專利名稱：乙型腦炎病毒PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗原表位多肽，尤其涉及乙型腦炎病毒PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽，本發(fā)明還涉及該抗原表位多肽在診斷乙型腦炎病毒中的應(yīng)用，屬于分子免疫學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
流行性乙型腦炎乙型腦炎是由乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitisvirus，JEV)引起的一種重要蚊媒性人獸共患傳染病。該病毒首先于1953年在日本從患者腦組織中分離獲得，因此稱日本腦炎病毒，所致疾病在日本稱日本乙型腦炎。在我國(guó)最早于1940年分離此病毒，為了與甲型腦炎相區(qū)別，定名為流行性乙型腦炎，簡(jiǎn)稱乙腦。在世界范圍內(nèi)每年有30,000-50,000例乙腦病例，約25％-30％死亡，50％導(dǎo)致永久性中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。我國(guó)近年每年的乙腦病例大于5000例，死亡200例以上。對(duì)于流行性乙型腦炎病毒多種動(dòng)物易感，但除人、馬和豬外通常不呈現(xiàn)臨床癥狀。對(duì)人主要引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性感染，人感染臨床上以高熱、意識(shí)障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激征為特征。母豬感染可引起流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或木乃伊胎，公豬感染導(dǎo)致睪丸腫大影響繁殖性能為特征，少數(shù)豬只感染可能呈現(xiàn)發(fā)熱和神經(jīng)癥狀，而其他豬則大多數(shù)不呈顯癥狀。給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。馬屬動(dòng)物易感染，少數(shù)引起腦炎與神經(jīng)癥狀，馬是終末宿主。蚊是JEV的主要傳播媒介，豬是該病毒在自然界中最重要的貯存與增殖宿主。乙型腦炎病毒主要在亞洲流行，而最近發(fā)現(xiàn)在南半球也有報(bào)道，這說(shuō)明流行性乙型腦炎可能在世界范圍內(nèi)威脅著人類健康。
乙型腦炎病毒屬黃病毒科，黃病毒屬，為單鏈正鏈RNA病毒?；蚪M約11kb，包含一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框架(ORF)，兩端是5’端和3’端非編碼區(qū)(UTR)?；蚪M5’端有帽子結(jié)構(gòu)，但在3’端沒(méi)有poly(A)尾。ORF編碼含3432個(gè)氨基酸的前體蛋白，在病毒和宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下加工為10個(gè)成熟蛋白，包含3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C，PrM/M，E)，7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。病毒粒子呈球形，直徑約30nm，有囊膜。JEV只有一個(gè)血清型，在抗原性上與西羅病毒、墨羅河谷腦炎病毒、圣路易腦炎病毒等屬同一血清群，存在抗原交叉反應(yīng)。E蛋白是乙型腦炎病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在誘導(dǎo)機(jī)體免疫及病毒感染細(xì)胞過(guò)程中都起著重要的作用，也是基因工程疫苗和診斷試劑研究最常用的靶蛋白。但也是E蛋白在黃病毒科不同病毒間和血清學(xué)交叉反應(yīng)最大。因此以E蛋白為靶蛋白進(jìn)行的血清學(xué)診斷不能對(duì)不同黃病毒感染進(jìn)行鑒別診斷。研究表明黃病毒科中乙型腦炎病毒，西尼羅病毒，登革熱病毒的PrM/M蛋白在血清學(xué)上不存在交叉反應(yīng)。所以將乙型腦炎病毒PrM/M蛋白作為血清學(xué)診斷檢測(cè)的靶蛋白具有更好的特異性(Cardose M J，Wang S M，Sum M S，et al.Antibodiesagainst prM protein distinguish between previous infection with dengueand Japanese encephalitis viruses.BMC Microbiology，2002，29)。
乙型腦炎病毒PrM/M蛋白是病毒粒子的膜蛋白，該蛋白全長(zhǎng)167氨基酸殘基長(zhǎng)，1～92aa為信號(hào)肽序列，在病毒粒子成熟的過(guò)程中被剪切掉，成為成熟的M蛋白。該蛋白分子量較小，屬膜蛋白，在基因工程表達(dá)中因其對(duì)宿主細(xì)胞具有一定毒性而難以表達(dá)。那么鑒定出該蛋白的抗原表位，利用抗原表位進(jìn)行診斷試劑研究較表達(dá)全長(zhǎng)M蛋白更具優(yōu)勢(shì)。抗原表位中的線性表位是由蛋白抗原中連續(xù)的氨基酸殘基組成，這種表位在變性蛋白中仍能被抗體識(shí)別。由于線性表位的特點(diǎn)，分析鑒定線性抗原表位的具體序列結(jié)構(gòu)信息較為容易。同時(shí)線性抗原表位也是較容易被直接用于診斷、基因工程疫苗、合成肽疫苗等相關(guān)應(yīng)用研究。在乙型腦炎病毒的主要抗原蛋白中關(guān)于抗原表位鑒定分析研究較多的是E蛋白。如Seif等(Seif S A，Morita K，Matsuo S，et al.Finer mappingof neutralizing epitope(s)on the C-terminal of Japanese encephalitis virusE-protein expressed in recombinant Escheriachia coli system.Vaccine，1995，13(16)1515～1521.)通過(guò)構(gòu)建4種分別表達(dá)E蛋白各個(gè)中和抗原決定簇的重組質(zhì)粒，檢測(cè)到了JEV特異性的抗原性和免疫原性，他們進(jìn)一步證明僅有E蛋白中的一段27個(gè)氨基酸殘基(373～399)的片段可以誘生中和抗體。該研究對(duì)E蛋白線性表位的確定最少長(zhǎng)度為27氨基酸殘基。Wu等(Wu C J，Huang H W，Tao M H，et al.Induction ofcross-protection against two wild-type Taiwanese isolates of Japaneseencephalitis virus using Beijing-1 strain DNA vaccine.Vaccine，2003，21(25-26)3938～3945.)將JEV CH2195LA分離株的E蛋白結(jié)構(gòu)域III(E292～402)的基因片段克隆到原核表達(dá)載體pET32a，在E.coli中表達(dá)重組融合，純化融合硫氧化還原蛋白(TrxD3)與弗氏佐劑或陽(yáng)離子脂質(zhì)體混合免疫小鼠，結(jié)果說(shuō)明TrxD3融合蛋白能夠使小鼠產(chǎn)生中和抗體和免疫保護(hù)。該研究所分析出有中和活性的E蛋白片段長(zhǎng)度為111氨基酸殘基。這些研究所報(bào)道的線性表位序列過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)檎鎸?shí)的線性抗原表位的長(zhǎng)度一般為6至12氨基酸殘基長(zhǎng)，那么111氨基酸殘基的片段中絕大部分序列是與表位無(wú)關(guān)的序列，或者該片段中根本不是一個(gè)線性表位，可能包含2個(gè)3個(gè)或多個(gè)線性抗原表位。即使是27氨基酸殘基的片段中也可能包含多個(gè)線性抗原表位。Kutubuddin等(KutubuddinM，Gore M M，Banerjee K，et al.Analysis of computer-predicted antibodyinducing epitope on Japanese encephalitis virus.Acta Virol，1993，37(6)417～428.)通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)74-CPTTGEAHNEKRAD-87是一個(gè)線性中和表位。Dewasthaly等(Dewasthaly S，Ayachit V M，Sarthi S A，et al.Monoclonal antibody raised against envelope glycoprotein peptideneutralizes Japanese encephalitis virus.Arch Virol，2001，1461427～1435.)通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)Indian株的表位，制備了預(yù)測(cè)表位的單抗，通過(guò)ELISA、間接免疫熒光及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明149-SENHGNYSAQVGASQ-163為Indian株的線性中和表位。
本發(fā)明采用覆蓋PrM/M蛋白重疊短肽融合表達(dá)技術(shù)，對(duì)PrM/M蛋白進(jìn)行系統(tǒng)的抗原表位作圖(Epitope Mapping)。本發(fā)明是首次全面對(duì)PrM/M蛋白進(jìn)行線性抗原表位分析。通過(guò)融合表達(dá)21個(gè)相互重疊且覆蓋全長(zhǎng)PrM/M蛋白的短肽融合蛋白，利用JEV陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA與免疫印跡掃描，鑒定出了一個(gè)線性抗原表位。為了對(duì)這該表位的核心序列進(jìn)行確定，針對(duì)該抗原表位設(shè)計(jì)依次從N端和C端進(jìn)行氨基酸殘基縮減的短肽，融合表達(dá)后于乙型腦炎抗血清進(jìn)行結(jié)合分析。確定出抗原表位的核心序列，即該抗原表位的基本序列，只能向兩側(cè)延伸而兩端都不能進(jìn)一步縮減任何氨基酸殘基的序列。
乙型腦炎病毒的各個(gè)毒株雖然常在毒力和血凝特性等方面有比較明顯的差異，但抗原性差異不大，沒(méi)有不同的血清型。乙型腦炎病毒在抗原上與墨羅山谷腦炎病毒(Murray Vally Encephalitis Virus，MVEV)，西尼羅病毒(West Nile Virus，WNV)，圣路易腦炎病毒(St.LouisEncephalitis Virus)有血清學(xué)交叉反應(yīng)，在黃病毒科中屬同一血清群。此外，JEV還與登革病毒(Dengue Virus，DV)存在血清交叉反應(yīng)。這些病毒都是蚊媒性人獸共患傳染病，各種病毒也慢慢突破了早期的流行地域范圍，不斷在世界范圍內(nèi)擴(kuò)散對(duì)人類健康及公共衛(wèi)生造成威脅。及時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)與診斷對(duì)預(yù)防控制該類病毒病意義重大，那么要克服它們之間的血清學(xué)交叉反應(yīng)，建立以上各種病毒病的特異的診斷方法是一項(xiàng)重要的工作。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供乙型腦炎病毒JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽。
本發(fā)明的目的之二是將所述的乙型腦炎病毒JEV PRM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽應(yīng)用于制備成診斷或檢測(cè)乙型腦炎病毒的試劑。
本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的 一種乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis virus)PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽，該抗原表位多肽氨基酸序列中含有SEQ ID NO33、SEQ ID NO38或SEQ ID NO39所示的任意一種或多種氨基酸序列。
優(yōu)選的，所述的抗原表位多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO33、SEQID NO38或SEQ ID NO39所示的任意一種。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可以對(duì)所述的抗原表位多肽的N端或C端進(jìn)行化學(xué)修飾。所述的化學(xué)修飾為多肽鏈N端的自然氨基化或乙酰化，或C端的自然羧基化或酰胺化。
本發(fā)明中所述的抗原表位多肽可以通過(guò)固相多肽合成方法合成得到，也可以通過(guò)基因工程技術(shù)制備得到，這些都為本領(lǐng)域人員所通曉。
本發(fā)明將所鑒定出的抗原表位序列與存在血清學(xué)交叉反應(yīng)的各黃病毒進(jìn)行了蛋白質(zhì)序列的同源性分析，對(duì)與乙型腦炎病毒抗原表位同源的其它黃病毒短肽也進(jìn)行了融合表達(dá)，表達(dá)后進(jìn)一步與乙型腦炎病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行反應(yīng)性分析。確定了部分乙型腦炎病毒PrM/M蛋白抗原表位可以用于乙型腦炎與其它黃病毒之間的鑒別診斷。將鑒定的表位合成多肽，單獨(dú)或與載體蛋白偶聯(lián)后包被ELISA板，可以用于乙型腦炎病毒抗體的檢測(cè)。
本發(fā)明抗原表位多肽或其連接物可用于制備成檢測(cè)抗乙型腦炎病毒JEV抗體或抗乙型腦炎病毒JEV多肽抗體的試劑。
將本發(fā)明所述的抗原表位多肽制備成抗原，至少包括所述的一個(gè)或全部抗原表位，這些多肽通過(guò)自身連接、相互連接或與載體連接。
檢測(cè)乙型腦炎病毒JEV可以針對(duì)PrM/M蛋白抗原表位的單克隆抗體或針對(duì)抗原表位多肽的多克隆抗體，檢測(cè)方法可以包括間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、直接免疫熒光技術(shù)、間接免疫熒光技術(shù)，快速檢測(cè)試紙條免疫膜層析技術(shù)等。
檢測(cè)乙型腦炎病毒JEV抗體，包括野毒感染產(chǎn)生抗體，疫苗免疫產(chǎn)生抗體，母源抗體，抗JEV單克隆抗體等。檢測(cè)方法可以包括間接ELISA、雙抗體夾心ELISA，快速檢測(cè)試紙條免疫膜層析技術(shù)等。
蛋白質(zhì)抗原B細(xì)胞抗原表位鑒定的方法有多種，如基因工程定點(diǎn)突變表達(dá)抗原蛋白分析法、噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)篩選技術(shù)、合成多肽檢測(cè)技術(shù)等。本項(xiàng)發(fā)明在鑒定抗原表位中主要采用的是基因工程技術(shù)多肽融合重疊(overlapping)表達(dá)JEV PrM/M蛋白，體外免疫反應(yīng)檢測(cè)多肽融合蛋白組與JEV抗血清的結(jié)合性鑒定抗原表位序列，進(jìn)一步縮短與突變表達(dá)表位融合蛋白，鑒定抗原表位的序列結(jié)構(gòu)；再應(yīng)用合成多肽技術(shù)驗(yàn)證表位的正確性；用表位融合蛋白抗原免疫動(dòng)物制備表位特異性單因子血清，分析抗原表位功能。
編碼本發(fā)明B細(xì)胞抗原表位多肽(SEQ ID NO33、SEQ ID NO38或SEQ ID NO39所示氨基酸)核苷酸序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；當(dāng)然，含有上述核苷酸序列的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明所要保護(hù)的技術(shù)方案。
本發(fā)明的有益效果如下 1.由本發(fā)明乙抗原表位多肽設(shè)計(jì)的免疫原免疫動(dòng)物機(jī)體后能夠產(chǎn)生針對(duì)JEV的抗體，利用針對(duì)PrM/M蛋白抗原表位的單克隆抗體或多克隆抗體可以檢測(cè)乙型腦炎病毒JEV或乙型腦炎病毒PrM/M蛋白。
2.本發(fā)明的抗原表位多肽或其連接物能夠檢測(cè)乙型腦炎病毒JEV抗體或抗乙型腦炎病毒JEV多肽抗體。



圖1為表位多肽SEQ ID NO33與GST融合表達(dá)蛋白與抗JEV血清Western blot檢測(cè)結(jié)果。圖中從左至右依次為M，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，GST對(duì)照；2，SEQ ID NO33。
圖2為表位多肽序列SEQ ID NO33與不同毒株JEV同源序列的比較結(jié)果。
圖3為表位多肽序列SEQ ID NO33與不同黃病毒的同源序列比較結(jié)果。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1 JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位的篩選 根據(jù)JEV(SA14-14-2株)PrM/M蛋白氨基酸序列，設(shè)計(jì)一總數(shù)為20個(gè)的系列多肽，這些多肽相互重疊，且覆蓋JEV PrM/M蛋白全長(zhǎng)(1-167aa)。根據(jù)每一條多肽氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)DNA鏈，將DNA鏈插入表達(dá)載體pGEX-6p-1與GST進(jìn)行融合表達(dá)。融合表達(dá)的系列重組蛋白與抗JEV血清進(jìn)行間接ELISA分析，分析JEV PrM/M蛋白抗原表位，結(jié)果見(jiàn)表1所示。
其具體流程如下 設(shè)計(jì)多肽序列→合成編碼多肽序列的DNA鏈→多肽融合表達(dá)載體構(gòu)建→誘導(dǎo)表達(dá)→表達(dá)融合蛋白親和層析純化→表達(dá)產(chǎn)物與抗JEV血清免疫反應(yīng)性檢測(cè)→分析JEV PrM/M蛋白抗原表位。
表1 多肽融合蛋白與抗JEV血清間接ELISA反應(yīng)結(jié)果 注包被抗原分別為多肽融合蛋白，GST為對(duì)照包被抗原，抗原包被濃度為10μg/ml；抗JEV血清為200倍稀釋，TMB底物顯色，讀取450nm波長(zhǎng)OD值。
結(jié)果分析表明，初步鑒定出的抗原表位序列為SEQ ID NO14。進(jìn)一步用Western blot分析，GST-M14融合蛋白能被JEV陽(yáng)性血清識(shí)別，而GST對(duì)照則不能，表明M14(SEQ ID NO14)是一個(gè)線性抗原表位(圖1)。
實(shí)施例2 抗原表位的核心序列定位 根據(jù)實(shí)施例1中初步鑒定出的抗原表位序列，進(jìn)一步設(shè)計(jì)小片段多肽，即設(shè)計(jì)從C端至N依次縮減一個(gè)氨基酸殘基的系列多肽以及從N端至C端依次縮減一個(gè)氨基酸殘基的系列多肽，融合表達(dá)后與JEV陽(yáng)性血清進(jìn)行間接ELISA分析，兩端分別縮減至多肽融合蛋白喪失與JEVPrM/M蛋白單克隆抗體結(jié)合的能力時(shí)確定該表位的核心序列，反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表2所示。
表2 多肽融合蛋白與抗JEV血清間接ELISA反應(yīng)結(jié)果 注包被抗原分別為多肽融合蛋白，GST為對(duì)照包被抗原，抗原包被濃度為10μg/ml；抗JEV PrM/M蛋白單克隆抗體為200倍稀釋，TMB底物顯色，讀取450nm波長(zhǎng)OD值。
結(jié)果分析表明，經(jīng)兩端依次縮減后確定的抗原表位核心序列為SEQID NO33(M14-13)。
實(shí)施例3 抗原表位核心序列的突變分析 實(shí)施例2中確定的抗原表位核心序列與不同毒株乙型腦炎PrM/M蛋白序列比較(圖2)以及與西尼羅病毒(WNV)，尤蘇它病毒(UsutuVirus，UV)，昆津病毒(Kunjin virus，KUN)以及登革病毒(DengueVirus，DV)等黃病毒PrM/M蛋白進(jìn)行同源性分析比較(圖3)。
比較根據(jù)實(shí)施例2中確定的抗原表位核心序列與其它病毒的同源性，先取同源性大于50％的同源序列短肽，將其進(jìn)行GST融合表達(dá)后Western blot分析與JEV陽(yáng)性血清(SA14-14-2株)的反應(yīng)性，反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3所示。
表3 多肽融合蛋白與抗JEV血清Western blot反應(yīng)結(jié)果

注檢測(cè)抗原分別為表中所示多肽的GST融合蛋白，GST為對(duì)照抗原，抗JEV血清為200倍稀釋。
結(jié)果分析表明表位SEQ ID NO33(M14-13)序列為JEV不同毒株的共有序列、少數(shù)突變毒株同源序列如SEQ ID NO38、SEQ ID NO39同樣也能與JEV SA14-14-2株陽(yáng)性血清作用。且該表位具有病毒特異性，其它黃病毒如WNV NY99株、KUN MRM61C株、UV的同源序列不能被JEV陽(yáng)性血清所識(shí)別。
實(shí)施例4 乙型腦炎病毒JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位的合成 根據(jù)JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位的氨基酸序列，應(yīng)用固相多肽合成技術(shù)，采用自動(dòng)多肽合成儀或人工多肽合成方法。固相樹(shù)脂采用Fmoc保護(hù)的氨基酸Wang樹(shù)脂或其它樹(shù)脂，樹(shù)脂經(jīng)DMF溶漲、piperidine膠Fmoc保護(hù)后，根據(jù)氨基酸序列順序，加入Fmoc保護(hù)的氨基酸，在HBTU存在情況下進(jìn)行?；磻?yīng)。酰化反應(yīng)完成后經(jīng)過(guò)洗滌，再加入第二位的Fmoc-氨基酸進(jìn)行酰化反應(yīng)，并洗滌。如此循環(huán)，從多肽序列C末端超起始向N末端，按照順序合成完整的多肽鏈。合成完成后，根據(jù)組成肽鏈氨基酸不同選取適當(dāng)試劑用TFA法裂解肽鏈與樹(shù)脂的連接并用冷乙醚沉淀TFA多肽，經(jīng)脫鹽純化、LC-MS和HPLC分析鑒定后備用。在整個(gè)合成過(guò)程中，每個(gè)氨基酸?；磻?yīng)后可以應(yīng)用Kaiser法或TMBS法測(cè)試反應(yīng)的完成情況。為了便于使表位多肽和載體蛋白連接，在合成多肽時(shí)可以在多肽序列的N末端加一個(gè)半胱氨酸。
按照上述方法，分別合成了SEQ ID NO33、SEQ ID NO38、SEQID NO39所示氨基酸序列的多肽片段。
實(shí)施例5 乙型腦炎病毒JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位的化學(xué)修飾 按照實(shí)施例4的方法合成的多肽片段，其N末端為自然氨基修飾，C末端為自然羧基修飾。
N末端乙?；揎椃椒ò凑找陨辖榻B的多肽合成至最后一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸偶聯(lián)結(jié)束，并進(jìn)行N末端Fmoc保護(hù)基團(tuán)的去除，然后進(jìn)行以下操作。取150μl乙酸酐和20μL EIPEA溶于4.8ml DMF中，充分混合并在冰浴中冷卻。然后將以上混合液加入多肽合成反應(yīng)管中反應(yīng)5min。再依次用5ml DMF和二氯甲烷(DCM)洗2次，每次5min。氮?dú)獯蹈珊蟀凑粘Ｒ?guī)方法進(jìn)行側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的去除、裂解、純化和鑒定。
C末端酰胺化修飾方法C末端酰胺化的多肽合成時(shí)應(yīng)選用樹(shù)脂為Rink樹(shù)脂。執(zhí)行合成程序時(shí)應(yīng)對(duì)樹(shù)脂用DMF溶漲20min，然后從C末端第一位氨基酸開(kāi)始執(zhí)行合成程序，同前過(guò)Fmoc-wang樹(shù)脂合成方法。
實(shí)施例6 乙型腦炎JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位與載體蛋白KLH和BSA的偶聯(lián) 載體蛋白KLH或BSA 4mg溶于0.5ml含5mM EDTA的PBS(pH7.2)緩沖液中，加入1.0mg連接劑Sulfo-SMCC，充分溶解后在室溫孵育60min或37℃孵育30min。應(yīng)用Sephadex G-25柱或透析方法脫鹽純化Sulfo-SMCC處理的載體蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白含量后備用。
稱取實(shí)施例4所合成的表位多肽4mg，加入0.5ml重蒸餾水溶解多肽，然后將溶解后的多肽與Sulfo-SMCC處理的載體蛋白混合，4℃孵育2小時(shí)或反應(yīng)過(guò)夜，分裝備用。
實(shí)施例7 乙型腦炎病毒JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位氧化實(shí)現(xiàn)自身的連接 含半胱氨酸的多肽可以通過(guò)巰基的氧化反應(yīng)形成自身連接。一般情況下應(yīng)用DMSO介導(dǎo)的氧化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)連接，根據(jù)多肽的酸堿性，氧化反應(yīng)可以在微酸或微堿性條件下進(jìn)行。
微酸性環(huán)境下的氧化反應(yīng)用適當(dāng)濃度的醋酸溶解多肽，使多肽的濃度在0.5-1.5mM范圍內(nèi)，醋酸的終濃度不超過(guò)5％，用(NH4)2CO3調(diào)整多肽溶液的pH為6.0左右，加入10-20％的DMSO，25℃反應(yīng)5-25h，氧化反應(yīng)的進(jìn)行程度可以通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)。然后，用1％TFA水和乙腈為流動(dòng)相，制備型反相HPLC純化氧化性多肽。
微堿性環(huán)境下的氧化反應(yīng)用0.01M磷酸鹽緩沖液，pH7.5，溶解多肽至終濃度1.0mM，加入濃度DMSO至終濃度1％，25℃反應(yīng)過(guò)夜，氧化反應(yīng)的進(jìn)行程度可以通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)。然后用1％TFA水和乙腈為流動(dòng)相，制備型反相HPLC純化氧化性多肽。
實(shí)施例8 乙型腦炎病毒JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位間接ELISA檢測(cè)豬抗JEV抗體 用JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位SEQ ID NO33合成表位多肽與載體的連接物為包被抗原，包被96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板。用pH9.6，0.1M碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至終濃度為10μg/ml，按100μl/孔加入酶標(biāo)板中，4℃包被過(guò)夜。然后用PBST(PBS+0.05％Tween 20)洗滌酶標(biāo)板3次；含1％BSA的PBST封閉酶標(biāo)板，37℃封閉2h，封閉后用洗液PBST洗板3次，立即用于檢測(cè)或-20℃存放備用。
抗體檢測(cè)操作程序加入待檢測(cè)豬血清(定性檢測(cè)血清100倍稀釋，抗體效價(jià)檢測(cè)血清進(jìn)行倍比稀釋，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性血清對(duì)照與陰性血清對(duì)照以及不加血清的空白對(duì)照)，37℃孵育1h，PBST洗液洗滌3次，每次3分鐘；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗豬IgG(Goat-anti-pigIgG-HRP)，37℃孵育1h，PBST洗液洗滌4次，每次3分鐘；加入HRP顯色底物(TMB顯色劑)，室溫孵育5-15分鐘觀察顯色反應(yīng)；充分顯色后，加入2M硫酸終止顯色反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm波長(zhǎng)的吸光值；判定結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)表4所示。
表4 表位多肽包被間接ELISA檢測(cè)豬抗JEV抗體
注包被抗原為抗原表位SEQ ID NO33合成多肽與BSA的連接物，10μg/ml。該陽(yáng)性血清效價(jià)為200。
判定結(jié)果時(shí)空白對(duì)照及陰性血清孔吸光值小于或等于0.2，陽(yáng)性血清對(duì)照孔吸光值大于0.4時(shí)結(jié)果有效；計(jì)算P/N值＝(檢測(cè)孔OD值-空白對(duì)照孔OD值)/(陰性血清OD值-空白對(duì)照孔OD值)，P/N值等于或大于2時(shí)為陽(yáng)性；以反應(yīng)陽(yáng)性血清的最大稀釋倍數(shù)為該樣品血清的抗體效價(jià)。
用同樣方法分別以JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位SEQ ID NO38，SEQ ID NO39合成表位多肽與載體的連接物為包被抗原檢測(cè)豬血清中抗JEV抗體，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 表位多肽包被間接ELISA檢測(cè)豬抗JEV抗體
注包被抗原分別為抗原表位SEQ ID NO38，SEQ ID NO39合成多肽與BSA的連接物，10μg/ml。
實(shí)施例9 乙型腦炎病毒JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位間接ELISA檢測(cè)人抗JEV抗體 實(shí)施方法同實(shí)施例8，待檢血清、陰性對(duì)照血清和陽(yáng)性對(duì)照血清為人血清；二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG(Goat-anti humanIgG-HRP)。
實(shí)施例10 乙型腦炎病毒JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位間接ELISA檢測(cè)馬抗JEV抗體 實(shí)施方法同實(shí)施例8，待檢血清、陰性對(duì)照血清和陽(yáng)性對(duì)照血清為馬血清；二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗馬IgG(Goat-anti horseIgG-HRP)。
實(shí)施例11 乙型腦炎病毒JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位Dot-ELISA檢測(cè)豬抗JEV抗體 用JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位SEQ ID NO33，SEQ ID NO38，SEQ ID NO39中的一種或多種表位多肽與載體的連接物的混合物為包被抗原，以BSA為對(duì)照抗原。在硝酸纖維素膜上定點(diǎn)包被抗原，2μg/點(diǎn)，37℃固定30min，PBST洗滌6次，2％BSA中4℃封閉過(guò)夜，PBST洗滌6次后即可用于抗體檢測(cè)。
檢測(cè)抗體時(shí)，將待檢測(cè)血清樣品適當(dāng)稀釋后與抗原包被膜于37℃孵育30min，PBST洗滌6次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗豬IgG(Goat-anti-pig IgG-HRP)，37℃孵育1h，PBST洗液洗滌6次；加入AEC或DAB底物顯色，室溫避光孵育10min觀察顏色反應(yīng)。
結(jié)果判定時(shí)，以包被抗原點(diǎn)呈現(xiàn)棕紅色顏色反應(yīng)，對(duì)照抗原點(diǎn)不出現(xiàn)顏色反應(yīng)者為陽(yáng)性。
實(shí)施例12 乙型腦炎病毒JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位Dot-ELISA檢測(cè)人抗JEV抗體 實(shí)施方法同實(shí)施例11，待檢血清為人血清；二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgG(Goat-anti human IgG-HRP)。
實(shí)施例13 乙型腦炎病毒JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位Dot-ELISA檢測(cè)馬抗JEV抗體 實(shí)施方法同實(shí)施例11，待檢血清為馬血清；二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗馬IgG(Goat-anti horse IgG-HRP)。
實(shí)施例14 乙型腦炎病毒JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位免疫原的制備及免疫實(shí)驗(yàn) 乙型腦炎病毒JEV PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位免疫原可以是合成抗原表位多肽，抗原表位多肽自身連接物，抗原表位多肽與載體連接物，抗原表位融合表位蛋白等。本實(shí)施例中用抗原表位多肽SEQ ID NO33與BSA連接物為免疫原；首次免疫免疫原用弗氏完全佐劑和抗原乳化，小動(dòng)物免疫抗原量為100μg每只；二三免時(shí)用弗氏不完全佐劑與抗原乳化，小動(dòng)物免疫抗原量為50-100μg每只進(jìn)行免疫。免疫途徑可為皮下注射、皮內(nèi)注射或肌肉注射。各次免疫期間隔兩周。加強(qiáng)免疫兩次后檢測(cè)抗體水平。試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表6。
表6 小鼠抗表位多肽M14-13抗體間接ELISA效價(jià)
注包被抗原為抗原表位多肽SEQ ID NO33，10μg/ml。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明而言僅僅是說(shuō)明性的，而非限制性的。本專業(yè)技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至、等效，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
序列表
<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
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權(quán)利要求
1、乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis virus)PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽，其特征在于其含有SEQ ID NO33、SEQ ID NO38或SEQ ID NO39所示的任意一種或多種氨基酸序列。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙型腦炎病毒PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽，其特征在于所述SEQ ID NO33、SEQ ID NO38或SEQ ID NO39的氨基酸序列的N端或C端進(jìn)行化學(xué)修飾。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的乙型腦炎病毒PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽，其特征是所述的N端的化學(xué)修飾為N端的自然氨基化或乙?；?；所述的C端的化學(xué)修飾為C端的自然羧基化或酰胺化。
4、編碼權(quán)利要求1所述乙型腦炎病毒PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽的核苷酸序列。
5、含有權(quán)利要求4所述核苷酸序列的表達(dá)載體。
6、含有權(quán)利要求5所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
7、權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的乙型腦炎病毒PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽與載體蛋白所形成的偶聯(lián)物。
8、權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的乙型腦炎病毒PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽在制備診斷或檢測(cè)乙型腦炎病毒試劑中的用途。
9、權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的乙型腦炎病毒PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽在制備防制乙型腦炎病毒藥物中的用途。
10、權(quán)利要求7所述的偶聯(lián)物在制備診斷或防制乙型腦炎病毒藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了乙型腦炎病毒PrM/M蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽，還公開(kāi)了該抗原表位多肽在診斷乙型腦炎病毒中的應(yīng)用，屬于分子免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明所述的抗原表位多肽的氨基酸序列分別為SEQ ID NO33、SEQ ID NO38、SEQID NO39所示的任意一種氨基酸序列。本發(fā)明的B細(xì)胞抗原表位多肽，重復(fù)抗原表位多肽，抗原表位多肽與載體蛋白偶聯(lián)物，抗原表位多肽融合表達(dá)物均能夠作為檢測(cè)乙型腦炎病毒抗體或抗乙型腦炎病毒多肽抗體的試劑。
文檔編號(hào)C07K7/06GK101607983SQ20091016065
公開(kāi)日2009年12月23日 申請(qǐng)日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者華榮虹, 步志高 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所