗體 29H3和/或31C3競爭結(jié)合到人類TLR3多肽上的能力進(jìn)行評價。
36.如權(quán)利要求四至35所述的方法，進(jìn)一步包括制造這些選出的單克隆抗體的片段或衍生物的步驟。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述片段或衍生物是選自下組，該組的組成為 Fab, Fab' ,Fab' _SH、F(ab' ) 2、Fv、雙抗體、單鏈抗體片段、或包括多種不同抗體片段的多特異性的抗體、人源化抗體、以及嵌合體抗體。
38.一種藥用組合物，該組合物包括如權(quán)利要求1-23中任何一項所述的一種抗體或根據(jù)權(quán)利要求M或四至37所述可以得到的一種抗體，以及一種藥學(xué)上可接受的載體。
39.一種用于治療或預(yù)防選自下組的疾病的方法，該組的組成為自身免疫性疾病、炎癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、感染、硬化以及膿毒癥，所述方法包括向需要它的病人給予一個治療有效量的如權(quán)利要求1- 或38中任何一項所述的一種抗體或藥用組合物。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中該疾病是一種感染。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其中該疾病是與感染相關(guān)聯(lián)的一種炎癥。
42.如權(quán)利要求39或41所述的方法，其中該疾病是肺部炎癥。
43.如權(quán)利要求39所述的方法，其中該疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
44.如權(quán)利要求39所述的方法，其中該疾病是膿毒癥。
45.如權(quán)利要求39所述的方法，其中該疾病是硬化。
46.如權(quán)利要求39所述的方法，其中該疾病是糖尿病。
47.如權(quán)利要求39所述的方法，其中該疾病是骨質(zhì)疏松癥。
48.如權(quán)利要求39所述的方法，其中該疾病是患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人體內(nèi)的骨質(zhì)疏松癥。
49.如權(quán)利要求39至48所述的方法，進(jìn)一步包括向該病人給予一個適當(dāng)?shù)念~外的選自下組的治療試劑的步驟，該組的組成為一種免疫調(diào)節(jié)劑、一種皮質(zhì)類固醇、一種免疫抑制劑、一種抗生素、一種抗病毒試劑以及一種抗炎劑。
50.一種用于治療或預(yù)防癌癥的方法，包括向需要它的病人給予一個治療有效量的如權(quán)利要求21或22中任何一項所述的一種抗體或藥用組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性地結(jié)合TLR3的并且任選地進(jìn)一步調(diào)節(jié)例如抑制信號傳送的抗體(例如單克隆抗體)、抗體片段、以及它們的衍生物。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這類抗體的細(xì)胞；制造這類抗體的方法；這類抗體的片段、變異體、以及衍生物；包括以上物質(zhì)的藥用組合物；使用這類抗體來診斷、治療或預(yù)防疾病例如自身免疫性疾病、炎性疾病等的方法。
文檔編號C07K16/28GK102471382SQ201080030919
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日
發(fā)明者亞尼斯·莫雷爾, 凱瑟琳·馬薩克里爾, 勞倫特·戈捷, 卡里納·帕蒂雷爾 申請人:依奈特制藥公司