專利名稱：針對(duì)il-25的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)白介素25 (IL-25)的抗體，包括其結(jié)合片段。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施 方案使用抗體2C3的抗體VH和/或VL結(jié)構(gòu)域。另一方面本發(fā)明提供了分別移植到人VH 和VL框架區(qū)域中的本文中所公開VH和VL結(jié)構(gòu)域的一種或更多種CDR。

背景技術(shù)：
哮喘是常見的氣道慢性炎癥，患者的數(shù)量在最近的數(shù)十年間急劇上升，世界衛(wèi)生 組織估算世界范圍內(nèi)有3億人患有哮喘。過敏性哮喘特征為無法控制的氣道高反應(yīng)性 (AHR)，其由多種激發(fā)性剌激誘導(dǎo)，與肺的2型炎性浸潤有關(guān)。 2型細(xì)胞因子在介導(dǎo)寄生蠕蟲感染的保護(hù)免疫、調(diào)節(jié)效應(yīng)器功能例如B細(xì)胞生長 和IgE分泌、誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生和相關(guān)的粘液生成、嗜曙紅細(xì)胞增多、肥大細(xì)胞增生病和纖 維化中起重要作用(1)。這些細(xì)胞因子在這些效應(yīng)器功能調(diào)節(jié)中的核心作用使之成為哮喘 的關(guān)鍵治療靶標(biāo)。實(shí)際上，這些細(xì)胞因子過表達(dá)的小鼠模型顯示顯著的哮喘特征。然而令 人驚訝的是，通過阻斷特異性2型細(xì)胞因子(除了抑制IL-13)改善實(shí)驗(yàn)性哮喘的努力已證 明是不成功的。 IL-13的抑制同時(shí)抑制了 AHR和氣道炎癥，但其機(jī)制仍不清楚(2， 3)。然而，由于
哮喘復(fù)雜的病理生理學(xué)和有限的病因?qū)W了解，靶向各個(gè)途徑是否能最終證明是成功的治療 是不確定的。 最近，結(jié)構(gòu)相關(guān)的IL-17細(xì)胞因子家族元件IL25/IL17E(8)的過表達(dá)已顯示能在 體內(nèi)誘導(dǎo)2型應(yīng)答(4-6)，并增加對(duì)氣道激動(dòng)劑的應(yīng)答性(7)。 1125—小鼠不能排出蠕蟲寄 生蟲，這是無效2型應(yīng)答的關(guān)鍵指標(biāo)(9， 10)。 抗體的基本結(jié)構(gòu)在本領(lǐng)域是公知的。天然存在的抗體通常具有四條多肽鏈兩條 相同的重鏈和兩條相同的輕鏈，其通過二硫鍵連接。重鏈和輕鏈各自具有恒定區(qū)和可變區(qū) (或結(jié)構(gòu)域)?？勺儏^(qū)主要負(fù)責(zé)抗體的結(jié)合。在每個(gè)可變區(qū)內(nèi)，三個(gè)已知為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR) 的亞區(qū)與抗原接觸。各個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的CDR從N端至C端編號(hào)為CDR1、CDR2和CDR3。在N 和C端與CDR之間是4個(gè)所謂的框架區(qū)，其與抗原的接觸即使有也很少。關(guān)于抗體結(jié)構(gòu)的 更多詳細(xì)情況在許多下文中所引用文獻(xiàn)中進(jìn)行了闡述，其通過援引并入本文。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人們制備了針對(duì)IL-25的抗體，并鑒定了與IL-25以高度親和性和特異性 結(jié)合的抗體分子。由于人和小鼠1卜25共有80%的序列同一性，認(rèn)為不大可能通過小鼠 或大鼠常規(guī)的免疫接種產(chǎn)生有效的抗IL-25抗體，因?yàn)樵撓嗨贫饶軠p少免疫原性表位的數(shù) 目。此外，受體配體界面(interface)很可能顯示最大程度上的保守性，因此阻礙了能阻 斷IL-25與其受體相互作用的抗體的產(chǎn)生。為了解決這些問題，本發(fā)明人們對(duì)經(jīng)設(shè)計(jì)缺乏 IL-25 (IL-25-/-)表達(dá)的小鼠進(jìn)行了免疫，相信該方法能增加開發(fā)針對(duì)IL-25/IL-25R界面 抗體的可能性。 該方法在產(chǎn)生針對(duì)IL-25的抗體方面是非常成功的，其很可能源于IL-25本身增
4強(qiáng)了體液免疫應(yīng)答。然而，即使使用本方法，從70個(gè)候選物中僅鑒定到2個(gè)阻斷抗體，其中 僅有1個(gè)可被回收。 通過常規(guī)方法克服了被認(rèn)為阻礙了有效阻斷抗體的產(chǎn)生的鼠和人IL-25之間相 似性的問題后，認(rèn)為該序列相似性可產(chǎn)生等價(jià)有效阻斷小鼠和人IL-25與其受體相互作用 的抗體。本發(fā)明現(xiàn)說明這的確如此。 盡管已有針對(duì)IL-25的其他抗體存在，相信本發(fā)明是首次說明所述能阻斷IL-25 生物活性的抗體。具體而言，本文提供了在哮喘鼠模型中進(jìn)行的試驗(yàn)，其顯示本發(fā)明的抗體 尤其在體內(nèi)預(yù)防或降低氣道高反應(yīng)性(哮喘的關(guān)鍵癥狀)中具有優(yōu)點(diǎn)和意料不到的性質(zhì)。
雖然已報(bào)道施用可溶性IL-25R-Fc融合蛋白可降低2型氣道炎癥，其效果顯著低 于本文中報(bào)道的那些，并且關(guān)鍵是未評(píng)價(jià)AHR(ll)。我們現(xiàn)證明IL-25在氣道炎癥和AHR中 起關(guān)鍵作用，最初增強(qiáng)2型細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥，并且在誘導(dǎo)不依賴于經(jīng)典2型細(xì)胞因子的 AHR中起重要作用。IL-25依賴的AHR的鑒定使鑒別新的IL-25下游治療靶標(biāo)成為可能。目 前我們不知道IL-25是否直接作用于氣道平滑肌以誘導(dǎo)支氣管收縮，或其效果通過誘導(dǎo)已 知的支氣管收縮物例如白三烯類介導(dǎo)。然而，IL-25的雙相活性使其成為體內(nèi)抑制氣道炎 癥和抑制氣道高反應(yīng)性的出色治療靶標(biāo)。 因此，本發(fā)明涉及新的抗體，更普遍為包含所述抗體CDR序列的靶標(biāo)結(jié)合元件，以 及所述靶標(biāo)結(jié)合元件在治療狀況例如哮喘中的應(yīng)用。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了結(jié)合IL-25的靶標(biāo)結(jié)合元件，其包括抗體VH結(jié) 構(gòu)域，所述抗體VH結(jié)構(gòu)域包括具有氨基酸序列SEQID NO. 7的VH CDR3。其為本發(fā)明抗體 2C3的VH CDR3序列。 在更具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件是VH結(jié)構(gòu)域，其包括SEQ ID NO :
7的VH CDR3，以及SEQ ID NO :5的CDR1和SEQID NO :6的CDR2。 所述VH結(jié)構(gòu)域可具有人框架區(qū)，或SEQ ID N0:2所示的框架區(qū)。所述VH結(jié)構(gòu)域可與本發(fā)明的VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)，例如具有SEQ IDNO :8的CDR1、 SEQ
ID NO :9的CDR2和SEQ ID NO :10的CDR3的VL結(jié)構(gòu)域。這些CDR可位于具有人框架區(qū)的
VL結(jié)構(gòu)域內(nèi)，或?yàn)镾EQID NO :4的VL結(jié)構(gòu)域。 因此在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了結(jié)合IL-25的靶標(biāo)結(jié)合元件，其包括2C3 VH結(jié)構(gòu) 域(SEQ ID NO :2)和/或2C3 VL結(jié)構(gòu)域(SEQ IDNO :4)。 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件的分離的核酸，包含所述核酸的載體和 在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述核酸以生產(chǎn)本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件的方法。 本發(fā)明還提供了本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件，例如以藥物組合物形式，用于治療包括 哮喘的疾病中的用途。 本發(fā)明的這些和其他方面在下文進(jìn)一步詳細(xì)描述，參照所附的實(shí)施例。


圖1顯示了致敏前和哮喘攻擊期間IL-25的中和。(A)最后一次氣霧化抗原攻擊 一天后測定OVA-致敏的小鼠的乙酰甲膽堿敏感性。合并2次試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，其表示14-18小 鼠/組的平均值±SEM。 (*與同種型對(duì)照相比p < 0. 05， **與同種型對(duì)照相比p < 0. 01) (B)肺部切片用giemsa染色，進(jìn)行血管周圍浸潤評(píng)分，每組n = 8。 (C)通過肺部切片高碘酸Schiff (PAS)染色測定粘液含量，每組n = 8。 (D)通過ELISA測定抗原特異性血清IgE， 0D讀取值通過與標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行比較轉(zhuǎn)化為任意單位，每組n = 8。 (E)通過用giemsa染色 的細(xì)胞離心涂片器的差別細(xì)胞計(jì)數(shù)測定BAL中嗜曙紅細(xì)胞的比例，每組n = 6。 (F)來自重 剌激縱隔淋巴結(jié)細(xì)胞的抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生成。通過ELISA測定蛋白水平，每組n = 6。 符號(hào)代表各個(gè)動(dòng)物，平均值用柱表示。數(shù)據(jù)代表至少2次獨(dú)立的試驗(yàn)。Sens二致敏前施用 的抗體，aero =每次氣霧劑攻擊前4小時(shí)施用的抗體。 圖2顯示了僅哮喘攻擊期間IL-25的中和。(A)最后一次氣霧化抗原攻擊一天后 測定OVA-致敏的小鼠的乙酰甲膽堿敏感性。合并2次試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，其表示14-18小鼠/ 組的平均值士SEM。 (*與同種型對(duì)照相比。<0.05，**與同種型對(duì)照相比。<0.01)。 (B) 肺部切片用giemsa染色，進(jìn)行血管周圍浸潤評(píng)分，每組n = 8。 (C)通過肺部切片高碘酸 Schiff(PAS)染色測定粘液含量，每組n = 8。 (D)通過用giemsa染色的細(xì)胞離心涂片器 的差別細(xì)胞計(jì)數(shù)測定BAL中嗜曙紅細(xì)胞的比例，每組n = 6。 (E)通過ELISA測定抗原特異 性血清IgE， OD讀取值通過與標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行比較轉(zhuǎn)化為任意單位，每組n = 8。 (F)來自重 剌激縱隔淋巴結(jié)細(xì)胞的抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生成。通過ELISA測定蛋白水平，每組n = 6。 符號(hào)代表各個(gè)動(dòng)物，平均值用柱表示。數(shù)據(jù)代表至少2次獨(dú)立的試驗(yàn)。Sens二致敏前施用 的抗體，aero =每次氣霧劑攻擊前4小時(shí)施用的抗體。 圖3顯示了首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠的rmlL-25施用。向野生型(A) 、 ill3—y—(B)或 i14—i15—i19—i113—(C)小鼠鼻內(nèi)施用1. 8ii g rIL-25或PBS。在攻擊后16小時(shí)測定乙 酰甲膽堿敏感性。*與同種型對(duì)照相比P < 0. 05，**與同種型對(duì)照相比p < 0. Ol，n = 4-8/ 組。數(shù)據(jù)代表至少2次獨(dú)立的試驗(yàn)。
序列 本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件參考下述序列鑒別號(hào)在本文中進(jìn)一步描述SEQIDNO. 12C3VH編碼核苷酸序列SEQIDNO. 22C3VH氨基酸序列SEQIDNO. 32C3VL編碼核苷酸序列SEQIDNO. 42C3VL氨基酸序列SEQIDNO. 52C3VH CDR1氨基酸序列SEQIDNO. 62C3VH CDR2氨基酸序列SEQIDNO. 72C3VH CDR3氨基酸序列SEQIDNO. 82C3VL CDR1氨基酸序列SEQ IDNO. 92C3VL CDR2氨基酸序列SEQIDNO. 102C3VL CDR3氨基酸序列 其他序列在所附的序列表中列出。
發(fā)明詳述
耙標(biāo)結(jié)合元件 此處描述了分子對(duì)的元件，所述分子對(duì)之間互相具有結(jié)合特異性。該特異性結(jié)合 對(duì)的元件可為天然來源的或全部或部分人工合成產(chǎn)生的。所述分子對(duì)的一個(gè)元件在其表面 具有區(qū)域，或空腔，其特異性的結(jié)合所述分子對(duì)另一元件的特定空間和極性結(jié)構(gòu)并因此與 之互補(bǔ)。因此，所述對(duì)的元件具有互相特異性結(jié)合的性質(zhì)。特異性結(jié)合對(duì)的類型的例子有抗原_抗體、生物素_抗生物素蛋白、激素_激素受體、受體_配體、酶_底物。 本申請(qǐng)與抗原-抗體類反應(yīng)有關(guān)，因此，本申請(qǐng)的靶標(biāo)結(jié)合元件將包括至少部分
的抗體分子，更具體為至少部分的所述分子的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 —般而言，抗體的重鏈可變區(qū)(VH結(jié)構(gòu)域)在抗體與抗原的結(jié)合中起重要作用。已 發(fā)現(xiàn)VH結(jié)構(gòu)域的CDR3區(qū)比CDR1和CDR2區(qū)更為多變，因此在大多數(shù)抗體中具有對(duì)所述抗 體靶標(biāo)的特異性。因此，本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件基于2C3抗體的VH CDR3區(qū)。本發(fā)明的靶 標(biāo)結(jié)合元件更優(yōu)選包括2C3抗體VH區(qū)的所有三個(gè)CDR。 包含CDR的本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件的結(jié)構(gòu)通常具有抗體分子的重鏈或輕鏈序列或 其基本部分，其中所述CDR位于相應(yīng)于重排(rearranged)免疫球蛋白基因編碼的天然存 在的VH和VL抗體可變結(jié)構(gòu)域的CDR的位置。免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置可參 照Kabat，E. A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest.第四片反.US D印artment of Health and Human Services. 1987，及其更新版本而確定。許多學(xué)術(shù)和商用 在線資源可用于查找該數(shù)據(jù)庫。例如，參見Martin，A.C.R. Accessing the Kabat Antibody Sequence Database byComputer PROTEINS :Structure， Function and Genetics, 25(1996) ， 130-133以及相關(guān)的在線資源，當(dāng)前的網(wǎng)址為http:〃www. bioinf. org. uk/abs/ simkab. html 。 —般而言，耙標(biāo)結(jié)合元件包括與VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)的VH結(jié)構(gòu)域，以提供抗體的抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域，盡管如下文所討論的，單獨(dú)的VH結(jié)構(gòu)域也可用于結(jié)合抗原。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方案中，所述2C3VH結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO. 2)與2C3VL結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO. 4)配對(duì)，由此形成 抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，其同時(shí)包括所述2C3 VH和VL結(jié)構(gòu)域。在另外實(shí)施方案中，所述2C3 VH與2C3VL以外的VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)。 輕鏈混雜性在本領(lǐng)域是公知的，如本文中其他部分所討論。 根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可以與2C3基本類似，例如±10%，的親和性結(jié)合 IL_25。靶標(biāo)結(jié)合元件通常是對(duì)IL-25特異性的。因此所述靶標(biāo)結(jié)合元件不會(huì)對(duì)其特異性 結(jié)合伴侶以外的分子顯示任何顯著的結(jié)合。例如，已發(fā)現(xiàn)2C3抗體不與IL-4、IL-5和IL-13 交叉反應(yīng)。因此避免與哮喘和類似過程有關(guān)的其他細(xì)胞因子交叉反應(yīng)是本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合 元件所需要的特征。 通常，可通過結(jié)合測定的方法測定特異性，例如使用一套抗原的ELISA。根據(jù)本發(fā)
明的耙標(biāo)結(jié)合元件可識(shí)別IL-25，但不識(shí)別IL-17家族的其他元件，尤其是IL-17A、 IL-17B
和IL-17C中的任何一個(gè)，更優(yōu)選所有三種IL-17A、 IL-17B和IL-17C。根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)
結(jié)合元件與IL-25的結(jié)合可通過與重組IL-25競爭而消除。 可在適宜的條件下比較不同靶標(biāo)結(jié)合元件的結(jié)合親和性和中和效價(jià)。 抗體分于 這里描述了天然或部分或全部合成產(chǎn)生的免疫球蛋白。已顯示完整抗體的片段可 行使結(jié)合抗原的功能。這樣對(duì)抗體的引用還包括任何包含抗體結(jié)合片段的多肽或蛋白質(zhì)。
結(jié)合片段的實(shí)例有(i)由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和 CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii)由單個(gè)抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由VH 結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段(Ward, E. S.等，Nature 341,544-546(1989)) ; (v)分離的CDR區(qū); (vi) F (ab' ) 2片段，包含兩個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中
7VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過肽接頭連接，所述肽接頭使兩個(gè)結(jié)構(gòu)域一起形成抗原結(jié)合位點(diǎn) (Bird等，Science, 242， 423-426， 1988 ;Huston等，PNAS USA， 85， 5879-5883， 1988) ;(viii) 雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)和(ix)"雙抗體"，由基因融合構(gòu)成的多價(jià) 或多特異性片段(W094/13804 ;P. Holliger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA906444-6448, 1993)。 Fv、 scFv或雙抗體分子可通過引入連接VH和VL結(jié)構(gòu)域的二硫化物橋而穩(wěn)定 (Y. Reiter等，Nature Biotech, 14， 1239-1245， 1996)。還可制備包括與CH3結(jié)構(gòu)域連接的 scFv的Minibody(S. Hu等，Cancer Res. ，56,3055-3061， 1996)。 使用雙特異性抗體時(shí)，其可以是常規(guī)的雙特異性抗體，可通過多種途徑制備 (Holliger，P.禾P Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4， 446-449 (1993))，例如通過化 學(xué)方法或從雜交體雜交瘤制備，或可以是任一前述的雙特異性抗體片段。雙抗體和scFv可 不使用Fc區(qū)、僅使用可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)建，潛在減少了抗個(gè)體基因型反應(yīng)的影響。
與雙特異性完整抗體相反，雙特異性雙抗體也是特別有用的，因?yàn)樗鼈兛煞奖愕?構(gòu)建和在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)。具有適當(dāng)結(jié)合特異性的雙抗體(以及許多其他多 肽例如抗體片段)可使用噬菌體展示技術(shù)(W094/13804)從文庫中方便的選擇。如果所 述雙抗體的一條臂保持恒定，例如，具有針對(duì)IL-25的特異性，則可構(gòu)建另一條臂變化的 文庫，選擇適當(dāng)特異性的抗體。雙特異性完整抗體可通過knobs-into-holes工程制備 (J. B. B. Ridgeway等，Protein Eng. ， 9， 616-621， 1996)。可以獲取單克隆和其他抗體，使用 重組DNA技術(shù)產(chǎn)生保留了原始抗體特異性的其他抗體或嵌合分子。這樣的技術(shù)可包括向不 同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)引入編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)、或互補(bǔ)決定 區(qū)(CDR)的DNA。例如參見EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A_239400。
優(yōu)選地，所述CDR區(qū)被移植到人框架區(qū)。人框架區(qū)可通過多種方法選擇，例如，通 過比較小鼠框架區(qū)或小鼠V區(qū)序列與已知的人框架或V區(qū)序列，選擇氨基酸相似性或同一 性程度最高或最高之一的人框架區(qū)。對(duì)天然的人序列框架區(qū)可進(jìn)行修飾，以進(jìn)一步優(yōu)化得 到的CDR移植抗體。 雖然在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面，優(yōu)選包括一對(duì)VH和VL結(jié)構(gòu)域的抗體分子，但基 于VH或VL結(jié)構(gòu)域序列的單個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了本發(fā)明的其他方面。已知單個(gè)免疫球蛋白 結(jié)構(gòu)域，尤其是VH結(jié)構(gòu)域能以特定的方式結(jié)合靶標(biāo)抗原。 在任一單鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域的情況下，這些結(jié)構(gòu)域可用于篩選能形成可結(jié)合IL-25的 雙結(jié)構(gòu)域靶標(biāo)結(jié)合元件的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域，如下文進(jìn)一步所述。 本發(fā)明的抗體分子可進(jìn)一步包括抗體恒定區(qū)或其部分。例如，VL結(jié)構(gòu)域可在其C 末端與抗體輕鏈恒定區(qū)連接，所述恒定區(qū)包括人CK或CA鏈，優(yōu)選CA鏈。類似的，基于 VH結(jié)構(gòu)域的靶標(biāo)結(jié)合元件可在其C末端與衍生自任何抗體同種型的完整免疫球蛋白重鏈 或其部分連接，所述抗體同種型例如IgG、IgA、IgE和IgM以及任何同種型亞類，尤其是IgGl 和IgG4。優(yōu)選IgG4。也可采用W099/58572中公開的Fc區(qū)，例如Anab禾口 Anac。
因此包括與另一多肽融合的靶標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其等價(jià)物的嵌合分子。嵌合抗體的 克隆與表達(dá)描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023中。 本發(fā)明抗體分子的框架區(qū)還可包括糖基化序列，其包括一個(gè)或更多個(gè)糖基化位 點(diǎn)。糖基化模式可依賴于耙標(biāo)結(jié)合元件表達(dá)的宿主細(xì)胞而不同。因此，編碼糖基化位點(diǎn)的 核酸構(gòu)建體可進(jìn)行修飾以除去所述位點(diǎn)或可在蛋白內(nèi)引入此類位點(diǎn)。例如，真核蛋白中的N-糖基化位點(diǎn)特征為氨基酸三聯(lián)體Asn-X-Y，其中X是除Pro外的任何氨基酸，Y是Ser或 Thr。對(duì)編碼所述三聯(lián)體的核苷酸序列的適當(dāng)取代、添加或缺失可預(yù)防Asn側(cè)鏈上附著糖殘 基。選擇改變單個(gè)核苷酸，使得Asn被不同的氨基酸替換，例如足以滅活N-糖基化位點(diǎn)。滅 活蛋白質(zhì)中N-糖基化位點(diǎn)的已知方法包括美國專利號(hào)5，071，972和EP 276,846中描述的 那些。 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域 此處描述了抗體分子的一部分，其包括與抗原的部分或全部特異性結(jié)合并與之互 補(bǔ)的區(qū)域。在抗原較大的情況下，抗體可能僅與該抗原的特定部分結(jié)合，該部分稱為表位。 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可通過一個(gè)或更多個(gè)抗體可變結(jié)構(gòu)域提供(例如由VH結(jié)構(gòu)域組成的所謂 的Fd抗體片段)。優(yōu)選地，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括至少抗體輕鏈可變區(qū)(VL)的基本部分和至 少抗體重鏈可變區(qū)(VH)的基本部分。 免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的基本部分包括至少三個(gè)CDR區(qū)以及其間插入的框架區(qū)。 優(yōu)選地，該部分還包括至少50%第一和第四框架區(qū)之一或兩者，所述50%為第一框架區(qū)的 C末端50%和第四框架區(qū)的N末端50% 。所述可變結(jié)構(gòu)域基本部分的N末端或C末端其他 殘基可以是與天然存在的可變結(jié)構(gòu)域區(qū)非通常相關(guān)的那些。例如，通過重組DNA技術(shù)制備 的本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件構(gòu)建可引入引入的接頭編碼的N或C末端殘基以利于克隆或其他 操作步驟。其他操作步驟包括引入接頭以連接本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域和其他蛋白序列，其包 括免疫球蛋白重鏈、其他可變結(jié)構(gòu)域(例如在制備雙抗體中)或蛋白標(biāo)簽，如下文更詳細(xì)討 論的。 包括 其通常以包含的意義使用，即允許一個(gè)或更多特征或成分的存在。
分離的 其是指根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件或編碼所述結(jié)合元件的核酸通常存在的 狀態(tài)。元件和核酸不含或基本不含其天然相關(guān)的物質(zhì)，例如在其天然環(huán)境或當(dāng)在體外或體 內(nèi)通過重組DNA技術(shù)制備時(shí)在其制備環(huán)境中(例如細(xì)胞培養(yǎng)物)中與其一起發(fā)現(xiàn)的其他多 肽或核酸。 靶標(biāo)結(jié)合元件和核酸可與稀釋劑或佐劑一起配制，為了實(shí)踐目的仍然是分離 的——例如所述元件如果用于在免疫測定中包被微量滴定板時(shí)通常與明膠或其他載體混 合；或當(dāng)用于診斷或治療時(shí)與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑混合。靶標(biāo)結(jié)合元件可以天然 被糖基化或通過異源真核細(xì)胞(例如CH0或NS0(ECACC 85110503)細(xì)胞)糖基化，或者其 可以是(例如通過在原核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生時(shí))未糖基化的。
耙標(biāo)結(jié)合元件的其他特征 除了抗體序列外，根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可包括其他氨基酸，例如形成肽或 多肽諸如折疊結(jié)構(gòu)域，或使該分子具有除結(jié)合抗原的能力外的其他功能性特征。本發(fā)明的 靶標(biāo)結(jié)合元件可攜帶可檢測的標(biāo)記，或可與毒素或酶綴合(例如通過肽基鍵或接頭)。
可檢測的標(biāo)記包括放射性標(biāo)記，例如1311或"Tc，其可使用抗體成像領(lǐng)域中已知的 常規(guī)化學(xué)方法與本發(fā)明的抗體連接。標(biāo)記還可包括酶標(biāo)記，例如辣根過氧化物酶。標(biāo)記還 可包括化學(xué)部分，例如生物素，其可通過與特異性同源檢測部分例如標(biāo)記的抗生物素蛋白 結(jié)合進(jìn)行檢測。
在所述其他特征是多肽結(jié)構(gòu)域或標(biāo)記的情況下，所述靶標(biāo)結(jié)合元件可通過重組技 術(shù)產(chǎn)生，即通過表達(dá)編碼所述靶標(biāo)結(jié)合元件和其他結(jié)構(gòu)域的融合物的核酸產(chǎn)生。
本發(fā)明的其他靶標(biāo)結(jié)合元件
序列變體 本文列出了其序列的VH和VL結(jié)構(gòu)域和CDR的，并且可用于IL-25的靶標(biāo)結(jié)合元 件的變體可通過序列改變或突變和篩選的方法獲得。本發(fā)明同樣提供了此類方法。
根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件也可以與任何靶標(biāo)結(jié)合元件競爭結(jié)合抗原，所述任何 靶標(biāo)結(jié)合元件結(jié)合抗原并包括本文中公開的靶標(biāo)結(jié)合元件，VH和/或VL結(jié)構(gòu)域，或2C3的 VH CDR3，或任何序列基本上如本文中所列出的這些的變體。因此，本發(fā)明的另一方面提供 了包含人抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的靶標(biāo)結(jié)合元件，其與2C3競爭結(jié)合IL-25。結(jié)合元件間的競 爭可在體外方便地測定，例如采用ELISA和/或通過向一個(gè)結(jié)合元件標(biāo)記特定的報(bào)告分子， 其可在其他未標(biāo)記結(jié)合元件存在下檢測，進(jìn)而能鑒定結(jié)合同一表位或重疊表位的靶標(biāo)結(jié)合 元件。 本領(lǐng)域中有多種方法可用于獲得針對(duì)IL-25的靶標(biāo)結(jié)合元件，其可與2C3競爭結(jié) 合IL-25。 根據(jù)本發(fā)明，可使用其序列在本文中具體公開的任何VH和VL結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu) 域氨基酸序列變體，如前面所討論的。具體的變體可包括一個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列的改變 (添加、缺失、取代和/或插入氨基酸殘基)，可能低于約20個(gè)改變、低于約15個(gè)改變、低于 約10個(gè)改變或低于約5個(gè)改變、4、3、2或1個(gè)改變。改變可在一個(gè)或更多個(gè)框架區(qū)和/或 一個(gè)或更多個(gè)CDR中進(jìn)行。 —方面，基本上如本文所示的CDR氨基酸序列是人可變結(jié)構(gòu)域的CDR或其基本部 分?；旧先绫疚乃镜腣H CDR3序列代表了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選地，每一所述序 列為人重鏈可變結(jié)構(gòu)域的VH CDR3或其基本部分。"基本上如......所示"表示本發(fā)明有關(guān)的CDR或VH或VL結(jié)構(gòu)域與其序列在本
文中所示的特定區(qū)域相同或高度相似。"高度相似"理解為在CDR和/或VH或VL結(jié)構(gòu)域中 可進(jìn)行1至5、優(yōu)選1至4，例如1至3或1或2，或3或4個(gè)氨基酸的取代。
本發(fā)明耙標(biāo)結(jié)合元件的序列變體可通過2C3 VH和/或VL基因之一或兩者的隨機(jī) 誘變?cè)谡麄€(gè)可變結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生突變產(chǎn)生。這樣的技術(shù)由Gram等人描述(1992，Proc. Natl. Acad. Sci. ， USA， 89 :3576-3580)，其使用了易錯(cuò)PCR。 另一種可使用的方法是VH或VL基因CDR區(qū)的定向誘變。此類技術(shù)由Barbas等人 (1994， Proc. Natl. Acad. Sci. ， USA， 91 :3809-3813)和Schier等人(1996， J. Mol. Biol. 263 : 551-567)所公開。 所有上述技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，其本身不構(gòu)成本發(fā)明的一部分。本領(lǐng)域技術(shù)
人員能使用此類技術(shù)通過本領(lǐng)域常規(guī)方法提供本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件。 因此，另一方面本發(fā)明提供了一種獲得針對(duì)IL-25抗體的方法，其包括 提供編碼靶標(biāo)結(jié)合元件的起始核酸，其具有一種或更多種SEQ IDN0:2或SEQ ID
NO :4的CDR序列； 修飾所述核酸，改變所述CDR序列；
表達(dá)所述修飾的靶標(biāo)結(jié)合元件；以及
10
測試所述修飾的靶標(biāo)結(jié)合元件與IL-25的結(jié)合。 優(yōu)選地，所述修飾可在復(fù)數(shù)種起始核酸分子上進(jìn)行，以提供具有不同結(jié)合親和性 的修飾的序列庫。 —方面，所述起始核酸包括SEQ ID NO :2的所有三種重鏈CDR，其以SEQ ID NO :2 本身的形式或在其他框架序列中的形式存在。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述修飾可針對(duì)單種CDR，例如CDR3，或所述修飾可同時(shí)針對(duì) 兩種或三種CDR區(qū)。 某于CDR3靶標(biāo)結(jié)合元件的牛產(chǎn) 本發(fā)明中采用的可變結(jié)構(gòu)域可從任何種系或重排的人可變結(jié)構(gòu)域獲得，或可以是 基于已知的人可變結(jié)構(gòu)域共有序列的合成可變結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的CDR序列(例如CDR3)可 通過重組DNA技術(shù)引入缺乏CDR(特別是CDR3)的可變結(jié)構(gòu)域庫。 例如，Marks等人(Bio/Technology， 1992， 10 :779-783)描述了生產(chǎn)抗體可變結(jié)構(gòu) 域庫的方法，其中使用針對(duì)可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域5'端或鄰近的通用引物和針對(duì)人VH基因第三 框架區(qū)的通用引物，以提供缺乏CDR3的VH可變結(jié)構(gòu)域庫(r印ertoire) 。 Marks等人還描 述了該庫如何與特定抗體的CDR3組合。使用類似的技術(shù)，本發(fā)明的CDR3衍生的序列可與 缺乏CDR3的VH或VL結(jié)構(gòu)域庫改組(shuffle)，改組的完整VH或VL結(jié)構(gòu)域與同源的VL或 VH結(jié)構(gòu)域組合以提供本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件。所述庫可隨后在適宜的宿主系統(tǒng)中展示，例 如W092/01047的噬菌體展示系統(tǒng)，由此選擇適宜的耙標(biāo)結(jié)合元件。庫可由超過104個(gè)元件 組成，例如106至108或101Q個(gè)元件。 類似的改組或組合技術(shù)同樣由Stemmer公開(Nature, 1994,370 :389-391)，其描 述了與內(nèi)酰胺酶基因相關(guān)的技術(shù)，但發(fā)現(xiàn)所述方法可用于產(chǎn)生抗體。
因此，本發(fā)明另一方面提供了一種制備對(duì)IL-25特異性的靶標(biāo)結(jié)合元件的方法， 該方法包括 (a)提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸起始庫，所述核酸包括將被替換的CDR3或缺乏 CDR3編碼區(qū)； (b)使所述庫與編碼基本上如本文所示VH CDR3的氨基酸序列的供體核酸組合，
這樣所述供體核酸插入到上述庫的CDR3區(qū)，從而提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸產(chǎn)物庫； (c)表達(dá)所述產(chǎn)物庫的核酸； (d)選擇對(duì)IL-25特異性的靶標(biāo)結(jié)合元件；并且 (e)回收所述靶標(biāo)結(jié)合元件或編碼其的核酸。 所述產(chǎn)物庫可從相同載體或不同載體中與VL結(jié)構(gòu)域共表達(dá)。該VL結(jié)構(gòu)域可以是 本發(fā)明的VL結(jié)構(gòu)域，或可以是一種或更多種如下文所述與鏈改組有關(guān)的不同VL結(jié)構(gòu)域。
可采用類似的方法，其中本發(fā)明的VL CDR3與編碼VL結(jié)構(gòu)域的核酸庫組合，所述 核酸包括將被替換的CDR3或缺失CDR3編碼區(qū)。使用前述方法，該VL產(chǎn)物庫可從相同載體 或不同載體中與VH結(jié)構(gòu)域共表達(dá)。該VH結(jié)構(gòu)域可以是本發(fā)明的VH結(jié)構(gòu)域，或可以是一種 或更多種如下文所述與鏈改組有關(guān)的不同VH結(jié)構(gòu)域。 類似地， 一種或更多種，或所有三種CDR均可被移植到VH或VL結(jié)構(gòu)域的庫中，隨 后篩選該庫中對(duì)IL-25特異性的靶標(biāo)結(jié)合元件。 通過這種方式獲得的靶標(biāo)結(jié)合元件構(gòu)成了本發(fā)明的另 一個(gè)方面。
鏈改組 本發(fā)明的另一方面提供了獲得針對(duì)IL-25的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，該方 法包括使本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件的VH結(jié)構(gòu)域(包括前述討論的變體)與一種或更多種VL 結(jié)構(gòu)域組合，以及測試所述VH/VL組合的針對(duì)IL-25的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
所述VL結(jié)構(gòu)域可具有基本上如本文所列出的氨基酸序列。 可采用類似的方法，其中將本文中公開的VL結(jié)構(gòu)域的一種或更多種序列變體與 一種或更多種VH結(jié)構(gòu)域組合。 這可以通過噬菌體展示篩選方法完成、使用如W092/01047中公開的所謂的等級(jí) 二元組合方法(hierarchical dual combinatorialapproach)，其中使用含有H或L鏈克隆 的單個(gè)菌落感染編碼另一條鏈(L或H)的完整克隆庫，根據(jù)例如該參考文獻(xiàn)中描述的那些 的噬菌體展示技術(shù)選擇得到的雙鏈靶標(biāo)結(jié)合元件。 因此，本發(fā)明提供了選擇針對(duì)IL-25抗體分子的方法，該方法包括 (a)提供包括靶標(biāo)結(jié)合元件的VH結(jié)構(gòu)域，所述靶標(biāo)結(jié)合元件結(jié)合IL-25并且包括
抗體VH結(jié)構(gòu)域，所述抗體VH結(jié)構(gòu)域包含具有SEQID NO. 7氨基酸序列的VH CDR3 ; (b)使所述VH結(jié)構(gòu)域與復(fù)數(shù)種抗體VL結(jié)構(gòu)域組合，獲得抗體分子； (c)篩選所述抗體分子與IL-25的結(jié)合；并且 (d)選擇與IL-25結(jié)合的抗體分子。 所述VH和VL結(jié)構(gòu)域可以以通過重組DNA、尤其是通過噬菌體或噬菌粒DNA表達(dá)的 蛋白的形式提供。 所述復(fù)數(shù)種VL結(jié)構(gòu)域可由超過104種各個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，例如106至108或101Q種 結(jié)構(gòu)域。 抗體分子和編碼這些分子的核酸可構(gòu)成本發(fā)明的另一方面。IL-25
11-25，在本領(lǐng)域中同樣指IL-17E，可從商業(yè)來源獲得(例如R&DSystems， MN， USA)，或可參考本領(lǐng)域中已有的IL-25序列克隆或合成。Hurst等人，2002 (下文參考文獻(xiàn) 7)描述了鼠IL-25 (NCBI蛋白NP_542767) 。 Fort等人描述了人IL_25(NCBI蛋白Q9H293) (下文參考文獻(xiàn)4)。為生產(chǎn)抗體或在免疫測定中使用，可使用重組IL-25的片段，尤其 是N末端截短的那些。例如，可商業(yè)獲得的重組人IL-25 (IL-17E)包括登記號(hào)Q9H293的 Tyr33-Gly177成熟蛋白序列，可商業(yè)獲得的鼠IL-25包括小鼠IL_17E(登記號(hào)NP_542767) 的殘基Vall7-Alal69。
核酸和載體 在其他方面，本發(fā)明提供了分離的核酸，其包括編碼根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件、 VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域的序列；本發(fā)明還提供了制備本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件、VH結(jié)構(gòu)域或 VL結(jié)構(gòu)域的方法，其包括在條件下表達(dá)所述核酸，生產(chǎn)所述靶標(biāo)結(jié)合元件、VH結(jié)構(gòu)域或VL 結(jié)構(gòu)域，以及回收上述物質(zhì)。 本發(fā)明的另一方面提供了通常分離的核酸，其編碼本文中公開的VH CDR或VL CDR 序列，尤其是選自SEQ ID NOs :5、6和7的VHCDR，選自SEQ ID NOs :8、9禾P 10的VL CDR，最 優(yōu)選2C3 VHCDR3 (SEQ ID NO. 7)。 本發(fā)明的核酸可包括SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :3的序列或其相關(guān)部分(例如 CDR編碼區(qū))。然而，密碼子使用可以不同，例如為在所需要的宿主細(xì)胞中優(yōu)化所述序列的表達(dá)。 本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件的分離的核酸。核酸包括DNA和RNA。 在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了編碼如前文所定義的本發(fā)明CDR或VH或VL結(jié)構(gòu)域的核酸。 根據(jù)本發(fā)明的核酸可包括DNA或RNA，可以是完全或部分合成的。除非上下文中另 外要求，本文中列出的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA，也包括具有指定序列的RNA， 其中用U代替T。 本發(fā)明還提供了載體，例如以質(zhì)粒、病毒，例如噬菌體、或噬菌粒、粘粒、轉(zhuǎn)錄或表 達(dá)盒的形式，其包括至少一種上述核酸。 可選擇或構(gòu)建適宜的載體，包含適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列，包括啟動(dòng)子序列，終止子序 列，多腺苷酸序列，增強(qiáng)子序列，標(biāo)記基因和其他適宜的序列。更多詳細(xì)情況參見例如 Molecular Cloning :a LaboratoryMa皿al : 第二片反，Sambrook等，1989， Cold Spring Harbor LaboratoryPress。 本發(fā)明的載體還包括能在體內(nèi)感染人細(xì)胞的病毒載體，例如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒 或腺相關(guān)病毒載體。此類載體可用于在人或動(dòng)物受試者細(xì)胞內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元 件，以生產(chǎn)和向所述受試者遞送該靶標(biāo)結(jié)合元件。 編碼本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件的核酸序列在一個(gè)方面可操作地與啟動(dòng)子連接，以在宿 主細(xì)胞中表達(dá)該靶標(biāo)結(jié)合元件。所述序列可在5'端包括先導(dǎo)序列以促進(jìn)靶標(biāo)結(jié)合元件在 宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和/或從宿主細(xì)胞分泌。本領(lǐng)域已知多種適宜的先導(dǎo)序列，可由本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員根據(jù)宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。 許多用于操作核酸的已知技術(shù)和方法，例如制備核酸構(gòu)建體、誘變、測序、將DNA 引入細(xì)胞和基因表達(dá)，以及蛋白分析，詳細(xì)描述于Current Protocols in Molecular Biology,第二版，Ausubel等eds. ， John Wiley & Sons，1992中。Sambrook等人和Ausubel 等人的公開通過援弓I并入本文。
宿主細(xì)胞和靶標(biāo)結(jié)合元件的產(chǎn)生 另一方面提供了用本發(fā)明核酸(例如以載體形式的核酸序列)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸被整合至宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)中。 按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可通過包含促進(jìn)與基因組重組的序列促進(jìn)所述整合。 另一方面提供了生產(chǎn)本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件的方法，該方法包括引發(fā)編碼核酸的表
達(dá)。這樣的方法可包括在用于生產(chǎn)所述靶標(biāo)結(jié)合元件的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。 通過表達(dá)生產(chǎn)后，VH或VL結(jié)構(gòu)域或靶標(biāo)結(jié)合元件可使用任何適宜的技術(shù)分離和/
或純化，隨后適當(dāng)時(shí)使用。生產(chǎn)的方法可包括分離和/或純化所述產(chǎn)品的步驟。 純化產(chǎn)品后，所述靶標(biāo)結(jié)合元件可通過物理或化學(xué)方法修飾，例如引入改變、例如
增加所述蛋白穩(wěn)定性或生物半衰期的保護(hù)基團(tuán)。例如，PEG化蛋白以獲得所述效果在本領(lǐng)
域是已知的，本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可以是PEG化的形式。 制備方法可包括將產(chǎn)品制成組合物，其包括至少一種附加成分，例如藥學(xué)上可接 受的賦形劑。 本發(fā)明還提供了重組宿主細(xì)胞，其包括一種或更多種上述核酸或載體。所提供的 編碼任何CDR、 VH或VL結(jié)構(gòu)域或靶標(biāo)結(jié)合元件的核酸本身構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)方面，包括
13從其編碼核酸表達(dá)的生產(chǎn)所述編碼的產(chǎn)物的方法也是如此。 在多種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是公知的。適宜的宿主細(xì)胞包括細(xì) 菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和桿狀病毒系統(tǒng)。本領(lǐng)域中可獲得的用于表達(dá)異源性多肽的哺乳動(dòng) 物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼侖鼠腎細(xì)胞、NS0小鼠黑色素瘤細(xì)胞、YB2/0 大鼠骨髓瘤細(xì)胞和多種其他細(xì)胞。通常優(yōu)選的細(xì)菌宿主是大腸桿菌。 抗體和抗體片段在原核細(xì)胞例如大腸桿菌中的表達(dá)在本領(lǐng)域已非常成熟。綜述 例如參見Pliickthun， A. Bio/Technology 9:545-551(1991)。作為生產(chǎn)耙標(biāo)結(jié)合元件的一 種選擇，在培養(yǎng)物中的真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)也是本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的。最近的綜述例如參見 Ref，M. E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4 :573-576 ;Trill J.J.等(1995) Curr. Opinion Biotech 6 :553-560。
組合物 因此，根據(jù)本發(fā)明，以及用于根據(jù)本發(fā)明的用途，的藥物組合物除活性成分外，可 包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的物質(zhì)。這 些物質(zhì)必須是無毒的，并且不應(yīng)干擾所述活性成分的功效。載體或其他物質(zhì)的精確性質(zhì)將 依賴于施用的途徑，其可以口服或注射，例如靜脈內(nèi)注射。 靶標(biāo)結(jié)合元件的治療劑可通過將所需純度的靶標(biāo)結(jié)合元件與任選生理上可 接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合制備成凍干粉或水溶液的形式用于儲(chǔ)存(參見例如 "Remington :The Science and Practice ofPharmacy ，，， 20片反，2000， pub丄ippincott， Williams & Wilkins.)?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所用的劑量和濃度下對(duì)接受者 是無毒的，包括緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽，以及其他有機(jī)酸；包括抗壞血酸的抗氧化 劑；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水 聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸； 單糖、二糖和其他糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA;糖醇，例如甘露醇 或山梨醇；成鹽平衡離子例如鈉；和/或非離子表面活性劑，例如吐溫(Tween)、普郎尼克
(Pluronics)或聚乙二醇(PEG)。 用于體內(nèi)施用的靶標(biāo)結(jié)合元件必須是無菌的。這可以在凍干和重構(gòu)前后用無菌過
濾膜過濾方便的完成。所述靶標(biāo)結(jié)合元件通常以凍干形式或溶液存儲(chǔ)。 用于口服施用的藥物組合物可以是片劑、膠囊、粉末或液體形式。片劑可包括固相
載體，例如明膠或佐劑。液體藥物組合物通常包括液相載體，例如水、石油、動(dòng)物或植物油、 礦物油或合成油。也可包括生理鹽水溶液、右旋糖或其他糖溶液，或二醇類，例如乙二醇、丙 二醇或聚乙二醇。 對(duì)于靜脈內(nèi)注射，或在痛苦(affliction)位點(diǎn)的注射來說，活性成分可以是腸胃 外可接受的水溶液形式，其是無熱原的，并且具有適宜的pH、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可使用例如等滲載體例如氯化鈉注射液、林格(Ringer' s)注射液、乳酸林格注射液制 備適宜的溶液。如果需要，可加入防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。
本發(fā)明的治療用途 本發(fā)明首次提供了針對(duì)IL-25的抗體能有效體內(nèi)預(yù)防或降低氣道高反應(yīng)性(哮喘 的主要癥狀)的證明。因此，一方面本發(fā)明提供了一種預(yù)防或降低需要治療的受試者(例 如人)的氣道高反應(yīng)性的方法，其包括向所述受試者施用與IL-25結(jié)合的靶標(biāo)結(jié)合元件，尤
14其是抗體分子。另一方面本發(fā)明提供了一種預(yù)防、降低或治療需要治療的受試者中哮喘的 方法，其包括向所述受試者施用與IL-25結(jié)合的靶標(biāo)結(jié)合元件，尤其是抗體分子。
上述方法可采用本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件(包括其組合物)，其能有效結(jié)合，并優(yōu)選 拮抗IL-25的作用，在多種IL-25起作用的疾病和病癥中具有治療潛能。所述方法也可采 用其他與IL-25結(jié)合的靶標(biāo)結(jié)合元件(包括其組合物)，其可如下文所附實(shí)施例所述獲得。
根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件(包括其組合物)可用于人或動(dòng)物受試者的治療(包 括預(yù)防性治療)或診斷方法中。所述治療或診斷方法(其可包括預(yù)防性治療)可包括向所 述受試者施用有效量的本發(fā)明靶標(biāo)結(jié)合元件。示范性的疾病和病癥在下文進(jìn)一步討論。
還提供了本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件(包括其組合物)在制備用于向人或動(dòng)物受試者 施用的藥劑中的用途。 抗IL-25靶標(biāo)結(jié)合元件可用于提供治療益處的臨床適應(yīng)癥包括任何IL-25具有病 理學(xué)后果的狀況。因此，通常本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可用于治療與不必要的Th-2應(yīng)答相關(guān) 的任何狀況。例如，本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可用于治療過敏和哮喘，尤其是哮喘。
抗IL-25治療可通過注射(例如靜脈內(nèi))或局部遞送方法給予?？笽L-25可通過 基因介導(dǎo)的技術(shù)遞送。備選的制劑策略可提供適于口服或栓劑途徑的制劑。施用的途徑取 決于治療的理化性質(zhì)和疾病的特殊考慮，以優(yōu)化功效或最小化副作用。
根據(jù)本發(fā)明，可向個(gè)體施用組合物。優(yōu)選以"治療有效量"施用，其足以顯示對(duì)患 者的益處。所述益處可至少為至少一種癥狀的改善。施用的實(shí)際量，以及施用率和時(shí)間過 程將取決于所治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重性。治療處方，例如關(guān)于劑量等的決定在普通從業(yè)醫(yī) 師和其他醫(yī)生的職責(zé)范圍內(nèi)?？贵w的適宜劑量在本領(lǐng)域是公知的，參見Lederma皿J.A.等， (1991)Int. J. Cancer 47 :659-664 ;Bagshawe K. D.等，(1991)Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4 :915—922。 精確的劑量依賴于多種因素，包括該抗體用于診斷還是治療，所治療區(qū)域的尺寸
和位置，所述抗體的精確性質(zhì)(例如全抗體、片段或雙抗體)，以及任何可檢測標(biāo)記或其他
與抗體連接的分子的性質(zhì)。典型的抗體劑量范圍為0.5mg-1.0g，可通過靜脈推注施用。其
他施用模式包括數(shù)小時(shí)內(nèi)的靜脈內(nèi)輸注以獲得類似的總累積劑量。這是對(duì)于成年患者的單
次治療劑量，對(duì)于兒童和嬰兒可按比例調(diào)節(jié)，對(duì)于其他抗體形式也可按分子量比例調(diào)節(jié)?？?br> 按每日一次、每周兩次、每周一次或每月一次的間隔重復(fù)治療，由醫(yī)師判定。 另一種給藥模式采用預(yù)涂布或整合入內(nèi)在的(indwelling)裝置，其抗體的最佳
量通過適當(dāng)試驗(yàn)確定。 在本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體分子是單體的片段，例如F(ab)或scFv。
此類抗體片段可具有半衰期相對(duì)較短、血小板活化風(fēng)險(xiǎn)(其可由受體群集引起)較低的優(yōu)
點(diǎn)。導(dǎo)致血小板活化的群集例如可為IL-25分子的或IL-25與Fc y RII分子的。 如果使用全抗體，優(yōu)選以不能活化和/或破壞血小板的形式使用。優(yōu)選使用IgG4
同種型或衍生自IgGl骨架的"設(shè)計(jì)者"同種型(新的Fc基因構(gòu)建體，W099/58572， Clark，
Armour，Williamson)?？墒褂幂^小的抗體片段，例如F(ab') 2。此外，可使用具有雙表位特
異性(例如由scFv2C3識(shí)別的表位)的全抗體或片段(例如F(ab')2或雙抗體)。盡管這
樣的實(shí)施方案可促進(jìn)受體群集，與各個(gè)受體的高締合速率可排除這一問題。 本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件通常以藥物組合物的形式施用，其可包括除靶標(biāo)結(jié)合元件外的至少一種成分。 依賴于所治療的狀況，本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可單獨(dú)或與其他治療同時(shí)或順序組 合施用。其他治療可包括施用適當(dāng)劑量的鎮(zhèn)痛藥物，例如非甾體抗炎藥(例如阿司匹林、醋 氨酚(paracetamol)、布洛芬或酮洛芬)或麻醉劑例如嗎啡，施用抗催吐藥，或施用至少另 一種對(duì)哮喘有活性的化合物，通常為支氣管擴(kuò)張劑，其導(dǎo)致氣道舒張或增強(qiáng)粘液清除，例如 P激動(dòng)劑(例如沙丁胺醇、沙美特羅)，色甘酸二鈉、類固醇或PDEIV抑制劑。
測定方法 本發(fā)明提供了一種包括引發(fā)或允許本文中所提供的靶標(biāo)結(jié)合元件與IL-25結(jié)合 的方法。如前所述，該結(jié)合可以在體內(nèi)發(fā)生，例如在施用靶標(biāo)結(jié)合元件、或編碼靶標(biāo)結(jié)合元 件的核酸后發(fā)生結(jié)合，或者在體外發(fā)生，例如在ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉 淀或親和色譜中。 可測定靶標(biāo)結(jié)合元件與IL-25的結(jié)合量。定量可以是關(guān)于測試樣品中抗原的量， 其可能是診斷相關(guān)的。 抗體對(duì)樣品的反應(yīng)性可通過任何適宜的方法測定。放射免疫測定(RIA)是一種可 能的選擇。放射性標(biāo)記的抗原與未標(biāo)記的抗原(測試樣品)混合，與所述抗體結(jié)合。從未 結(jié)合抗原中物理分離結(jié)合的抗原，測定與抗體結(jié)合的放射性抗原的量。測試樣品中存在的 抗原越多，與抗體結(jié)合的放射性抗原越少。競爭性結(jié)合測定也可使用非放射性抗原，其使用 與報(bào)告分子連接的抗原或類似物。所述報(bào)告分子可以是熒光染料、磷光劑或激光染料，其具 有光譜分離的吸收或發(fā)射特性。適宜的熒光染料包括熒光素、若丹明、藻紅蛋白和得克薩斯 紅。適宜的發(fā)色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。 其他報(bào)告物包括大分子膠粒或顆粒物例如乳膠珠，其為染色的、磁性或順磁性的； 能直接或間接引起可檢測信號(hào)用于視覺觀察、電子檢測或其他記錄的生物或化學(xué)活性劑。 例如，這些分子可以是酶類，其催化產(chǎn)生或改變顏色、或引起電性質(zhì)變化的反應(yīng)。它們可以 是分子可激發(fā)的，這樣不同能級(jí)之間的電子躍遷導(dǎo)致特征性光譜吸收或發(fā)射。它們也可以 包括與生物傳感器聯(lián)用的化學(xué)實(shí)體?？墒褂蒙锼?抗生物素蛋白或生物素/鏈霉抗生物 素蛋白和堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)。 各個(gè)抗體_報(bào)告物綴合物產(chǎn)生的信號(hào)可用于衍生樣品(標(biāo)準(zhǔn)和試驗(yàn))中結(jié)合的相 關(guān)抗體的可定量絕對(duì)或相對(duì)數(shù)據(jù)。 本發(fā)明還提供了上述靶標(biāo)結(jié)合元件在競爭性測定中測定抗原水平中的用途，即通 過在競爭性測定中應(yīng)用本發(fā)明提供的靶標(biāo)結(jié)合元件測定樣品中抗原水平的方法。這可以是 不需要結(jié)合與未結(jié)合抗原物理分離的情況。連接報(bào)告分子和靶標(biāo)結(jié)合元件，使得結(jié)合時(shí)發(fā) 生物理或視覺變化是一種可能。報(bào)告分子可直接或間接產(chǎn)生可檢測的、優(yōu)選可測量的信號(hào)。 報(bào)告分子的連接可直接或間接，共價(jià)(例如通過肽鍵)或非共價(jià)。通過肽鍵的連接可以是 編碼抗體和報(bào)告分子的基因融合物重組表達(dá)的結(jié)果。 本發(fā)明還通過例如在生物傳感器系統(tǒng)中使用根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件直接測 定抗原水平。 測定結(jié)合的模式不是本發(fā)明的特征，本領(lǐng)域技術(shù)人員能根據(jù)其偏好和常識(shí)選擇適 宜的模式。 本發(fā)明還擴(kuò)展至與任何靶標(biāo)結(jié)合元件競爭結(jié)合IL-25的靶標(biāo)結(jié)合元件，所述任何靶標(biāo)結(jié)合元件結(jié)合抗原并且包含包括CDR的V結(jié)構(gòu)域，所述CDR具有基本上如本文所示氨 基酸，或包含具有基本上如本文所示的氨基酸序列的V結(jié)構(gòu)域。結(jié)合元件間的競爭可在體 外方便地測定，例如通過在一個(gè)結(jié)合元件上標(biāo)記特異性報(bào)告分子，其可在其他未標(biāo)記結(jié)合 元件存在下檢測，以鑒別結(jié)合同一表位或重疊表位的靶標(biāo)結(jié)合元件。競爭可使用ELISA或 流式細(xì)胞法測定。 競爭性反應(yīng)可用于選擇一種或更多種靶標(biāo)結(jié)合元件，例如2C3的衍生物，其可具 有一種或更多種額外的或改善的性質(zhì)。這類似于根據(jù)本發(fā)明的2C3選擇方法，除了 IL-25 并非從其微配體洗脫，而是從抗體分子洗脫。這是重要的，因?yàn)槠鋾?huì)產(chǎn)生直接與母體競爭的 更高比例的子代抗體。實(shí)際上如此選擇的所述子代抗體可能具有比母體更高的抗原親和性 (允許增強(qiáng)親和力，其可能是由于每個(gè)噬菌體展示超過1個(gè)抗體分子)。選擇具有改進(jìn)的親 和性的"子代"噬菌體抗體的現(xiàn)有方法包括 使用低于原始母體抗體的解離常數(shù)的(標(biāo)記)靶抗原的濃度； 使用過量未標(biāo)記的靶抗原作為競爭者，如Hawkins等人所述(1992)。然而，他們并
沒有必要地規(guī)定"改進(jìn)的"抗體必須替換/占據(jù)母體的同一表位。加入洗脫步驟可產(chǎn)生更
高比例的替換母體的子代抗體。通過這種方法選擇的子代抗體可結(jié)合與其母體抗體非常類
似的表位，但具有更高的親和性。 在競爭性測試中可使用所述抗原的肽片段，尤其是包括感興趣表位的肽?？墒褂?具有表位序列加上任一端一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽。這樣的肽可稱為"基本上由所述的指 定序列組成"。根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)結(jié)合元件可以使得其與抗原的結(jié)合被具有或包括上述序 列的肽所抑制。在該測試中，可使用具有任一序列加上一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的肽。
通過用所述肽淘選(pan)，可例如從噬菌體展示文庫中分離結(jié)合特定肽的靶標(biāo)結(jié) 合元件。
實(shí)施例 本發(fā)明的方面和實(shí)施方案現(xiàn)通過參考下述實(shí)驗(yàn)的實(shí)施例進(jìn)行說明。
實(shí)施例1 :針對(duì)IL-25抗體的產(chǎn)生 對(duì)在針對(duì)鼠IL-25 (R&D Systems)免疫的il25—y—小鼠中產(chǎn)生的一大組抗體進(jìn)行 篩選。在體外生物測定中，發(fā)現(xiàn)這些抗IL-25抗體其中之一 (2C3)能劑量依賴性地抑制 rmIL-25和可溶性mlL-25R-Fc融合蛋白的相互作用以及抑制原始小鼠非B、非T細(xì)胞的 IL-25依賴性的IL-13生成。該抗體還抑制hIL-25和可溶性hIL_25R_Fc融合物的相互作 用。這些性質(zhì)的組合進(jìn)一步在體內(nèi)系統(tǒng)中進(jìn)行了研究，以證明能有效用于治療哮喘。
實(shí)施例2 :過敏性哮喘的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?在用氣霧化OVA攻擊前，BALB/c小鼠首先用抗原卵清蛋白(OVA)致敏，致敏和攻 擊的BALB/c小鼠發(fā)展了特征性的哮喘表型。上述特征表現(xiàn)為與用PBS攻擊的對(duì)照BALB/c 小鼠相比，在暴露于剌激物乙酰甲膽堿后AHR增加、氣道嗜曙紅細(xì)胞浸潤、杯狀細(xì)胞增生和 血清IgE分泌(圖1)。 作為對(duì)比，在每次致敏和用OVA氣霧化前施用抗IL-25mAb導(dǎo)致用氣霧化的乙酰甲 膽堿攻擊后AHR的顯著消除，其具有與PBS對(duì)照小鼠相當(dāng)?shù)牡挚怪?圖1A)。施用同種型匹 配的對(duì)照mAb并沒有抑制AHR(圖1A)。
該抗IL-25mAb還顯著降低了肺部脈管系統(tǒng)周圍細(xì)胞浸潤的水平(圖1B和3A)、氣 道杯狀細(xì)胞增生(圖1C和3B)和抗原特異性血清IgE水平(圖1D)。 支氣管肺泡灌洗(BAL)分析表明，在施用抗IL-25mAb后，與同種型對(duì)照處理的小 鼠相比，嗜曙紅細(xì)胞浸潤同樣被顯著抑制(圖1E)。由于已知2型細(xì)胞因子能調(diào)節(jié)這些效 應(yīng)子作用，我們測定了從分離自抗原重剌激后引流(draining)縱隔淋巴結(jié)的細(xì)胞分泌的 細(xì)胞因子水平。與通過BALB/c小鼠中0VA致敏和攻擊誘導(dǎo)的2型細(xì)胞因子，IL-4、IL-5和 IL-13的水平升高相比，抗IL-25mAb的施用導(dǎo)致了這些細(xì)胞因子水平顯著下降(圖1F)。
這些數(shù)據(jù)支持了下述假設(shè)阻斷IL-25信號(hào)傳導(dǎo)可抑制2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致 消除了 2型效應(yīng)子作用，包括炎癥和AHR。因此，若從應(yīng)答起始就開始施用，IL-25的拮抗劑 能有效抑制2型炎癥。
材料和方法:
小鼠 BALB/c小鼠獲自Harlan區(qū)，并且在SABU/CBS或國立心肺研究所實(shí)驗(yàn)室中于無特 異病原體環(huán)境下飼養(yǎng)。本報(bào)告中列出的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)UK內(nèi)政部批準(zhǔn)進(jìn)行。
致敏和變應(yīng)原暴露 在第0天和第12天，向BALB/c小鼠(6_12周)腹膜內(nèi)施用鋁絡(luò)合卵清蛋白 (20iig/注射)或僅僅鋁(對(duì)照)進(jìn)行致敏。隨后在第19、20、21天氣霧劑施用1%的卵清 蛋白，每天20分鐘。在第22天使用體積描記法分析動(dòng)物，評(píng)價(jià)AHR。
抗rmIL-25單克隆抗體的施用 如前所述誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)性(AHR)，在每次腹膜內(nèi)OVA致敏前一天、向肺中起始 OVA攻擊和每次OVA氣霧化前4小時(shí)腹膜內(nèi)施用抗IL-25mAb (500 P g/劑)。在其他實(shí)驗(yàn)中， 僅在每次氣霧化前當(dāng)天腹膜內(nèi)施用抗IL-25mAb(500ii g/劑)。對(duì)照小鼠接受鹽水或同種型 對(duì)照(500iig/劑)代替抗IL-25單抗。同種型對(duì)照為抗-c-myc(小鼠IgGl，克隆9E10. 2)。
氣道反應(yīng)性的測量 麻醉動(dòng)物，切開氣管置于通風(fēng)機(jī)上(SAR-830系列，CWE公司)，頻率為150次 (breath)/分，潮氣量0. 2ml。在全身體體積描記器(EMKATechnologies， Paris)中監(jiān)測小 鼠，通過線內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)器評(píng)價(jià)經(jīng)肺壓。記錄穩(wěn)定的基線肺阻力后，通過氣霧劑施用增加濃度的乙 酰-e-碘甲膽堿氯化物(乙酰甲膽堿)(Sigma， Dorset,區(qū))，每個(gè)濃度下使用超聲噴霧器 施用15秒，記錄5分鐘內(nèi)的肺阻力。使用10X軟件分析氣道阻力、順應(yīng)性和標(biāo)準(zhǔn)肺參數(shù)。
支氣管肺泡灌洗(BAL) 頸脫位法處死小鼠，通過氣管造口術(shù)注入4X500ii1等分量PBS并回收。在用 giemsa染色的細(xì)胞離心涂片器上進(jìn)行150細(xì)胞的差別細(xì)胞計(jì)數(shù)。
實(shí)施例3 :攻擊之前施用 我們還評(píng)價(jià)了僅在0VA氣霧化攻擊前施用時(shí)抗IL-25mAb是否有效。使用抗 IL-25mAb的治療顯著減少了乙酰甲膽堿激發(fā)試驗(yàn)誘導(dǎo)的氣道阻力，即使在應(yīng)答之后施用也 是如此(圖2A)。作為對(duì)比，施用對(duì)照同種型匹配的mAb并沒有消除AHR。
顯著地，肺部組織切片分析表明，抗IL-25mAb治療的小鼠和OVA攻擊的BALB/c對(duì) 照或同種型匹配的mAb治療的對(duì)照之間血管周圍的細(xì)胞浸潤水平(圖2B)或氣道杯狀細(xì)胞 增生(圖2C)沒有顯著變化。
此夕卜，施用抗IL-25mAb后，嗜曙紅細(xì)胞在BAL液中的比例(圖2D)或抗原特異性血 清IgE的水平(圖2E)均沒有顯著的下降。令人驚訝的是，在抗原重剌激后，2型細(xì)胞因子 IL-5和IL-13的水平仍然維持與OVA攻擊的BALB/c對(duì)照或同種型匹配的mAb治療的對(duì)照 相當(dāng)(圖2F) ， BAL中的IL-13水平也沒有變化。這樣，在應(yīng)答的攻擊期間施用抗IL-25可 特異性的消除AHR，即使2型細(xì)胞因子及其下游效應(yīng)子并沒有被下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明IL-25 可通過獨(dú)立于經(jīng)典2型應(yīng)答的途徑啟動(dòng)AHR。
材料和方法 材料和方法如實(shí)施例2所述，外加
肺組織收集和組織學(xué) 將肺在福爾馬林(在0.9%鹽溶液中的10%甲醛)中固定以供組織學(xué)分析。肺部 切片用giemsa染色用于杯狀細(xì)胞的炎性浸潤和過碘酸-Schiff (PAS)。使用數(shù)字評(píng)分系統(tǒng)
盲法測定氣道上皮中PAS染色的杯狀細(xì)胞(0 :< 5%杯狀細(xì)胞；1 :5-25% ;2 :25_50% ;3 :
50-75%;4 :> 75% )。將各個(gè)肺氣道評(píng)分總和除以檢測的氣道數(shù)，20-40氣道/小鼠，以任
意單位的PAS評(píng)分表示。使用數(shù)字評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)炎癥以評(píng)估血管周圍的浸潤細(xì)胞數(shù)(0:血 管周圍的浸潤炎癥細(xì)胞層<2個(gè)細(xì)胞厚度；1 :2-4個(gè)細(xì)胞厚度；2 :5_8個(gè)細(xì)胞厚度；3>8個(gè)
細(xì)胞厚度)。將各個(gè)肺氣道評(píng)分總和除以檢測的血管數(shù)，20-40氣道/小鼠，以任意單位表 示。 實(shí)施例4 :IL-25通過獨(dú)立于2型的途徑作用 我們對(duì)在缺乏抗原致敏或攻擊的情況下外源性施用rmIL-25是否能增強(qiáng)AHR進(jìn)行 了評(píng)價(jià)。向BALB/c小鼠鼻內(nèi)施用rmIL-25后16小時(shí)我們檢測到氣道阻力顯著上升(圖 3A)。之前的報(bào)道表明IL-13在哮喘表型、尤其是AHR中起中心作用。為確定IL-25是否 通過IL-13在AHR中起作用，我們向i113——小鼠施用了 rmIL-25。我們?cè)僖淮斡^察到使用 rmIL-25處理后AHR升高(圖3B)。由于其他2型細(xì)胞因子同樣顯示對(duì)哮喘表型起作用，我 們同樣評(píng)估了 i14——i15—i19——i113——對(duì)鼻內(nèi)施用rmIL-25的應(yīng)答。即使在缺乏所有經(jīng)典 2型細(xì)胞因子的情況下，用IL-25處理增強(qiáng)了乙酰甲膽堿激發(fā)試驗(yàn)后的AHR(圖3C)。這些 數(shù)據(jù)支持了 IL-25通過獨(dú)立于2型細(xì)胞因子的途徑加劇AHR的作用。
材料和方法 材料和方法如實(shí)施例2和3所述，外加
小鼠 BALB/c背景下的轉(zhuǎn)基因i14-八i15-7-i19-7-i113-八小鼠(P. G. Fallon等，2002. Immunity 17，7)和i113—y—小鼠(G. J. McKenzie等，1998. Curr Biol.8，339)如前所述。 C57BL/6x129 F2背景下的1125+小鼠如前所述(P. G. Fallon等2006. J. Exp. Med. 203， 1105)。 鼻內(nèi)IL-25施用 在第0天向小鼠鼻內(nèi)施用1.8iig rIL-25(R&D Systems)或 1. 8ii grlL-13(P印rotech)的40 PBS/鼠。對(duì)照動(dòng)物僅接受PB S。
實(shí)施例5 :克隆2C3的可變結(jié)構(gòu)域 分離來自3個(gè)2c3亞克隆的RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA。 使用保守的5'VH區(qū)引物MHV7(SEQ ID NO :11)與IgGl恒定區(qū)引物MHCG1 (SEQ IDNO :12)的組合通過PCR擴(kuò)增免疫球蛋白的重鏈(IgH)cDNA。 類似的，使用保守的5' IgK區(qū)引物MKV9(SEQ ID NO : 13)與k即pa恒定區(qū)引物
MKC(SEQ ID NO :14)的組合擴(kuò)增免疫球蛋白輕鏈(IgK)。在整個(gè)PCR反應(yīng)中使用耐熱聚合酶Phusion(NEB F-531L)。 使用TOPO-blunt cloning⑧試劑盒(Cat 45-0245)，將來自3個(gè)獨(dú)立的cDNA的采 用VH7+MHCG1作為引物的PCR反應(yīng)的2c3擴(kuò)增產(chǎn)物直接連接到pCRI1⑧Blunt- T〇p〇
載體中，同樣處理輕鏈擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物。通過將白色菌落挑取到瓊脂網(wǎng)格上的PCR篩選 混合物中，將用所述連接的pCRII-bl皿t載體構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的大腸桿菌T0P10細(xì)菌克隆至 LB-氨芐西林-XGal瓊脂平板上。PCR擴(kuò)增克隆的質(zhì)粒插入物。凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒定預(yù) 測的產(chǎn)物。產(chǎn)生正確大小的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的每一克隆的過夜培養(yǎng)物(5ml)用QIApr印Spin Minipr印試劑盒方案(cat 27106)處理，產(chǎn)生小量制備的DNA質(zhì)粒。 使用BigDye⑧Terminator v3. 0循環(huán)測序快速反應(yīng)試劑盒(ABI cat. 4390242)
對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測序。每一選擇的質(zhì)粒使用M13正向和反向引物從兩個(gè)方向測序，在
GeneAmp9600 PCR儀上循環(huán)。電泳序列分析在ABI毛細(xì)管測序儀上進(jìn)行。 重復(fù)進(jìn)行RT-PCR、克隆、DNA序列分析的完整循環(huán)以獲得每一免疫球蛋白鏈三套
完全獨(dú)立的序列信息。 VH和Vka卯a(chǎn)基因的全推斷核苷酸序列分別如SEQ ID NO :15和SEQ ID NO :16所 示。這些序列包括每一可變基因片段頭部的先導(dǎo)序列，其編碼用于將新合成的抗體鏈轉(zhuǎn)運(yùn) 至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)序列；它們并不出現(xiàn)在最終的重鏈和輕鏈中。
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權(quán)利要求
結(jié)合IL-25的靶標(biāo)結(jié)合元件，其包括抗體VH結(jié)構(gòu)域，該抗體VH結(jié)構(gòu)域包括具有基本上如SEQ ID NO7所示的氨基酸序列的VHCDR3。
2. 權(quán)利要求1所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其中所述VH結(jié)構(gòu)域還包括具有基本上如SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列的CDRl，和具有基本上如SEQ ID NO :6所示氨基酸序列的CDR2。
3. 權(quán)利要求1或2所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其中所述VH結(jié)構(gòu)域包括人框架區(qū)。
4. 權(quán)利要求1或2所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其中所述VH結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO :2。
5. 前述任一權(quán)利要求所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其還包括VL結(jié)構(gòu)域，該VL結(jié)構(gòu)域包含具有 基本上如SEQ ID NO :8所示氨基酸序列的CDR1，具有基本上如SEQ ID N0:9所示氨基酸序 列的CDR2，以及具有基本上如SEQ ID NO :10所示氨基酸序列的CDR3。
6. 權(quán)利要求5所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其中所述VL結(jié)構(gòu)域包括人框架區(qū)。
7. 權(quán)利要求5所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其中所述VL結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO :4。
8. 前述任一權(quán)利要求所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其為Fab、F(ab' )2、scFv抗體片段。
9. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其包括抗體恒定區(qū)。
10. 權(quán)利要求9所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其中所述恒定區(qū)是IgGl或IgG4恒定區(qū)。
11. 權(quán)利要求9所述的靶標(biāo)結(jié)合元件，其包括全抗體。
12. 分離的核酸，其包括編碼前述任一權(quán)利要求所述的靶標(biāo)結(jié)合元件的核苷酸序列。
13. 用于表達(dá)前述任一權(quán)利要求所述的靶標(biāo)結(jié)合元件的表達(dá)載體，該表達(dá)載體包括可 操作地與啟動(dòng)子連接的權(quán)利要求12的核酸。
14. 攜帶權(quán)利要求13所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
15. 生產(chǎn)靶標(biāo)結(jié)合元件的方法，該方法包括在用于生產(chǎn)所述靶標(biāo)結(jié)合元件的條件下培 養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，還包括分離所述靶標(biāo)結(jié)合元件。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的方法，其還包括將所述靶標(biāo)結(jié)合元件制成包 括至少一種附加成分的組合物。
18. 組合物，其包含權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的靶標(biāo)結(jié)合元件和藥學(xué)上可接受的載體。
19. 凍干粉形式的權(quán)利要求18所述的組合物。
20. 治療或預(yù)防哮喘的方法，所述方法包括向需要治療的受試者施用有效量的權(quán)利要 求1-11任一項(xiàng)所述的靶標(biāo)結(jié)合元件或權(quán)利要求18的組合物。
21. 用于治療或預(yù)防哮喘的權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的靶標(biāo)結(jié)合元件或權(quán)利要求18 的組合物。
22. 生產(chǎn)針對(duì)IL-25抗體的方法，該方法包括(a) 提供VH結(jié)構(gòu)域，其包括靶標(biāo)結(jié)合元件，所述靶標(biāo)結(jié)合元件結(jié)合IL-25并且包括抗體 VH結(jié)構(gòu)域，所述抗體VH結(jié)構(gòu)域包含VHCDR3，所述VH CDR3具有基本上如SEQ ID NO. 7所示 氨基酸序列；(b) 使所述VH結(jié)構(gòu)域與復(fù)數(shù)種抗體VL結(jié)構(gòu)域組合以提供抗體分子；(c) 篩選所述抗體分子與IL-25的結(jié)合；并且(d) 選擇與IL-25結(jié)合的抗體分子。
23. 權(quán)利要求22所述的方法，其中所述VH結(jié)構(gòu)域如權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所定義。
24. 生產(chǎn)針對(duì)IL-25的抗體的方法，該方法包括(a) 提供編碼VH結(jié)構(gòu)域的核酸起始庫，所述核酸包括將被替換的CDR3或缺乏CDR3編 碼區(qū)；(b) 使所述庫與供體核酸組合，所述供體核酸編碼具有基本上如SEQ ID N0:7所示氨 基酸序列的VH CDR3，這樣所述供體核酸插入到上述庫的CDR3區(qū)，從而提供編碼VH結(jié)構(gòu)域 的核酸產(chǎn)物庫；(c) 表達(dá)所述產(chǎn)物庫的核酸；(d) 選擇對(duì)IL-25特異性的靶標(biāo)結(jié)合元件；并且(e) 回收所述靶標(biāo)結(jié)合元件或編碼其的核酸。
25. 權(quán)利要求24所述的方法，其中所述產(chǎn)物庫與VL結(jié)構(gòu)域共表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明提供了抗體2C3和結(jié)合白介素25的基于2C3的靶標(biāo)結(jié)合元件。它們?cè)谥委?、例如治療哮喘中是有效的?br> 文檔編號(hào)C07K16/24GK101711256SQ200880020620
公開日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2008年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月18日
發(fā)明者A·N·J·麥肯茲, S·巴蘭坦 申請(qǐng)人:醫(yī)療研究局