專利名稱：禽流感病毒及用于檢測(cè)、預(yù)防禽流感病毒的試劑盒和疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及三種H9N2禽流感病毒的新毒株及用于檢測(cè)、預(yù)防 禽流感病毒的試劑盒和疫苗。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian influenza, Al)是由A型流感病毒引起的一種嚴(yán)重危害禽類健康 的傳染性疾病。禽類感染禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)后，癥狀可表現(xiàn)為非 顯性感染、亞臨診感染，或輕度呼吸道疾病、產(chǎn)蛋量降低直至急性全身致死性疾病等多種形 式。根據(jù)AIV對(duì)易感雞致病性的差異，可將AIV分為高致病性AIV和低致病性AIV。高致病 性AIV(HPAIV)感染禽類所導(dǎo)致的禽流感對(duì)養(yǎng)禽業(yè)具有毀滅性的打擊，故被國(guó)際獸疫局規(guī) 定為A類疾?。欢恍┑椭虏⌒訟IVjn H9AIV的感染雖然對(duì)感染禽的致死率低，但可引起 產(chǎn)蛋量的減少和淘汰率的上升，并造成免疫抑制，引起其他疫病的發(fā)生或混合感染，對(duì)養(yǎng)禽 業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失也相當(dāng)可觀。因此，AI—直是威脅世界養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一，世界各 國(guó)都十分重視對(duì)AIV的研究工作。已有研究表明來自于禽類的H9N2禽流感病毒能偶爾從 禽類傳染給哺乳動(dòng)物，包括人和豬。Ck/Bei-like和Gl-Iike H9N2禽流感病毒在1990底首 次從人和豬中分離到。2003年分離到的人H9N2禽流感病毒是一個(gè)新的重組體，很可能來源 于當(dāng)?shù)氐幕钋菔袌?chǎng)。這種跨種間傳播表明目前的H9N2禽流感病毒對(duì)人仍有潛在的感染性。 AIV存在著廣泛的抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變現(xiàn)象，其抗原變異頻率很高。因此測(cè)定AIV的全基因 序列，對(duì)于研究禽流感病毒的檢測(cè)、分布、流行規(guī)律以及控制禽流感的流行、蔓延均具有重 要的意義。本研究分離鑒定了 2002-2008年上海地區(qū)活禽市場(chǎng)的H9N2亞型禽流感病毒，經(jīng) 全基因序列測(cè)定分為三種基因型，對(duì)這三種基因型毒株的8個(gè)基因片段進(jìn)行關(guān)鍵位點(diǎn)的分 析以及基因進(jìn)化關(guān)系分析，表明這三種基因型與目前報(bào)道的基因型存在差異，為H9N2禽流 感病毒Ck/Bei系中的三種新的基因型，分別命名為Yl，Y2，Y3。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了三種H9N2禽流感病毒及用于檢測(cè)、預(yù)防禽流感病毒的試劑盒和疫 苗，所述的這三種H9N2禽流感病毒及用于檢測(cè)、預(yù)防禽流感病毒的試劑盒和疫苗要解決現(xiàn) 有技術(shù)中無法確認(rèn)和預(yù)防新的禽流感病毒從而導(dǎo)致新的禽流感疫情在禽類或者人類傳播 的技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種分離的禽流感病毒(Yl)，其基因組由SEQ ID NO =USEQ ID NO 2、SEQ ID NO :3、SEQID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 和 SEQID NO 8 所 示的RNA片段組成。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒，其保藏號(hào)為CGMCC NO :3117。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)上述的分離的禽流感病毒的試劑盒，含有上述的分 離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和含有引物的PCR反應(yīng)液，所述的PCR反 應(yīng)液中的引物為
HA 基因上游引物 P1 5，-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3，，下游引物P2 :5，-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3，；M 基因上游引物 P1 5，-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3，，下游引物P2 :5，-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3，；NA 基因上游引物 P1 5，-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3，，下游弓丨物P2 5，-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3，；NP 基因上游引物 P1 5，-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3，，下游引物P2 :5，-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3，；NS 基因上游引物 P1 5，-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3，，下游弓丨物P2 5，-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，；PA 基因上游引物 P1 5，-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3，，下游弓丨物P2 5，-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3，；PB1 基因上游引物 P1 5，-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3，，下游引物P2 :5，-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3，； PB2 基因上游引物 P1 5，-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3，，下游引物P2 5，-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3，。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防上述的禽流感病毒的疫苗，含有滅活的上述的分離 的禽流感病毒。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其包括如下步驟 a)，一個(gè)疫苗抗原液制備及毒價(jià)測(cè)定的步驟，將上述的禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋后， 接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測(cè)定其毒價(jià)在109. 6-109. 8ELD50, HA價(jià)在1 256-512之 間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b)，一個(gè)抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗(yàn)合格后作為制備 抗原液；c)，一個(gè)制備油相佐劑的步驟；d)，一個(gè)制備疫苗水相的步驟；e)，一個(gè)配制疫苗的步驟，將油相與水相預(yù)混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內(nèi) 乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。進(jìn)一步的，所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。進(jìn)一步的，在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經(jīng)高溫滅菌后，加入到己滅活抗 原液中，吐溫-80的終濃度在2% -5%之間，經(jīng)充分溶解混合即為水相。本發(fā)明還提供了一種抗體，抗上述的一種分離的禽流感病毒(Yl)。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒(Y2)，其基因組由SEQ ID NO :9、SEQID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 14、SEQ ID N0:15 禾口 SEQ ID NO 16所示的RNA片段組成。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒，其保藏號(hào)為CGMCC NO :3118。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)上述的分離的禽流感病毒的試劑盒，含有上述的分 離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和含有引物的PCR反應(yīng)液，所述的PCR反 應(yīng)液中的引物為
HA 基因上游引物 P 1:5，-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3，，下游引物P2 :5，-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3，；M 基因上游引物 P1 5，-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3，，下游引物P2 :5，-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3，；NA 基因上游引物 P1 5，-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3，，下游引物P2 :5，-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3，； NP 基因上游引物 P1 5，-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3，，下游引物P2 :5，-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3，；NS 基因上游引物 P1 5，-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3，，下游引物P2 :5，-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，；PA 基因上游引物 P1 5，-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3，，下游引物P2 :5，-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3，；PB1 基因上游引物 P1 5，-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3，，下游引物P2 :5，-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3，；PB2 基因上游引物 P1 5，-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3，，下游引物P2 5，-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3，。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防上述的禽流感病毒的疫苗，含有滅活的上述的禽流
感病毒。本發(fā)明還提供了上述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其包括如下步 驟a)，一個(gè)疫苗抗原液制備及毒價(jià)測(cè)定的步驟，將上述的禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋 后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測(cè)定其毒價(jià)在109 6-109 8ELD50，HA價(jià)在1 256-512之 間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b)，一個(gè)抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗(yàn)合格后作為制備 抗原液；c)，一個(gè)制備油相佐劑的步驟；d)，一個(gè)制備疫苗水相的步驟；e)，一個(gè)配制疫苗的步驟，將油相與水相預(yù)混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內(nèi) 乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。進(jìn)一步的，所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。進(jìn)一步的，在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經(jīng)高溫滅菌后，加入到己滅活抗 原液中，吐溫-80的終濃度在2% -5%之間，經(jīng)充分溶解混合即為水相。本發(fā)明還提供了一種抗體，抗上述的一種分離的禽流感病毒(Y2)。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒(Y3)，其基因組由SEQ ID NO :17、SEQ IDNO :18、SEQ ID N0:19、SEQ ID NO 20、SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23 禾口 SEQ ID NO 24所示的RNA片段組成。本發(fā)明還提供了一種分離的禽流感病毒，其保藏號(hào)為CGMCC NO :3119。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)上述的分離的禽流感病毒的試劑盒，含有上述的分 離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和含有引物的PCR反應(yīng)液，所述的PCR反 應(yīng)液中的引物為
HA 基因上游引物 P1 5，-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3，，下游引物P2 :5，-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3，；M 基因上游引物 P1 5，-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3，，下游引物P2 :5，-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3，；NA 基因上游引物 P1 5，-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3，，下游引物P2 :5，-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3，；NP 基因上游引物 P1 5，-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3，，下游引物P2 :5，-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3，；NS 基因上游引物 Pl :5，-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3，，下游引物P2 :5，-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，；PA 基因上游引物 P1 5，-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3，，下游引物P2 :5，-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3，；PB1 基因上游引物 P1 5，-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3，，下游引物P2 :5，-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3，；PB2 基因上游引物 P1 5，-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3，，下游引物P2 5，-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3，。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防上述的禽流感病毒的疫苗，含有滅活的上述的禽流
感病毒。本發(fā)明還提供了上述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其包括如下步 驟a)，一個(gè)疫苗抗原液制備及毒價(jià)測(cè)定的步驟，將上述的禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋 后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測(cè)定其毒價(jià)在109 6-109 8ELD50，HA價(jià)在1 256-512之 間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b)，一個(gè)抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗(yàn)合格后作為制備 抗原液；c)，一個(gè)制備油相佐劑的步驟；d)，一個(gè)制備疫苗水相的步驟；e)，一個(gè)配制疫苗的步驟，將油相與水相預(yù)混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內(nèi) 乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。進(jìn)一步的，所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。進(jìn)一步的，在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經(jīng)高溫滅菌后，加入到己滅活抗 原液中，吐溫-80的終濃度在2% -5%之間，經(jīng)充分溶解混合即為水相。本發(fā)明還提供了一種抗體，抗權(quán)利要求1所述的一種分離的禽流感病毒(Y3)。本發(fā)明借助MEGA3. 1分析軟件，對(duì)這三種基因型H9N2禽流感病毒的8個(gè)基因片段 分別進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制和分析。這三種基因型毒株屬于Ck/Bei系，均為四重重組 體，并且這三種基因型與目前報(bào)道的Ck/Bei系中的基因型不同，因此為RT-PCR檢測(cè)這三種 新基因型8個(gè)基因片段提供了模板序列。通過本發(fā)明的試劑盒，可以迅速的檢測(cè)或者排除 是否是新的禽流感由本發(fā)明的三種基因型的H9N2禽流感病毒所致，從而盡快的控制禽流 感疫情。同時(shí)，接種本發(fā)明的疫苗，可以預(yù)防本發(fā)明的三種基因型的H9N2禽流感病毒的感 染。使用本發(fā)明的抗體，可以治療本發(fā)明的三種基因型的H9N2禽流感病毒的感染。
本發(fā)明對(duì)分離的三種H9N2禽流感病毒進(jìn)行了保藏。第一種分離的H9N2禽流感病 毒的分類命名為甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，該病毒保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理 委員會(huì)普通微生物中心(C G M C C)中，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2009年6月 12號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC N0:3117。第二種分離的H9N2禽流感病毒的分類命名為甲型流感病 毒H9N2禽流感病毒，該病毒保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(C G M C C)中，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的地址為北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號(hào)院(中科院微生物研究所)，保藏日期為2009年6月12號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC NO 3118。第三種分離的H9N2禽流感病毒的分類命名為甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，該病 毒保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(C GM C C)中，中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院(中科院微生物 研究所)，保藏日期為2009年6月12號(hào)，保藏號(hào)為CGMCCN0 :3119。本發(fā)明還可以對(duì)禽流感病毒監(jiān)測(cè)系統(tǒng)提供生物信息。對(duì)這三種基因型病毒關(guān)鍵位 點(diǎn)的分析能提供這三種基因型是否有向人類感染的威脅以及8個(gè)片段重排的規(guī)律，尤其是 有無H5片段的存在等，提供是否有向高致病性禽流感轉(zhuǎn)變的可能性，并為我國(guó)H9N2禽流感 病毒種子庫提供儲(chǔ)備，并為病毒的追蹤溯源提供序列信息。


圖1是H9N2禽流感病毒中HA基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖2是H9N2禽流感病毒中NA基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖3是H9N2禽流感病毒中PB2基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖4是H9N2禽流感病毒中PBl基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖5是H9N2禽流感病毒中PA基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖6是H9N2禽流感病毒中M基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖7是H9N2禽流感病毒中NP基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。圖8是H9N2禽流感病毒中NS基因片段的進(jìn)化關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1病毒的獲得于2002年至2008年從上海地區(qū)的活禽批發(fā)市場(chǎng)獲得商品代三黃雞，采集活禽樣 品包括氣管或泄殖腔拭子，將采集樣品放在含有抗菌素的pH值7. 0 7. 4的等滲磷酸鹽緩 沖液(PBS)內(nèi)。將鑒定為陽性樣品的棉拭子充分捻動(dòng)、擰干后棄去拭子，樣品液經(jīng)IOOOr/ min離心lOmin，取上清液作為接種材料。取處理好的樣品以0. 2mL/胚的量經(jīng)尿囊腔途徑 接種9日齡 11日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接種5個(gè)胚，于35°C 37°C孵化箱內(nèi)孵育，18h 后每8h觀察雞胚死亡情況。無菌收取18h以后的死胚及96h仍存活雞胚的雞胚尿囊液，測(cè) 血凝活性，通過下面的實(shí)施例對(duì)從雞胚尿囊液中的病毒進(jìn)行基因測(cè)序和鑒定，是三種新的 甲型流感病毒H9N2禽流感病毒，對(duì)此進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)分別為CGMCC NO :3117(Ck/SH/ Y1/06), CGMCC NO :3118 (Ck/SH/Yl/07)、CGMCC NO 3119 (Ck/SH/Yl/08)。實(shí)施例2三種基因型H9N2禽流感病毒的全基因測(cè)序
2. 1于2002年至2008年從上海地區(qū)的活禽批發(fā)市場(chǎng)獲得商品代三黃雞，共分離、 鑒定了三種基因型H9N2禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/Yl/06(簡(jiǎn)寫為Ck/SH/Yl/06， 基因型 Yl) ；A/Chicken/Shanghai/Yl/07 (簡(jiǎn)寫為 Ck/SH/Yl/07,基因型 Y2) ；A/Chicken/ Shanghai/Yl/08 (簡(jiǎn)寫為Ck/SH/Y 1/08，基因型Y3)。病毒鑒定用的H9亞型血清購自中國(guó)農(nóng) 科院哈爾濱獸醫(yī)研究所。設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增H9亞型AIV所有8個(gè)基因片段的特異引物由寶生 物(大連)工程公司合成。HA 基因上游引物 P1 5，-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3，；下游引物P2 5，-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3，。M 基因上游引物 P1 5，-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3，；下游引物P2 5，-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3，。NA 基因上游引物 P1 5，-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3，；下游引物P2 5，-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3，。NP 基因上游引物 P1 5，-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3，；下游引物P2 5，-GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3，。NS 基因上游引物 P1 5，-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3，；下游引物P2 5，-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，。PA 基因上游引物 P 1:5，-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3，；下游引物P2 5，-ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3，。PB1 基因上游引物 P1 5，-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3，；下游引物P2 5，-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3，。PB2 基因上游引物 P1 5，-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3，；下游引物P2 5，-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3，。2. 2將陽性樣本接種SPF雞胚，取感染雞胚尿囊液用TRIzoI抽提試劑進(jìn)行RNA的 抽提。2.3 8個(gè)基因片段RT-PCR擴(kuò)增如下采用20yL的cDNA合成體系置于0. 2mL反應(yīng) 管中，取溶于DEPC處理水中的AIV RNA樣品9 μ L，分別加入上游引物3 μ L，5倍RT-PCR緩 沖液 4 μ L，dNTPs (10mmol/L) 2. 5 μ L, RNA 酶抑制劑 0. 5 μ L，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 2 μ L，用無 RNase 的超純水加至總體積為20 μ L，置于PCR儀中進(jìn)行cDNA合成，以30°C IOmin, 42°C 60min,進(jìn) 入PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系100 μ L 在PCR反應(yīng)管中分別加入cDNAlO μ L，上、下游引物各 3μ L(20pmol/y L) ,IOXLA PCR BufferlOy L, dNTPs (2. 5mmol/L) 10 μ L, MgCl2 (25mmol/ L) 8 μ L，LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L (5U/ μ L)，滅菌超純水加至100 μ L，置于PCR儀中進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。首先95°C預(yù)變性2min，然后進(jìn)行以94°C 30s, 55°C 60s (HA, PBl，M，NP這4個(gè)基 因的退火溫度為55°C，PB2，NS，PA，NA的退火溫度為52°C )，72°C 180s的PCR循環(huán)，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)后于72°C延伸lOmin。2. 4 8個(gè)基因片段的cDNA克隆、鑒定和測(cè)序RT_PCR產(chǎn)物電泳經(jīng)凝膠回收后，按 PMD18-T載體說明書進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定；鑒定為陽性克 隆后送英駿生物有限公司測(cè)序。其具體實(shí)施步驟如下
2. 4. 1 RT-PCR 產(chǎn)物電泳取RT-PCR產(chǎn)物加IOXloading buffer，在1 %瓊脂糖凝膠(含0. lug/ml的溴化 乙錠)中，以TAE緩沖液(0. 04M Tris-acetate，ImMEDTA)電泳0. 5hr，電泳結(jié)束后，在紫外 線下觀察。2.4.2 RT-PCR 產(chǎn)物回收1)將目的片段切下；2)先凍融，再搗碎；3)加 500ul 平衡酚混勻，置-20°C，60min ；4)取出后立即離心，5000gX5min ；5)小心地將水相轉(zhuǎn)移至另一 EP管中；6)在原EP管內(nèi)加200ulTE(PH8.0)，充分混勻。必要時(shí)可用玻棒再次搗碎， 置-20°C,30min ；7)離心，500gX5min，將水相轉(zhuǎn)移并合并至含有上次水相的EP管中；8)加等體積酚、氯仿異戊醇各抽提一次；9)在轉(zhuǎn)移出的水相中加1/10體積3mol乙酸鈉(PH5. 2)和2. 5倍體積的無水乙醇 置-20 0C 30min ；10)離心，12000gX15min。棄上清，70%乙醇洗滌一次，真空干燥；11)沉淀用7ul TE緩沖液(PH8. 0)溶解，_20°C保存?zhèn)溆?；上述操作也可通過相關(guān)公司生產(chǎn)的膠回收試劑盒進(jìn)行回收。2.4.3回收的產(chǎn)物與PMD18-T載體的連接SolutionI :5ul ；pMD18-T Vector 0. 5ul ；PCR Product 4. 5ul ；4°C 連接 12h_24h。2. 4. 4感受態(tài)細(xì)胞的制備1)劃平板，盡量形成單一菌落，使性質(zhì)均一(一定要熟悉E. coli的顏色、大小、亮 度，什么時(shí)候最好)，37°C過夜，16h。選擇分散、單個(gè)菌落，一般8h可見菌落，16h差不多；2)挑取單個(gè)菌落，接種到3-5mlLB培養(yǎng)過夜(37°C振搖，200_300rpm)；3)取 Iml 菌液到 LB 中，37°C，2_4h，200_300rpm 振蕩培養(yǎng)至 OD550 = 0. 3-0. 5，此時(shí) 正好是E. coli對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期早期，生命力最好；4)放入冰水中，停止增殖，保持該狀態(tài)10-15min ；5)離心，棄上清，留沉淀于冰浴中(4°C，4000gXlOmin)；6)0. IMCaCI2 (4°C預(yù)冷)，體積多一些沒關(guān)系，作用20-30min，時(shí)間可以長(zhǎng)一些；7)4°C，4000gX10min 離心，去 CaCI2 ；8)加CaCI2，量只有上一次的1/5到1/10 ；9)分裝 200ul 于 EP 管中。置4°C冰箱，12-24h即可用于轉(zhuǎn)化。2. 4. 5細(xì)菌的轉(zhuǎn)化1)無菌操作取一定量的感受態(tài)細(xì)胞(200ul)置冰?。?br> 2)加入需1. 4. 3制備的連接物10ul，輕輕手腕旋轉(zhuǎn)或吹打以充分混勻；3)取出置42°C熱休克90S，不要搖動(dòng)，立刻冰浴l-2min ；4)每管加預(yù)熱的LB800ul，37°C振搖45min-lh，以復(fù)蘇抗性；5)稍離心一下，棄去部分上清，剩200ul左右全部涂板，帶有Amp抗性的平板；待 液體被吸收后，置37°C培養(yǎng)12-18hr ；6)觀察見有數(shù)個(gè)單、小菌落，繼續(xù)培養(yǎng)，挑選單菌落接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基 中2. 4. 6重組質(zhì)粒的提取及酶切鑒定1)從搖床中取出上述培養(yǎng)物，取1.5ml于EP管中，l，2000rpm，Imin;2)棄上清，加預(yù)冷的溶液IlOOul，用槍吹起菌體；3)加新鮮配制溶液II200ul，通過手腕混勻；4)加預(yù)冷溶液 III150ul，倒轉(zhuǎn)混勻，12000rpm, 5min ；5)上清移于另一 EP管中，加等體積酚/氯仿，混勻，12000rpm,5min ；6)上清移于另一 EP管中，并加2倍體積冷無水乙醇-20°C沉淀一段時(shí)間， 12000rpm,5min ；7)棄上清，加lml70%乙醇洗滌沉淀，棄去，完全干燥沉淀，并用20ul TE(ph8.0, 含20ug/mlRNaSe)重懸沉淀。用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切鑒定。發(fā)現(xiàn)陽性克隆的送英 駿公司測(cè)序(具體見序列表)。實(shí)施例3 HA基因氨基酸序列分析推導(dǎo)的氨基酸序列分析表明，三種基因型毒株均含有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn) (Asn-X-Ser/Thr，X為除Pro以外的任意氨基酸)，其中5個(gè)位于HAl部分(29aa 31aa、 141aa 143aa、218aa 220aa、298aa 300aa、305aa 307aa)，2 個(gè)位于 HA2 部分 (492aa 494aa、551aa 553aa)。裂解位點(diǎn)序列分析發(fā)現(xiàn)，所有毒株均為RSSR丨GLFJi 禽類為低致病力。構(gòu)成受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸(109aa、161aa、163aa、191aa、202aa、203aa) 除198位氨基酸變化較大外，其它位點(diǎn)在所有毒株中都是相當(dāng)保守的。此外本研究表明Ck/ SH/Y1/06在HA基因226位點(diǎn)為Gln，證明為人類非易感性的H9亞型AIV，而其余2個(gè)毒株 在該位點(diǎn)為L(zhǎng)eu，表明有向人類感染的嗜性(如表1所示)。表1 HA基因幾個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的比較 Note :#Receptor_binding sites (受體結(jié)合位點(diǎn))，their locations are (它 們的具體位置):a(109aa), b(161aa), c(163aa), d(191aa), e(198aa), f (202aa), g(203aa) ；*Potential glycoylation sites (潛在糖基化位點(diǎn))，their locationsare (它 們的具體位置)l(29aa-31aa)，2(141aa-143aa)，3(218aa-220aa)，4(298aa-300aa)， 5(305aa-307aa)，6(492aa-494aa)，7(551aa-553aa) ；Ck:chicken(雞)；SH :Shanghai(上 海)。實(shí)施例4繪制系統(tǒng)發(fā)育樹借助MEGA3. 1分析軟件，對(duì)三種基因型毒株的8個(gè)基因片段分別進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育 樹的繪制和分析(如圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7和圖8所示)。分析結(jié)果表明這 三種基因型毒株屬于Ck/Bei系，均為四重重組體，這三種基因型不同于以往報(bào)道的Ck/Bei 系中的H9N2禽流感病毒基因型，本研究中這三種基因型組成情況見表2，目前已報(bào)道的Ck/ Bei系中的基因型組成情況見表3，本研究中這三種基因型其內(nèi)源性基因中含有H5W的片 段(表2中的Gs/⑶系為H5m病毒)。表2. 2002-2008年上海地區(qū)雞群中三種新基因型H9N2禽流感病毒的基因組成情 況 Abbreviations (縮寫)？ , unknown avian host or lineage ；Aq, aquatic bird ； Ck, chicken ；Ck/Bei，Ck/Bei jing/l/94-like ；Dk, duck ；Gl，Qa/HK/Gl/97-like ；Gs/GD，Gs/ GD-like ；H5N1/01, H5Nl/01_like ；MP, minor poultry species，鵪鶉除外；Qa, quail.實(shí)施例5三種基因型H9N2禽流感病毒8個(gè)基因片段RT-PCR診斷試劑盒試劑盒的組成包括病毒RNA抽提液、RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和PCR反應(yīng)液。其中，病毒RNA的抽提采用TRIzol法，由于TRIzol法抽提病毒RNA為本領(lǐng)域的常 規(guī)技術(shù)，在這里不再贅述。RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成如下隨機(jī)引物，5倍RT-PCR緩沖液，dNTPs (10mmol/L)，RNA 酶抑制劑，AMV反轉(zhuǎn)錄酶，無RNase的超純水。PCR 反應(yīng)液組成如下上、下游引物(20pmol/ii L)，10XLA PCR Buffer, dNTPs (2. 5mmol/L)，MgCl2 (25mmol/L)，LA Taq DNA 聚合酶(5U/ u L)。這三種基因型H9N2禽流感病毒8個(gè)基因片段的上、下游引物情況如下表 5. 1 RT-PCR診斷試劑盒使用說明取11 y L的RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和9 ii L的病毒RNA置于0. 2mL反應(yīng)管中，以 30°C 10min,42°C 60min，置于PCR儀中進(jìn)行cDNA合成；取5 ii L的上述cDNA產(chǎn)物和45 ii L的 PCR反應(yīng)液置于0. 2mL反應(yīng)管中，首先95°C預(yù)變性2min，然后進(jìn)行以94°C 30s, 55°C 60s (HA, PB1，M，NP這4個(gè)基因的退火溫度為55°C，PB2，NS, PA, NA的退火溫度為52°C )，72°C 180s 的PCR循環(huán)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后于72°C延伸lOmin。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后判定結(jié)果， 8個(gè)片段長(zhǎng)度見上表。
實(shí)施例6三種基因型H9N2禽流感病毒的滅活疫苗6.1疫苗抗原液制備及毒價(jià)測(cè)定將這三種基因型H9N2禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋后，接種9日齡非免疫雞 胚，37°C培養(yǎng)72h (棄去24h內(nèi)死亡雞胚)，4°C冷藏24h后，收取尿囊液，測(cè)定其毒價(jià)在 109_6-109_8ELD50，HA價(jià)在1 256-512。病毒液置_18°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?. 2抗原液滅活將福爾馬林溶液加入病毒液中，福爾馬林溶液終濃度為0. 2%，置37°C溫箱內(nèi)搖 動(dòng)作用1.6小時(shí)后，經(jīng)接種9日齡SPF雞胚檢驗(yàn)合格后作為制備抗原液。6.3油相佐劑制備以注射用專用白油(杭州煉油廠)、司本-80 (上海大眾藥業(yè))和硬脂酸鋁(上海 遠(yuǎn)航試劑廠)，按一定比例(94%輕質(zhì)白油，6%司本-80，再加2%硬脂酸鋁)配制混合，經(jīng) 高溫滅菌后備用。6.4疫苗水相制備將一定量的吐溫-80 (上海大眾藥業(yè))經(jīng)高溫滅菌后，加入到己滅活抗原液中，吐 溫-80的終濃度為3%，經(jīng)充分溶解混合即為水相。6. 5疫苗配制將一定比例的油相與水相(比例為1 1)在立式膠體磨機(jī)中預(yù)混后，再將混合物 注入到高壓勻漿泵內(nèi)乳化，制成油包水乳劑。6. 6無菌及安全檢驗(yàn)隨機(jī)抽取4瓶疫苗，分別接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，無菌生長(zhǎng)。另取 免疫劑量的3倍量，頸部皮下注射10日齡非免雛雞6羽，觀察2周，無任何不良反應(yīng)。6. 7理化性狀檢查疫苗色澤正常，3000rpm離心15分鐘不分層，37°C放置21天不破乳。6. 8免疫效果評(píng)估取SPF4周齡公雞，在清潔條件下隔離飼養(yǎng)。為預(yù)防試驗(yàn)期間被感染并模仿實(shí)際生 產(chǎn)條件，所以雞在接種這三種基因型H9N2禽流感油乳劑滅活苗前均用Lasota株NDV弱毒 疫苗及雞傳染性法氏囊弱毒疫苗免疫，5d后注射這三種基因型H9N2禽流感油乳滅活苗。在 接種這三種基因型H9N2禽流感油乳劑滅活苗后2、3、4、5周后分別采血，測(cè)定對(duì)H9亞型AIV HI抗體效價(jià)。以0. 5ml 一次肌肉注射后2、3、4和5周采血，分離血清測(cè)定其對(duì)H9亞型AIV的 滴度。2周后大多數(shù)雞都已表現(xiàn)出不同程度的HI抗體。在3周后，所有免疫雞都產(chǎn)生抗 H9的HI抗體，且較2周時(shí)顯著上升，這一 HI抗體滴度在5周齡時(shí)上升至最高值，這三種基 因型H9N2禽流感油乳劑滅活苗Y1平均可達(dá)101og2，Y2平均可達(dá)8. 61og2, Y3平均可達(dá) 9.61og2。而且個(gè)體間差異減少。據(jù)有關(guān)資料表明，當(dāng)HI抗體的平均值達(dá)到41og2就有保護(hù)力，但有時(shí)能分離到病 毒。當(dāng)達(dá)到51og2以上時(shí)其保護(hù)率達(dá)100%并且分離不到病毒。以上試驗(yàn)說明這三種基因 型H9N2禽流感油乳劑滅活苗免疫效果較好，能抵抗AIV的侵襲，性能穩(wěn)定。
權(quán)利要求
一種分離的禽流感病毒，其基因組由SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示的RNA片段組成。
2.如權(quán)利要求1所述的一種分離的禽流感病毒，其保藏號(hào)為CGMCCN0:3117。
3.一種用于檢測(cè)權(quán)利要求1或2所述的分離的禽流感病毒的試劑盒，其特征在于含有 權(quán)利要求1或2所述的分離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和含有引物的PCR 反應(yīng)液，所述的PCR反應(yīng)液中的引物為HA 基因上游引物 Pl :5，-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3，， 下游引物 P2 :5，-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3，； M 基因上游引物 Pl :5，-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3，， 下游引物 P2 :5，-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3，； NA 基因上游引物 Pl :5，-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3，， 下游引物 P2 :5，-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3，； NP 基因上游引物 Pl :5，-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3，， 下游引物 P2 :5’ -GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3，； NS 基因上游引物 Pl :5，-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3，， 下游引物 P2 :5，-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，； PA 基因上游引物 Pl :5，-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3，， 下游引物 P2 :5’ -ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3，； PBl 基因上游引物 Pl :5，-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3，， 下游引物 P2 :5，-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3，； PB2 基因上游引物 Pl :5，-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3，， 下游引物 P2 :5，-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3，。
4.一種用于預(yù)防權(quán)利要求1或2所述的禽流感病毒的疫苗，其特征在于含有滅活的 權(quán)利要求1或2所述的分離的禽流感病毒。
5.權(quán)利要求4所述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步 驟a)，一個(gè)疫苗抗原液制備及毒價(jià)測(cè)定的步驟，將權(quán)利要求1或2所述的禽流感病毒用滅 菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測(cè)定其毒價(jià)在109 6-109 8ELD50，HA價(jià)在 1 256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b)，一個(gè)抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗(yàn)合格后作為制備抗原液；c)，一個(gè)制備油相佐劑的步驟；d)，一個(gè)制備疫苗水相的步驟；e)，一個(gè)配制疫苗的步驟，將油相與水相預(yù)混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內(nèi)乳 化，制成油包水乳劑即為疫苗。
6.如權(quán)利要求5所述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于所述的 油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。
7.如權(quán)利要求5所述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于在制備 疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經(jīng)高溫滅菌后，加入到已滅活抗原液中，吐溫-80的終濃度 在2% -5%之間，經(jīng)充分溶解混合即為水相。
8.一種抗體，抗權(quán)利要求1或2所述的一種分離的禽流感病毒。
9.一種分離的禽流感病毒，其基因組由SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID NO :11、 SEQ ID NO 12,SEQ ID NO : 13、SEQ ID NO : 14、SEQ ID N0:15 禾口 SEQ ID N0:16 所示的 RNA 片段組成。
10.如權(quán)利要求9所述的一種分離的禽流感病毒，其保藏號(hào)為CGMCCNO :3118。
11.一種用于檢測(cè)權(quán)利要求9或10所述的分離的禽流感病毒的試劑盒，其特征在于含 有權(quán)利要求9或10所述的分離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和含有引物 的PCR反應(yīng)液，所述的PCR反應(yīng)液中的引物為HA 基因上游引物 P 1 :5，-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3，， 下游引物 P2 :5，-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3，； M 基因上游引物 Pl :5，-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3，， 下游引物 P2 :5，-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3，； NA 基因上游引物 Pl :5，-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3，， 下游引物 P2 :5，-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3，； NP 基因上游引物 Pl :5，-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3，， 下游引物 P2 :5’ -GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3，； NS 基因上游引物 Pl :5，-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3，， 下游引物 P2 :5，-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，； PA 基因上游引物 Pl :5，-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3，， 下游引物 P2 :5’ -ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3，； PBl 基因上游引物 Pl :5，-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3，， 下游引物 P2 :5，-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3，； PB2 基因上游引物 Pl :5，-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3，， 下游引物 P2 :5，-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3，。
12.一種用于預(yù)防權(quán)利要求9或10所述的禽流感病毒的疫苗，其特征在于含有滅活 的權(quán)利要求9或10所述的禽流感病毒。
13.權(quán)利要求12所述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于包括如下 步驟a)，一個(gè)疫苗抗原液制備及毒價(jià)測(cè)定的步驟，將權(quán)利要求9或10所述的禽流感病毒用 滅菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測(cè)定其毒價(jià)在109 6-109 8ELD50，HA價(jià) 在1 256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b)，一個(gè)抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗(yàn)合格后作為制備抗原液；c)，一個(gè)制備油相佐劑的步驟；d)，一個(gè)制備疫苗水相的步驟；e)，一個(gè)配制疫苗的步驟，將油相與水相預(yù)混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內(nèi)乳 化，制成油包水乳劑即為疫苗。
14.如權(quán)利要求13所述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于所述 的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。
15.如權(quán)利要求13所述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經(jīng)高溫滅菌后，加入到己滅活抗原液中，吐溫-80的終濃 度在2% -5%之間，經(jīng)充分溶解混合即為水相。
16. 一種抗體，抗權(quán)利要求9或10所述的一種分離的禽流感病毒。
17. 一種分離的禽流感病毒，其基因組由SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO 20, SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 22, SEQ ID NO :23 禾口 SEQ ID NO :24 所示的 RNA片段組成。
18.如權(quán)利要求17所述的一種分離的禽流感病毒，其保藏號(hào)為CGMCCNO :3119。
19.一種用于檢測(cè)權(quán)利要求17或18所述的分離的禽流感病毒的試劑盒，其特征在于含 有權(quán)利要求17或18所述的分離的禽流感病毒的RNA抽提液、RT反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和含有引物 的PCR反應(yīng)液，所述的PCR反應(yīng)液中的引物為HA 基因上游引物 Pl :5，-CAGGGGAATTTCACAACCAGTCAAA-3，， 下游引物 P2 :5，-GCCAGGGTGTTTTTGCCAATTATATAC-3，； M 基因上游引物 Pl :5，-AAGATGAGCCTTCTAACCGAGGTC-3，， 下游引物 P2 :5，-CGGGGTAGTTTTTTACTCCAGCTCTATG-3，； NA 基因上游引物 Pl :5，-AGCAGGAGTGAAAATGAATCCA-3，， 下游引物 P2 :5，-AATTGCGAGAGCTTATATAGGC-3，； NP 基因上游引物 Pl :5，-ATCATGGCGTCTCAAGGCACCAAA-3，， 下游引物 P2 :5’ -GCCTCTTTAATTGTCATACTCCCCTGC-3，； NS 基因上游引物 Pl :5，-ACATAATGAACTCCAACACTGTGTC-3，， 下游引物 P2 :5，-GCAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTC-3，； PA 基因上游引物 Pl :5，-AAATGGAAGACTTTGTGCGACAATG-3，， 下游引物 P2 :5’ -ACAACTATCTCAGTGCATGTGTGAG-3，； PBl 基因上游引物 Pl :5，-AGGCAAACCATTTGAATGGATGTCA-3，， 下游引物 P2 :5，-AATTCACTATTTTTGCCGTCTGAGC-3，； PB2 基因上游引物 Pl :5，-GCGAAAGCAGGTCAATTATATTCAG-3，， 下游引物 P2 :5，-AACAATTCGACACTAATTGATGGCC-3，。
20. 一種用于預(yù)防權(quán)利要求17或18所述的禽流感病毒的疫苗，其特征在于含有滅活 的權(quán)利要求17或18所述的禽流感病毒。
21.權(quán)利要求20所述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于包括如下 步驟a)，一個(gè)疫苗抗原液制備及毒價(jià)測(cè)定的步驟，將權(quán)利要求17或18所述的禽流感病毒 用滅菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測(cè)定其毒價(jià)在109 6-109 8ELD50，HA 價(jià)在1 256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆?；b)，一個(gè)抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗(yàn)合格后作為制備抗原液；c)，一個(gè)制備油相佐劑的步驟；d)，一個(gè)制備疫苗水相的步驟；e)，一個(gè)配制疫苗的步驟，將油相與水相預(yù)混后，再將混合物注入到高壓勻漿泵內(nèi)乳 化，制成油包水乳劑即為疫苗。
22.如權(quán)利要求21所述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。
23.如權(quán)利要求21所述的用于預(yù)防禽流感病毒的疫苗的制備方法，其特征在于在制 備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經(jīng)高溫滅菌后，加入到己滅活抗原液中，吐溫-80的終濃 度在2% -5%之間，經(jīng)充分溶解混合即為水相。
24.一種抗體，抗權(quán)利要求17或18所述的一種分離的禽流感病毒。
全文摘要
一種禽流感病毒及用于檢測(cè)、預(yù)防禽流感病毒的試劑盒和疫苗。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及分離的禽流感病毒新毒株，本發(fā)明公開了三種H9N2禽流感病毒。本發(fā)明還公開了三種檢測(cè)H9N2禽流感病毒的試劑盒，以及三種用于預(yù)防的H9N2禽流感病毒的疫苗，以及抗H9N2禽流感病毒的抗體。通過本發(fā)明的試劑盒，可以迅速的檢測(cè)或者排除是否是由本發(fā)明的三種基因型的H9N2禽流感病毒所致的禽流感，從而盡快的控制禽流感疫情。同時(shí)，接種本發(fā)明的疫苗，可以預(yù)防本發(fā)明的三種基因型的H9N2禽流感病毒的感染。并且本發(fā)明還可以為禽流感病毒監(jiān)測(cè)系統(tǒng)提供生物信息。
文檔編號(hào)C07K16/10GK101899418SQ201010192680
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者劉佩紅, 劉健, 周錦萍, 張維誼, 李凱航, 葛菲菲, 鞠厚斌 申請(qǐng)人:上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心