專利名稱：：一種穗花杉雙黃酮的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及卷柏中穗花杉雙黃酮(amentoflavone)的制備方法，其含量釆用HPL,C法檢測(cè)應(yīng)在95。/。以上。屬于中藥提取分離、純化領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：中國(guó)藥典2005年版中規(guī)定卷柏為巻柏科植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring或墊狀卷柏Selaginellapulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.的千燥全草。全年均可釆收，除去須根及泥沙，曬干。辛，平。歸肝、心經(jīng)。具有活血通經(jīng)。用于經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕痞塊，趺撲損傷。巻柏炭化瘀止血。用于吐血，崩漏，便血，脫肛。卷柏中含有多種化學(xué)成分，如黃酮類，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)卷柏中含有芹菜素(apigenin)、穗花杉雙黃酮(amentoflavone)、扁柏雙黃酉同(hinokiflavone)、異柳杉素(isocryptomerin)及阿曼托黃色(amentoflavone)等苯丙素類、生物堿類、酚類、有機(jī)酸類等化合物。藥理作用顯示具有免疫及抗腫瘤作用、對(duì)血液系統(tǒng)的作用、抗病毒、抑菌與抗炎作用、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜等作用。本發(fā)明提供了一種方便、簡(jiǎn)便、快速的制備高純度穗花杉雙黃酮的方法。目前現(xiàn)有技術(shù)中未見此穗花杉雙黃酮的提取方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種從中藥卷柏中提取一種含量在95。/。以上的穗花杉雙黃酮(amentoflavone)的制備方法，目的是通過簡(jiǎn)單的工藝過程得到含量較高(含量大于95%)的穗花杉雙黃酮(amentoflavone)。本發(fā)明的技術(shù)方案是從中藥卷柏中提取一種含量在95%以上的穗花杉雙黃酮(amentoflavone)的制備方法，其具體方法步驟為a)將巻柏禾斗植物巻柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring或墊狀巻柏Selaginellapulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.的干燥全草原料切成寸段；'b)用乙醇、甲醇、水中的一種或乙醇和甲醇中的一種與水按比例(1:10~10:1)混合和Z或與水混合的混合溶劑回流提取，加入相當(dāng)于藥材重量的2-16倍溶劑，回流提取l-5次，每次0.5至6小時(shí)，合并提取液，濾過，得提取液；c)將提取液回收溶劑并濃縮至相對(duì)密度為1.05-1.40(60°C)的清膏或稠膏，放置0.5-24小時(shí)，濾過，得固體沉淀物。d)固體沉淀物用2-100倍量的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的--種或任意兩種按比例(1:1010:l)混合的混合溶劑溶解。e)將固體沉淀物的有機(jī)溶劑或混合有機(jī)溶劑加入以硅膠為吸附劑的層析柱上吸附。f)將吸附固體沉淀物的硅膠層析柱用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、4三氯甲烷一種或任意兩種按比例(1:10~10:l)混合的混合溶劑分別與乙醇或甲醇(10:1~1:l)的混合溶劑洗脫，分別以每份1/100~1/20總量洗脫劑的體積量收集洗脫液流份，以三氯甲烷甲醇(10:1-1:1)為展開劑釆用TLC檢查斑點(diǎn)，合并相同的黃色斑點(diǎn)洗脫流份。g)將合并的相同黃色斑點(diǎn)洗脫流份回收溶劑，得黃色固體粉末。h)將黃色固體粉末用2-100倍量的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一種或幾種按比例(1:10~10:l)混合的混合有機(jī)溶劑溶解。i)將黃色固體粉末的有機(jī)溶劑或混合有機(jī)溶劑加入以S印hadexLH-20為吸附劑的層析柱上吸附。j)將吸附黃色固體粉末的SephadexLH-20層析柱用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷一種或任意兩種按比例(1:1010:1)混合的混合溶劑分別與乙醇或甲醇(10:1~Ll)的混合溶劑洗脫，分別以每份1/100-1/20總量洗脫劑的體積量收集SephadexLH-20層析柱的黃色色帶，直至完全。以三氯甲烷甲醇(10:1)為展開劑采用TLC跟蹤檢查斑點(diǎn)，合并相同的黃色斑點(diǎn)洗脫流份。k)將合并的相同黃色斑點(diǎn)洗脫流份回收溶劑，得黃色固體粉末，即穗花杉雙黃酮(amentoflavone)精制品，其含量采用HPLC法檢測(cè)應(yīng)在95%以上。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>黃色粉末，F(xiàn)eCL3反應(yīng)，鹽酸-鎂粉反應(yīng)均呈陽性，提示其可能為黃酮類化合物。'HNMR(300MHz,DMSO-A)譜與單一黃酮?dú)渥V圖比較發(fā)現(xiàn)56.78(1H,s,H-113),6.82(1H,s,H-I3)為雙黃酮兩個(gè)3位質(zhì)子信號(hào)；并且在氫譜低場(chǎng)區(qū)有6個(gè)羥基質(zhì)子信號(hào)分別為^3.09(1H，s,H-I5),12.%UH,s,H-II5)為兩個(gè)黃酮的5-羥基;狐55(2H,brs,4"-0H和H-4〃'-0H);10.82(1H,s,7-OH)，10.28(1H，s,7"-OH)，結(jié)合130麗11(75MHz,DMSO-^)譜中給出的30個(gè)碳信號(hào)，進(jìn)一步提示該化合物可能為雙黃酮。氫譜中56.45(1H，d,J二2.0Hz,H-8),6.18UH,d,J=2.0Hz,H-6)提示為黃酮A環(huán)間位偶合質(zhì)子，說明某一個(gè)黃酮A環(huán)為5，7-二羥基取代；氫譜中唯一剩下的一個(gè)尖銳單峰信號(hào)為廉.39(1H，s)，推測(cè)可能為另一個(gè)黃酮的6位或8位質(zhì)子，說明該雙黃酮化合物是由一個(gè)黃酮結(jié)構(gòu)單元A環(huán)上的6位或8位與另一個(gè)黃酮B環(huán)的某個(gè)質(zhì)子相連。J7.58(2H，d，/=8.7Hz，H-2〃'，6"')，56.72(2H,d,/=8.7Hz,H畫3"'，5'〃)提示為其中一個(gè)黃酮B環(huán)對(duì)位取代時(shí)形成的AA'BB'偶合系統(tǒng)。此時(shí)氫譜中還剩下3個(gè)氫信號(hào)，根據(jù)峰型和偶合常數(shù)，推測(cè)其中一個(gè)黃酮B環(huán)為ABX偶合系統(tǒng)，同時(shí)也進(jìn)一步說明這兩個(gè)黃酮通過其中一個(gè)B環(huán)的3'或5'位與另一個(gè)黃酮的6位或8位質(zhì)子相連，具體歸屬如下^7.15(1H,d，J=9.3Hz),況.01(1H,d,J=2.0Hz,6.9Hz),J7.99(1H,d,^2.0Hz)(以上構(gòu)成ABX系統(tǒng))。通過與單黃酮的13CNMR相比較，其中一個(gè)黃酮的C-8移向低場(chǎng)區(qū)，化學(xué)位移值增大約6ppm,表明確實(shí)有其它基團(tuán)相連，結(jié)合氫譜中黃酮B環(huán)存在的ABX偶合系統(tǒng)，進(jìn)一步推斷兩個(gè)單黃酮確實(shí)以3'-8〃連接。根據(jù)以上質(zhì)子分布情況，故推測(cè)該化合物為amentoflavone。結(jié)構(gòu)如Figure.<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>5'116.37.15(lH，d,J=9.3Hz)5'"6'131.58.01(lH,d，J=2.0Hz,6'〃6.9Hz)5-OH13.095'〃-OH7陽OH10.827'"-OH4'-OH10.554'"-OH115.96.72(2H，d，_/=8.7)128.37.58(2H,d，./=8.7)12.9610.2810.55本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(1)工藝操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，產(chǎn)率高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。(2)本產(chǎn)品的純度較高，其含量采用HPLC法檢測(cè)在95。/。以上。德花杉雙黃酉同(amentoflavone)的應(yīng)用(1)本發(fā)明的穗花杉雙黃酮(amentoflavone)適合于制備臨床上使用的1類新藥制劑。(2)本發(fā)明的穗花杉雙黃酮(amentoflavone)也可以與其它化合物或藥,物聯(lián)合使用，制備臨床上使用的新藥制劑。(3)本發(fā)明的穗花杉雙黃酮(amentoflavone)可以制成各種臨床上使用的藥物劑型。(3)本發(fā)明的穗花杉雙黃酮(amentoflavone)也可以做為對(duì)照品使用。(4)本發(fā)明的穗花杉雙黃酮(amentoflavone)也可以制成各種臨床上使用的保健食品以及功能'性化妝品。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例來更詳細(xì)的說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。實(shí)施例1:將干燥巻柏全草100g，切成寸段，加30%乙醇回流提取三次，每次加入ll倍量，每次2小時(shí)，合并提取液，濾過，得提取液。將提取液回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度為1.30(60°C)的清膏，放置12小時(shí)，濾過，得固體沉淀物。將固體沉淀物用40倍量的甲醇溶解后加入以硅膠為吸附劑的層析柱上吸附。硅膠層析柱用,三氯甲烷與甲醇(10:1:、1:l)的混合溶劑梯査斑點(diǎn)(以三氯甲烷、甲醇3:、為展開劑)，合并相同的黃色斑點(diǎn)洗脫流份。將合并的相同黃色斑點(diǎn)洗脫流份回收溶劑，得黃色固體粉末。將黃色固體粉末用30倍量的丙酮溶解后，加入以ScphadexLH-20為吸附劑的層析柱上吸附。將SephadexLH-20層析柱用三氯甲烷與甲醇(3:1)的混合溶劑洗脫，分別以每份1/30總量洗脫劑的體積量收集SephadexLH-20層析柱的黃色色帶，直至完全。采用TLC跟蹤檢査斑點(diǎn)(以三氯甲烷甲醇4:l為展開劑)，合并相同的黃色斑點(diǎn)洗脫流份。將合并的相同黃色斑點(diǎn)洗脫流份回收溶劑，得黃色固體粉末，即穗花杉雙黃酮(amentoflavone)精制品，其含量采用HPLC法檢測(cè)為98.1%上。實(shí)施例2:將干燥卷柏全草2kg,切成寸段，加75%乙醇回流提取三次，每次加入10倍量，每次1.5小時(shí)，合并提取液，濾過，得提取液。將提取液回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度為1.10(60°C)的清膏，放置8小時(shí)，濾過，得固體沉淀物。將固體沉淀物用30倍量的乙酸乙酯溶解后加入以硅膠為吸附劑的層析柱上吸附。硅膠層析柱用三氯甲烷與甲醇(10:1~1:l)的混合溶劑梯度洗脫，以每份1/30總量洗脫劑的體積量收集洗脫液流份，釆用TLC檢查斑點(diǎn)(以三氯甲烷甲醇2:1為展開劑)，合并相同的黃色斑點(diǎn)洗脫流份。將合并的相同黃色斑點(diǎn)洗脫流份回收溶劑，得黃色固體粉末。將黃色固體粉末用20倍量的丙酮溶解后，加入以SephadexLH-20為吸附劑的層析柱上吸附。將SephadexLH-20層析柱用三氯甲烷與甲醇(4:1)的混合溶劑洗脫，分別以每份1/20總量洗脫劑的體積量收集SephadexLH-20層析柱的黃色色帶，直至完全。采用TLC跟蹤檢查斑點(diǎn)(以三氯甲烷甲醇2:l為展開劑)，合并相同的黃色斑點(diǎn)洗脫流份。將合并的相同黃色斑點(diǎn)洗脫流份回收溶劑，得黃色固體粉末，即穗花杉雙黃酮(amentoflavone)精制品，其含量釆用HPLC法檢測(cè)為96.6%。實(shí)施例3:將干燥卷柏全草30kg,切成寸段，加50%乙醇回流提取三次，每次加入9倍量，每次1.5小時(shí)，合并提取液，濾過，得提取液。將提取液回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度為1.25(60°C)的清膏，放置6小時(shí)，離心，得固體沉淀物。將固體沉淀物用20倍量的丙酮溶解后加入以硅膠為吸附劑的層析柱上吸附；,膠層析JJ]三氯甲烷與甲y(10:1、；k、、)的j昆合溶劑檢査斑點(diǎn)(以三氯甲烷;醇3:l為展^劑)，合并相同的^色斑點(diǎn)洗脫流份。將合并的相同黃色斑點(diǎn)洗脫流份回收溶劑，得黃色固體粉末。將黃色固體粉末用IO倍量的丙酮溶解后，加入以SephadexLH-20為吸附劑的層析柱上吸附。將SephadexLH-20層析柱用三氯甲烷與甲醇(3:1)的混合溶劑洗脫，分別以每份1/30總量洗脫劑的體積量收集SephadexLH-20層析柱的黃色色帶，直至完全。采用TLC跟蹤檢查斑點(diǎn)(以三氯甲烷甲醇3:l為展開劑)，合并相同的黃色斑點(diǎn)洗脫流份。將合并的相同黃色斑點(diǎn)洗脫流份回收溶劑，得黃色固體粉末，即穗花杉雙黃酮(amentoflavone)精制品，其含量釆用HPLC法檢測(cè)為95.3%。權(quán)利要求1、一種穗花杉雙黃酮，具有如下式(I)的結(jié)構(gòu)其特征在于其含量在95％以上。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的穗花杉雙黃酮，其特征在于所述穗花杉雙黃酮的英文名為amentoflavone;分子式為C3oH1801();分子量為538.47。3、一種如權(quán)利要求1所述的穗花杉雙黃酮的制備方法，其特征在于該方法采用中藥卷柏為原料，用有機(jī)溶劑和/或水進(jìn)行提取或釆用柱層析進(jìn)行分離4、J艮據(jù)權(quán)利要求3所述的穗花杉雙黃酮的制備方法，其特征在于所述的中藥卷柏為巻柏禾年植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring或墊狀巻柏Selaginellapulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.的干燥全草原料。5、根據(jù)權(quán)利要求3所述的穗花杉雙黃酮的制備方法，其特征在于所述的提取方法中，所述溶劑包括乙醇、甲醇、水中的一種，乙醇、甲醇中的一種與水按比例1:10~10:l混合的混合溶劑。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的穗花杉雙黃酮的制備方法，其特征在于所述的柱層析分離方法中，所用柱層析吸附劑為硅膠、SephadexLH-20。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述的穗花杉雙黃酮的制備方法，其特征在于所述的柱層析分離方法中，所用柱層析洗脫劑為石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一種或任意兩種按比例10:1~1:IO混合的混合有機(jī)溶劑。8、根據(jù)權(quán)利要求3所述的穗花杉雙黃酮的制備方法，其特征在于所述具Selaginellapulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.的干燥全草原料切b)用乙醇、甲醇、水中的一種或乙醇和甲醇中的一種與水按比例1:10~c)將提取液回收溶劑并濃縮至60。C下相對(duì)密度為1.05-1.40的清膏或d)固體沉淀物用2-100倍量(重量/體積比)的石油醚、乙醚、乙酸乙酉旨、丙酮、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一種或任意兩種按比例1:10~10:1混合的混合溶劑溶解；e)將固體沉淀物的有機(jī)溶劑或混合有機(jī)溶劑加入以硅膠為吸附劑的層析柱上吸附；f)將吸附固體沉淀物的硅膠層析柱用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷一種或任意兩種按比例1:10~10:l混合的混合溶劑分別與乙醇或甲醇10:1~1:1的混合溶劑洗脫，分別以每份1/100~1/20總量洗脫劑的體積量收集洗脫液流份，以三氯甲烷甲醇10:1為展開劑釆用TLC檢查斑點(diǎn)，合并相同的黃色斑點(diǎn)洗脫流份；g)將合并的相同黃色斑點(diǎn)洗脫流份回收溶劑，得黃色固體粉末；h)將黃色固體粉末用2-100倍量的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇、甲醇中的一種或任意兩種按比例1:10~10:l混合的混合有機(jī)溶劑溶解；i)將黃色固體粉末的有機(jī)溶劑或混合有機(jī)溶劑加入以SephadexLH-20j)將吸附黃色固體粉末的S印hadexLH-20層析柱用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷一種或任意兩種按比例1:10~10:1混合的混合溶劑分別與乙醇或甲醇10:1~1:1的混合溶劑洗脫，分別以每份1/100~1/20總量洗脫劑的體積量收集SephadexLH-20層析柱的黃色色帶，直至完全；以三氯甲垸甲醇10:1~]:1為展開劑釆用TLC跟蹤檢查斑點(diǎn)，合并相同的黃色斑點(diǎn)洗脫流份；k)將合并的相同黃色斑點(diǎn)洗脫流份回收溶劑，得黃色固體粉末，即穗花杉雙黃酮精制品，其含量釆用HPLC法檢測(cè)應(yīng)在95%以上。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的穗花杉雙黃酮，其特征在于所述的穗花杉雙黃酮可以和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑結(jié)合制備成臨床上可接受的各種制劑。10、根據(jù)權(quán)利要求8所述的穗花杉雙黃酮，其特征在于所述的制劑包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、滴丸。全文摘要本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，提供了一種從中藥卷柏中制備含量在95％以上的穗花杉雙黃酮(amentoflavone)的制備方法。該化合物具有如下式(I)的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中所述的穗花杉雙黃酮(amentoflavone)是采用卷柏科植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring或墊狀卷柏Selaginellapulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.的干燥全草原料為起始原料，用有機(jī)溶劑和/或水進(jìn)行提取并且采用柱層析分離法進(jìn)行分離得到的。本發(fā)明具有工藝操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，產(chǎn)率高，適合于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，且本產(chǎn)品的純度較高，其含量采用HPLC法檢測(cè)在95％以上。文檔編號(hào)C07D311/30GK101585825SQ20091001209公開日2009年11月25日申請(qǐng)日期2009年6月17日優(yōu)先權(quán)日2009年6月17日發(fā)明者張國(guó)剛,宏田申請(qǐng)人:沈陽藥科大學(xué)