專利名稱：可注射生物材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及原彈性蛋白(tropoelastin)，并涉及使用生物材料進行組織修復(fù)和復(fù)原。
背景技術(shù)：
彈性蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，其主要存在于皮膚、血管、肺以及需要一定程度的彈性來行使功能的其它組織和器官中。它通常是這樣形成的原彈性蛋白分子上的賴氨酸殘基與另一些原彈性蛋白分子上的賴氨酸殘基發(fā)生交聯(lián)，形成在水溶液中幾乎不溶的團。預(yù)期彈性蛋白、原彈性蛋白和相關(guān)蛋白質(zhì)可用于包括組織修復(fù)和復(fù)原的醫(yī)療應(yīng)用中，尤其需要可通過注射施用給組織的、具有高固含量(high solids content)的此類蛋白質(zhì)的組合物。盡管在W099/11196和W02008/058323中提到了由生物材料形成的微顆粒，但是尚沒有具有高固含量之此類蛋白質(zhì)并具有足以通過注射進行組織遞送之流動特性的更小顆粒結(jié)構(gòu)的組合物。一個問題是，當(dāng)固含量高時，原彈性蛋白形成的團不能通過臨床和美容應(yīng)用中采用的各種規(guī)格的針進行遞送。仍需要這樣的組合物，其具有高固含量的原彈性蛋白或其它彈性材料并具有使所述組合物能通過注射遞送到組織的流動特性。在本說明書中對任何現(xiàn)有技術(shù)的引用不是也不應(yīng)被認(rèn)為是對以下的承認(rèn)或任何形式的暗示，即該現(xiàn)有技術(shù)形成澳大利亞或任何其它管轄區(qū)域的公知常識的一部分，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員有理由預(yù)期該現(xiàn)有技術(shù)被確認(rèn)、理解并認(rèn)為是相關(guān)的。發(fā)明概述在一些實施方案中，提供了一種由原彈性蛋白形成的可注射組合物，所述組合物包含含有原彈性蛋白的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)還包含一種其量有效地為所述物質(zhì)提供流動特性以使所述組合物能被注射的試劑。所述含有原彈性蛋白的物質(zhì)可為顆?；蚍穷w粒。在一些實施方案中，提供了一種用于矯正組織缺陷的可注射組合物，所述組合物包含含有多個由原彈性蛋白形成之微顆粒的液相，所述液相具有溶于其中的聚結(jié)控制劑， 其量有效地減少所述微顆粒的聚結(jié)。在一些實施方案中，提供了生產(chǎn)由原彈性蛋白形成之微顆粒的方法，其包括在液相中凝聚或聚合原彈性蛋白的步驟，所述液相中溶解有聚結(jié)控制劑。除了根據(jù)上下文有另外解釋的情形外，本文所用的術(shù)語“包含”及該術(shù)語的多種變化形式(如“包括”、“含有”)不旨在排除其它添加物、組分、整數(shù)或步驟。


圖IA 由原彈性蛋白形成的、估計直徑為1 μ m的微顆粒的SEM圖，其通過用堿處理ang/mL的原彈性蛋白溶液[實施例1]而后在37°C孵育4小時來制備。圖IB 彈性材料團的圖，所述彈性材料團如實施例2所述進行制備，即用堿處理 10mg/ml的原彈性蛋白溶液，然后在不存在聚結(jié)控制劑的情況下于37°C下孵育。制得的材料是不適于注射的致密彈性團。圖2 由原彈性蛋白形成的小球的SEM圖，所述小球通過在1 % (重量/體積)CMC 存在下用0. 05% (體積/體積)戊二醛處理50mg/mL的原彈性蛋白溶液而后在37°C孵育 24小時來制備。圖3 由原彈性蛋白形成的聚結(jié)小球的SEM圖，所述聚結(jié)小球通過在(重量/ 體積)中等粘度HA存在下用0. 05% (體積/體積)戊二醛處理50mg/mL的原彈性蛋白溶液而后在37°C孵育16小時來制備。圖4A 由原彈性蛋白形成之聚結(jié)小球制成的材料的SEM圖，所述聚結(jié)小球的表觀直徑范圍為約1 4 μ m，所述材料通過在1 % (重量/體積)HA存在下用堿處理10mg/mL 的原彈性蛋白溶液而后在37°C孵育過夜來制備。圖4B 由原彈性蛋白形成之聚結(jié)小球制成的材料的SEM圖，所述聚結(jié)小球的表觀直徑范圍為約1 4μπι，所述材料通過在(重量/體積)HA存在下用堿處理25mg/mL 的原彈性蛋白溶液而后在37°C孵育過夜來制備。圖4C 由原彈性蛋白形成之聚結(jié)小球制成的材料的SEM圖，所述聚結(jié)小球的表觀直徑范圍為約1 10 μ m，所述材料通過在1 % (重量/體積)HA存在下用堿處理50mg/mL 的原彈性蛋白溶液而后在37°C孵育過夜來制備。圖4D 由原彈性蛋白形成之聚結(jié)小球制成的材料的SEM圖，所述聚結(jié)小球的表觀直徑范圍為約0. 5 20 μ m，所述材料通過在1 % (重量/體積)HA存在下用堿處理75mg/ mL的原彈性蛋白溶液而后在37°C孵育過夜來制備。圖5 通過在(重量/體積)HA存在下用堿處理(〇)lOmg/mL原彈性蛋白； (· ) 25mg/mL原彈性蛋白；(□ ) 50mg/mL原彈性蛋白和(■ ) 75mg/mL原彈性蛋白而后在 37°C孵育過夜制成的小球的大小分布(小球直徑(ym)相對于所計數(shù)小球的百分比)。數(shù)據(jù)從圖4A-4D的SEM圖中獲取。圖6A和6B 由原彈性蛋白形成的多種大小的聚結(jié)小球所制成的材料的SEM圖，所述材料通過在1 % (重量/體積)CMC存在下用0. 05 % (體積/體積)GA處理lOOmg/mL的原彈性蛋白溶液而后在37°C攪拌4小時來制備。圖7A和7B 由原彈性蛋白形成的聚結(jié)小球所制成的材料的SEM圖，所述材料通過在1 % (重量/體積)CMC存在下用堿處理lOOmg/mL的原彈性蛋白溶液而后在37°C攪拌孵育4小時來制備。圖7C和7D 由原彈性蛋白形成的聚結(jié)小球所制成的材料的SEM圖，所述材料如下制備在1 % (重量/體積)CMC存在下用堿處理lOOmg/mL的原彈性蛋白溶液，然后在37°C 攪拌孵育4小時，在4°C冷藏16小時，之后用IM HCl對溶液進行中和。圖8A和8B 通過在1. 5 % (重量/體積)黃原膠存在下用0. 05 % (體積/體積) GA處理lOOmg/mL原彈性蛋白溶液而后在37°C攪拌4小時所制成的材料的SEM圖。圖9A和9B 通過在2 % (重量/體積)HPC存在下用0.05% (體積/體積)GA處理lOOmg/mL的原彈性蛋白溶液而后在37°C攪拌4小時所制成的材料的照片和SEM圖。實施方案詳述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在原彈性蛋白固含量高的情況下原彈性蛋白聚結(jié)并交聯(lián)形成彈性蛋白和/或?qū)υ瓘椥缘鞍走M行堿性聚合作用形成彈性材料時(如W02008/058323所述，其內(nèi)容通過引用整體并入本文)，所形成的團不能通過手術(shù)針。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，不能注射之團的形成是由于固含量高的原彈性蛋白單體凝集或聚結(jié)成微顆粒或小球，其進一步凝集或聚結(jié)形成不能注射的團。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過在聚結(jié)控制劑的存在下聚結(jié)或聚合原彈性蛋白，原彈性蛋白固含量高時形成的不能注射的團可被減少(如果不能完全避免的話)， 從而形成具有高固含量和可注射組合物所需之流動特性的組合物。而且發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)整原彈性蛋白和聚結(jié)控制劑的相對量，可以控制小球凝集的程度，從而得到凝集小球形式的含原彈性蛋白的物質(zhì)，所述凝集小球具有預(yù)定的大小或結(jié)構(gòu)并具有注射應(yīng)用所期望的流動特性。還可以產(chǎn)生團形式的含原彈性蛋白的物質(zhì)，所述團也是可注射的但基本無微顆?；蛐∏蚪Y(jié)構(gòu)。在該情況下，所述可注射材料可以更好地被描述為“可變形團”，而不是分散的顆?；蛐∏?。這是引人關(guān)注的，因為通過原彈性蛋白交聯(lián)或堿性聚合形成的團通常不適于注射。 這些實施方案在如下情況下尤其有利臨床或美容應(yīng)用需要可注射入應(yīng)用位點的植入物。I.定義應(yīng)理解“原彈性蛋白”是指這樣的蛋白質(zhì)，其含有源自可交聯(lián)(通常通過賴氨酰氧化酶在賴氨酸殘基處交聯(lián))形成彈性蛋白的蛋白質(zhì)分子的至少部分疏水結(jié)構(gòu)域。已知多種原彈性蛋白的同工型(參見例如W099/03886，其內(nèi)容通過弓|用整體并入本文)。正常情況下在組織中不存在任何顯著量的原彈性蛋白，因為其通常幾乎在合成后立即交聯(lián)形成彈性蛋白。原彈性蛋白可以具有與GenBank條目AAC98394相同的序列。本領(lǐng)域已知另一些原彈性蛋白序列，其包括但不限于CAA33627(人，Homo sapiens)、P15502(人)、AAA42271 (褐家鼠，Rattus norvegicus)、AAA42272 (褐家鼠)、AAA42268 (褐家鼠)、AAA42269 (褐家鼠)、 AAA80155(小家鼠，Mus musculus)、AAA49082 (原雞，Gallus gallus)、P04985 (家牛，Bos taurus)、ABF82224(Danio rerio)、ABF82222 (Xenopus tropicalis)、 P11547(綿羊，Ovis aries)。原彈性蛋白還可以是這些序列的片段。一個實例是AAC98394 的27至7 位氨基酸。原彈性蛋白的另一實例由UniProtKB/Swiss 條目P15502描述。術(shù)語原彈性蛋白還旨在涉及彈性蛋白樣肽(elastin like ρ印tide)或“ELP”。原彈性蛋白可以是天然或重組的。例如，可通過重組表達系統(tǒng)(其實例在W000/04043和 W094/14958(其內(nèi)容通過引用在本文中全部公開)以及W099/03886中討論)或肽合成(如固相肽合成)獲得原彈性蛋白。“原彈性蛋白同源物”是指所具有的序列與原彈性蛋白參照序列不相同但相似的蛋白質(zhì)。其還與所述參照序列具有相同的功能。“彈性蛋白”是指正常情況下存在于皮膚、血管、肺以及需要彈性來行使功能的其它組織和器官中的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。其通過原彈性蛋白分子上的賴氨酸殘基共價交聯(lián)成團而形成，所述團幾乎不溶于水溶液。通常體內(nèi)原彈性蛋白分子的交聯(lián)通過一種或多種賴氨酰氧化酶發(fā)生。原彈性蛋白分子的交聯(lián)可以在體外通過化學(xué)交聯(lián)劑(如戊二醛或六亞甲基二異氰酸酯或其它能與蛋白質(zhì)反應(yīng)的交聯(lián)劑)介導(dǎo)。胺反應(yīng)性交聯(lián)劑的實例包括雙琥珀酰亞胺戊二酸酯(DSG)、雙(磺基琥珀酰亞胺)辛二酸鹽(BS3)、中性條件(pH 7)下的乙二醇二縮水甘油醚(E⑶E)、三琥珀酰亞胺氨基三乙酸酯(TSAT)、雙琥珀酰亞胺辛二酸酯(DSS)和β -[三(羥甲基)膦基]丙酸(THPP)。羧基反應(yīng)性交聯(lián)劑的實例包括1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和酸性條件(ρΗ<4)下的乙二醇二縮水甘油醚(EGDE)。由于原彈性蛋白可以以多種形式提供，彈性蛋白本身可以由多種結(jié)構(gòu)構(gòu)成，這影響彈性蛋白的彈性。交聯(lián)的程度不需要完全，在完全交聯(lián)時原彈性蛋白分子的所有潛在反應(yīng)位點都已交聯(lián)。事實上，原彈性蛋白可以僅部分交聯(lián)?！熬劢Y(jié)”是指隨著溫度升高到生理范圍原彈性蛋白(其通常在低溫下可溶于水溶液)傾向于凝集形成致密粘彈性相的過程。該過程主要由原彈性蛋白疏水結(jié)構(gòu)域之間的相互作用產(chǎn)生。通常認(rèn)為聚結(jié)是原彈性蛋白形成彈性蛋白的共價交聯(lián)的必要前提?！皬椥圆牧稀笔侵竿ㄟ^堿性聚合過程由原彈性蛋白形成的材料，所述過程如 W02008/058323所述涉及原彈性蛋白的疏水結(jié)構(gòu)域，它是形成具有彈性(可拉伸、有張力、 有彈性并且能回縮)的固體的不可逆過程。所述彈性材料可以僅部分聚合；在某些實施方案中聚合反應(yīng)不完全。彈性材料無論是否交聯(lián)均具有彈性；因此形成彈性材料的堿性聚合過程可以任選地進一步包括化學(xué)交聯(lián)步驟?！霸瓘椥缘鞍仔纬傻男∏颉被颉霸瓘椥缘鞍仔纬傻奈㈩w?！笔侵赴皬椥缘鞍住焙?“彈性材料”之一或兩者或由其組成的顆粒。這些顆粒傾向于在無聚結(jié)控制劑存在下進一步聚結(jié)或凝集成不可注射的團?！盎緹o顆粒結(jié)構(gòu)的可注射組合物”是原彈性蛋白形成的組合物，其中原彈性蛋白形成的小球已經(jīng)聚結(jié)或凝集成組合物中小球或顆粒結(jié)構(gòu)已不再明顯的狀態(tài)。盡管如此，所述組合物仍能被注射?！熬劢Y(jié)控制劑”是指減少、抑制或以另外方式控制原彈性蛋白形成之顆?；蛐∏虻哪?、聚簇或聚結(jié)從而允許本發(fā)明組合物進行遞送(通常經(jīng)由具有一般臨床或美容應(yīng)用中采用的內(nèi)徑或管徑的針或插管通過正壓遞送)的化合物或提取物。聚結(jié)控制劑一般增加液相的粘度，在所述液相中發(fā)生由原彈性蛋白聚結(jié)或聚合成彈性蛋白或彈性材料的過程。 在某些實施方案中，聚結(jié)控制劑限制從原彈性蛋白形成的小球進一步彼此聚結(jié)。在某些實施方案中，聚結(jié)控制劑阻止或抑制基本無顆粒結(jié)構(gòu)的含原彈性蛋白的材料形成不可注射固體。短語“有效減少聚結(jié)的量”是指足以抑制、減緩、延遲或基本上阻止由原彈性蛋白聚結(jié)形成小球的聚結(jié)控制劑之量。不需要阻止所有小球與其它小球的凝集或聚結(jié)。在某些實施方案中，優(yōu)選地可以發(fā)生小球的進一步聚結(jié)，前提是這基本不會防礙組合物被注射。特別地，在某些實施方案中，有效阻止凝結(jié)的量提供了基本無顆?；蛐∏蚪Y(jié)構(gòu)的可注射組合物?！翱勺⑸浣M合物”是指具有使其流過針或插管的特性的組合物。通常，所述針或插管具有臨床或美容應(yīng)用中通常采用的內(nèi)徑或管徑。在某些實施方案中，組合物將無顯著阻礙地通過內(nèi)徑約1. 194mm(對應(yīng)16號(gauge，G)針)的針或插管。更優(yōu)選地，所述組合物能容易地通過21號針。更優(yōu)選地，所述組合物能容易地通過27號針。術(shù)語“組織缺陷”是指導(dǎo)致異常組織結(jié)構(gòu)和/或功能的異常、畸形或不健全。組織缺陷可源于先天病癥、外科手術(shù)、外傷、疾病或其它損傷，或者通常與它們相關(guān)?；蛘?，組織缺陷可與衰老相關(guān)。實例包括組織彈性缺損、組織體積缺損、組織起皺和凹陷?！敖M織缺陷” 還可以指組織的結(jié)構(gòu)和功能處于解剖學(xué)和生理學(xué)的正常范圍內(nèi)，但患者認(rèn)為不充足并希望擴充的情形?！俺C正組織缺陷”是指至少部分地復(fù)原和/或增大組織結(jié)構(gòu)和/或功能，包括支持、加強、擴大組織或使組織更具彈性，或者促使組織缺陷中的組織生長。術(shù)語“治療有效量”是指改變或矯正組織缺陷所需的可注射組合物的量。所述有效量可根據(jù)以下因素來變化患者吸收或降解可注射組合物之組分的能力、被治療之病癥的性質(zhì)、治療部位、可注射組合物的組成、由原彈性蛋白形成的小球的濃度和特性，或者基本無顆粒結(jié)構(gòu)的含原彈性蛋白之團的量和性質(zhì)。II.組合物和制劑在某些實施方案中，提供了用于矯正組織缺陷的可注射組合物，所述組合物包含含有由原彈性蛋白形成的多個顆?；蛐∏虻囊合?，所述液相中溶解有能有效減少小球聚結(jié)之量的聚結(jié)控制劑。通常，由原彈性蛋白形成的小球的平均大小為0. 1微米至100微米。小球可以球或微球形式來提供。優(yōu)選的微球直徑范圍一般為約0. 05 μ m至50 μ m，優(yōu)選0. 1 μ m至25 μ m。 在某些實施方案中，小球基本上被聚結(jié)，從而提供了非顆粒外觀的組合物。包含在組合物中的原彈性蛋白的量為約1. 5mg/mL至約400mg/mL。優(yōu)選地，所包含的原彈性蛋白的量為約5mg/mL至約300mg/mL。更優(yōu)選地，所包含的原彈性蛋白的量為約 10mg/mL 至約 200mg/mLo如本文所討論地，每個小球均由原彈性蛋白形成，這意味著小球本身可以包含彈性蛋白、彈性材料或兩者皆有。因此，小球可以由共價交聯(lián)的原彈性蛋白或非交聯(lián)的原彈性蛋白形成，或者由這兩者形成。所述可注射組合物通常具有更加顆?；耐庥^，其中當(dāng)原彈性蛋白的濃度為約 50mg/mL及更低時，組合物具有分散的(或更典型地，部分凝集或聚結(jié)的)小球。不希望受理論的約束，認(rèn)為顆?；庥^是由于原彈性蛋白濃度較低時小球聚結(jié)或凝集的水平降低所
致。 在另一些實施方案中，提供了用于矯正組織缺陷的可注射組合物，所述組合物包含由原彈性蛋白形成的凝集小球和聚結(jié)控制劑(其量有效地減少小球的聚結(jié))。當(dāng)原彈性蛋白的濃度為約50mg/mL以上時，可注射組合物通常具有程度較低的顆粒化外觀。同樣，不希望受理論的約束，認(rèn)為原彈性蛋白濃度的增加導(dǎo)致小球聚結(jié)或凝集的增加，從而產(chǎn)生具有顆?；蛐∏蚪Y(jié)構(gòu)減少的可注射組合物。本發(fā)明的組合物通常包含聚結(jié)控制劑，尤其是為含原彈性蛋白的物質(zhì)提供流動特性的試劑。聚結(jié)控制劑一般是生物相容性的，例如，它們可顯示低毒性并且為非免疫原性的。 聚結(jié)控制劑可以是合成的、半合成的或天然來源的分子。在一個實施方案中，當(dāng)溶于液相時聚結(jié)控制劑具有凈負(fù)電荷。在另一個實施方案中，聚結(jié)控制劑包含當(dāng)溶于液相時具有凈負(fù)電荷的官能團。在一個實施方案中，聚結(jié)控制劑包含強酸性官能團，例如羧酸、硫酸、磷酸等。在另一實施方案中，聚結(jié)控制劑包含羥基官能團。聚結(jié)控制劑可以是具有多個羥基官能團的多元醇。在某些實施方案中，聚結(jié)控制劑是多糖。多糖為聚合糖結(jié)構(gòu)，由通過糖苷鍵連接在一起的重復(fù)單元(通常為單糖或二糖)形成。這些結(jié)構(gòu)通常為線性的，但是可以包含不同程度的分支。多糖常常是相當(dāng)不均一的，含有重復(fù)單元的少量修飾。根據(jù)結(jié)構(gòu)，這些大分子
8可具有與其寡糖構(gòu)成嵌段(oligosaccharide building block)不同的性質(zhì)。優(yōu)選地，多糖包含負(fù)電荷的官能團。在另一優(yōu)選實施方案中，聚結(jié)控制劑是包含艾杜糖醛酸、葡糖醛酸或N-乙酰葡糖胺殘基的多糖。合適的多糖包括例如羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、透明質(zhì)酸、黃原膠、瓜爾豆膠、葡聚糖、藻酸鹽、羧甲基葡聚糖及其可藥用鹽?；蛘?，多糖可以是果膠或其衍生物，包括線性或有分支的多糖。在另一實施方案中，聚結(jié)控制劑為單糖或寡糖，例如3’-Ν_乙酰神經(jīng)氨酰-N-乙酰氨基乳糖苷、3’ -唾液酸基-N-乙酰氨基乳糖苷、3’ -N-乙酰神經(jīng)氨酰-3-巖藻糖基乳糖、 6’-唾液酸基-N-乙酰氨基乳糖苷、N-乙酰葡糖胺、葡萄糖、乳糖、麥芽三糖醇、蔗糖、LS-四糖b及其可藥用鹽。另一些聚結(jié)控制劑包括糊精，如琥珀酰-β -環(huán)糊精、羧甲基-β -環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精，及其可藥用鹽。多糖衍生物可包括但不限于交聯(lián)或未交聯(lián)的多糖，其通常具有包含一下一種或多種基團的取代基或額外側(cè)鏈氫；烷基；芳基；烷基芳基；芳基烷基；含有氧、氮、硫或磷原子的取代烷基芳基；含有氧、氮、硫、磷、鹵素原子或金屬離子的取代芳基烷基；含有氧、氮、 硫、磷、鹵素原子或金屬離子的取代雜環(huán)基；并且其中所述取代基團可以直接彼此連接或者由選自以下的成員所分隔醚、酮、氨基、氧代羰基、硫酸鹽/酯、亞砜、甲酰胺、炔烴和烯烴； 其中所述取代基或額外側(cè)鏈的末端為包括但不限于以下的基團氫、肽、醛、胺、芳基疊氮、 酰胼、馬來酰亞胺、硫氫基、活性酯、酯、羧酸鹽/酯、亞氨酯、鹵素或羥基。在一些實施方案中，多糖衍生物包括已使用化學(xué)交聯(lián)劑交聯(lián)的多糖，所述化學(xué)交聯(lián)劑包括但不限于二乙烯砜(DVS)、1，4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)、1，2，7，8-二環(huán)氧辛烷(DEO)或本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的其它交聯(lián)劑。聚結(jié)控制劑可以是糖蛋白，如粘蛋白。在另一實施方案中，所述聚結(jié)控制劑為氨基酸。優(yōu)選地，所述氨基酸具有酸性側(cè)鏈。合適的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸及其可藥用鹽。在另一實施方案中，所述聚結(jié)控制劑為脂質(zhì)或脂肪酸酯。合適的脂肪酸酯包括例如磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和甘油單油酸酯。所述脂肪酸酯可以與多種另外的試劑聯(lián)用。例如，丙二醇和磷脂可以彼此聯(lián)用。在另一實施方案中，所述聚結(jié)控制劑為合成聚合物。此類聚合物包括例如聚甲基丙烯酸脂、聚乙二醇和具有聚乙二醇亞單元的(嵌段)共聚物。例如，共聚物Poloxamer 188和Poloxamer 407可適于用作聚結(jié)控制劑。在另一實施方案中，所述聚結(jié)控制劑為表面活性劑。合適的表面活性劑的實例包括月桂基硫酸鈉和聚山梨酸酯。優(yōu)選的聚結(jié)控制劑包括泛醇、聚乙二醇、黃原膠、瓜爾豆膠、聚山梨酸酯80、N-乙酰葡糖胺及其可藥用鹽。尤其優(yōu)選的聚結(jié)控制劑為羧甲基纖維素、透明質(zhì)酸、黃原膠、羥丙基甲基纖維素和羥丙基纖維素及其可藥用鹽。通常，當(dāng)聚結(jié)控制劑為多糖時，組合物中提供的該試劑量為約0. 01 (重量/體積)％至約10(重量/體積)％。優(yōu)選地，當(dāng)聚結(jié)控制劑為多糖時，所提供的該試劑的量為約0. 5 (重量/體積)％至約3. 5 (重量/體積)％。當(dāng)所述聚結(jié)控制劑為羧甲基纖維素或黃原膠時，可提供的該試劑的量為約 0. 01 (重量/體積)％至10 (重量/體積)%。在一個優(yōu)選實施方案中，當(dāng)聚結(jié)控制劑為羧甲基纖維素或黃原膠時，所提供的該試劑的量為0. 5 (重量/體積)％至3. 5 (重量/體積)％。當(dāng)所述聚結(jié)控制劑為透明質(zhì)酸時，可提供的該試劑的量為約0.01(重量/體積)％ 至10(重量/體積)％。在一個優(yōu)選實施方案中，當(dāng)所述聚結(jié)控制劑為透明質(zhì)酸時，所提供的該試劑的量為0. 5 (重量/體積)％至3. 5 (重量/體積)％。當(dāng)所述聚結(jié)控制劑為PEG時，可提供的該試劑的量為約10(重量/體積)％至約 90 (重量/體積)％。應(yīng)理解，所提供的聚結(jié)控制劑的有效量取決于多種因素，例如聚結(jié)控制劑的特性、 組合物中其它組分的性質(zhì)以及形成所述組合物所用的方法。尤其地，聚結(jié)控制劑的有效量將取決于組合物中原彈性蛋白的濃度。不希望受理論的約束，認(rèn)為阻止聚結(jié)所需的聚結(jié)控制劑的量隨著組合物中原彈性蛋白濃度的增加而增加。此外，聚結(jié)控制劑的性質(zhì)會影響其控制聚結(jié)的能力。因此，本發(fā)明提供了包含原彈性蛋白和多糖聚結(jié)控制劑的組合物，其中原彈性蛋白與多糖的質(zhì)量比為約0.05 1至3000 1。優(yōu)選地，原彈性蛋白與多糖的比為約0. 1 1 至約500 1。更優(yōu)選地，原彈性蛋白與多糖的比為約0.2 1至約100 1。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含原彈性蛋白和羧甲基纖維素的組合物，其中原彈性蛋白與羧甲基纖維素的質(zhì)量比為0.1 1至約500 1。在一些實施方案中，原彈性蛋白與羧甲基纖維素的質(zhì)量比為約0.2 1至約100 1。在另一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含原彈性蛋白和黃原膠的組合物，其中原彈性蛋白與黃原膠的質(zhì)量比為0.1 1至約500 1。在一些實施方案中，原彈性蛋白與黃原膠的質(zhì)量比為約0.2 1至約100 1。在另一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含原彈性蛋白和透明質(zhì)酸的組合物，其中原彈性蛋白與透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為0. 1 1至約500 1。在一些實施方案中，原彈性蛋白與透明質(zhì)酸的質(zhì)量比為約0.2 1至約100 1。在一個實施方案中，用于為含原彈性蛋白的物質(zhì)提供流動特性的試劑不包括或不是 PEG 或 DMSO。在另一些實施方案中，本發(fā)明的組合物還可以包含液相。應(yīng)理解，“液相”通常是指適于注射的生物可接受液體載體。通常，液相的溶劑是水。優(yōu)選的液相包括水溶液，如磷酸鹽緩沖液(PBS)。所述液相可以包含緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和另一些有機酸。在另一實施方案中，所述液相包含旨在改變所述液相之離子強度的至少一種試劑。本發(fā)明的組合物可包含一種或多種另外的試劑活性組分(principle)或成分。所述另外的試劑可提供治療效用，例如激活組織修復(fù)?；蛘?，所述另外的試劑可以防止或限制不利的組織應(yīng)答。此外，所述另外的試劑可以有助于可注射組合物的穩(wěn)定性或持久性。在某些實施方案中，提供了另一些化合物作為稀釋劑、運載體(carrier)、賦形劑等。所述另外的試劑可存在于(溶解于或懸浮于)組合物的液相中?；蛘?，所述另外的試劑可存在于組合物的小球中。在一個實施方案中，所述組合物中可包含藥劑，包括抗生素、生長促進劑、抗感染劑、殺菌劑、促血管生成化合物、抗癌劑、抗炎劑、蛋白酶抑制劑等。在另一實施方案中，所述組合物中可包含生物因子，如組織因子、細(xì)胞因子、生長因子等。尤其優(yōu)選的是參與傷口愈合、纖維化和肉芽形成的那些因子。
在另一實施方案中，所述組合物中可包含細(xì)胞，尤其是參與傷口愈合的細(xì)胞。實例包括上皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞前體、角質(zhì)形成細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞等。所述組合物可采用多種方式包裝，包括其中放置有適當(dāng)形式之組合物的容器。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知合適的容器，包括諸如瓶(塑料的和玻璃的)、注射器、袋、安瓿瓶、塑料袋、金屬圓筒等用具。所述容器還可以包含防干擾裝置(tamper-proof assemblage)以防止輕易獲取包裝內(nèi)含物。此外，還可以在容器上放置描述容器內(nèi)含物的標(biāo)簽。該標(biāo)簽還可以包括適當(dāng)?shù)木?。III.制造方法在另一實施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)由原彈性蛋白形成的組合物的方法， 其包括在具有溶于其中之聚結(jié)控制劑的液相中聚結(jié)或聚合原彈性蛋白的步驟。所述方法的一個重要優(yōu)點是由其生產(chǎn)的組合物無需另外操作或加工步驟即可用于注射。這是本發(fā)明的一個區(qū)別方面，因為本領(lǐng)域目前已知的許多可注射生物材料組合物都需要另外的加工步驟(例如，清洗以除去交聯(lián)劑)才可用于注射。所述方法的另一重要優(yōu)點是通過該方法生產(chǎn)的組合物含有高的原彈性蛋白固含量同時仍保持了所述組合物的可注射特性。與本領(lǐng)域已知的其它含生物材料之組合物相比，這也是本發(fā)明的一個區(qū)別方面。一般地，濃度大于約1. 5mg/mL的原彈性蛋白溶液能形成具有期望完善性的可注射組合物，但是也可使用更低的濃度。在大多數(shù)應(yīng)用中，所述溶液濃度低于約400mg/mL。因此，優(yōu)選濃度為約1.5mg/mL至約400mg/mL的原彈性蛋白溶液。更優(yōu)選地，使用濃度為約 5mg/mL至約300mg/mL的原彈性蛋白溶液。最優(yōu)選地，使用濃度為約10mg/mL至約200mg/ mL的原彈性蛋白溶液?？赏ㄟ^添加鹽(包括任何離子化合物)或能影響溶液摩爾滲透壓濃度的低分子量種類來控制液相的鹽濃度。例如可以使用NaCl、KCl、MgS04、Na2CO3或葡萄糖。優(yōu)選的鹽是 NaCl。當(dāng)目的是形成由原彈性蛋白形成的、由彈性蛋白(或交聯(lián)的原彈性蛋白)組成的組合物時，溶液溫度可升至約37 °C的生理范圍，從而形成粘彈性相?？稍谠摼劢Y(jié)步驟之前或添加交聯(lián)劑(如戊二醛)，或者可在之后添加。當(dāng)目的是形成由原彈性蛋白形成的、包含彈性材料的組合物時，約pH 7. 5或更高的PH值足以使溶液中的原彈性蛋白形成彈性材料。通常，將pH值保持為不超過約pH 13， 因為高于該PH值不利于形成彈性材料。更優(yōu)選地，約pH 9至pH 13的pH值是期望的。然而，最優(yōu)選地，使用約PH 10至pH 11的pH值?？梢允褂玫钠渌黳H量度包括8.0、8.5、9. 5、 10、10.5和11.5?？稍诟淖僷H之前添加交聯(lián)劑(如戊二醛)，或者可以在之后添加。可以通過多種方法調(diào)節(jié)堿度，包括1)向原彈性蛋白溶液直接添加提高PH的物質(zhì)，2)將含有足夠量之pH提高物質(zhì)的溶液與原彈性蛋白溶液混合以使其呈堿性。pH提高物質(zhì)可以是堿、緩沖劑、質(zhì)子吸附劑材料。已發(fā)現(xiàn)可用于PH提高或控制物質(zhì)的實例包括Tris 堿、NH4OH 和 NaOH。當(dāng)pH為堿性并低于約9. 5時，可能需要鹽來形成本發(fā)明的彈性材料。當(dāng)使用鹽時， 濃度一般高于25mM并且可高至200mM。優(yōu)選地，鹽濃度為約IOOmM至150mM。更優(yōu)選地，鹽濃度為約150mM。當(dāng)pH降低(但仍保持堿性)至低于pH 10時，需要鹽來形成彈性材料， 并且所需的鹽的量隨著PH的降低而增加。例如，在約pH 9至10時需要鹽，例如應(yīng)向溶液提供相當(dāng)于約60mM的鹽濃度。在一些實施方案中，溶液具有的摩爾滲透壓濃度相當(dāng)于哺乳動物的等滲鹽水(150mM)或更低。在另一些實施方案中，溶液具有的摩爾滲透壓濃度高于 150mM。鹽濃液還可以為OmM?？赏ㄟ^添加鹽(包括任何離子化合物)、一價或二價離子或者能影響溶液摩爾滲透壓濃度的低分子量種類來控制溶液的鹽濃度。例如可以使用NaCl、KCl、MgS04、Na2CO3或葡萄糖。優(yōu)選的鹽是NaCl。任選地，可以在聚結(jié)期間攪拌液相?？赏ㄟ^機械手段攪拌液相，例如通過使用磁力攪拌裝置、手動混合或置于軌道振蕩器上。可以在無菌條件下實施本發(fā)明方法以確保本方法生產(chǎn)的組合物適于體內(nèi)使用。在另一實施方案中，可將組合物的pH調(diào)整至生理可接受范圍內(nèi)的值。在另一實施方案中，將組合物的離子強度調(diào)整至生理可接受的范圍內(nèi)。IV.裝置和藥盒在某些實施方案中，可以以一次性或重復(fù)利用之裝置的形式提供組合物，所述裝置包含用于容納所述組合物的容器。在一個實施方案中，所述裝置是注射器。所述裝置可以容納0. 1至IOmL的組合物。更優(yōu)選地，所述裝置可以容納0. 5至5ml的組合物。裝置中的組合物可以以直接使用的狀態(tài)(例如以交聯(lián)形式)或者以需要混合或添加另外成分(如交聯(lián)劑，如果需要交聯(lián)劑的話)的狀態(tài)提供。在另一些實施方案中，提供了用于上述實施方案之一的藥盒，所述藥盒包含-容納本發(fā)明組合物的容器；-具有使用說明的標(biāo)簽或說明書。在某些實施方案中，除小球外，藥盒還可包含一種或多種活性組分或成分。這些活性成分如上文所述。藥盒可包含容器以及在容器上或與容器一起的標(biāo)簽或說明書。合適的容器包括例如瓶、小管、注射器、吸塑包裝等。容器可以由多種材料形成，如玻璃或塑料。所述容器容納組合物或其制劑，并且可以具有無菌入口(例如，容器可以是靜脈內(nèi)施用溶液袋或是具有可被皮下注射針穿透的塞的小管)。標(biāo)簽或說明書標(biāo)示出組合物用于治療所選病癥，例如擴充組織。在一個實施方案中，標(biāo)簽和說明書包含使用說明，并標(biāo)示出組合物可用于治療由組織缺陷引起的失調(diào)或并發(fā)癥。所述藥盒可包含(a)包含本發(fā)明組合物的第一容器和(b)其中含有活性組分或成分的第二容器。本發(fā)明該實施方案中的藥盒還可包含說明書，其標(biāo)示出所述組合物和其它活性組分可用于治療疾病。作為替代地或另外地，所述藥盒還可包含第二(或第三)容器， 其含有可藥用緩沖液，如注射用抑菌水(bacteriostatic water for injection，BWFI)、磷酸鹽緩沖液、林格氏溶液和右旋糖溶液。它還可包含從商品和使用者角度所期望的其它材料，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針和注射器。V.治療方法在某些實施方案中，提供了本發(fā)明組合物在制備用于矯正組織缺陷(特別是需要增大軟組織或皮膚的缺陷)的制劑或假體中的用途。
在另一些實施方案中，提供了增大皮膚軟組織的方法，該方法包括向需要這種治療的個體施用有效量的本發(fā)明組合物。適于用該方法治療的個體可顯示輕微的衰老癥狀，例如，眼和嘴周圍的輕微皺紋、 唇部的輕微皺紋和唇體積的輕微減小?；蛘撸梢允敲黠@的衰老跡象。例如，個體可顯示更明顯的衰老跡象，具有深的皺紋和鼻唇溝的加深。另外，可以有面部結(jié)構(gòu)(如顴骨脂肪墊) 的萎縮和下陷。此外，個體可期望在尚無任何衰老跡象的情況下改善他們的外觀，例如個體可期望增加他們的唇體積。在某些實施方案中，所述組合物可通過真皮內(nèi)、皮內(nèi)和/或皮下注射。組合物的注射提供了擴充或填充效果，減少了外觀的皺紋或褶皺，或者提供美觀功效?？墒┯盟鼋M合物的其它組織缺陷包括例如由皮膚病(如痤瘡、病毒性腮腺炎、 雞痘或麻疹)導(dǎo)致的皮膚疤痕、外傷(損傷或燒傷)或外科手術(shù)導(dǎo)致的疤痕。可施用所述組合物的其它組織缺陷還包括整個組織缺失或萎縮，例如作為逆轉(zhuǎn)錄病毒治療之副作用的HIV患者面部的脂肪萎縮。在一個實施方案中，提供了本發(fā)明組合物用于治療與括約肌機能不全相關(guān)的病癥的用途。適于該治療的個體可患有如下病癥或疾病例如先天括約肌缺陷、尿失禁、胃腸道回流病或膀胱輸尿管回流。此外，適于此類治療的個體可患有大便失禁。通常，通過注射向組織缺陷部位施用組合物，然而，根據(jù)組織缺陷的性質(zhì)，其它施用途徑可能是合適的。當(dāng)通過注射施用組合物時，可使用一定范圍規(guī)格的針。所用規(guī)格取決于含原彈性蛋白的材料的性質(zhì)(例如，其粘度)和缺陷的性質(zhì)(例如，注射部位的深度) 等。例如，當(dāng)要將組合物用于增大組織時，針的規(guī)格一般在約16號至31號的范圍內(nèi)。通常， 對于皮膚填充物來說，針的規(guī)格在約25號至31號的范圍內(nèi)。對于細(xì)小皺紋的淺表真皮注射來說，可采用例如規(guī)格在27 31號范圍內(nèi)的針，而對于真皮下的深部注射來說，需要使用例如25號或27號的較大規(guī)格的針。對于失禁應(yīng)用來說，針的規(guī)格一般在約16號至約21 號之間?？舍槍Χ喾N治療施用所述組合物，以矯正組織缺陷和/或?qū)崿F(xiàn)或維持期望的結(jié)
: O應(yīng)理解，在本說明書中公開并限定的發(fā)明可擴展至文字或附圖中提及或顯見的兩個或更多個單獨特征的所有替代性組合。所有這些不同的組合構(gòu)成了本發(fā)明的多個替代性方面。
實施例以下實施例旨在說明而非限制本發(fā)明。實施例1 使用堿性聚合法，在低原彈性蛋白濃度下生產(chǎn)由原彈性蛋白形成的小球材料和方法將20mg原彈性蛋白溶于IOmL的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，于4°C過夜(估計16小時)，從而提供終濃度為2mg/ml的原彈性蛋白。在整個過程中將溶液置于冰上，測量溶液的初始pH(pH 7. 2)，加入39 μ L的IM NaOH將溶液的ρΗ值調(diào)整為10. 7。然后，將所得溶液在 15mL管中于37°C孵育4小時，而后將其從孵箱中取出并置于室溫下。
MS所得到的微顆粒傾向于覆蓋于管壁上。溶液樣品的SEM圖(圖1A)顯示，存在的微顆粒的估計直徑為1 μ m。由于彈性材料的“粘性”特征，球傾向于凝集在一起。實施例2 在不存在聚結(jié)控制劑的情況下，濃度為10mg/ml的原彈性蛋白的堿性聚合材料和方法將50mg原彈性蛋白溶于4. 9mL PBS中，于4°C過夜(估計16小時)。在整個過程中將溶液置于冰上，測量溶液的初始PH(pH 7. 22)，加入47 μ L的IM NaOH將溶液ρΗ值調(diào)整為10. 7。加入另外的53 μ L PBS，使原彈性蛋白溶液的終濃度為10mg/mL。然后，將溶液在 5mL平底管中于37°C孵育過夜(16小時)，而后將其從孵箱中取出并置于室溫下。MM從圖IB中可見，所得到的材料是保持其制備管形狀的固體彈性材料。從所得固體中分離出多于4. 5mL的液體，這表明50mg原彈性蛋白中的大部分(> 40mg)存在于所得構(gòu)建體中的約0. 5mL液體中。換言之，由于在無聚結(jié)控制劑的情況下原彈性蛋白在該濃度下的致密凝集，原彈性蛋白與起始材料(lOmg/mL)相比在固體中明顯地濃度更高。實施例3 使用化學(xué)交聯(lián)，在作為聚結(jié)控制劑的CMC存在下生產(chǎn)小球材料和方法通過將300mg原彈性蛋白溶于1. 5mL PBS中于4°C過夜得到200mg/mL的原彈性蛋白貯液。通過將2g CMC溶于IOOmL PBS中并在室溫下攪拌過夜得到2% (重量/體積) 的高粘度羧甲基纖維素(CMC;Sigma貨號C5013)貯液。在整個過程中將溶液置于冰上，將250 μ L原彈性蛋白貯液與200 μ L PBS和 500 μ L的2% (重量/體積)CMC混合。在冰上開啟新的25% (體積/體積)戊二醛(GA) 溶液管，將2 μ L的25% (體積/體積)GA與48 μ L PBS混合，而后立即加入原彈性蛋白溶液中。將所得的50mg/mL原彈性蛋白、(重量/體積)CMC、0. 05% (體積/體積)GA的混合物用冷卻的吸管頭攪拌(通過在_20°C放置過夜來預(yù)冷吸管頭)，而后在5mL平底管中于37°C下孵育M小時。MM在孵育3小時后所得到的材料呈粉色且粘稠，并且在M小時孵育期間的剩余階段后仍保持該性狀。該材料可通過四號針，而后通過31號針，并在通過針后表現(xiàn)出更低的粘度。該材料樣品的SEM圖顯示直徑范圍為約0. 5 1 μ m的小球的均一混合物(圖2)。在該制劑中，小球之間的聚結(jié)水平明顯很低。實施例4 使用化學(xué)交聯(lián)，在作為聚結(jié)控制劑的HA存在下生產(chǎn)小球材料和方法原彈性蛋白貯液向200mg凍干原彈性蛋白中加入H2O (ImL)+PBS (0. 5ml)，并置于2 8°C下用以溶解，所得濃度(通過測量280nm下H2O中1/250稀釋物的UV吸光度來確定)為150mg/ml。 使用0. 3125mL/mg. cm的消光系數(shù)來確定濃度。透明質(zhì)酸(HA)貯液通過向Ig HA添加高壓滅菌的PBS而用PBS制備2%的HA溶液(終體積50mL)，并用磁力攪拌器攪拌。將樣品儲存在2 8°C。戊二醛貯液通過向48 μ L PBS中添加2 μ L的25% GA并在Eppendorf管中混合來制備的戊二醛溶液。所有吸頭均在使用前冷卻至< 10°c。測試樣品制備和組成將所有組分置于冰上備用。使用吸管在置于冰上的5ml管中混合所需量的HA、PBS 和原彈性蛋白貯液。將所得的組合物用磁力攪拌器在2 8°C混合2分鐘，并用離心機短暫離心以除去所有氣泡。添加戊二醛，將所得組合物用磁力攪拌器在2 8°C再混合2分鐘。 除去攪拌棒；用離心機短暫離心樣品以除去所有氣泡，然后在37°C孵育16小時。最終組合物50mg/ml原彈性蛋白、ΗΑ、0. 05%戊二醛。MM所得材料顯示為粉色粘稠凝膠。該材料可直接通過31號針，并且在通過針之后外觀未發(fā)生改變。該材料樣品的SEM圖(圖3)顯示直徑約為1 μ m的小球的均一混合物。小球之間有明顯的清晰連接。從31號針擠出并且用過量水或PBS清洗后的材料的SEM分析顯示材料的結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。實施例5 在使用堿催化由原彈性蛋白形成小球時，針對聚結(jié)控制劑調(diào)整原彈性蛋白濃度的效果材料和方法通過將300mg原彈性蛋白溶于1. 5mL PBS中并在4°C過夜得到200mg/mL原彈性蛋白貯液。通過將IOOmg HA溶于5mL PBS中并在4°C過夜得到2% (重量/體積)透明質(zhì)酸 (來自人臍帶的HA鈉鹽；Sigma貨號H1876)貯液。為了得到針對HA濃度的原彈性蛋白不同濃度的測定，通過在冰上混合適當(dāng)?shù)娜芤簛碇苽湟韵聵悠窐悠稟 :50 μ L原彈性蛋白溶液+450 μ L PBS+500 μ L HA溶液。通過添加4 μ L的 IM NaOH將初始ρΗ 6. 8調(diào)整至ρΗ 10.7。所得到的最終溶液為10mg/mL原彈性蛋白， (重量/體積)HA。樣品B :125 μ L原彈性蛋白溶液+375 μ L PBS+500 μ L HA溶液。通過添加7 μ L的 IM NaOH將初始ρΗ 6. 8調(diào)整至ρΗ 10.3。所得到的最終溶液為25mg/mL原彈性蛋白，1 % (重量/體積)HA。樣品C :250 μ L原彈性蛋白溶液+250 μ L PBS+500 μ L HA溶液。通過添加10. 5 μ L 的IM NaOH將初始ρΗ 6.8調(diào)整至？!1 10.4。所得到的最終溶液為50mg/mL原彈性蛋白，1 % (重量/體積)HA。樣品D :375 μ L原彈性蛋白溶液+125 μ L PBS+500 μ L HA溶液。通過添加16 μ L 的IM NaOH將初始ρΗ 6調(diào)整至ρΗ 10. 3。所得到的最終溶液為75mg/mL原彈性蛋白，1 % (重量/體積)HA。然后，將所有樣品在5ml平底管中于37°C孵育過夜(16小時)。結(jié)果樣品A IOmgZmL原彈性蛋白，1 % (重量/體積)ΗΑ，ρΗ 10. 7所產(chǎn)生的材料為均一的白色液體，其可以在通過18號、21號、25號和30號針依次擠出后通過30號針。所得溶液的SEM圖(圖4A)顯示了由原彈性蛋白形成的直徑范圍約 1 4 μ m的聚結(jié)小球的相對均一混合物。樣品B :25mR/mL原彈件蛋白，(重量/體積)HA, pH 10. 3所產(chǎn)生的材料為管底部形成的白色濃稠糊狀物，并被白色液體所覆蓋。該糊狀物可混合入剩余的溶液中；然而，該溶液相當(dāng)不均一并阻塞四號針，可能該材料能被擠出通過更大規(guī)格的針(如18號)[注意僅嘗試了直接進入所確定之四號針的擠出，此處沒有嘗試依次擠出方法]?；旌虾笏萌芤旱腟EM圖(圖4B)表明存在直徑范圍約1 4 μ m的聚結(jié)小球。樣品C :50mR/mL原彈件蛋白，1 % (重量/體積)HA, pH 10. 4所產(chǎn)生的材料為管底部形成的白色濃稠糊狀物/固體。該糊狀物可以部分地混合入上層液體中，然而這樣得到的是含有大塊固體材料的不均一混懸液。其不能通過四號針，但是可能該材料能被擠出通過更大規(guī)格的針(如18號)[注意僅嘗試了直接進入所確定之四號針的擠出，此處沒有嘗試依次擠出方法]?；旌虾笏萌芤旱腟EM圖(圖4C)表明存在直徑范圍約1 10 μ m的聚結(jié)小球。樣品D :75mR/mL原彈件蛋白，(重量/體積)HA, pH 10. 3所產(chǎn)生的材料為管底部形成的白色濃稠糊狀物/固體。該糊狀物可以部分地混合入上層液體中，然而這樣得到的是含有大塊固體材料的不均一混懸液。其不能通過四號針，但是可能該材料能被擠出通過更大規(guī)格的針(如18號)[注意僅嘗試了直接進入所確定之四號針的擠出，此處沒有嘗試依次擠出方法]?；旌虾笏萌芤旱腟EM圖(圖4D)表明存在直徑范圍約0. 5 20 μ m的聚結(jié)小球。利用上述SEM圖，圖5中顯示了小球直徑的大小分布。隨著原彈性蛋白濃度的升高，小球的大小和聚結(jié)水平增加。實施例6 在存在聚結(jié)控制劑的情況下攪拌對小球形成的作用材料和方法通過將IOOmg原彈性蛋白溶于450 μ L PBS中并在4°C過夜得到222mg/mL原彈性蛋白溶液。通過將2g CMC溶于IOOmL PBS中并在室溫下攪拌過夜得到2% (重量/體積) 高粘度羧甲基纖維素(CMC;Sigma貨號C5013)的貯液。在整個過程中將溶液置于冰上，將450μ L原彈性蛋白溶液與500μ L的2% (重量/體積)CMC混合。在冰上開啟新的25% (體積/體積)戊二醛溶液管，將2yL的25% (體積/體積)GA與48yL PBS混合，而后立即加入原彈性蛋白溶液中。將所得的IOOmg/ mL原彈性蛋白、1 % (重量/體積)CMC、0. 05 % (體積/體積)GA的混合物用冷卻的吸管頭攪拌(通過在-20°C放置過夜來預(yù)冷吸管頭)。將混合物放置在37°C孵箱中并用磁力攪拌器攪拌4小時。然后，溶液在無攪拌的情況下冷藏過夜(16小時)。MM在37°C孵育最初4小時后，所產(chǎn)生的材料為粉色、不透明和粘稠的。冷藏后材料變得略微半透明(但仍為粉色且粘稠的)；然而，當(dāng)溫?zé)嶂潦覝睾?，其再次迅速地變?yōu)椴煌该鞯?。該材料可以通過31號針。在通過針后溶液仍不發(fā)生變化。在SEM下觀察時，樣品(圖6A和6B)顯示不同大小的聚結(jié)小球。實施例7 使用堿性聚合法，在聚結(jié)控制劑的存在下生產(chǎn)小球
材料和方法在冰上將450 μ L原彈性蛋白(22ang/ml)加入500 μ L的2 % CMC中。在充分混合后，用19yL的IM NaOH將溶液pH從7. 1調(diào)節(jié)到10. 2，然后加入31 μ L PBS，其間樣品始終置于冰上。然后，將樣品在37°C孵育4小時并攪拌，而后在4°C儲存。對于中性樣品，用 11 μ L的IM HCl在室溫下將pH從9. 7調(diào)節(jié)至7. 4。所得溶液包含100mg/mL原彈性蛋白， 1% (重量/體積)CMC。MM所得的材料為白色均一液體，其可以通過沈號 四號的針。堿性溶液(圖7A和 7B)和經(jīng)中和的堿性溶液(圖7C和7D)的SEM圖顯示包含聚結(jié)小球的材料。兩種材料在 4°C均為半透明的淺棕粘稠液體，溫?zé)岷笞兂刹煌该鞯陌咨?棕色粘稠液體。實施例8 在聚結(jié)控制劑的存在下由原彈性蛋白形成的微顆粒的穩(wěn)定性將實施例4A和實施例6得到的樣品于4°C保存超過60天。在超過60天后，材料仍適于注射，并且通過SEM判斷其外觀未發(fā)生改變。實施例9 包含交聯(lián)的原彈性蛋白和黃原膠(XG)的可注射材料的形成材料和方法在冰上將450 μ L原彈性蛋白Q22mg/ml)加入到500 μ L的3% XG中并充分混合。 在冰上開啟新的25% (體積/體積)戊二醛溶液管，將2yL的25% (體積/體積)GA與 48uL PBS混合，而后立即加入原彈性蛋白溶液中。然后，將樣品在37°C孵育4小時并攪拌， 而后在4°C儲存。所得的混合物包含lOOmg/mL原彈性蛋白，1. 5% (重量/體積)XG、0. 05% (體積/體積)GA。MM所產(chǎn)生的材料在4°C為半透明的粉色粘稠凝膠，溫?zé)岷笞兂刹煌该鞯姆凵z。 SEM成像(圖8A和8B)顯示該材料包含粘連物。所述材料能夠通過31號針。在通過針后溶液不發(fā)生改變。實施例10 含有交聯(lián)原彈性蛋白和HPC的、用于通過寬內(nèi)徑針或插管遞送的材料的形成材料和方法在冰上將450 μ L原彈性蛋白Q22mg/ml)加入到500 μ L的4 %羥丙基纖維素 (HPC)中并充分混合。在冰上開啟新的25% (體積/體積)戊二醛溶液管，將2yL的25% (體積/體積)GA與48 μ L PBS混合，而后立即加入原彈性蛋白溶液中。然后，將樣品在37°C 孵育4小時并攪拌，而后在4°C儲存。所得的混合物包含lOOmg/mL原彈性蛋白、2% (重量 /體積)HPC,0. 05 % (體積/體積)GA。MM得到了淡粉色、軟的大塊材料(圖9A)。SEM成像(圖9B)顯示所述材料是纖維狀的并具有一些粘連跡象。所述材料可通過注射器的2mm內(nèi)徑。實施例11 用于通過小規(guī)格針遞送的制劑的優(yōu)化進行了優(yōu)化研究，以確定用于原彈性蛋白制劑的原彈性蛋白聚結(jié)控制劑之質(zhì)量比的可能限制，所述制劑適于通過四號 31號規(guī)格范圍的針注射。下表中粗體顯示的樣品不能通過29/31號針。
權(quán)利要求
1.由原彈性蛋白形成的可注射組合物，所述組合物包含含原彈性蛋白的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)還包含多糖或多糖衍生物形式的試劑，所述試劑的量有效地為所述物資提供使所述組合物能用于注射的流動特性。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述物資采用非顆粒狀的團的形式。
3.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述試劑是透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素和黃原膠中的一種或多種。
4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述試劑是透明質(zhì)酸，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0. 2 1至約100 1。
5.權(quán)利要求3的組合物，其中所述試劑是羧甲基纖維素，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0. 2 1至約100 1。
6.權(quán)利要求3的組合物，其中所述試劑是黃原膠，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約 0. 2 1 至約 100 1。
7.權(quán)利要求3的組合物，其中所述試劑是羥丙基纖維素，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0. 2 1至約100 1。
8.權(quán)利要求3的組合物，其中所述試劑是羥丙基甲基纖維素，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0.2 1至約100 1。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述物質(zhì)采用顆粒狀的團的形式。
10.權(quán)利要求9的組合物，其中所述試劑是透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素和黃原膠中的一種或多種。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述試劑是透明質(zhì)酸，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0. 2 1至約100 1。
12.權(quán)利要求10的組合物，其中所述試劑是羧甲基纖維素，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0.2 1至約100 1。
13.權(quán)利要求10的組合物，其中所述試劑是黃原膠，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0. 2 1至約100 1。
14.權(quán)利要求10的組合物，其中所述試劑是羥丙基纖維素，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0.2 1至約100 1。
15.權(quán)利要求10的組合物，其中所述試劑是羥丙基甲基纖維素，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0.2 1至約100 1。
16.權(quán)利要求1的組合物，其中所述物質(zhì)采用小球的形式。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述試劑是透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、 羥丙基甲基纖維素和黃原膠中的一種或多種。
18.權(quán)利要求16的組合物，其中所述試劑是透明質(zhì)酸，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0. 2 1至約100 1。
19.權(quán)利要求16的組合物，其中所述試劑是羧甲基纖維素，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0.2 1至約100 1。
20.權(quán)利要求16的組合物，其中所述試劑是黃原膠，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0. 2 1至約100 1。
21.權(quán)利要求16的組合物，其中所述試劑是羥丙基纖維素，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0.2 1至約100 1。
22.權(quán)利要求16的組合物，其中所述試劑是羥丙基甲基纖維素，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0.2 1至約100 1。
23.用于生產(chǎn)由原彈性蛋白形成的小球的方法，其包括在液相中聚結(jié)原彈性蛋白的步驟，所述液相具有溶于其中的多糖或多糖衍生物形式的聚結(jié)控制劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述液相的pH為7至13。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述液相的溫度為約37°C。
26.權(quán)利要求23的方法，其中所述液相還包含鹽。
27.權(quán)利要求23的方法，其中所述液相還包含用于使聚結(jié)的原彈性蛋白交聯(lián)的交聯(lián)劑。
28.權(quán)利要求27的方法，其中在聚結(jié)后將所述交聯(lián)劑添加到所述液相中。
29.權(quán)利要求23的方法，其包括在聚結(jié)過程中攪拌所述液相。
30.權(quán)利要求23的方法，其包括將所聚結(jié)的原彈性蛋白通過小規(guī)格的針擠出從而使在所述液相中形成的小球分散。
31.用于生產(chǎn)由原彈性蛋白形成的小球的方法，其包括在液相中加熱原彈性蛋白以形成由彈性材料形成之小球的步驟，所述液相具有堿性PH并具有溶于其中的多糖或多糖衍生物形式的聚結(jié)控制劑。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述液相還包含鹽。
33.權(quán)利要求31的方法，其還包括用交聯(lián)劑使所述彈性材料交聯(lián)。
34.用于改變或矯正組織缺陷的可注射組合物，所述組合物包含含有多個由原彈性蛋白形成之小球的液相，所述液相具有溶于其中的多糖或多糖衍生物形式的聚結(jié)控制劑，所述聚結(jié)控制劑的量有效地減少所述小球的聚結(jié)。
35.權(quán)利要求34的組合物，其中所述試劑是透明質(zhì)酸、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、 羥丙基甲基纖維素和黃原膠中的一種或多種。
36.權(quán)利要求35的組合物，其中所述試劑是透明質(zhì)酸，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0. 2 1至約100 1。
37.權(quán)利要求35的組合物，其中所述試劑是羧甲基纖維素，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0. 2 1至約100 1。
38.權(quán)利要求35的組合物，其中所述試劑是黃原膠，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0. 2 1至約100 1。
39.權(quán)利要求35的組合物，其中所述試劑是羥丙基纖維素，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0.2 1至約100 1。
40.權(quán)利要35的組合物，其中所述試劑是羥丙基甲基纖維素，并且原彈性蛋白與試劑的質(zhì)量比為約0.2 1至約100 1。
41.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述物質(zhì)由非交聯(lián)原彈性蛋白形成。
42.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述原彈性蛋白為原彈性蛋白的片段。
43.前述權(quán)利要求中任一項的組合物，其中所述小球為微球形式。
全文摘要
由原彈性蛋白形成的、用于組織修復(fù)和復(fù)原的可注射生物材料組合物。所述組合物包含多糖或多糖衍生物形式的聚結(jié)控制劑，其量有效地為所述物質(zhì)提供流動特性，使其能夠用于注射。
文檔編號C07K14/435GK102348464SQ201080011493
公開日2012年2月8日 申請日期2010年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月10日
發(fā)明者安托尼·史蒂文·魏斯, 蘇珊娜·瑪麗·米蒂厄 申請人:悉尼大學(xué)