專利名稱：一種采用正相色譜法純化丹參酚酸a的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用正相色譜法純化丹參酚酸A的方法。
背景技術(shù)：
丹參是我國(guó)心腦血管病的基本治療藥物，因療效確切，丹參已成為我國(guó)用量最大 (1. 5萬(wàn)噸/年)、銷(xiāo)售額最高、制劑生產(chǎn)廠最多的中藥(制劑生產(chǎn)廠960家，劑型主要有丹參滴丸、丹參注射液、丹參片、丹參顆粒、丹參沖劑和丹參膠囊)，此外丹參還與其它藥材復(fù)方，用于肺心病、高脂血癥、高血粘度綜合征、哮喘、支氣管肺炎、肝炎、肝硬化、腎病綜合征、 關(guān)節(jié)炎、糖尿病循環(huán)障礙、各種細(xì)菌性和病毒性感染、抗內(nèi)毒素、腫瘤、硬皮病、皮膚炎、銀屑病、過(guò)敏性紫癜、紅斑狼瘡、血栓閉塞性脈管炎、痤瘡、難治性癲癇、視網(wǎng)膜病變等多種疾病的治療。丹參的主要有效成分是丹酚酸。現(xiàn)代藥理研究表明，丹酚酸是以抗氧化、抗炎(通過(guò)NF-κ β途徑抑制多種炎性細(xì)胞因子表達(dá))為特點(diǎn)、同時(shí)具有保護(hù)脈管內(nèi)皮細(xì)胞、降脂、 升高高密度脂蛋白、保護(hù)心肌缺血缺氧、擴(kuò)張冠脈血管、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、抑制纖維蛋白原合成、激活纖溶、抑制血栓形成、螯合鈣鐵離子等多種藥理作用。在所有已知酚類化合物中(包括黃酮類化合物)丹酚酸類化合物的抗氧化活性最強(qiáng)，其中又以丹酚酸 A(salvianolic acid A，SA)的活性最佳〔《中草藥現(xiàn)代研究》II，1996，498-533. Yi Yang Hu et al. ， World JGastroentero,2000 ；6 (3) :402-404. Cheng Hai Liu et al. ， World J Gastroentero,2000 ；6 (3) :361-364. Yun-Lian Lin et al. J. Nat. Prod. 2002,65,745-747. Lin YL et al. . J. Ethnopharmaco1. 2005.Chen YF et al. . J. Chromatogr A.2005 ； 1088(1-2) :140-5. Hsu YC et al. . J Biomed Sci. 2005 ；12(1) :185-95. Lay IS et al.. J Surg Res. 2003 ；115 (2) :279-85. Lay IS et al. . Planta Med. 2003 ；69(1) :26-32. Chen YL et al. . J CellBiochem. 2001 ；83 (3) :484-93. Chen YH et al. . J Cell Biochem. 2001 ； 82(3) :512-21. Hung HH et al. . Histol Histopathol. 2001 ；16(1) :175-83. Wu YJ et al.. ArteriosclerThromb Vasc Biol. 1998 ；18(3) :481-6.〕，但是，丹參中丹酚酸 A 的天然含量及其純化技術(shù)一直制約著丹酚酸A的研發(fā)。丹參藥材中，主要含丹酚酸B，丹酚酸A的含量約為0.03% 0.06%。在高溫處理丹參提取物制備丹酚酸A的技術(shù)建立，基本解決了其資源供給后，丹酚酸A的開(kāi)發(fā)利用主要面臨批量分離純化的挑戰(zhàn)。但由于丹酚酸A水溶性高、不結(jié)晶、共存大量性質(zhì)相近化合物和擬“膠體”類雜質(zhì)， 目前文獻(xiàn)報(bào)道和專利公開(kāi)的純化技術(shù)或不能批量制備(如葡聚糖疑膠s印hadex LH-20價(jià)格高昂、流速低、處理量??；C8或Q8處理量小、壽命短)，或產(chǎn)品達(dá)不到安全可控的藥用要求，致使丹酚酸A至今沒(méi)有得到實(shí)際應(yīng)用。根據(jù)色譜行為(圖1、圖2)，丹A待分離體系的化學(xué)物質(zhì)分為四大類1、前沿雜質(zhì)(主要是以丹參酮為代表的低極性物質(zhì))；2、酚酸類雜質(zhì)(主要是丹參素、原兒茶醛和丹 B) ；3、丹A鄰近雜質(zhì)；4、擬“膠體”類雜質(zhì)(主要是以在TLC分析中原點(diǎn)處物質(zhì)為代表的一類雜質(zhì))。前沿雜質(zhì)較容易分離，大孔吸附樹(shù)脂便可有效實(shí)現(xiàn)；酚酸類雜質(zhì)無(wú)論在反相色譜或正相色譜上均具有滿足批量制備的分離度(分離度> 2)，分離難度不大，分離丹A鄰近雜質(zhì)本發(fā)明人也取得了顯著的成果，因此，丹A原料藥制備所面臨的主要問(wèn)題是擬“膠體”類雜質(zhì)(主要是以在TLC分析中原點(diǎn)處物質(zhì)為代表的一類雜質(zhì))的分離。擬“膠體”類雜質(zhì)是從色譜行為上對(duì)植物中目前尚未給出明確化學(xué)表征的一類物質(zhì)。該類物質(zhì)在正相和反相TLC上均主要集中于原點(diǎn)，卻又少量全程分布于正相和反相TLC 上；在TLC上沒(méi)有明確的斑點(diǎn)，在HPLC又無(wú)明確的UV吸收峰；在任何極性的洗脫液洗脫時(shí)， 都有少量被洗脫。這一獨(dú)特的行為使擬“膠體”類雜質(zhì)去除成為天然產(chǎn)物分離純化關(guān)鍵問(wèn)題之一，特別是對(duì)那些不能結(jié)晶的化合物。它的去除與否在很大程度上決定了目標(biāo)化合物的純度是否滿足藥用要求。作為口服制劑，只有在腸道游離的目標(biāo)化合物才能被吸收，膠體與目標(biāo)化合物相互作用強(qiáng)，影響生物利用度；作為注射劑，刺激、過(guò)敏、凝聚試驗(yàn)和異常毒性均可能與這類物質(zhì)密切相關(guān)。目前，分離擬“膠體”類化合物的相關(guān)技術(shù)有1、膜分離技術(shù)；2、CW反相色譜；3、溶劑萃取；膜分離技術(shù)盡管能有效去除擬“膠體”類雜質(zhì)，但因其屬于非切向力分離技術(shù)，目標(biāo)化合物往往與這類雜質(zhì)有極高親和力，而導(dǎo)致目標(biāo)化合物損失嚴(yán)重。此外，膜技術(shù)用于這類雜質(zhì)的分離時(shí)，還面臨膜孔阻塞和膜壽命的問(wèn)題。溶劑萃取技術(shù)中溶劑的選擇性至關(guān)重要，效果也不理想。傳統(tǒng)的C18反相色譜因使用上樣量小、PH范圍有限、不能進(jìn)行有效再生、壽命短、受限于成本等因素，不能廣泛使用。因此，丹A工業(yè)化生產(chǎn)的制備一直受此制約，因此，迫切需要提供一種新的純化丹酚酸A的方法，以便更有效的分離丹A擬“膠體”類雜質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷出發(fā)，提供了一種新的采用正相色譜純化丹酚酸 A的方法。本發(fā)明提供的采用正相色譜純化丹酚酸A的方法，所述的正相色譜填料為色譜硅膠，粒度100 200目，其中所述的正相色譜操作為用乙酸乙酯萃取丹參酚酸A水溶液， 再濃縮乙酸乙酯萃取液至固含量約20% 30%，再加入丹酚酸A含量2 2. 5倍的色譜硅膠，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓干燥制成流動(dòng)性固體樣品，將固體樣品置于硅膠濕柱頂端。優(yōu)選的，其中所述的正相色譜操作為用乙酸乙酯萃取丹參酚酸A水溶液，再濃縮乙酸乙酯萃取液至固含量約25%，再加入丹酚酸A含量2. 3倍的色譜硅膠，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓干燥制成流動(dòng)性固體樣品，將固體樣品置于硅膠濕柱頂端。另外，將固體樣品置于硅膠濕柱頂端后，依次用8/2或7/3的正己烷/乙酸乙酯， 或者8/2或7/3的正己烷/丙酮，或者95/5或98/2的氯仿/甲醇，或者95/5或98/2的二氯甲烷/甲醇洗脫完雜質(zhì)，用7/3或6/4的正己烷/乙酸乙酯，或者7/3或6/4的正己烷/ 丙酮，或9/1的氯仿/甲醇，或9/1的二氯甲烷/甲醇洗脫收集丹參酚酸A，最后用6/4或 5/5的正己烷/乙酸乙酯，或者6/4或5/5正己烷/丙酮，或85/15氯仿/甲醇或85/15 二氯甲烷/甲醇洗脫合并的含雜質(zhì)的丹參酚酸A。。為了取得更優(yōu)的效果，其中用乙酸乙酯萃取丹參酚酸A水溶液還包括先將丹參酚酸A水溶液減壓濃縮后回收乙醇，無(wú)醇丹參酚酸A濃縮液再用乙酸乙酯萃取多次，乙酸乙酯與無(wú)醇丹參酚酸A濃縮液的體積比為1 (3 幻，再將乙酸乙酯萃取液減壓濃縮回收乙酸乙酯至小體積得到丹參酚酸A乙酸乙酯濃縮液，固含量約20% 30%。優(yōu)選的，其中用乙酸乙酯萃取丹參酚酸A水溶液還包括先將丹參酚酸A水溶液減壓濃縮后回收乙醇，無(wú)醇丹參酚酸A濃縮液再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯與無(wú)醇丹參酚酸A濃縮液的體積比為1 4，再將乙酸乙酯萃取液減壓濃縮回收乙酸乙酯至小體積得到丹參酚酸A乙酸乙酯濃縮液，固含量約25 %。另一方面，為取得更好的純化效果，其中所述的硅膠濕柱為正己烷預(yù)裝色譜硅膠， 其中丹參酚酸A與預(yù)裝色譜硅膠的重量比為1 (5 8)。優(yōu)選的，其中丹參酚酸A與預(yù)裝色譜硅膠的重量比為1 6。綜上所述，本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，提供了一種新的正相色譜填料，并確定了合理的粒度范圍，并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)合理的配置正相色譜填料的加入量，從而大大提高了分離丹A擬“膠體”類雜質(zhì)的效率，并且成本大大降低，采用本發(fā)明提供的正相樹(shù)脂填料， 可有效去除提取物中大量的擬“膠體”類雜質(zhì)，經(jīng)濟(jì)方便，大大降低了后續(xù)分離負(fù)荷。并且待分離體系與樹(shù)脂適應(yīng)性好時(shí)，也能用于單體化合物的純化，為大批量生產(chǎn)丹酚酸A提供了產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控、成本可接受的新的方法。


圖1丹參化學(xué)成分的TLC圖譜
圖2丹參化學(xué)成分的HPLC圖譜
圖3工藝流程圖-丹A的正相色譜純化
圖4產(chǎn)品樣品的TLC圖譜
圖5產(chǎn)品樣品的HPLC圖譜
圖6產(chǎn)品樣品的紫外吸收光譜
圖7產(chǎn)品樣品的紅外吸收光譜
圖8產(chǎn)品樣品的高分辨質(zhì)譜圖譜
圖9產(chǎn)品樣品的電噴霧電離負(fù)離子質(zhì)譜圖譜
圖10產(chǎn)品樣品的1H-NMR圖譜
圖11產(chǎn)品樣品的"C-NMR圖譜
具體實(shí)施例方式首先，附圖1中的各數(shù)字所代表的含義和具體條件為，1 丹酚酸B ；2 丹酚酸A ；3 丹參水提物；4 :65%丹酚酸B ；色譜條件C18柱(4. 6mmX 250mm，5 μ m)，流速1. Oml/min， 檢測(cè)波長(zhǎng)觀011111，流動(dòng)相梯度為0 8分鐘，8 18%B;8 15分鐘，18 21 % B ;14 40 分鐘，21 34% B ；溶劑劑 A =H3PO4 H2O = 0. 02 100 ；溶劑劑 B =H3PO4 CH3CN = 0. 02 100]。附圖5中的具體條件為色譜條件ODS柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m)；流動(dòng)相乙腈-0. 2%磷酸水(30 70)；檢測(cè)波長(zhǎng):285nm ；柱溫:30°C ；流速1. Oml/min。下面詳細(xì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。本發(fā)明提供的采用正相色譜純化丹酚酸A的方法，所述的正相色譜填料為色譜硅膠，粒度100 200目，其中所述的正相色譜操作為用乙酸乙酯萃取丹參酚酸A水溶液， 再濃縮乙酸乙酯萃取液至固含量約20% 30%，再加入丹酚酸A含量2 2. 5倍的色譜硅膠，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓干燥制成流動(dòng)性固體樣品，將固體樣品置于硅膠濕柱頂端。其中色譜硅膠加入量為丹參酚酸A的重量的2 2. 5倍。具體的，色譜硅膠與丹參酚酸A的重量比可以采用如下表1所示，但并不局限于表1所示的具體實(shí)施方式
。表1
權(quán)利要求
1.一種采用正相色譜純化丹參酚酸A的方法，所述的正相色譜填料為色譜硅膠，粒度 100 200目，其中所述的正相色譜操作為用乙酸乙酯萃取丹參酚酸A水溶液，再濃縮乙酸乙酯萃取液至固含量約20% 30%，再加入丹參酚酸A含量2 2. 5倍的色譜硅膠，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓干燥制成流動(dòng)性固體樣品，將固體樣品置于硅膠濕柱頂端洗脫。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的正相色譜操作為用乙酸乙酯萃取丹參酚酸A水溶液，再濃縮乙酸乙酯萃取液至固含量約25%，再加入丹參酚酸A含量2. 3倍的色譜硅膠，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓干燥制成流動(dòng)性固體樣品，將固體樣品置于硅膠濕柱頂端洗脫。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，將固體樣品置于硅膠濕柱頂端，依次用8/2或7/3的正己烷/乙酸乙酯、或者8/2或7/3的正己烷/丙酮、或者95/5或98/2的氯仿/甲醇、或者 95/5或98/2的二氯甲烷/甲醇洗脫完雜質(zhì)，用7/3或6/4的正己烷/乙酸乙酯、或者7/3 或6/4的正己烷/丙酮、或9/1的氯仿/甲醇、或9/1的二氯甲烷/甲醇洗脫收集丹參酚酸 A，最后用6/4或5/5的正己烷/乙酸乙酯、或者6/4或5/5正己烷/丙酮、或85/15氯仿/ 甲醇、或85/15 二氯甲烷/甲醇洗脫合并的含雜質(zhì)的丹參酚酸A。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中用乙酸乙酯萃取丹參酚酸A水溶液包括先將丹參酚酸A水溶液減壓濃縮后回收乙醇，無(wú)醇丹參酚酸A濃縮液再用乙酸乙酯萃取多次，乙酸乙酯與無(wú)醇丹參酚酸A濃縮液的體積比為1 (3 幻，再將乙酸乙酯萃取液減壓濃縮回收乙酸乙酯至小體積得到丹參酚酸A乙酸乙酯濃縮液，固含量約20% 30%。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其中用乙酸乙酯萃取丹參酚酸A水溶液包括先將丹參酚酸A水溶液減壓濃縮后回收乙醇，無(wú)醇丹參酚酸A濃縮液再用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯與無(wú)醇丹參酚酸A濃縮液的體積比為1 4，再將乙酸乙酯萃取液減壓濃縮回收乙酸乙酯至小體積得到丹參酚酸A乙酸乙酯濃縮液，固含量約25%。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的硅膠濕柱為正己烷預(yù)裝色譜硅膠，其中丹參酚酸A與預(yù)裝色譜硅膠的重量比為1 (5 8)。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其中丹參酚酸A與預(yù)裝色譜硅膠的重量比為1 6。
全文摘要
本發(fā)明基于丹參化學(xué)成分的理化性質(zhì)、色譜行為及其與單元分離技術(shù)適應(yīng)性，提供了一種采用正相色譜純化丹酚酸A的方法，所述的正相色譜填料為色譜硅膠，粒度100～200目，其中所述的正相色譜操作為用乙酸乙酯萃取丹參酚酸A水溶液，再濃縮乙酸乙酯萃取液至固含量約20％～30％，再加入丹酚酸A含量2～2.5倍的色譜硅膠，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓干燥制成流動(dòng)性固體樣品，將固體樣品置于硅膠濕柱頂端。該方法制備的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控、成本可接受。
文檔編號(hào)C07C67/56GK102212005SQ201010143689
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者何克江, 劉軍鋒, 劉珂, 張祁, 陳棟, 韓飛 申請(qǐng)人:山東靶點(diǎn)藥物研究有限公司, 海南鑫鴻凱實(shí)業(yè)有限公司