專(zhuān)利名稱：用于核酸熱啟動(dòng)擴(kuò)增的化學(xué)修飾的核苷5’-三磷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文提供的是用于核酸復(fù)制的方法和組合物。在一些具體的方面和實(shí)施方式中， 所述方法和組合物用于熱啟動(dòng)的核酸擴(kuò)增。
背景技術(shù)：
提供下列說(shuō)明以幫助讀者理解。所提供的信息或引用的參考文獻(xiàn)沒(méi)有一個(gè)被承認(rèn) 是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)很可能是現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物技術(shù)中最廣泛應(yīng)用的方 法，并且被迅速應(yīng)用到遺傳檢測(cè)、診斷學(xué)、法醫(yī)學(xué)和生物防御。Kolmodin，L. A. , et al., Nucleic Acid Protocols Handbook,569-580(Rapley, R. ed. , Humana Press2000)； Budowle, B. , et al. ,301Science,1852-1853(2003) ；Sato, Y. , et al. ,5 (Suppl. 1)Legal Medicine, S191-S193(2003) ；Saldanha, J.，et al. ,43 J. Medical Virol.，72—76(1994)； Dahiya, R. , et al. ,44Biochemistry and Molecular Biology International, 407-415(1998)；和 Elnifro，E. M.，et al. , 13Clin. Microbiol. Rev. , 559-570 (2000) PCR 被描述在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，683，195和4，683，202中。在PCR擴(kuò)增過(guò)程的各個(gè)循環(huán)中一般有幾 個(gè)步驟。雙鏈DNA靶序列首先在高溫( 95°C)下熱變性。變性的第一次出現(xiàn)在本文中 被稱為“初始變性步驟(initial denaturation step)”。接著是合成寡核苷酸引物在較低 溫度( 60°C )下與每個(gè)鏈退火。這些正向和反向引物然后都通過(guò)熱穩(wěn)定的、鎂離子依賴 性的DNA聚合酶在高溫( 70°C)下從其3’ -末端延伸，所述聚合酶結(jié)合2’ -脫氧核苷 5，-三磷酸(dNTPs)并且產(chǎn)生焦磷酸(PPi)。PCR的效用由其迅速提供 IO6倍的靶擴(kuò)增的能力以及高特異性驅(qū)動(dòng)，所述高特異 性部分取決于寡核苷酸引物雜交的特異性。因此對(duì)寡核苷酸引物序列和長(zhǎng)度進(jìn)行設(shè)計(jì)以在 退火所用溫度下僅能雜交到預(yù)期靶序列。然而，PCR擴(kuò)增反應(yīng)一般在環(huán)境室溫下制備幾分 鐘或幾小時(shí)的時(shí)間，所述室溫室溫完全低于確保寡核苷酸引物雜交的特異性所需的溫度范 圍。在這種低嚴(yán)格性的樣品制備條件下并且在初始預(yù)PCR變性步驟后，寡核苷酸引物可非 特異性地結(jié)合到其他序列并且潛在地引發(fā)不期望延伸產(chǎn)物的合成，其可沿著靶序列進(jìn)行擴(kuò) 增。與引物具有部分互補(bǔ)性的非特異性靶序列的擴(kuò)增，所謂的“錯(cuò)誤引發(fā)(mis-priming) ”， 可與期望靶序列的擴(kuò)增進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，并且可顯著降低期望序列擴(kuò)增的效率，尤其對(duì)于低拷貝 數(shù)靴(Chou, Q.，et al.，20Nucleic Acids Res. 1717-1723 (1992))?！耙锒垠w”的形成是另一種非特異性雜交的問(wèn)題形式，根據(jù)Chou，Q.，et al.， 這是在彼此的序列上雜交而沒(méi)有沒(méi)有明顯間插序列的兩個(gè)延長(zhǎng)寡核苷酸引物的擴(kuò)增的結(jié) 果。這些研究進(jìn)一步注意到，引物二聚體可在PCR期間經(jīng)歷擴(kuò)增的寡聚體化作用以產(chǎn)生寡 核苷酸引物人為產(chǎn)物(artifact)的復(fù)雜混合物，其數(shù)量和性質(zhì)經(jīng)常與低拷貝數(shù)擴(kuò)增中特 異性PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率成反比。盡管由于錯(cuò)誤引發(fā)和引物二聚體形成引起的前述問(wèn)題在所有PCR應(yīng)用中都可遇 到，但是這些問(wèn)題可能對(duì)于高靈敏性分析PCR方案特別具有挑戰(zhàn)性，諸如血液性傳播傳染因子(Saldanha，J.，et al. ；Elnifro, Ε. M.，et al·)、生物危害性細(xì)菌(Budowle, B.，et al·)、缺陷或癌基因(Dahiya，R.，et al.)以及法醫(yī)學(xué)(Budowle, B.，et al. ；Y. Sato, et al.)的檢測(cè)所用的方案。此外，在多重PCR中形成假的擴(kuò)增產(chǎn)物的機(jī)會(huì)更大。Markoulatos， P. ,et al. , 16 J. of Clin. Laboratory Analysis，47-51 (2002)。在逆轉(zhuǎn)錄酶 PCR(RT-PCR) 中，檢測(cè)靶RNA序列的最靈敏方式是在RT步驟中采用基因特異性寡核苷酸引物。Zhang，J.， et al.，337 Biochem. J.，231-241 (1999) ；Lekanne Deprez, R. H.，et al.，307Analytical Biochem.，63-69 (2002) ；Bustin, S. A.，et al.，15 J. of Biomolecular Techniques， 155-166(2004)。鑒于這些高靈敏性應(yīng)用——其要求高的特異性以避免“假陰性”和“假陽(yáng) 性”的嚴(yán)重不利結(jié)果——的重要性，關(guān)鍵是具有這樣的試劑和方案，其提供機(jī)能上不含由于 錯(cuò)誤引發(fā)和引物二聚體形成所引起的人為產(chǎn)物的分析?；谒^“熱啟動(dòng)”的方法，許多一般策略已經(jīng)被研究用于減少非特異性擴(kuò)增，所 述“熱啟動(dòng)”的方法旨在減弱在樣品制備期間以及在初始預(yù)PCR變性步驟之后，在低嚴(yán)格條 件例如室溫下，由于錯(cuò)誤引發(fā)和寡核苷酸引物二聚體形成引起的不期望的擴(kuò)增。當(dāng)反應(yīng)混 合物達(dá)到高嚴(yán)格性即“熱的”溫度以“啟動(dòng)”聚合酶介導(dǎo)的、僅與靶序列雜交的寡核苷酸引 物延伸時(shí)，擴(kuò)增隨即開(kāi)始。因此，僅在引物/靶雜交條件的嚴(yán)格性對(duì)特異性來(lái)說(shuō)為最佳時(shí)的 高溫下，溫度觸發(fā)寡核苷酸引物的酶促延伸。這些對(duì)于“熱啟動(dòng)”的一般策略包括使用⑴溫度敏感材料，如蠟作為屏障或 螯合劑以控制反應(yīng)物的混合(Chou, Q.，et al. ；Tanzer, L. R.，et al.，273 Analytical Biochem. ,307-310(1999)) ； (2)寡核苷酸適配體(Dang, C.，et al.，264 J. Mol. Biol.， 268-278(1996))或抗體(Eastlund，Ε.，et al.，2 LifeScience Quarterly, 2-5 (2001)； Mizuguchi，H.，et al.，126 J. Biochem. (Tokyo)，762-768 (1999))，其抑制 DNA 聚合酶 的功能；(3)使用第二熱穩(wěn)定酶，如焦磷酸酶(Clark，D.R.，et al.，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朩O 2002088387)以除去通過(guò)加入焦磷酸(PPi)引起的抑制；(4)用水解可逆的反應(yīng)物化學(xué) 修飾的聚合酶，如檸康酸修飾的賴氨酸(Birch，D. Ε.，et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，773，258)在 AmpliTaq Gold(Moretti, Τ. , et al. ,25BioTechniques,716-722(1998) ；Saldanha, J., et al.)中；(5)不喜低溫錯(cuò)誤引發(fā)的寡核苷酸引物序列構(gòu)建物，如競(jìng)爭(zhēng)序列(competitor sequence) (Puskas, L. G.，et al.，5 Genome Research, 309—311 (1995))或“修補(bǔ)禾口 環(huán) 結(jié)合的寡核苷酸引物” (TULIPS-PCR) (Ailenberg, M.，et al. , 29 (5) BioTechniques, 1018-1023(2000))；和(6)在引物的3’ -末端附近包含磷酸三酯核苷酸間鍵(或多個(gè))的 化學(xué)修飾引物(即磷酸三酯引物)(Zon,G. ,et al.，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0070281308 (2007))。

發(fā)明內(nèi)容
本文提供的是用于核酸復(fù)制的方法和組合物。這些方法涉及核苷5’ -三磷酸 (NTPs)、寡核苷酸引物和酶在溫度依賴性核酸模板依賴性聚合反應(yīng)中的應(yīng)用。在某些方面， 所述方法通過(guò)使用修飾NIPs進(jìn)行，該修飾NIPs在核酸復(fù)制中提供效用。在特別優(yōu)選的實(shí) 施方式中，修飾NIPs具有3’ -取代，即在末端3’ -位置除了羥基外的基團(tuán)。這種NIPs在 這些方法中的應(yīng)用可以是用于核酸擴(kuò)增，尤其熱啟動(dòng)擴(kuò)增。在某些實(shí)施方式中，在核酸復(fù)制 的高溫下初始溫育階段之前諸如PCR的初始變性步驟中，NTP的3’ -取代消弱了聚合酶介 導(dǎo)的寡核苷酸引物延伸。在某些方面和實(shí)施方式中，提供的是這樣的方法和組合物，其中如本文所公開(kāi)的NIPs的3’ -取代基在核酸復(fù)制的初始變性步驟期間或之后以及如果適用的 話在隨后的復(fù)制循環(huán)期間轉(zhuǎn)變成開(kāi)放的3’ -羥基(3’ -0H)基團(tuán)。在一些方面，提供的是核酸(如DNA)被復(fù)制的方法，其中至少一個(gè)修飾NTP被添 加到具有如本文所公開(kāi)的3’-取代的復(fù)制反應(yīng)中。優(yōu)選地，在初始溫育期間之前，即核酸復(fù) 制的初始變性溫度諸如在PCR的80-105°C以及RT-PCR的42_70°C下，至少一個(gè)修飾NTP的 3’_取代不支持(例如，在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選地核酸聚合酶能結(jié)合并延伸未取代的或天 然NIPs并且不能結(jié)合并延伸3 ’ -取代NIPs)、消弱或防止聚合酶介導(dǎo)的寡核苷酸弓I物延伸。 在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，3’ -取代消弱了在寡核苷酸引物下核酸聚合酶介導(dǎo)的3’ -取代 NTP的結(jié)合，因此防止了引物的3，-延伸。這種3，-取代NTP代表了“非底物NTP”。在其 它一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，3’ -取代NTP可結(jié)合到寡核苷酸引物的3’ -末端并且3’ -取代 基然后消弱寡核苷酸引物任何另外的核酸聚合酶介導(dǎo)的延伸。這種3’ -取代NTP代表“終 止 NTP”。在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了適合用于本文所述組合物和方法的修飾基團(tuán)的熱不穩(wěn)定 保護(hù)基團(tuán)(例如，3’ -取代和核苷酸間鍵)在寡核苷酸合成方法中的應(yīng)用。參見(jiàn)例如， Grajkowski, et al.，3 Org. Lett. ,1287-1290(2001) ；ffilk, Α.，et al. ,42 Tetrahedron Lett. ,5635-5439(2001) ；ffilk, Α.，et al. ,67 J. Org. Chem. ,6430-6438(2002) ；Cieslak, J.，et al. ,68 J. Org. Chem. , 10123-10129(2003) ；Cieslak, J.，et al. , 69J. Org. Chem.， 2509-2515(2004) ；Beaucage，et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 7，355，037 ；和 Beaucage，et al.，美國(guó)專(zhuān) 利號(hào) 6，762，298。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種基于利用3，-取代NIPs和核苷二磷酸(NDI^s)的應(yīng)用。Jeng et al. ,3 J. Supramol. Struct. ,448-468(1975)描述了 3，-芳基疊氮基 ATP 類(lèi)似物的合 成及其在肌球蛋白ATP酶的光親和標(biāo)記上的應(yīng)用。類(lèi)似的化合物在其它ATP酶系統(tǒng)中 進(jìn)行制備和測(cè)試(Schafer, et. al. ,87 FEBS Lett.，318-322 (1978) ； Lunardi, et. al.， 20Biochemistry，473-480 (1981))。Hiatt et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，232，465 及引用的專(zhuān)利描 述了用于酶催化的不依賴于模板產(chǎn)生磷酸二酯鍵的3’-保護(hù)的核苷5’-三磷酸在寡核苷酸 合成中的應(yīng)用。形成磷酸二酯鍵后，所結(jié)合的核苷酸的3’ -保護(hù)基團(tuán)可以被化學(xué)去除并且 可以繼續(xù)合成寡核苷酸。3’-取代NIPs的另一用途是逐步合成法測(cè)序。Cheeseman，美國(guó)專(zhuān) 利號(hào)5，302，509描述了 3’-修飾NIPs，其包含多核苷酸測(cè)序用的可去除熒光標(biāo)記。Metzker， et al. ,22 Nucleic Acids Res.，4259-4267 (1994)描述了作為新測(cè)序策略開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵組 分的具有UV-可去除的3’ -保護(hù)基團(tuán)的修飾NIPs的合成。類(lèi)似的方法包括包含3’ -0-烯 丙基和3’ -0-甲氧基甲基保護(hù)基團(tuán)的染料標(biāo)記的NIPs的應(yīng)用，如Ju，et al.，美國(guó)專(zhuān)利 號(hào) 6，664，079 ；Meng, Q.，et al，78 J. Org. Chem.，3248—3252 (2006)；禾口 Bi，L.，et al.，128 J. Amer. Chem. Soc. ,2542-2543(2006))所開(kāi)發(fā)。3’ _0_烯丙基保護(hù)基團(tuán)可在高溫下中性水 溶液中通過(guò)鈀催化劑去除。其他專(zhuān)利也描述了具有可去除3’-取代基的3’-取代dNIPs的 合成和應(yīng)用。例如，3’-保護(hù)基團(tuán)可通過(guò)加入鹽酸至pH 2(例如，Tsien，R. Y，W0 91/06678)； 或通過(guò)加入還原劑如巰基乙醇(例如，Kwiatkowski，M.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，279，56 ；或者通過(guò) 加入三(2-羧乙基)膦(例如，Milton，J.，et al，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，414，116)而去除。某些 3，-取代基可通過(guò)UV照射(例如，Dower，et al.，WO 92/10587)去除。已經(jīng)描述了寡核苷 酸的可去除3，-取代基(例如，Bi，W.，WO 08/016562 (A2))。
在某些方面，提供的是這樣的組合物(即3’_取代NIPs)，其包括本文進(jìn)一步描述 的式IA和IB中所示的化學(xué)式。在相關(guān)的方面，提供的是這樣的方法，其中DNA被復(fù)制，其 利用包括本文進(jìn)一步描述的式IA和IB中所示的化學(xué)式的組合物；和/或利用包含至少一 個(gè)單體單元的寡核苷酸，所述單體單元由包括式IA和IB中所示的化學(xué)式的3’ -取代NTP 的結(jié)合得到。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“非底物NTP”是指這樣的3’ -取代NTP，其具有不能結(jié)合入寡核 苷酸引物的3’-取代(圖1A)。本文提供的方法和組合物的非底物NTP具有兩種狀態(tài)。非 底物NTP由于3’ -取代基的存在是非活性狀態(tài)，并且不是核酸聚合酶的底物(圖1A)。達(dá) 到初始變性溫度——通常95°C之后，非活性非底物NTP可以被轉(zhuǎn)變成活性狀態(tài)，這是通過(guò) 3’_取代基的熱誘導(dǎo)的分子內(nèi)和/或分子間轉(zhuǎn)變或者通過(guò)其他導(dǎo)致3’-取代基轉(zhuǎn)變成未修 飾或開(kāi)放的3’ -OH基團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)。這種活性狀態(tài)的非底物NTP是相應(yīng)的天然或3’ -未 取代NTP或其功能衍生物，其具有未取代或開(kāi)放的3’-0H基團(tuán)，并且可以是核酸聚合酶的底 物并支持核酸復(fù)制(圖1和幻。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，3’ -取代基的部分或完全轉(zhuǎn)變 在溫育期間于大約95°C下發(fā)生大約1-120分鐘。在一些實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的3’-取代 NIPs可與本領(lǐng)域已知的一種或多種其他熱啟動(dòng)方法和組合物聯(lián)合使用，諸如利用溫度敏感 性材料如蠟作為屏障或鰲合劑以控制反應(yīng)物的混合；寡核苷酸適配體或抗體，其抑制DNA 聚合酶的功能；使用第二熱穩(wěn)定酶，如焦磷酸酶以除去通過(guò)加入焦磷酸(PPi)引起的抑制； 用水解可逆的反應(yīng)物化學(xué)修飾的聚合酶，如檸康酸修飾的賴氨酸；不喜低溫錯(cuò)誤引發(fā)的寡 核苷酸引物序列構(gòu)建物，如競(jìng)爭(zhēng)序列；和在引物的3’ -末端附近包含磷酸三酯核苷酸間鍵 (或多個(gè))的化學(xué)修飾引物(即磷酸三酯引物)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，除了標(biāo)準(zhǔn)dNIPs的 復(fù)制反應(yīng)中通常使用的那些條件外，3’-取代基的轉(zhuǎn)變與溫度相關(guān)地發(fā)生并且不需要酶、另 外的化學(xué)試劑或修改的聚合反應(yīng)條件。本文提供的組合物和方法的核苷和核苷酸的不同 3’ 一取代基被描述在例如 Greene, T. W.禾口 Wuts, P. G. Μ· , Protective groups in organic synthesis, John Wiley &Sons, Inc. (1999)中。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“終止NTP”是指這樣的3，-取代NTP，其能被結(jié)合到寡核苷酸 引物的3’ -末端(圖1B)。由于終止NTP的結(jié)合，形成了終止引物并且防止了引物的進(jìn)一 步延伸。終止NTP具有兩種狀態(tài)并且在兩種狀態(tài)下都是核酸聚合酶的底物。由于3’-取 代基的存在，終止NTP處于終止?fàn)顟B(tài)。終止NTP在引物3’ -末端的結(jié)合導(dǎo)致(N+1)延長(zhǎng)的 終止引物的形成并且防止引物的進(jìn)一步延伸(圖1B)。在高溫如95°C下，終止NTP可轉(zhuǎn)變 成活性狀態(tài)，這是通過(guò)3’ -取代基的熱誘導(dǎo)的分子內(nèi)和/或分子間去除或者通過(guò)其他導(dǎo)致 3’ -取代基轉(zhuǎn)變成未修飾或開(kāi)放的3’ -OH基團(tuán)的化學(xué)反應(yīng)(圖1B)。在這種狀態(tài)下，終止 NTP被轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的天然或未取代NTP或其功能衍生物，其具有未取代或開(kāi)放的3’ -0H,并 且可以是核酸聚合酶的底物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，3’ -取代基的部分或完全轉(zhuǎn)變?cè)?溫育期間大約95°C下發(fā)生大約1-120分鐘。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，除了標(biāo)準(zhǔn)dNIPs的復(fù)制 反應(yīng)中通常使用的那些條件外，3’-取代基的轉(zhuǎn)變與溫度相關(guān)地發(fā)生并且不需要酶、另外的 化學(xué)試劑或修改的聚合反應(yīng)條件。本文提供的組合物和方法的核苷和核苷酸的不同3’-取 代基被描述在例如Greene，Τ. W.，et al中。在核酸聚合酶結(jié)合終止NTP到引物的3’ -末端的情況下，終止NTP變成(N+1)延 長(zhǎng)引物——其被稱為“終止引物”~的一部分。在達(dá)到高溫——通常95°C之前，終止引物由于在其末端3’ -取代基的存在不可能被進(jìn)一步延長(zhǎng)并且保持在“終止?fàn)顟B(tài)”，最后的核苷 單元源于結(jié)合的終止NTP。終止引物的這種終止?fàn)顟B(tài)等同于本文定義的非底物NTP的非活 性狀態(tài)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，除了包含3’ -取代基外，終止引物包含另外的修飾，例如具 有修飾的糖、堿基、(5’ -3’)_核苷酸間鍵或其組合的修飾核苷殘基。更優(yōu)選地，終止引物 包含熱不穩(wěn)定的3’ -取代基。一旦達(dá)到高溫(例如，PCR的初始變性溫度)，終止引物就可 通過(guò)去除3’ -取代基的熱誘導(dǎo)分子內(nèi)和/或分子間片段化變成可延長(zhǎng)引物(圖IB和2)。 “可延長(zhǎng)引物(extendable primer) ”具有未取代或開(kāi)放的3’-OH并且能通過(guò)核酸聚合酶延 長(zhǎng)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，3’ -取代基的部分或完全轉(zhuǎn)變?cè)跍赜蟠蠹s95°C下發(fā)生大 約1-120分鐘。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，除了標(biāo)準(zhǔn)dNIPs的復(fù)制中通常使用的那些條件外，終 止引物的3’ -取代基的轉(zhuǎn)變與溫度相關(guān)地發(fā)生并且不需要酶、另外的化學(xué)試劑或修改的聚 合反應(yīng)條件。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，聚合反應(yīng)中存在的NTP聚合反應(yīng)混合物的一種或多種成分 諸如3’ -取代NTP、修飾NTP、未修飾NTP或其組合可用可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。因此，復(fù)制 后，目標(biāo)片段可通過(guò)例如大小、質(zhì)量、親合力捕獲或顏色進(jìn)行鑒定。可檢測(cè)標(biāo)記優(yōu)選地是熒 光染料，親合力捕獲標(biāo)記優(yōu)選為生物素。在另一方面，本文的方法和組合物提供用于核酸復(fù)制的3’ -取代NIPs，其包括具 有一個(gè)或多個(gè)修飾基團(tuán)的NTP。3’-取代NIPs可包括本文進(jìn)一步描述的式IA和IB中所述 化學(xué)結(jié)構(gòu)中的一個(gè)或多個(gè)。在又一方面，本文的方法和組合物提供合成本文所公開(kāi)的3’ -取代NIPs的方法。還提供了包括本文所述用于進(jìn)行復(fù)制的3’-取代NIPs的試劑盒。例如，試劑盒可 包含針對(duì)普通復(fù)制靶標(biāo)諸如持家基因的PCR試劑。包含3’ -取代NTP的試劑盒可包括標(biāo) 定用于核酸復(fù)制的容器、進(jìn)行核酸復(fù)制的說(shuō)明書(shū)、和/或一種或多種試劑，所述試劑選自修 飾引物、未修飾引物、修飾NIPs (例如，3’-取代NIPs)、未修飾OTPs、核酸聚合酶、氯化鎂或 其它二價(jià)陽(yáng)離子(例如，鎂和錳)和反應(yīng)緩沖劑。在一種實(shí)施方式中，試劑盒包括3’ -取 代OTPs、核酸聚合酶和至少一種另外的酶(例如，第二核酸聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、連接酶或限 制酶)，并且可包括適于所述至少一種另外的酶的另外緩沖成分。優(yōu)選地，試劑盒包括兩種 或更多種核酸復(fù)制試劑，優(yōu)選地三種或更多種以及更優(yōu)選地四種或更多種。包含3’ -取代 NTP的試劑盒還可包括寡核苷酸引物。在一種實(shí)施方式中，寡核苷酸引物被修飾，例如，在 核苷酸間鍵、核苷酸糖、三磷酸鏈和/或核苷酸堿基上具有任何取代或修飾。試劑盒可包括 標(biāo)定用于核酸復(fù)制的容器、進(jìn)行核酸復(fù)制的說(shuō)明書(shū)、和/或一種或多種試劑，所述試劑選自 dNTPs、核酸聚合酶、鎂和反應(yīng)溶液。本文提供的用于核酸復(fù)制的方法和組合物可用于這樣的應(yīng)用中，所述應(yīng)用利用合 成和/或天然MPs、修飾寡核苷酸引物、未修飾寡核苷酸引物和用于延伸核酸的聚合酶。本 文提供的方法和組合物的NIPs可具有單個(gè)3’ -取代或者可任選地具有另外的修飾位點(diǎn)。本文提供的方法和組合物的3’ -取代NIPs具有重大的優(yōu)點(diǎn)。例如，終端用戶可 采用與未取代標(biāo)準(zhǔn)NIPs已經(jīng)采用的相同的復(fù)制方案和方法。本文提供的方法和組合物的 3’-取代NIPs與現(xiàn)有的復(fù)制系統(tǒng)和試劑兼容(包括各種熱啟動(dòng)PCR方法)；不需要另外的 酶或試劑但是可以使用。標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)和酶促合成方法可被用于合成本文提供的方法和組合物 的3’ -取代OTPs。要求保真度、基于聚合酶的復(fù)制應(yīng)用可與本文提供的方法和組合物的3，-取代NIPs —起應(yīng)用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“復(fù)制(r印lication)”、“擴(kuò)增(amplification)”或“擴(kuò)增 (amplify)”是指本領(lǐng)域已知的、用于復(fù)制靶核酸從而增加選擇的核酸序列的拷貝數(shù)的方 法。涉及本文提供的組合物和方法的復(fù)制和擴(kuò)增可以利用3’ -取代NIPs和/或核酸聚 合酶延伸的引物。靶核酸的復(fù)制或擴(kuò)增可以是指數(shù)的、非線性的或線性的。優(yōu)選地，復(fù)制 或擴(kuò)增是指數(shù)的或非線性的。靶核酸(目標(biāo)核酸)可以是DNA、RNA、cDNA或修飾的核酸 模板。盡管下文描述的示例性方法涉及PCR擴(kuò)增，但是適于本文提供的方法和組合物的很 多其它用于核酸酶促擴(kuò)增和復(fù)制的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，其它酶促?gòu)?fù)制和擴(kuò)增方 法包括等溫法(isothermal methods)、滾環(huán)法(rolling circle methods)、熱啟動(dòng) PCR、 實(shí)時(shí)PCR、等位基因特異性PCR、裝配PCR或聚合酶循環(huán)裝配(PCA)、不對(duì)稱PCR、菌落PCR、 乳液PCR、快速PCR、實(shí)時(shí)PCR、核酸連接、缺口連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(缺口 LCR)、連接介導(dǎo)的PCR、 多重連接依賴性探針擴(kuò)增(MLPA)、缺口延伸連接PCR(GEXL-PCR)、定量PCR^hPCR)、定量 實(shí)時(shí)PCROlRT-PCR)、多重PCR、解旋酶依賴性擴(kuò)增、序列間特異性(ISSR)PCR、反向PCR、線 性-然后-指數(shù)性-PCR (LATE-PCR)、甲基化特異性PCR(MSP)、嵌套式PCR、重疊-延伸PCR、 PAN-AC分析、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、cDNA末端迅速擴(kuò)增(RACE PCR)、單分子擴(kuò)增PCR(SMA PCR)、熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(TAIL-PCR)、遞降PCR、長(zhǎng)PCR、核酸測(cè)序(包括DNA測(cè)序和RNA測(cè) 序)、轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、DNA或RNA連接和本領(lǐng)域已知的其它核酸延伸反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù) 人員將理解，其它方法可以替代PCR方法使用或與PCR方法一起使用，包括未來(lái)開(kāi)發(fā)的酶 促?gòu)?fù)制反應(yīng)。參見(jiàn)，例如 Saiki，“Amplification of Genomic DNA” in PCR Protocols, Innis et al. ,eds. ,Academic Press,San Diego,CA,13-20(1990) ； ffharam,et al·,29(11) Nucleic Acids Res, E54-E54 (2001) ；Hafner, et al.，30 (4)Biotechniques，852-6，858， 860passim(2001) ；Ross, P. , et al.，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?WO 91/06678 ；Kwiatkowski，Μ.，美國(guó) 專(zhuān)利號(hào) US 6, 255, 475,US 6309836 和 US 6, 639, 088 以及 ΕΡ1218391 ;Anazawa，Τ.，et al.， 美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6242193 ;Ju，et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) US 6, 664, 079 ；Tsien, R. Y. , et al.，國(guó)際專(zhuān) 利申請(qǐng)?zhí)朩O 91/06678 ；禾口 Dower，et al.，國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朩O 92/10587。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸”、“核苷酸序列，，或“核酸序列，，是指寡核苷酸、多核苷酸 或其任何片段、任意核糖或脫氧核糖衍生物，并且指天然產(chǎn)生或合成分子，其包含天然和 /或修飾的核苷酸殘基以及核苷酸間鍵。這些短語(yǔ)也指天然的(例如，基因組的)或合成 來(lái)源的DNA或RNA——其可以是單鏈的、雙鏈的、三鏈的或四鏈的，并可以代表有義鏈或反 義鏈——或指任何DNA-樣或RNA-樣物質(zhì)?！癛NA等同物”相對(duì)于DNA序列，由核苷酸的 線性序列組成，該核苷酸的線性序列與參照DNA序列是相同的，除了所有或大部分存在的 含氮堿基胸腺嘧啶被尿嘧啶取代，并且糖骨架由核糖，而不是2’ -脫氧核糖組成。適合本 文提供的方法和組合物的另外可選的核酸骨架包括，但不限于，硫代磷酸酯、硒代磷酸酯 (phosphoroselenoate)、烷基磷酸三酯、芳基磷酸三酯、烷基膦酸酯、芳基膦酸酯、鎖定核酸 (LNA)和肽核酸(PNA)和硼磷酸酯(phosphoboronate)。RNA可以被用于本文所述的方法和 /或可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄被轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA用于本文所述的方法。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“3’ -取代NTP”是指這樣的核苷5’ -三磷酸，其在3’ _位置具 有除了開(kāi)放羥基外的化學(xué)部分基團(tuán)。3’ -取代NTP包括，例如包括修飾糖、堿基或三磷酸 鏈或者修飾糖、堿基或三磷酸鏈的任意組合的NTP，例如，如本文進(jìn)一步描述的式IA和IB中所示。這種 NTPs 的實(shí)例可以在例如"Nucleoside Triphosphates and Their Analogs Chemistry,Biotechnology and Biological Applications, "Vaghefi,M. ,ed. ,Taylor and Francis, Boca Raton (2005) ；Metzker, Μ. L. 15Genome Researchl767_1776 (2005)(以及本 文的參考文獻(xiàn))中找到。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“引物”、“寡核苷酸”或“寡核苷酸引物”是指核糖-或脫氧核 糖-多核苷酸，通常為單鏈，可以是天然發(fā)生的或合成的，通常包含約5至約50個(gè)核苷酸之 間的序列，更優(yōu)選為約10至約30個(gè)核苷酸，或更優(yōu)選為約15至25個(gè)核苷酸。寡核苷酸可 包含一個(gè)或多個(gè)修飾基團(tuán)。寡核苷酸可包括DNA、RNA、PNA、LNA和/或其他修飾核苷。熟 練技術(shù)人員能設(shè)計(jì)和制備適合復(fù)制靶序列的引物。在本文提供的方法和組合物中使用的引 物的引物雜交序列的長(zhǎng)度取決于幾個(gè)因素，包括核苷酸序列的同一性以及這些核酸在體外 核酸復(fù)制期間被雜交或使用的溫度。對(duì)于確定特定序列同一性的引物的引物雜交序列的優(yōu) 選長(zhǎng)度所必需的考慮事項(xiàng)，是普通技術(shù)人員所熟知的。例如，短核酸或寡核苷酸的長(zhǎng)度可以 與其雜交特異性或選擇性相關(guān)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“終止引物”是指這樣的引物或寡核苷酸引物，其通過(guò)將終止NTP 核酸聚合酶介導(dǎo)的結(jié)合到引物的3’ -末端而結(jié)合的3’ -取代基。終止引物——其可包括 本文提供的方法和組合物的一個(gè)或多個(gè)另外的修飾基團(tuán)——在將3’-取代基轉(zhuǎn)化為開(kāi)放的 3’ -OH基團(tuán)之前不可能被延長(zhǎng)。終止引物可包括天然DNA或RNA核苷、修飾核苷或核苷類(lèi) 似物，其包含天然核苷酸間磷酸二酯鍵或其修飾，或者其組合。優(yōu)選地，3’ -取代基是熱不 穩(wěn)定的，并且隨著復(fù)制反應(yīng)介質(zhì)的溫度升高以增加的速度與終止引物解離。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可延長(zhǎng)引物(extendable primer) ”是指這樣的引物或寡核苷 酸引物，其包含未修飾的或開(kāi)放的3’ -OH基團(tuán)并且其可通過(guò)將NTP核酸聚合酶結(jié)合到引物 的3’-末端而被延長(zhǎng)。可延長(zhǎng)引物可以是原始啟動(dòng)引物，或者可以是轉(zhuǎn)化的終止引物，其中 3’ -取代基已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為自由的3’ -OH基團(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“3’-取代基”是指除了未修飾或開(kāi)放的羥基(3’_0H)外NTP或 引物的3’ -位置上的化學(xué)部分。在某些實(shí)施方式中，化學(xué)部分是醚、酯或碳酸酯。在一些 優(yōu)選的實(shí)施方式中，3’ -取代基選自0-(對(duì)甲苯)磺酸酯；0-磷酸酯；0-硝酸酯；0-[4_甲 氧基]四氫吡喃基；0-[4_甲氧基]-四氫硫代吡喃基；0-四氫硫代吡喃基；0-[5_甲 基]-四氫呋喃基；0-[2_甲基，4-甲氧基]-四氫吡喃基；0-[5_甲基]-四氫吡喃基；0-四 氫吡喃基；0-四氫呋喃基；0-苯氧基乙酰基；0-甲氧基乙?；?-乙?；?；O-C(O)-OCH3 ； O-C(O)-CH2CH2CNjPO-C(S)-OCH3t5在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，3’-取代基選自0-甲氧 基四氫吡喃基；0-四氫吡喃基；和0-四氫呋喃基。本文提供的方法和組合物的3’ -取代NIPs對(duì)于寡核苷酸或核酸延伸優(yōu)選地沒(méi) 有功效或具有降低的功效。優(yōu)選地，下列情況認(rèn)為延伸被削弱作為復(fù)制反應(yīng)中的底物， 3’ -取代NTP與其對(duì)應(yīng)的3’ -未取代NTP相比功效降低至少50%，作為復(fù)制反應(yīng)中的底物 比其對(duì)應(yīng)的3’ -未取代NTP優(yōu)選地功效降低至少60%，優(yōu)選地功效降低至少70%，更優(yōu)選 地功效降低至少80%，更優(yōu)選地功效降低至少90%，更優(yōu)選地功效降低至少95%，更優(yōu)選 地功效降低至少99%以及最優(yōu)選地功效降低100%。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易確定底物活性 的水平以及NIPs的功效。在實(shí)施例4中闡明了一種確定底物功效的方法。在一些優(yōu)選的 實(shí)施方式中，3’-取代基是熱不穩(wěn)定的，并且隨著復(fù)制反應(yīng)介質(zhì)的溫度升高以增加的速度與3，-取代NTP解離。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“3-未取代”、“天然”或“未修飾”在NIPs和寡核苷酸引物的上 下文中是指不帶有修飾基團(tuán)的NIPs和寡核苷酸引物或者不帶有修飾基團(tuán)的NIPs和寡核苷 酸引物的功能等同物。除了 3’ -取代基外，3’ -取代NTP或3’ -取代引物可包含一個(gè)或多個(gè)另外的修 飾基團(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“修飾基團(tuán)，，是指可在包括但不限于磷酸酯、糖、三磷酸酯鏈或核 苷堿基部分的位置連接到NTP或引物上的任何化學(xué)部分。NTP或引物的修飾基團(tuán)可以是與 核酸復(fù)制過(guò)程兼容的任何性質(zhì)的基團(tuán)。修飾基團(tuán)可以是不穩(wěn)定的基團(tuán)，其隨著酶反應(yīng)介質(zhì) 的溫度升高以增加的速度與修飾NTP或修飾引物解離。在一種實(shí)施方式中，聚合反應(yīng)中存 在的修飾引物的修飾基團(tuán)可以存在于核苷酸間鍵中，例如，如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?007(^81308 中所述。在另一實(shí)施方式中，聚合反應(yīng)中存在的修飾NTP或引物的修飾基團(tuán)可以是可檢測(cè) 標(biāo)記。因此，復(fù)制后，靶片段可以通過(guò)大小、質(zhì)量、親和力捕獲和/或顏色進(jìn)行鑒定?？蓹z測(cè) 標(biāo)記優(yōu)選地是熒光染料；親和力捕獲標(biāo)記優(yōu)選地是生物素。如本文所用，關(guān)于寡核苷酸的術(shù)語(yǔ)“末端”，指在寡核苷酸的3'或5'末端上的核 苷酸。優(yōu)選地，寡核苷酸的末端包括末端的6個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地末端的5個(gè)核苷酸，更優(yōu) 選地末端的4個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地末端的3個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地末端的2個(gè)核苷酸或更優(yōu)選 地末端的1個(gè)核苷酸。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化(convert)”、“解離(dissociate) ”、“解離 (dissociation) ”或“片段化(fragmentation) ”是指修飾基團(tuán)從NTP或引物中的去除或轉(zhuǎn) 化(例如，通過(guò)3’ -取代基的去除或3’ -取代基轉(zhuǎn)化為3’ -OH基團(tuán))。修飾基團(tuán)的去除 或轉(zhuǎn)化可以是部分的，例如當(dāng)3’ -取代基與一部分修飾分子解離時(shí)，或者是完全的，例如當(dāng) 3’ -取代基與所有修飾分子解離時(shí)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，3’ -位置上修飾基團(tuán)的去 除或轉(zhuǎn)化導(dǎo)致在NTP或引物的3’ -位置上形成了開(kāi)放的3’ -OH基團(tuán)。修飾基團(tuán)的去除或 轉(zhuǎn)化可以通過(guò)分子間反應(yīng)或通過(guò)與另一分子的反應(yīng)發(fā)生。優(yōu)選地，3’ -取代基的去除或轉(zhuǎn) 化將3’ -取代NTP轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)并且將終止引物轉(zhuǎn)化為可延長(zhǎng)引物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核苷酸間鍵”是連接寡核苷酸引物或核酸的兩個(gè)核苷的鍵(一 個(gè)或多個(gè))并且可以是天然磷酸二酯鍵或者修飾的鍵。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“靶(標(biāo))”、“靶核酸序列”或“核酸靶(標(biāo))”是指待被鑒定的 核苷酸序列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記”或“可檢測(cè)標(biāo)記”是指任何分子或分子的組合，其可以被 附著或以其他方式連結(jié)于分子上，以致該分子能通過(guò)檢測(cè)此標(biāo)記被直接或間接地檢測(cè)。可 檢測(cè)標(biāo)記可以是放射性同位素(例如，碳、磷、碘、銦、硫、氚等)、質(zhì)量同位素(例如，H2、C13 或N15)、染料或熒光團(tuán)(例如，花青、熒光素、若丹明)、半抗原(例如，生物素)或任何其它 能被直接或間接檢測(cè)的試劑。在標(biāo)記的NTP結(jié)合到擴(kuò)增子或其他聚合產(chǎn)物后，標(biāo)記可被檢 測(cè)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“熱誘導(dǎo)”或“熱轉(zhuǎn)化”是指這樣的過(guò)程，其中應(yīng)用熱以將3’ -取 代NTP的3’ -取代基去除或轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生核酸聚合酶的合適底物。術(shù)語(yǔ)熱誘導(dǎo)或熱轉(zhuǎn)化 還是指這樣的過(guò)程，其中應(yīng)用熱以將終止引物的3’ -取代基去除或轉(zhuǎn)化產(chǎn)生可延長(zhǎng)引物， 由此使其成為核酸聚合酶的底物。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“熱啟動(dòng)”是指核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其中聚合酶介導(dǎo)的核酸復(fù)制被減 弱，直至反應(yīng)達(dá)到期望溫度，所述期望溫度優(yōu)選地是高于酶的最佳延伸溫度的初始溫度。 在熱啟動(dòng)PCR應(yīng)用中，初始溫度達(dá)到約80-105°C之間；或至少80°C、或至少85°C、或至少 90°C、或約94°C、或約95°C、或約96°C或約100°C。優(yōu)選地，“熱啟動(dòng)”P(pán)CR要求在初始變性 步驟之前加入核酸聚合酶和所有其他PCR成分。術(shù)語(yǔ)熱啟動(dòng)在本領(lǐng)域中是熟知的，并且有 很多已知的減弱復(fù)制的方法，如修飾的聚合酶、具有減弱雜交的二級(jí)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸或具 有減弱延長(zhǎng)的化學(xué)修飾的寡核苷酸以及包含在溫度敏感屏障如蠟中的反應(yīng)物。在一個(gè)優(yōu)選 實(shí)施方式中，熱啟動(dòng)擴(kuò)增是由熱誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化非底物NTP、終止NTP或終止引物中的3’-取代基 成開(kāi)放的3’ -OH基團(tuán)引起的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“錯(cuò)誤引發(fā)(mis-priming) ”是指核酸聚合酶介導(dǎo)的引物延伸的 非特異性啟動(dòng)。具體地，它涉及與引物具有一定程度的非互補(bǔ)性并且可能啟動(dòng)不期望延伸 產(chǎn)物的合成的核酸序列，其可沿著靶序列擴(kuò)增。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“無(wú)活性狀態(tài)”或“無(wú)活性的”在NTP的上下文中是指具有3’-取 代基的非底物NTP。在一種實(shí)施方式中，3’ -取代基與NTP的連接使其無(wú)活性并且消弱了 3’-取代NTP向寡核苷酸引物中的結(jié)合，因此防止通過(guò)核酸聚合酶的3’-延長(zhǎng)(圖1A)。如 本文所用，術(shù)語(yǔ)“終止?fàn)顟B(tài)”在終止NTP的上下文中是指這樣的3’ -取代NTP，其能被結(jié)合 到引物的3’ -末端以形成不可延長(zhǎng)的N+1延長(zhǎng)引物(即終止引物)(圖1B)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“終止?fàn)顟B(tài)”在引物的上下文中是指在其3’ -末端包含3’ -取 代基的引物(圖1B)。在一種實(shí)施方式中，將3’ -取代終止NTP結(jié)合到引物的3’ -末端引 起引物延伸的暫時(shí)終止。所得終止引物不支持核酸復(fù)制反應(yīng)并且直到3’-取代基被轉(zhuǎn)化為 開(kāi)放的3’ -OH基團(tuán)才可能被進(jìn)一步延長(zhǎng)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“活性狀態(tài)，，或“活性的”在NTP的上下文中是指這樣的NTP，其 可以是聚合酶的底物。優(yōu)選地，“活性的”NTP不具有3’ -取代或者它可以是包含轉(zhuǎn)化的 3’ -取代基的終止NTP。優(yōu)選地，活性的NTP具有未修飾的3’ -OH基團(tuán)并且可在復(fù)制反應(yīng) 中充當(dāng)核酸聚合酶的底物?；钚誀顟B(tài)NTP可以是從未具有3’ -取代的NTP，或者3’ -取代 已經(jīng)被轉(zhuǎn)變、去除或轉(zhuǎn)化的NTP。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“引物二聚體”是指非特異性寡核苷酸引物延長(zhǎng)產(chǎn)物，這是在彼 此的序列上雜交而沒(méi)有沒(méi)有明顯間插序列的兩個(gè)延長(zhǎng)寡核苷酸引物的擴(kuò)增的結(jié)果。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜交”或“特異性雜交”是指這樣的過(guò)程，其中兩條互補(bǔ)的核 酸鏈在適當(dāng)?shù)膰?yán)格條件下互相退火。與靶核酸的雜交典型的并且優(yōu)選以探針長(zhǎng)度核酸分 子進(jìn)行，其優(yōu)選為20-100長(zhǎng)度的核苷酸。核酸雜交技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的。參見(jiàn)，例 如，Sambrook, et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Second Edition,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N. Y. (1989) ；Ausubel,F. Μ. ,et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N. J. (1994)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格雜交(stringent hybridization)條件”是指不允許兩個(gè) 非完全互補(bǔ)的核酸雜交的雜交條件。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“樣品”或“測(cè)試樣品”是指任何被認(rèn)為包含目的核酸的液體或 固體材料。測(cè)試樣品可以來(lái)自任何生物源(即，生物樣品)，如培養(yǎng)基中的細(xì)胞或組織樣品 或合成產(chǎn)生的，包括化學(xué)合成的模板。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)(complement) ”、“互補(bǔ)的(complementary) ”或“互補(bǔ) 性(complementarity)”，在寡核苷酸或多核苷酸(即核苷酸序列，如寡核苷酸引物或靶核 酸)的上下文中，指標(biāo)準(zhǔn)Watson/Crick堿基配對(duì)原則?；パa(bǔ)序列也可以是與DNA序列或 其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的DNA或RNA序列，并且也可以是cDNA。例如，序列“5' -A-G-T-3”與序 列“3' -T-C-A-5’”是互補(bǔ)的。某些在天然核酸中一般不被發(fā)現(xiàn)的或化學(xué)合成的核苷酸可 以包括本文所述的核酸中；這些包括但不限于堿基和糖修飾的核苷、核苷酸和核酸，諸如肌 苷、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、2’ -0-甲基鳥(niǎo)嘌呤、2’ -氟-2’ -脫氧胞啶、鎖定核酸(LNA)和肽核酸 (PNA)?；パa(bǔ)性不需要是完全的；穩(wěn)定的雙鏈體可以包含錯(cuò)配的堿基對(duì)、簡(jiǎn)并的或未配對(duì)的 堿基。核酸技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以經(jīng)驗(yàn)地確定雙鏈體穩(wěn)定性，這考慮到許多變量，包括， 例如，寡核苷酸的長(zhǎng)度、寡核苷酸的堿基組成和序列、錯(cuò)配堿基對(duì)的發(fā)生率、離子強(qiáng)度和其 他雜交緩沖成分和條件?；パa(bǔ)性可以是“部分的”，其中兩條核酸鏈的僅僅一些核苷酸堿基根據(jù)堿基配對(duì)原 則匹配。互補(bǔ)性可以是完全的或全部的，其中兩條核酸鏈的所有核苷酸堿基都根據(jù)堿基配 對(duì)原則匹配?；パa(bǔ)性可以是不存在的，其中兩條核酸鏈中沒(méi)有核苷酸堿基根據(jù)堿基配對(duì)原 則匹配。核酸鏈之間的互補(bǔ)性的程度顯著影響核酸鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度。這在擴(kuò)增反 應(yīng)以及依賴核酸之間結(jié)合的檢測(cè)方法中是特別重要的。這些術(shù)語(yǔ)也可以用于指單獨(dú)的核苷 酸，尤其是在多核苷酸的上下文中。例如，在對(duì)比或比較在寡核苷酸的剩余部分和核酸鏈之 間的互補(bǔ)性中，在寡核苷酸中的特定核苷酸可被記下其與另一條核酸鏈中的核苷酸的互補(bǔ) 性或其互補(bǔ)性的缺乏。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基本上互補(bǔ)的，，是指兩個(gè)序列，其在嚴(yán)格雜交條件下雜交。技 術(shù)人員將會(huì)理解基本上互補(bǔ)的序列不必沿著它們的全長(zhǎng)雜交。尤其是，基本上互補(bǔ)的序列 包含不與靶序列雜交的堿基的相鄰堿基序列，其定位在嚴(yán)格雜交條件下與靶序列雜交的堿 基的相鄰序列的3'或5'端。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“正向引物”是指寡核苷酸引物，其與單鏈的RNA、單鏈的DNA或 雙鏈的DNA的反義鏈退火。“反向引物”與單鏈的RNA、單鏈的DNA或雙鏈的DNA的有義鏈 退火。如本文所用，如果當(dāng)寡核苷酸引物和核酸比對(duì)時(shí)，寡核苷酸引物的寡核苷酸引物 雜交序列與核酸的一部分具有至少50%的序列同一性，寡核苷酸引物對(duì)核酸是“特異性 的”。對(duì)核酸特異性的寡核苷酸引物是，在適合的雜交或清洗條件下，能與目的靶雜交雜交， 且基本上不與非目的核酸序列雜交的寡核苷酸引物。更高水平的序列同一性是優(yōu)選的，并 包括至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%以及更優(yōu)選100%的 序列同一性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核苷”包括所有天然發(fā)生的核苷，包括在天然核酸中發(fā)現(xiàn)的所 有形式的核苷堿基和呋喃糖苷。天然發(fā)生的核苷中最常見(jiàn)的堿基環(huán)是嘌呤和嘧啶環(huán)。天然 發(fā)生的嘌呤環(huán)包括，例如，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和N6-甲基腺嘌呤。天然發(fā)生的嘧啶環(huán)包括，例如 胞嘧啶、胸腺嘧啶和5-甲基胞嘧啶。天然發(fā)生的核苷例如，包括但不限于，腺苷、鳥(niǎo)苷、胞 啶、胸苷、胞苷、肌苷、7-脫氮鳥(niǎo)苷、7-甲基鳥(niǎo)苷的核糖和2’ -脫氧核糖衍生物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核苷類(lèi)似物”、“修飾的核苷”或“核苷衍生物”包括如本文所述 的合成的核苷。核苷衍生物也包括具有修飾的堿基或/和糖部分的核苷，其具有或不具有保護(hù)基。這種類(lèi)似物包括，例如，2’-脫氧-2’-氟尿苷、2’-0-甲基尿苷和類(lèi)似物。本文提 供的化合物和方法包括這些堿基環(huán)和其合成的類(lèi)似物，以及非自然的雜環(huán)-取代堿基糖和 甚至非環(huán)取代堿基糖。而且，核苷衍生物包括其它嘌呤和嘧啶類(lèi)似物，例如，鹵素-取代嘌 呤(例如，6-氟嘌呤)、鹵素-取代嘧啶、N6-乙基腺嘌呤、N4-(烷基)_胞嘧啶、5-乙基胞嘧 啶以及類(lèi)似物。核苷衍生物和類(lèi)似物包含廣泛的多種修飾，如那些在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，762，298 中所描述的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“通用堿基NTP ”、“簡(jiǎn)并堿基NTP ”、“通用堿基NTP類(lèi)似物，，、 “簡(jiǎn)并堿基NTP類(lèi)似物”包括，例如，具有人工堿基的NTP類(lèi)似物，其優(yōu)選地作為任何特異 性NTP的替代品可被核酸聚合酶識(shí)別，所述特異性NTP諸如dATP、ATP、dTTP、dUTP、dCTP、 CTP, dGTP、GTP和其它特異性NTP。具有通用堿基或變性堿基的NIPs也可以使用并且實(shí) 例也可在 Loakes，D.，29 Nucleic Acids Res. 2437-2447(2001) ；Crey-Desbiolles, C., et. al. ,33 Nucleic Acids Res. 1532-1543(2005) ；Kincaid,K. ,et. al. ,33 Nucleic Acids Res. 2620-2628(2005) ；Pr印arata，F(xiàn)P，Oliver，JS，11 J. Comput. Biol. 753-765 (2004)；和 Hill, F.，et. al. ,95 Proc Natl Acad Sci U S A. 4258-4263 (1998)中找到。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“修飾的寡核苷酸”包括，例如，這樣的寡核苷酸，其包含修飾的 核苷、修飾的核苷酸間鍵、或者具有修飾的核苷和修飾的核苷酸間鍵的任意組合(即使在 寡核苷酸鏈中僅存在天然核苷)。寡核苷酸核苷酸間鍵修飾的實(shí)例可以在例如Waldner， et al. ,6 Bioorg. Med. Chem. Letters 2363-2366(1996)中找到。修飾的寡核苷酸的實(shí) 例是寡核苷酸的硫代磷酸酯、磷酸三酯、和甲基膦酸酯衍生物，可以在例如Stec，W. J.，et al.，33Chem. Int. Ed. Engl.，709—722 (1994) ；Lebedev, Α. V.，et al.，Ε·，4 Perspect. Drug Discov. Des.，17-40(1996)；和 hn，et al.，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?20070281308 中找到。術(shù)語(yǔ)修 飾的寡核苷酸包括在3’ -末端核苷上具有3’ -取代的寡核苷酸。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“?；北硎净鶊F(tuán)-C(O)Ra，其中Ra是氫、低級(jí)烷基、環(huán)烷基、雜環(huán) 基、芳基、雜芳基和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“取代的?；北硎净鶊F(tuán)-C(O)Ra'，其中Ra'是取代的低級(jí)烷 基、取代的環(huán)烷基、取代的雜環(huán)基、取代的芳基、取代的雜芳基和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“酰氧基”表示基團(tuán)-OC(O)Rb，其中Rb是氫、低級(jí)烷基、取代的低 級(jí)烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的 雜芳基和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷烴”是指這樣的有機(jī)化合物，其包括碳原子和氫原子，包括 C-H鍵并且另外在除了甲烷外的烷烴中包括C-C單鍵。術(shù)語(yǔ)“烷烴”包括直鏈烷烴諸如具有 1至20個(gè)碳原子的烷烴。在一些實(shí)施方式中，烷烴包括直鏈烷烴諸如具有1至8個(gè)碳原子 的烷烴，諸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷和辛烷。術(shù)語(yǔ)“烷烴”也包括支鏈烷烴， 諸如，但不限于具有1-20個(gè)碳原子的支鏈烷烴，并且在一些實(shí)施方式中具有1-8個(gè)碳原子 的支鏈烷烴諸如，但不限于，2-甲基丙烷、2，2- 二甲基丙烷、2-甲基丁烷、2，3- 二甲基丁烷、 2，2_ 二甲基丁烷、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、2，3_ 二甲基戊烷、2，4_ 二甲基戊烷、2，2_ 二甲 基戊烷、3，3_二甲基戊烷、2-甲基己烷、3-甲基己烷、2，2_二甲基己烷、2，3_二甲基己烷、2， 4-二甲基己烷、2，5_ 二甲基己烷、3，3_ 二甲基己烷、3，4_ 二甲基己烷、2-甲基庚烷、3-甲基 庚烷、4-甲基庚烷、3-乙基戊烷、3-乙基-2-甲基戊烷、3-乙基己烷和類(lèi)似物。烷烴的C-C或C-H鍵可以用與另一基團(tuán)的鍵取代，諸如羥基，鹵素諸如F、Cl、Br或I，硫氫基或胺基。被 這樣的基團(tuán)取代的烷烴可分別命名為羥基烷烴、鹵代烷烴諸如氟代烷烴、氯代烷烴、溴代烷 烴、碘代烷烴、巰基烷烴和氨基烷烴。 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”表示直-鏈或支-鏈烴基，其具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵，并 且除非另外特別說(shuō)明，其包含約2至約20個(gè)碳原子，優(yōu)選約2至約10個(gè)碳原子，更優(yōu)選約2 至約8個(gè)碳原子，并且最優(yōu)選為約2至約6個(gè)碳原子。鏈烯基的實(shí)例包括乙烯基、烯丙基、 1，4_ 丁間二烯基、異丙烯基和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烯基芳基”是指烯基-取代的芳基，并且“取代的烯基芳基”是 指這樣的烯基芳基，其進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“亞鏈烯基(alkenylene) ”是指二價(jià)的直鏈或支鏈的烴基基團(tuán)， 其具有至少一個(gè)碳碳雙鍵，并且典型的包含2-20個(gè)碳原子，優(yōu)選為2-12個(gè)碳原子，優(yōu)選為 2-8個(gè)碳原子，并且“取代的亞鏈烯基”是指這樣的亞鏈烯基基團(tuán)，其進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè) 如本文所列的取代基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷基”是指烴的單鍵鏈，通常范圍從1-20個(gè)碳原子，優(yōu)選為1-8 個(gè)碳原子，其實(shí)例包括甲基、乙基、丙基、異丙基和類(lèi)似物。此烷基的實(shí)例包括甲基、乙基、丙 基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基、辛基、十二烷基和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷基”是指烴的直鏈或支鏈，其范圍通常是從1-6個(gè)碳原 子，優(yōu)選為2-5個(gè)碳原子。其實(shí)例包括乙基、丙基、異丙基和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“亞烷基”是指二價(jià)的烴基，其包含1-20個(gè)碳原子，優(yōu)選為1-15 個(gè)碳原子，直鏈或支鏈，其中兩個(gè)氫原子從相同的碳原子或從不同的碳原子被奪取。亞烷基 的實(shí)例包括，但不僅限于，亞甲基(-CH2-)、亞乙基(-CH2CH2-)和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“炔基”表示直-鏈或支-鏈烴基，其具有一個(gè)或多個(gè)三鍵，并包 含從約2-20個(gè)碳原子，優(yōu)選為從約2-10個(gè)碳原子，更優(yōu)選為從約2-8個(gè)碳原子，并且最優(yōu) 選為從約2-6個(gè)碳原子。炔基的實(shí)例包括乙炔基、丙炔基(炔丙基)、丁炔基和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“炔芳基”是指炔基-取代的芳基，并且“取代炔芳基”是指進(jìn)一 步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的炔芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷氧基”表示基團(tuán)_0R%其中Re是所限定的低級(jí)烷基、取代的低 級(jí)烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、雜烷基、雜芳烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷 基、環(huán)雜烷基或取代的環(huán)雜烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷氧基”表示基團(tuán)_0Rd，其中Rd是低級(jí)烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷基芳基”是指烷基-取代的芳基，并且“取代烷基芳基”是指 進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的烷基芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷基羰基氨基”表示基團(tuán)-NRT(O)Rf，其中Re是任選取代的烷 基，并且Rf是氫或烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷基亞磺酰基”表示基團(tuán)-S (0)Rg，其中Rg是任選取代的烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷基磺酰基”表示基團(tuán)-S (O)2Rg，其中Rg是任選取代的烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷基磺酰氨基”表示基團(tuán)-NReS (O)2Rf，其中Re是任選取代的烷 基，并且Rf是氫或烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷基硫代”是指-S-Rh基團(tuán)，其中Rh是烷基。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“取代的烷基硫代”是指-S-Ri基團(tuán)，其中Ri是取代的烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“亞炔基(alkynylene) ”是指二價(jià)的直鏈或支鏈的烴基團(tuán)，其具 有至少一個(gè)碳碳三鍵，并且通常具有約2-12個(gè)碳原子、優(yōu)選為約2-8個(gè)碳原子，以及“取代 的亞炔基”是指進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的亞炔基基團(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“酰氨基(amido) ”表示基團(tuán)-C(0)NRjRj，，其中Rj和Rj'可以獨(dú) 立地為氫、低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代 的雜芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“取代的酰氨基”表示基團(tuán)-C (0) NRkRk'，其中Rk和Rk’獨(dú)立地為 氫、低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基，然而條件是，Rk 和Rk’的至少一個(gè)不是氫。RkRk’與氮的組合可以形成任選取代的雜環(huán)或雜芳環(huán)。 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脒基”表示基團(tuán)-C ( = NRm) NRm' Rm”，其中Rm、Rm’和Rm”獨(dú)立地 為氫或任選取代的烷基、芳基或雜芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“氨基”或“胺”表示基團(tuán)-NRnRn’，其中鏟和Rn’可以獨(dú)立地為如 本文所定義的氫、低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基 或取代的雜芳基。“二價(jià)胺”表示基團(tuán)-NH-?！叭〈亩r(jià)胺”表示基團(tuán)-NR-，其中R是低 級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“取代的氨基”或“取代的胺”表示基團(tuán)_NRPRP’，其中『和Rp’獨(dú) 立地為氫、低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代 的雜芳基，然而條件是，鏟和鏟’的至少一個(gè)不是氫。RpRp’與氮的組合可以形成任選取代 的雜環(huán)或雜芳環(huán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“芳基炔基”是指芳基-取代的炔基和“取代的芳基炔基”是指 進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的芳基炔基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“芳烷基”表示如本文所限定的烷基，其中烷基氫原子被本文所 限定的芳基取代。芳烷基的實(shí)例包括芐基、苯乙基、1-苯丙基、2-苯丙基、3-苯丙基、1-萘 丙基、2-萘丙基、3-萘丙基、3-萘丁基和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“芳?；笔侵阜蓟?羰基類(lèi)，如苯甲?；?，并且“取代的芳酰基” 是指進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的芳?；鶊F(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“芳基烷基”是指芳基-取代的烷基，和“取代的芳基烷基”是指 進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的芳基烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“芳基”單獨(dú)或在組合中表示苯基、萘基或稠合的芳香族雜環(huán)，其 任選地具有優(yōu)選5-7個(gè)、更優(yōu)選5-6個(gè)環(huán)成員的環(huán)烷基和/或任選地用1至3個(gè)基團(tuán)或取代 基取代，所述基團(tuán)或取代基是商素，羥基，烷氧基，烷基硫代，烷基亞磺?；?，烷基磺?；?，酰 氧基，芳氧基，雜芳氧基，用烷基、芳基或雜芳基基團(tuán)任選地單取代或雙取代的氨基，脒基， 用烷基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基任選地取代的脲，用烷基、芳基或雜芳基任選地N-單或N， N-雙取代的氨基磺?；?，烷基磺酰氨基，芳基磺酰氨基，雜芳基磺酰氨基，烷基羰基氨基，芳 基羰基氨基，雜芳基羰基氨基或類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“芳基羰基氨基”表示基團(tuán)-NRtlC(O)If,其中Rtl是氫或低級(jí)烷基 或烷基，并且Rlr是任選取代的芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“亞芳基”是指二價(jià)的芳基，其通常具有6至14個(gè)碳原子，并且“取代的亞芳基”是指進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的亞芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“芳氧基”表示基團(tuán)-OAr，其中Ar是芳基或取代的芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“芳基磺酰氨基”表示基團(tuán)-NRtlS(O)2If,其中Rtl是氫或低級(jí)烷基 或烷基，并且Rlr是任選取代的芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“氨基甲酸酯基團(tuán)”表示基團(tuán)-O-C(O)-NR2，其中每一個(gè)R獨(dú)立地 為H、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“ 二硫代氨基甲酸酯基團(tuán)”表示基團(tuán)-S-C⑶-NR2，其中每一個(gè)R 獨(dú)立地為H、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基，如本文所列。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“碳環(huán)”是指具有由連接的碳原子組成的單環(huán)或多稠環(huán)的飽和的 基團(tuán)、不飽和的基團(tuán)或芳基。所述環(huán)(一個(gè)或多個(gè)環(huán))可以任選為未取代的或由下列基團(tuán) 取代的例如鹵素、低級(jí)烷基、烷氧基、烷基硫代、乙炔、氨基、酰氨基、羧基、羥基、芳基、芳氧 基、雜環(huán)、雜芳基、取代的雜芳基、硝基、氰基、硫羥、磺氨基以及類(lèi)似基團(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“環(huán)烯基”是指包含環(huán)狀環(huán)的基團(tuán)，其包含3至20個(gè)碳原子并具 有至少一個(gè)碳碳雙鍵，并且“取代的環(huán)烯基”是指進(jìn)一步具有一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代 基的環(huán)烯基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”是指單環(huán)或多環(huán)烷基，其包含3至15個(gè)碳原子，并且 “取代的環(huán)烷基”是指進(jìn)一步具有一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的環(huán)烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“亞環(huán)烷基”是指包含二價(jià)環(huán)的基團(tuán)，其包含約3-12個(gè)碳原子， 并且“取代的亞環(huán)烷基”是指進(jìn)一步具有一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的亞環(huán)烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“胍基”表示基團(tuán)-N = C(NH2)2，并且“取代的胍基”表示基團(tuán)-N = C(NR2)2，其中每個(gè)R獨(dú)立地為如本文所列的H、烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“鹵”或“鹵素”指所有鹵素，S卩，氯(Cl)、氟(F)、溴(Br)和碘 ⑴。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜芳基”指包含5或6個(gè)環(huán)原子的單環(huán)芳環(huán)結(jié)構(gòu)，或具有8-10 個(gè)原子的雙環(huán)芳基，具有一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選具有1-4，更優(yōu)選1-3，甚至更優(yōu)選1-2個(gè)雜原子， 所述雜原子獨(dú)立地選自0、S和N，并且用如下的1-3個(gè)基團(tuán)或取代基任選地取代鹵，羥基， 烷氧基，烷基硫代，烷基亞磺?；?，烷基磺?；?，酰氧基，芳氧基，雜芳氧基，用烷基、芳基或 雜芳基任選地進(jìn)行單取代或雙取代的氨基，脒基，用烷基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基任選地取 代的脲，用烷基、芳基或雜芳基任選地進(jìn)行N-單取代或N，N-雙取代的氨基磺酰基，烷基磺 酰氨基，芳基磺酰氨基，雜芳基磺酰氨基，烷基羰基氨基，芳基羰基氨基，雜芳基羰基氨基， 或類(lèi)似基團(tuán)。雜芳基也意在包括氧化的S或N，如亞磺?；?，磺?；?，和叔環(huán)氮的N-氧化物。 碳或氮原子是雜芳基環(huán)結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)，以便保持穩(wěn)定的芳環(huán)。雜芳基的例子是苯鄰二甲酰 亞胺、吡啶基、噠嗪基、吡嗪基、喹唑啉基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、嘧啶基、吡咯基^惡唑基、 噻唑基、噻吩基、異ρ惡唑基J惡噻二唑基(oxathiadiazolyl)、異噻唑基、四唑基、咪唑基、三 嗪基、呋喃基、苯并呋喃基、吲哚基和類(lèi)似基團(tuán)。取代的雜芳基包含一個(gè)連接到適合的碳或 氮上以產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物的取代基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“取代的雜芳基”指用如下的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)任選地單取代或 多取代的雜環(huán)例如鹵素、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、烷基硫代、乙炔基、氨基、酰氨基、羧基、羥 基、芳基、芳氧基、雜環(huán)、取代的雜環(huán)、雜芳基(hetaryl)、取代的雜芳基(hetaryl)、硝基、氰基、硫羥、磺氨基以及類(lèi)似基團(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜芳基羰基氨基”表示基團(tuán)-NRtlC(O)If,其中Rtl是氫或低級(jí)烷 基和Rlr是任選取代的芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜芳氧基”是指基團(tuán)-OHet，其中Het是任選取代的雜芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜芳基磺酰氨基”表示基團(tuán)-NRtlS (O)2Rs，其中Rtl是氫或低級(jí)烷 基和Rs是任選取代的雜芳基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)”指飽和的基團(tuán)、不飽和的基團(tuán)或芳基，其具有單個(gè)環(huán)(例 如嗎啉代、吡啶基或呋喃基)或多個(gè)稠環(huán)(例如萘吡啶基、喹喔啉基、喹啉基、中氮茚基或苯 并[b]噻吩基)，以及在環(huán)內(nèi)具有碳原子和至少一個(gè)雜原子，如N、0或S，它們可以任選地未 取代或者用如下基團(tuán)取代例如鹵素，低級(jí)烷基，低級(jí)烷氧基，烷基硫代，乙炔基，氨基，酰氨 基，羧基，羥基，芳基，芳氧基，雜環(huán)，雜芳基，取代的雜芳基，硝基，氰基，硫羥，磺氨基以及類(lèi) 似基團(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“取代的雜環(huán)”指用一個(gè)或多個(gè)，例如1、2或3個(gè)取代基取代的 雜環(huán)，該取代基選自任選取代的烷基，任選取代的烯基，任選取代的炔基，商，羥基，烷氧基， 烷基硫代，烷基亞磺?；?，烷基磺?；?，酰氧基，芳基，取代的芳基，芳氧基，雜芳氧基，氨基， 酰氨基，脒基，用烷基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基任選取代的脲，用烷基、芳基或雜芳基任選地 N-單取代或N，N-雙取代的氨基磺?；?，烷基磺酰氨基，芳基磺酰氨基，雜芳基磺酰氨基，烷 基羰基氨基，芳基羰基氨基，雜芳基羰基氨基，?；然?，雜環(huán)，取代的雜環(huán)，雜芳基，取代 的雜芳基，硝基，氰基，硫羥，氨磺酰以及氧代，它們?cè)谌我饪衫命c(diǎn)被連接以產(chǎn)生穩(wěn)定的化 合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烴基”包含任意有機(jī)基團(tuán)，其中其主鏈僅包含碳和氫。因此烴基 包含烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、環(huán)烯基、炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、芳基烯基、烯基芳基、 芳基炔基、炔基芳基和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“取代的烴基”指進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)取代基的任意上 述引用的烴基，所述取代基選自羥基、烴氧基、取代的烴氧基、烷基硫代、取代的烷基硫 代、芳基硫代、取代的芳基硫代、氨基、烷基氨基、取代的烷基氨基、羧基、-C(S)SR, -C(O) SR、-C⑶NR2——其中每個(gè)R獨(dú)立地為氫、烷基或取代的烷基——、硝基、氰基、鹵素、-SO3M 或-OSO3M——其中M是H、Na、K、Zn、Ca或葡甲胺(meglumine)、胍基、取代的胍基、烴基、取 代的烴基、烴基羰基、取代的烴基羰基、烴氧基羰基、取代的烴氧基羰基、烴基羰氧基、取代 的烴基羰氧基、?；ⅤＱ趸?、雜環(huán)、取代的雜環(huán)、雜芳基、取代的雜芳基、雜芳基羰基、取代 的雜芳基羰基、氨基甲?；?、單烷基氨基甲?；⒍榛被柞；?、芳基氨基甲酰基、氨基 甲酸酯基團(tuán)、二硫代氨基甲酸酯基團(tuán)、芳?；?、取代的芳酰基、有機(jī)磺酰基、取代的有機(jī)磺酰 基、有機(jī)亞磺酰基、取代的烷基亞磺?；?、烷基磺酰氨基、取代的烷基磺酰氨基、芳基磺酰氨 基、取代的芳基磺酰氨基、氨磺?；鶊F(tuán)、砜基和類(lèi)似物，包括兩個(gè)或更多的上述基團(tuán)，通過(guò)這 樣的連接/間隔部分(linker/spacer moiety)連接到所述烴基部分，所述連接/間隔部分 如-0-、-S-、NR-，其中R是氫、烷基或取代的烷基、-C(O)-, -C⑶-、-C( = NR，)-、_C(=
CR，2)--其中 R，是烷基或取代的烷基、-O-C (0) -、-O-C (0) -0-、-O-C (0) -NR-(或-NR-C (
0)-0-),-NR-C(0)-,-NR-C(0)-NR-、-S_C(0)-,-S-C(0)-0-、-S_C(0) -NR-、-0_S(0) 2-、-0_S (0) 2-0-、-O-S (0) 2-NR-、-O-S(0)-、-O-S(0)-0-、-O-S(0)-NR-、-O-NR-C(0)-、-O-NR-C(0)-0-、-0-NR-C(0)-NR-、-NR-O-C(0)-,-NR-O-C(0)-0-,-NR-O-C(0)-NR-、-0-NR-C(S)-,-O-NR-C(S)_0_、 -O-NR-C (S) -NR-、-NR-O-C (S) -、-NR-O-C (S) _0_、-NR-O-C (S) -NR-、-O-C (S) -、-O-C (S) _0_、 -O-C (S) -NR-(或-NR-C (S) -0-)、-NR-C (S)-,-NR-C (S) -NR-、-S—S (0) 2-,-S-S (0) 2_0_、-S—S (0) 2_ NR-、-NR-O-S (0) -、-NR-O-S (0) _0_、-NR-O-S (0) -NR-、-NR-O-S (0) 2_、-NR-O-S (0) 2_0_、-NR-O-S (0) 2-NR-、-0-NR-S (0) -,-O-NR-S (0) -0-,-O-NR-S (0) -NR-、-0_NR-S (0) 2-0-、-0_NR-S (0) 2_N R-、-O-NR-S (0) 2-、_0-P (0) R2-^-S-P (0) R2-或-NR-P (0) &_，其中每個(gè) R 獨(dú)立地為氫、烷基或 取代的烷基，和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烴氧基”表示-0-烴基，其包含2-20個(gè)碳原子，并且“取代的烴 氧基”是指進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的烴氧基基團(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烴基羰基”是指-C (0)-烴基，其包含2-20個(gè)碳原子，并且“取 代的烴基羰基”是指進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的烴基羰基基團(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烴氧基羰基”是指-C (0) -0-烴基，其包含2-20個(gè)碳原子，并且 “取代的烴氧基羰基”是指進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的烴氧基羰基基團(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烴基羰氧基”是指-O-C (0)-烴基，其包含2-20個(gè)碳原子，并且 “取代的烴基羰氧基”是指進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的烴基羰氧基基團(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“亞烴基(hydrocarbylene)”包含任意二價(jià)有機(jī)基，其中其主鏈 僅包含碳和氫。因此亞烴基包含亞烷基、亞環(huán)烷基、亞鏈烯基、亞環(huán)烯基、亞炔基、亞芳基、烷 基亞芳基、芳基亞烷基、芳基亞鏈烯基、烯基亞芳基、芳基亞炔基、炔基亞芳基和類(lèi)似物，并 且“取代的亞烴基”是指進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)如本文所列的取代基的任何上述提及的亞 烴基基團(tuán)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“羥基(hydroxyl和hydroxy)，，指基團(tuán)-0H。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有機(jī)亞磺?；北硎净鶊F(tuán)-S (0)-有機(jī)基團(tuán)，其中有機(jī)基團(tuán)包含 烷基_、烷氧基_、烷基氨基_、和芳基部分，以及取代的烷基_、烷氧基_、烷基氨基_、和芳基 部分。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有機(jī)磺?；北硎净鶊F(tuán)-S (0) 2-有機(jī)基團(tuán)，其中有機(jī)基團(tuán)包含烷 基_、烷氧基-和烷基氨基-部分，以及取代的烷基_、烷氧基-或烷基氨基-部分。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“氧代”是指與連接的碳雙鍵連接的氧取代基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“亞磺?；北硎净鶊F(tuán)-S(0)-。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“取代的亞磺?；北硎净鶊F(tuán)-S(O) Rt,其中Rt是低級(jí)烷基、取代 的低級(jí)烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、取代的環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán) 基、雜環(huán)基烷基、取代的雜環(huán)基烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜芳烷基、 取代的雜芳烷基、芳烷基或取代的芳烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“磺酰基”表示基團(tuán)-S(0)2_。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“取代的磺?；北硎净鶊F(tuán)-S(O)2Rt，其中Rt是低級(jí)烷基、取代的 低級(jí)烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、取代的環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、 雜環(huán)基烷基、取代的雜環(huán)基烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜芳烷基、取代 的雜芳烷基、芳烷基或取代的芳烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“磺酰氨基”表示基團(tuán)-NRtlS (O)2-，其中Rtl是氫或低級(jí)烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“取代的磺酰氨基”表示基團(tuán)-NRtlS (O)2Ru,其中Rtl是氫或低級(jí)烷基，并且Ru是低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、芳 基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、雜芳烷基、取代的雜芳烷基、芳烷基或取代的芳烷基。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“砜基(sulfuryl) ”表示基團(tuán)_S(0)2_。如本文使用的與數(shù)值相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“接近”和“約”表示所示數(shù)值的30%。


圖IA和IB是兩種機(jī)制的示意圖，其圖解了核酸聚合酶介導(dǎo)的引物延伸如何在熱 啟動(dòng)激活之前能被3’ -取代的dNTP削弱。圖2A和2B是熱誘導(dǎo)的熱啟動(dòng)激活的示例性方案的示意圖。“X”表示取代基。圖 2A顯示包含3’ -X基團(tuán)的3’ -取代的dNTP向未取代的、活性狀態(tài)3’ -OH dNTP的轉(zhuǎn)化。圖 2B顯示包含3’ -X取代基的“終止引物”向未取代的可延伸引物的轉(zhuǎn)化。圖3顯示dTTP在95°C下于PCR緩沖液中從3，-取代的dTIPs形成的動(dòng)力學(xué)。圖4顯示3，-醚取代的dTTP通過(guò)Klenow DNA聚合酶在引物延伸反應(yīng)中與未加熱 的(上圖)和預(yù)熱的(下圖)3’_取代的dTTPs的挑戰(zhàn)性結(jié)合的結(jié)果。圖5顯示在λ系統(tǒng)中幾種3’ -取代的dTTP衍生物的熱啟動(dòng)PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果凝 膠電泳分析(上圖)和擴(kuò)增子與脫靶產(chǎn)物的比例的圖示(下圖)。圖6顯示在HIV DNA系統(tǒng)中幾種3，-取代的dTTP衍生物的熱啟動(dòng)PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié) 果凝膠電泳分析(上圖)和擴(kuò)增子與脫靶產(chǎn)物的比例的圖示(下圖)。圖7顯示3，-THF取代的dTTP和dATP對(duì)36^p HIV-I片段的熱啟動(dòng)PCR擴(kuò)增的 效率的組合影響凝膠電泳分析(上圖)和擴(kuò)增子與脫靶產(chǎn)物的比例的圖示(下圖)。圖8是利用3’ -取代的dNIPs聯(lián)合磷酸三酯引物的優(yōu)選單管缺口延伸連接 PCR(Gap Extension Ligation PCR ；GEXL-PCR)方法的圖示。發(fā)明詳述核酸復(fù)制反應(yīng)如PCR包括(a)寡核苷酸引物與靶核酸的雜交，接著(b)通過(guò)核酸 聚合酶將核苷5’-三磷酸(NTPs)結(jié)合到寡核苷酸上以形成至少一個(gè)拷貝，優(yōu)選多拷貝的靶 序列。不過(guò)，由于錯(cuò)誤引發(fā)和引物二聚體形成，復(fù)制反應(yīng)經(jīng)常產(chǎn)生不需要的產(chǎn)物，這影響該 過(guò)程和可能的下游過(guò)程的效率和精確度。許多不需要的產(chǎn)物在復(fù)制反應(yīng)的樣品制備和初始 溫度升高(初始變性步驟)期間產(chǎn)生。本文的方法和組合物提供用于核酸復(fù)制的改進(jìn)的方法和組合物。在特定方面，該 方法和組合物涉及NIPs在溫度依賴性核酸復(fù)制反應(yīng)中的應(yīng)用。在其他方面，核酸復(fù)制方法 使用優(yōu)選在糖的3’-位置具有熱可去除修飾基團(tuán)的一個(gè)或多個(gè)3’-取代NIPs，其的存在削 弱不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。在一方面，本文提供的是利用至少一種修飾NTP復(fù)制核酸的方法，其中所述修飾 NTP包括在3’-位置具有至少一種取代基的一個(gè)或多個(gè)修飾基團(tuán)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式 中，3’-位置上的取代基在復(fù)制反應(yīng)的初始變性步驟期間轉(zhuǎn)化成3’-0H基團(tuán)或與NTP解離。 例如，初始變性步驟在逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中在大約42-70°C下發(fā)生10-100分鐘并且對(duì)于PCR反 應(yīng)在大約94°C、95°C、96°C或100°C下發(fā)生3-30分鐘。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于用本文提供的 3’ -取代NIPs進(jìn)行的復(fù)制反應(yīng)將能確定初始變性步驟發(fā)生的參數(shù)。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本文的方法和組合物提供3’-取代NTP，其中NTP具有一個(gè) 或多個(gè)修飾基團(tuán)，其中至少一個(gè)修飾在3’-位置(即3’-取代NTP)。根據(jù)一種機(jī)制，3’-取 代NTP是非底物NTP并且不能被用作核酸聚合酶的底物(圖1A)。因此，3’-取代NTP直到 3’ -取代基被去除或者另外地被轉(zhuǎn)化成自由的羥基才被結(jié)合到寡核苷酸或多核苷酸鏈上。 在第二種機(jī)制中，3’ -取代NTP是終止NTP并且可通過(guò)核酸聚合酶被結(jié)合以在3’ -位置延 長(zhǎng)多核苷酸或寡核苷酸引物一個(gè)修飾的核苷單位，從而產(chǎn)生終止引物(圖1B)。因此，終止 引物進(jìn)一步的鏈延長(zhǎng)被防止，除非并且直至3’ -取代基被去除，或者另外地被轉(zhuǎn)化為自由 的羥基，以產(chǎn)生可延長(zhǎng)引物。因此，NTP的3’-取代在復(fù)制的高溫下——諸如在PCR的初始 變性步驟中，其優(yōu)選地為在約95°C下——在初始溫育步驟之前消弱了核酸聚合酶介導(dǎo)的引 物延伸1-120分鐘。在達(dá)到期望溫度例如高溫后，終止引物通過(guò)熱誘導(dǎo)的分子內(nèi)和/或分 子間片段化——其去除了 3’ -取代基，或者另外地將3’ -取代基轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的(即未修飾 的)3’_羥基——變成可延長(zhǎng)引物。可延長(zhǎng)引物具有開(kāi)放的3’-羥基(3’-0H)并且可通過(guò) 核酸聚合酶被有效地延長(zhǎng)。本文提供的3’ -取代基的部分轉(zhuǎn)化(例如，從所有修飾分子中的一部分)或完全 轉(zhuǎn)化(例如，從所有修飾分子中)為3’-羥基優(yōu)選地在大約95°C下溫育后在1-120分鐘內(nèi)， 優(yōu)選地在1-30分鐘內(nèi)，優(yōu)選地在1-15分鐘內(nèi)，優(yōu)選地在1-10分鐘內(nèi)，更優(yōu)選地在1-5分鐘 內(nèi)，并且更優(yōu)選地在1-2分鐘內(nèi)發(fā)生。在某些實(shí)施方式中，3’ -取代NTP或終止引物向活 性狀態(tài)的轉(zhuǎn)化與溫度相關(guān)地發(fā)生并且不需要酶、另外的化學(xué)試劑或改良的聚合反應(yīng)條件但 是可與它們聯(lián)合應(yīng)用。在某些實(shí)施方式中，復(fù)制反應(yīng)不包括任何另外的物質(zhì)。另外的物質(zhì) 的實(shí)例包括但不限于化學(xué)化合物和酶。在特殊實(shí)施方式中，不包括在復(fù)制反應(yīng)中的另外化 合物是化學(xué)切割劑諸如本領(lǐng)域中使用以去除3’ -取代基的那些(例如，高溫下在中性水溶 液中鈀催化劑(參見(jiàn)，例如Ju, et al.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，664，079 ；Meng, Q.，et al，78J. Org. Chem.，3248-3252 (2006)；和 Bi，L.，et al.，128 J. Amer. Chem. Soc.，2542-2543 (2006))、 鹽酸以達(dá)到pH2(參見(jiàn)，例如Tsien, R. Y，WO 91/06678)、還原劑諸如巰基乙醇(參見(jiàn)，例如 Kwiatkowski, M.，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，279，563)或者通過(guò)加入三_(2-羧乙基)膦(參見(jiàn)，例如 Milton, J. ,et al，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，414，116)。在特殊實(shí)施方式中，3’ -取代基的去除不是通 過(guò)UV照射(參見(jiàn)，例如Dower，et al.，WO 92/10587)。在一些實(shí)施方式中，復(fù)制反應(yīng)不包 括3’-取代基的化學(xué)切割(例如，通過(guò)切割酶)。在其它實(shí)施方式中，復(fù)制反應(yīng)是不包括任 何另外物質(zhì)的測(cè)序反應(yīng)，優(yōu)選地不包括在復(fù)制反應(yīng)中的另外化合物是切割劑。在一些其它 實(shí)施方式中，復(fù)制反應(yīng)不是通過(guò)逐步分析進(jìn)行的測(cè)序(例如，靶序列的線性復(fù)制)。在一方面，根據(jù)本發(fā)明的3’ -取代NIPs和其衍生物提供式IA的化合物
權(quán)利要求
1.復(fù)制核酸的方法，所述方法包括 復(fù)制核酸，其中加入到復(fù)制反應(yīng)中的至少一種NTP包括熱不穩(wěn)定的3’ -取代基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述3’-取代NTP不支持、削弱或防止反應(yīng)中核酸聚合酶 延伸。
3.權(quán)利要求1-2的方法，其中所述至少一種3’-取代NTP是非底物NTP。
4.權(quán)利要求1-2的方法，其中所述至少一種3’-取代NTP是終止NTP。
5.權(quán)利要求1-4的方法，其中所述至少一種3’-取代NTP結(jié)合到寡核苷酸引物中，導(dǎo) 致終止引物。
6.權(quán)利要求1-5的方法，其中所述3’-取代基在核酸復(fù)制期間轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’-羥基基團(tuán)。
7.權(quán)利要求1-5的方法，其中所述3’-取代基在室溫和核酸復(fù)制的初始變性溫度之間 轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’ -羥基基團(tuán)。
8.權(quán)利要求7的方法，其中室溫是大約20°C。
9.權(quán)利要求1-5的方法，其中所述3’-取代基在核酸復(fù)制的初始變性步驟期間轉(zhuǎn)化成 開(kāi)放的3’ -羥基基團(tuán)。
10.權(quán)利要求6-9的方法，其中轉(zhuǎn)化是部分的。
11.權(quán)利要求6-9的方法，其中轉(zhuǎn)化是完全的。
12.權(quán)利要求1-11的方法，其中所述轉(zhuǎn)化在足以解離所述3’-取代基以形成開(kāi)放的 3’ -羥基基團(tuán)的溫度下發(fā)生。
13.權(quán)利要求1-12的方法，其中所述3’-取代基在大約0°C-100°C之間的溫度下轉(zhuǎn)化 成開(kāi)放的3’ -羥基基團(tuán)。
14.權(quán)利要求1-12的方法，其中所述3’-取代基在大約37°C -100°C之間的溫度下轉(zhuǎn) 化成開(kāi)放的3’ -羥基基團(tuán)。
15.權(quán)利要求1-12的方法，其中所述3’-取代基在大約50°C -100°C之間的溫度下轉(zhuǎn) 化成開(kāi)放的3’ -羥基基團(tuán)。
16.權(quán)利要求1-12的方法，其中所述3’-取代基在大約70°C -100°C之間的溫度下轉(zhuǎn) 化成開(kāi)放的3’ -羥基基團(tuán)。
17.權(quán)利要求1-16的方法，其中所述3’-取代基在大約50°C的溫度下轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的 3’ -羥基基團(tuán)。
18.權(quán)利要求1-16的方法，其中所述3’-取代基在大約55°C的溫度下轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的 3’ -羥基基團(tuán)。
19.權(quán)利要求1-16的方法，其中所述3’-取代基在大約65°C的溫度下轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的 3’ -羥基基團(tuán)。
20.權(quán)利要求1-16的方法，其中所述3’-取代基在大約75°C的溫度下轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的 3’ -羥基基團(tuán)。
21.權(quán)利要求1-16的方法，其中所述3’-取代基在大約80°C的溫度下轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’ -羥基基團(tuán)。
22.權(quán)利要求1-16的方法，其中所述3’-取代基在大約90°C的溫度下轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’ -羥基基團(tuán)。
23.權(quán)利要求1-16的方法，其中所述3’-取代基在大約95°C的溫度下轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’ -羥基基團(tuán)。
24.權(quán)利要求1-16的方法，其中在大約95°C下所述3’_取代基轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’ -羥 基基團(tuán)的t1/2在大約1-120分鐘之間。
25.權(quán)利要求1-16的方法，其中在大約95°C下所述3’-取代基轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’ -羥 基基團(tuán)的t1/2在大約1-5分鐘之間。
26.權(quán)利要求1-16的方法，其中在大約95°C下所述3’-取代基轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’ -羥 基基團(tuán)的t1/2在大約5-30分鐘之間。
27.權(quán)利要求1-16的方法，其中在大約50°C下所述3’-取代基轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’ -羥 基基團(tuán)的t1/2在大約1-10分鐘之間。
28.權(quán)利要求1-16的方法，其中在大約55°C下所述3’-取代基轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’ -羥 基基團(tuán)的t1/2是大約10分鐘。
29.權(quán)利要求1-16的方法，其中在大約50°C下所述3’-取代基轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’ -羥 基基團(tuán)的t1/2是大約1-120分鐘。
30.權(quán)利要求1- 的方法，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)包括具有兩個(gè)或多個(gè)不同3’-取代基的 3’ -取代 OTPs。
31.權(quán)利要求的方法30，其中所述不同3’-取代基在不同溫度下轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’ -羥基基團(tuán)。
32.權(quán)利要求31的方法，其中第一3’ -取代基在大約50°C下轉(zhuǎn)化成開(kāi)放的3’ -羥基 基團(tuán)并且第二 3’ -取代基在大約95°C下轉(zhuǎn)化。
33.權(quán)利要求1-32的方法，其中核酸復(fù)制是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、等位基因特異性 PCR、裝配PCR或聚合酶循環(huán)裝配(PCA)、不對(duì)稱PCR、菌落PCR、乳液PCR、快速PCR、缺口延伸 連接PCR(GEXL-PCR)、缺口連接鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(缺口 LCR)、解旋酶依賴性擴(kuò)增、熱啟動(dòng)PCR、序列 間特異性(ISSR)PCR、反向PCR、連接介導(dǎo)的PCR、線性-然后-指數(shù)性-PCR(LATE-PCR)、甲 基化特異性PCR(MSP)、多重連接依賴性探針擴(kuò)增(MLPA)、多重PCR、嵌套式PCR、重疊-延伸 PCR、PAN-AC、定量 PCIUQ-PCR)、定量實(shí)時(shí) PCR^jRT-PCR)、實(shí)時(shí) PCR、逆轉(zhuǎn)錄(RT)、cDNA 末端 迅速擴(kuò)增(RACE PCR)、單分子擴(kuò)增PCR (SMA PCR)、熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR (TAIL-PCR)、遞降PCR、 長(zhǎng)PCR、核酸連接、DNA測(cè)序或逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)。
34.權(quán)利要求1-33的方法，其中核酸復(fù)制是PCR。
35.權(quán)利要求1-33的方法，其中所述PCR是熱啟動(dòng)PCR。
36.權(quán)利要求1-33的方法，其中所述PCR是缺口延伸連接PCR(GEXL-PCR)。
37.權(quán)利要求1-33的方法，其中所述復(fù)制是逆轉(zhuǎn)錄(RT)。
38.權(quán)利要求1-33的方法，其中核酸復(fù)制是DNA測(cè)序。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA測(cè)序不通過(guò)逐步合成法測(cè)序發(fā)生。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA測(cè)序不包括任何另外的化學(xué)切割試劑。
41.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA測(cè)序包括使用二脫氧NIPs(ddNTPs)。
42.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA測(cè)序通過(guò)染料引物測(cè)序。
43.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA測(cè)序通過(guò)染料終止子測(cè)序。
44.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA測(cè)序?qū)е掳行蛄械木€性復(fù)制。
45.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA測(cè)序?qū)е掳行蛄械姆蔷€性復(fù)制。
46.權(quán)利要求38的方法，其中所述DNA測(cè)序?qū)е掳行蛄械闹笖?shù)復(fù)制。
47.權(quán)利要求1-46的方法，其中核酸復(fù)制反應(yīng)包括選自下列的一種或多種酶DNA依賴 性DNA聚合酶、RNA依賴性DNA聚合酶、DNA依賴性RNA聚合酶、RNA依賴性RNA聚合酶、DNA 連接酶、RNA連接酶、合成酶、核酸酶和限制酶。
48.權(quán)利要求1-46的方法，其中核酸復(fù)制反應(yīng)包括選自下列的兩種或多種酶DNA依賴 性DNA聚合酶、RNA依賴性DNA聚合酶、DNA依賴性RNA聚合酶、RNA依賴性RNA聚合酶、DNA 連接酶、RNA連接酶、合成酶、核酸酶和限制酶。
49.權(quán)利要求1-48的方法，其中所述核酸是DNA、RNA、LNA、PNA或其組合。
50.權(quán)利要求1-48的方法，其中所述核酸是DNA。
51.權(quán)利要求1-48的方法，其中所述核酸是RNA。
52.權(quán)利要求1-51的方法，其中所述NIPs是選自下列的一種或多種3’-取代NIPs 3，-取代 dATP、3，-取代 dTTP、3，-取代 dGTP、3，-取代 dCTP 和 3，-取代 dUTP。
53.權(quán)利要求1-51的方法，其中所述NIPs是選自下列的兩種或多種3’-取代NIPs 3，-取代 dATP、3，-取代 dTTP、3，-取代 dGTP、3，-取代 dCTP 和 3，-取代 dUTP。
54.權(quán)利要求1-51的方法，其中所述NIPs是選自下列的三種或多種3’-取代NIPs 3，-取代 dATP、3，-取代 dTTP、3，-取代 dGTP、3，-取代 dCTP 和 3，-取代 dUTP。
55.權(quán)利要求1-51的方法，其中所述NIPs是選自下列的四種或多種3’-取代NIPs 3，-取代 dATP、3，-取代 dTTP、3，-取代 dGTP、3，-取代 dCTP 和 3，-取代 dUTP。
56.權(quán)利要求1-51的方法，其中所述3-取代NIPs包括3，-取代dATP、3，_取代dTTP、 3，-取代dGTP和3，-取代dCTP。
57.權(quán)利要求1-51的方法，其中所述3’-取代NIPs包括3’ -取代dATP、3’ -取代 dUTP、3’ -取代 dGTP 和 3’ -取代 dCTP。
58.權(quán)利要求1-56的方法，其中所述3’-取代NIPs占復(fù)制反應(yīng)中總NTP的25%或更少。
59.權(quán)利要求的方法1-56，其中所述3，-取代NIPs占復(fù)制反應(yīng)中總NTP的25%或更多。
60.權(quán)利要求1-56的方法，其中所述3，-取代NIPs占復(fù)制反應(yīng)中總NTP的50%至 100%。
61.權(quán)利要求的方法1-56，其中所述3’-取代NIPs占復(fù)制反應(yīng)中總NTP的75%或更多。
62.權(quán)利要求1-56的方法，其中所述3’-取代NIPs占復(fù)制反應(yīng)中總NTP的80%或更多。
63.權(quán)利要求1-56的方法，其中所述3，-取代NIPs占復(fù)制反應(yīng)中總NTP的90%或更多。
64.權(quán)利要求1-56的方法，其中所述3，-取代NIPs占復(fù)制反應(yīng)中總NTP的95%或更多。
65.權(quán)利要求1-56的方法，其中所述3’-取代NIPs占復(fù)制反應(yīng)中總NTP的100%。
66.權(quán)利要求1-56的方法，其中所述3’-取代NIPs進(jìn)一步包括一種或多種另外的修飾基團(tuán)。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述一種或多種另外的修飾基團(tuán)在選自糖、三磷酸酯鏈 或堿基的位置上。
68.權(quán)利要求1-67的方法，其中所述3’-取代NTP進(jìn)一步包括可檢測(cè)標(biāo)記。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述可檢測(cè)標(biāo)記是放射性同位素、質(zhì)量同位素、熒光團(tuán)或 半抗原。
70.權(quán)利要求1-69的方法，其中所述3’-取代NIPs是手性純的、外消旋的或非對(duì)映異 構(gòu)體的混合物。
71.權(quán)利要求1-70的方法，其中與采用對(duì)應(yīng)的未取代NTP的復(fù)制相比，復(fù)制反應(yīng)中 3’ -取代NIPs的存在減少了非特異性產(chǎn)物的形成和隨后的復(fù)制。
72.權(quán)利要求1-71的方法，其中所述3’-取代基選自0-[4_甲氧基]四氫吡喃基； 0-四氫吡喃基；0-四氫呋喃基；0-苯氧基乙?；?；0-甲氧基乙?；?；0-乙酰基；0-(對(duì)甲 苯)磺酸酯；O-磷酸酯；0-硝酸酯；0-[4_甲氧基]-四氫硫代吡喃基；0-四氫硫代吡喃基； 0-[5-甲基]-四氫呋喃基；0-[2-甲基，4-甲氧基]-四氫吡喃基；0-[5-甲基]-四氫吡喃 基；和0-四氫噻吩基。
73.權(quán)利要求1-72的方法，其中所述3’-取代NTP和其衍生物具有式IA的結(jié)構(gòu)
74.權(quán)利要求73的方法，其中X1、X3和X4是H;W是CH2 ；Ζ0、Z1、Z6和Z7是0 ；并且Z5和 Z8 是 0H。
75.權(quán)利要求73的方法，其中A是NH、0、CH2或S；父1、X2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Z0、 Z1、Z3、Z4、Z6 和 Z7 是 0 ；并且 Z2、Z5、Z8 和 Z9 是 OH0
76.權(quán)利要求73 的方法，其中 X2 是 H、0H、F、CH3> OCH3> N3> NH2 或 NHCH3 ；A 是 0 ；X1、X3、 X4 和 X5 是 H 是 CH2 ；Ζ0、Ζ1、Z3、Z4、Z6 和 Z7 是 0 ；Ζ2、Z5、Z8 和 Z9 是 OH0
77.權(quán)利要求的方法73，其中乂5是!1、5!1、0134、0013、朋2或朋013；A是0 X2、X3和 X4 是 H 是 CH2 ；Ζ0、Ζ1、Z3、Z4、Z6 和 Z7 是 0 ；并且 Z2、Z5、Z8 和 Z9 是 OH0
78.權(quán)利要求73 的方法，其中 Z2 是 OH、SH、BH3> CH3> OCH3 或 OCH2CH3 ；A 是 0 ；Χ1、X2、X3、 X4 和 X5 是 H 是 CH2 ；Ζ0、Ζ1、Z3、Z4、Z6 和 Z7 是 0 ；并且 Z5、Z8 和 Z9 是 OH0
79.權(quán)利要求73的方法，其中Z4是0或S;n是1 ;A是0 Χ2、X3、X4和X5是H 是 CH2 ；Z0、Ζ1、Z3、Z6 和 Z7 是 0 ；并且 Z2、Z5、Z8 和 Z9 是 OH0
80.權(quán)利要求73 的方法，其中 Z9 是 SH、SCH2CH2CN, 0H、F、OCH3> 0CH2CH3、OC6H5, NHCH3> NH2、NHCH2CH2NH2、NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2 或磷酸酯基團(tuán)；η 是 1 ;A 是 0 ;X\X2、X3、X4 和 X5 是 H 是 CH2 ；Ζ0、Ζ1、Z3、Z4、Z6 禾口 Z7 是 0 ；并且 Z2、Z5 和 Z8 是 OH0
81.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是0 A1J^X3J4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\ Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；并且 Z2、Z5、Z8 和 Z9 是 OH0
82.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是S義、鏟、父3、父4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\ Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-(對(duì)甲苯)磺酸酯。
83.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 ；Χ\Χ3>Χ4和X5是H ；X2是O-CH3 ；W是CH2 ； Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是0 ；Z2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0_(對(duì)甲苯)磺酸酯。
84.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 ；X1,X2,X3和X4是H ；X5 = CH3 ；W是CH2 ；Ζ°、 Ζ1、Ζ3、Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Ζ5、Z8和Z9是OH ；并且R是0_(對(duì)甲苯)磺酸酯。
85.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是0義、鏟、父3、父4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\ Ζ4、Z6和Z7是0 ；Z2是SH ；Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0_(對(duì)甲苯)磺酸酯。
86.權(quán)利要求的方法73、其中η是1;Α是0次、f、f、t和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、Ζ3、 Z6和Z7是0 ；Ζ2、Ζ5、Z8和Z9是OH ;Ζ4是S ；并且R是0_(對(duì)甲苯)磺酸酯。
87.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是0義、鏟、父3、父4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\ Ζ4、Z6和Z7是0 ；Z2、Z5和Z8是OH ；Z9是SH ；并且R是0_(對(duì)甲苯)磺酸酯。
88.權(quán)利要求的方法73、其中η是1;Α是0次、f、f、t和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、Ζ3、Z4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-(對(duì)甲苯)磺酸酯。
89.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是0義、鏟、父3、父4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\ Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-磷酸酯。
90.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是0 A1J^X3J4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\ Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-硝酸酯。
91.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是S A1J^X3J4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\ Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-四氫呋喃基。
92.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 ；Χ\Χ3>Χ4和X5是H ；X2是O-CH3 ；W是CH2 ； Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是0 ；Z2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-四氫呋喃基。
93.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 ；X1,X2,X3和X4是H ；X5 = CH3 ；W是CH2 ；Ζ°、 Ζ1、Ζ3、Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Ζ5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-四氫呋喃基。
94.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是0義、鏟、父3、父4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\ Ζ4、Z6和Z7是0 ；Z2是SH ；Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-四氫呋喃基。
95.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是0義、鏟、父3、父4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\ Z6和Z7是0 ；Z2、Z5、Z8和Z9是OH ;Z4是S ；并且R是0-四氫呋喃基。
96.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是0義、鏟、父3、父4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\ Ζ4、Z6和Z7是0 ；Z2、Z5和Z8是OH ；Z9是SH ；并且R是0-四氫呋喃基。
97.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是0義、鏟、父3、父4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\ Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-[4-甲氧基]-四氫吡喃基。
98.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是0義、鏟、父3、父4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\ Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-四氫吡喃基。
99.權(quán)利要求73的方法，其中η是1；A是0義、鏟、父3、父4和X5是H 是CH2 -,l\l\l\Z4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-四氫呋喃基。
100.權(quán)利要求73的方法，其中η是1 ;Α是0 ；X1、X2、X3、X4 和 X5 是 H 是 CH2 ；Zc‘、Z1、Z3'、τ4、ζ6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0--[4-甲氧基]-四氫硫代吡喃基。
101.權(quán)利要求73的方法，其中η是1 ;Α是0 ；X1、X2、X3、X4 和 X5 是 H 是 CH2 ；Zc‘、Z1、Z3'、τ4、ζ6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0--四氫硫代吡喃基。
102.權(quán)利要求73的方法，其中η是1 ;Α是0 ；X1、X2、X3、X4 和 X5 是 H 是 CH2 ；Zc‘、Z1、Z3'、τ4、ζ6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0--[5-甲基]-四氫呋喃基。
103.權(quán)利要求73的方法，其中η是1 ;Α是0 ；X1、X2、X3、X4 和 X5 是 H 是 CH2 ；Zc‘、Z1、Z3'、τ4、ζ6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0--[2-甲基，4-甲氧基]-四氫吡喃基。
104.權(quán)利要求73的方法，其中η是1 ;Α是0 ；X1、X2、X3、X4 和 X5 是 H 是 CH2 ；Zc‘、Z1、Z3'、τ4、ζ6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0--[5-甲基]-四氫吡喃基。
105.權(quán)利要求73的方法，其中η是1 ;Α是0 ；X1、X2、X3、X4 和 X5 是 H 是 CH2 ；Zc‘、Z1、Z3'、τ4、ζ6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0--四氫噻吩基。
106.權(quán)利要求73的方法，其中η是1 ;Α是S ；X1、X2、X3、X4 和 X5 是 H 是 CH2 ；Zc‘、Z1、Z3'、τ4、ζ6和Z7是0 ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0--苯氧基乙?；?。
107.權(quán)利要求73的方法，其中η是1 ;Α是0 ；Χ\Χ\Χ4和X5是H ；X2是-O-CH3 ；W是CH2 ；Ζ°、Ζ1、Ζ3、Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Ζ5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-苯氧基乙?；?。
108.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;A是0 J1、X2、X3和X4是H ；X5是-CH3 ；W是CH2 ； Z0、Z1、Z3、Z4、Z6和Z7是0 ；Z2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-苯氧基乙酰基。
109.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;A是0 Χ2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Ζ3、Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ5、Z8和Z9是OH ；Z2是SH ；并且R是0-苯氧基乙?；?br> 110.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 X2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ0、Z1、 Z3、Z6和Z7是0 ；Z4是SH ；Ζ2、Z5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-苯氧基乙?；?。
111.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;A是0 Χ2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Ζ3、Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Z5和Z8是OH ；Z9是SH ；并且R是0-苯氧基乙?；?。
112.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 Χ2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Ζ3、Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Ζ5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-苯氧基乙?；?。
113.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 Χ2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Ζ3、Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Ζ5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-甲氧基乙?；?。
114.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 Χ2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Ζ3、Ζ4、Z6和Z7是0 ；Ζ2、Ζ5、Z8和Z9是OH ；并且R是0-乙?；?。
115.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是S Χ2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Ζ3、Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；Ζ2、Ζ5、Z8 和 Z9 是 OH ；并且 R 是 O-C(O) -OCH30
116.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 ；Χ\Χ3、Χ4和X5是H ；X2是O-CH3 ；W是CH2 ； Ζ\Ζ\Ζ\Ζ\Ζ6 和 Z7 是 0 ;Ζ2、Ζ5、Ζ8 和 Z9 是 OH ；并且 R 是 O-C(O)-OCH3。
117.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 ；Χ1、X2、X3和X4是H ；X5是CH3 ；W是CH2 ； Ζ\Ζ\Ζ\Ζ\Ζ6 和 Z7 是 0 ;Ζ2、Ζ5、Ζ8 和 Z9 是 OH ；并且 R 是 O-C(O)-OCH3。
118.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 Χ2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Ζ3、Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；Z2 是 SH ；Z5、Z8 和 Z9 是 OH ；并且 R 是 O-C(O) -OCH30
119.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 Χ2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Ζ3、Z6 和 Z7 是 0 ；Z4 是 S ；Ζ2、Z5、Z8 和 Z9 是 OH ；并且 R 是 O-C (0) -OCH30
120.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 Χ2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Ζ3、Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；Ζ2、Z5 和 Z8 是 OH ；Z9 是 SH ；并且 R 是 O-C(O) -OCH30
121.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 Χ2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Ζ3、Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；Ζ2、Ζ5、Z8 和 Z9 是 OH ；并且 R 是 O-C(O)-O CH3。
122.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;A是0 Χ2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Ζ3、Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；Ζ2、Ζ5、Z8 和 Z9 是 OH ；并且 R 是 O-C(O) -CH2CH2CN0
123.權(quán)利要求73的方法，其中η是1;Α是0 Χ2、X3、X4和X5是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Ζ3、Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；Ζ2、Ζ5、Z8 和 Z9 是 OH ；并且 R 是 O-C (S) -0 CH3。
124.權(quán)利要求73的方法，其中η是0并且Z3是3’-0-寡核苷酸基殘基或延長(zhǎng)的寡核 苷酸引物。
125.權(quán)利要求73-1 的方法，其中B是胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶、氨 基烯丙基-尿嘧啶、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮-7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮-7-碘代鳥(niǎo)嘌呤、7-脫 氮-7-氨基烯丙基-鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮-8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、 5-硝基-胞嘧啶、5-氨基烯丙基-胞嘧啶、5-(生物素-16)-胞嘧啶、5-(熒光素-11)-胞 嘧啶、4-甲基氨基-胞嘧啶、2-硫代-5-甲基尿嘧啶或4-硫代-5-甲基尿嘧啶。
126.權(quán)利要求73-1M的方法，其中B是腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
127.權(quán)利要求1-72的方法，其中所述3’-取代NTP和其衍生物具有式IB的結(jié)構(gòu)
128.權(quán)利要求127的方法，其中A是NH、0、CH2或SX2和X3是H 是CH2 ；Ζ°、Ζ1、 Z6 和 Z7 是 0 ； Z5 和 Z8 是 OH0
129.權(quán)利要求127的方法，其中A是ΝΗ、0、CH2或SX2、X3和X4是H 是CH2 ；Z°、 Ζ1、Ζ3、Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；Ζ2、Ζ5、Z8 和 Z9 是 OH。
130.權(quán)利要求127 的方法，其中 X4 是 H、SH、CH3> F、OCH3> NH2 或 NHCH3 ；A 是 0 ；X1、X2 和 X3 是 H ；Ζ0、Ζ1、Z3、Z4、Z6 和 Z7 是 0 ；Z2、Z5、Z8 和 Z9 是 OHo
131.權(quán)利要求127 的方法，其中 22是0!1、5!1、8!13、013、0013或0012013 ；A 是 0 ;Χ\Χ2、Χ3 和 X4 是 H 是 CH2 ；Ζ0、Ζ1、Z3、Z4、Z6 和 Z7 是 0 ；并且 Z5、Z8 和 Z9 是 OH0
132.權(quán)利要求127的方法，其中Z4是0或S;n是1 ;A是0 ；Χ1、X2、X3和X4是H 是 CH2 ；Ζ0、Ζ1、Z3、Z6 和 Z7 是 0 ；并且 Z2、Z5、Z8 和 Z9 是 OH0
133.權(quán)利要求127 的方法，其中 Z9 是 SH、SCH2CH2CN, 0H、F、OCH3> 0CH2CH3、NHCH3> NH2, NHCH2CH2NH2、NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2 或磷酸酯基團(tuán)；η 是 1 ;A 是 0 ；X1,X2,X3 禾口 X4 是 H 是 CH2 ；Ζ0、Ζ1、Z3、Z4、Z6 和 Z7 是 0 ；并且 Z2、Z5 和 Z8 是 OH0
134.權(quán)利要求127的方法，其中η是1;A是0 ；X\X2^X3和X4是H 是CH2 ;Z\Z\Z\ Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；并且 Z2、Z5、Z8 和 Z9 是 OH0
135.權(quán)利要求127的方法，其中η是1;Α是S ；Χ1、X2、X3和X4是H 是CH2 ；Χ5、Ζ°、Ζ1、 Ζ\ Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；Ζ2、Ζ5、Z8 和 Z9 是 OH ；并且 Y1 是 C = S。
136.權(quán)利要求127的方法，其中η是1;Α是0 ；X1,X2和X3是H ；X4是CH3 ；W是CH2 ；X5、 Z0、Z1、Z3、Z4、Z6 和 Z7 是 0 ；Z2、Z5、Z8 和 Z9 是 OH ；并且 Y1 是 C = S。
137.權(quán)利要求127的方法，其中η是1;Α是0 ；Χ1、X2、X3和X4是H 是CH2 ；Χ5、Ζ°、Ζ1、 Ζ\ Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；Z2 是 SH ；Z5、Z8 和 Z9 是 OH ；并且 Y1 是 C = S。
138.權(quán)利要求127的方法，其中η是1;Α是0 ；Χ1、X2、X3和X4是H 是CH2 ；Χ5、Ζ°、Ζ1、 Z\ Z6 和 Z7 是 0 ；Ζ2、Ζ5、Z8 和 Z9 是 OH ；Z4 是 SH ；并且 Y1 是 C = S。
139.權(quán)利要求127的方法，其中η是1;Α是0 ；Χ1、X2、X3和X4是H 是CH2 ；Χ5、Ζ°、Ζ1、 Ζ\ Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；Ζ2、Z5 和 Z8 是 OH ；Z9 是 S ；并且 Y1 是 C = S。
140.權(quán)利要求127 的方法，其中 η 是 1 A1、X2、X3 和 X4 是 H 是 CH2 ；A、X5、Z0、Ζ1、Z3、 Z4、Z6 和 Z7 是 0 ；Z2、Z5、Z8 和 Z9 是 OH ；并且 Y1 是 C = 0。
141.權(quán)利要求127 的方法，其中 η 是 1 A1、X2、X3 和 X4 是 H 是 CH2 ；A、X5、Z0、Ζ1、Z3、 Z4、Z6 和 Z7 是 0 ；Z2、Z5、Z8 和 Z9 是 OH ；并且 Y1 是 C = S。
142.權(quán)利要求127的方法，其中η是1X2、X3和X4是H ；X5是S 是CH2 ；Α、Ζ°、Ζ1、 Ζ\ Ζ4、Z6 和 Z7 是 0 ；Ζ2、Ζ5、Z8 和 Z9 是 OH ；并且 Y1 是 C = 0。
143.權(quán)利要求127的方法，其中η是0；并且Z3是3’ -0-寡核苷酸基殘基或寡核苷酸 引物。
144.權(quán)利要求127-143的方法，其中B是胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、尿嘧啶、氨 基烯丙基-尿嘧啶、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮-7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮-7-碘代鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮-7-氨基烯丙基-鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮-8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、2，6- 二氨基嘌呤、 5-硝基-胞嘧啶、5-氨基烯丙基-胞嘧啶、5-(生物素-16)-胞嘧啶、5-(熒光素-11)-胞 嘧啶、4-甲基氨基-胞嘧啶和2-硫代-5-甲基尿嘧啶或4-硫代-5-甲基尿嘧啶。
145.權(quán)利要求127-144的方法，其中B是腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
146.權(quán)利要求73-145的方法，其中B可被核酸聚合酶識(shí)別。
147.用于核酸擴(kuò)增的試劑盒，其包括權(quán)利要求1-146的一種或多種3’-取代OTPs。
148.權(quán)利要求147的試劑盒，其進(jìn)一步包括選自下列的一種或多種用于進(jìn)行利用一 種或多種3’ -取代NIPs的方法的說(shuō)明以進(jìn)行所述方法、標(biāo)記用于核酸擴(kuò)增的容器、未修飾 dNTPs、修飾NIPs、核酸聚合酶、氯化鎂或其他二價(jià)陽(yáng)離子和反應(yīng)緩沖液。
149.權(quán)利要求148的試劑盒，其包括核酸聚合酶和一種或多種另外的酶。
全文摘要
本文提供的是用于核酸擴(kuò)增的方法和組合物。這些方法涉及3’-取代核苷5’-三磷酸或3’-取代終止引物在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的應(yīng)用。在某些方面，該方法通過(guò)使用在核酸擴(kuò)增中提供效用的3’-取代NTPs和/或3’-取代終止引物完成。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，NTPs和/或引物在3’-位置被特定熱不穩(wěn)定化學(xué)基團(tuán)諸如醚、酯或碳酸酯取代。
文檔編號(hào)C07H19/00GK102105481SQ200980129133
公開(kāi)日2011年6月22日 申請(qǐng)日期2009年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月27日
發(fā)明者A·V·列別代夫, I·克可哈洛娃 申請(qǐng)人:垂林克生物技術(shù)公司