專利名稱：乳鐵蛋白的親和分離材料和乳鐵蛋白的親和純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物醫(yī)藥技術領域的純化方法，特別是一種乳鐵蛋白的親 和分離材料和乳鐵蛋白的親和的純化方法。
背景技術：
乳鐵蛋白又名乳轉鐵蛋白，是一種分子質(zhì)量為70 80kDa的糖蛋白，屬于轉鐵 蛋白家族成員，廣泛分布于哺乳動物乳汁和其他多種組織及其分泌液中(包括淚液、 精液、膽汁、滑膜液等內(nèi)、外分泌液和嗜中性粒細胞)。除參與鐵代謝外，乳鐵蛋 白及其蛋白降解產(chǎn)物一乳鐵蛋白肽還具有廣泛的生物學活性，包括廣譜抗菌和抗病 毒活性，抑制腫瘤細胞生長，調(diào)節(jié)機體免疫反應和抗炎癥，抗氧化作用，作為細胞 生長因子等，被認為是一種新型抗菌、抗病毒、抗癌藥物和極具潛力的食品、化妝 品和飼料添加劑。美國食品藥品管理局早已允許乳鐵蛋白作為食品添加劑用于運 動、功能性食品。
目前乳鐵蛋白主要來源于哺乳動物乳汁(如牛乳，羊奶和人乳)和利用基因工 程技術在真菌、植物和乳腺組織中表達乳鐵蛋白產(chǎn)物。
經(jīng)對現(xiàn)有技術文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，從乳清中制備乳鐵蛋白的方法主要為陽離子交 換層析，如中國專利200410080264 "牛初乳中乳鐵蛋白的分離純化技術"，中國 專利200710102035 "—種從轉基因牛乳中純化重組人乳鐵蛋白的方法"；由于單用 陽離子交換色譜純化乳鐵蛋白回收率低且純度有限，中國專利"200610040528 —種 從牛初乳中工業(yè)化分離純化乳鐵蛋白的方法"將膜分離技術和工業(yè)色譜技術相結合， 先將乳清經(jīng)分步超濾獲得乳鐵蛋白粗制品，再經(jīng)強陽離子交換得乳鐵蛋白精制品。 該純化方法步驟較多，操作復雜且成本高，使得工業(yè)化應用受限。中國專利03152940 "牛初乳中乳鐵蛋白的分離提純工藝方法"利用肝素一瓊脂糖親和層析柱從牛初乳
中分離純化乳鐵蛋白，該法獲得產(chǎn)品純度高，但得率較低且生產(chǎn)成本較高。因此，有必要開發(fā)效率高、成本低、生產(chǎn)步驟更簡便的乳鐵蛋白分離材料和和生產(chǎn)工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服乳鐵蛋白生產(chǎn)現(xiàn)有純化技術的缺點，提供一種乳鐵蛋白 的親和分離材料和乳鐵蛋白的親和的純化方法，能夠快速、簡便、低成本、大批量 純化乳鐵蛋白。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的，本發(fā)明的純化方法，即仿生親和純化技術， 以專一性地識別乳鐵蛋白作為基礎，其步驟如下
第一步，在基礎層析介質(zhì)上進行固相合成，制備仿生親和分離材料；
合成乳鐵蛋白專一的親和分離材料，首先以帶氨基的基礎層析介質(zhì)，或用常規(guī) 化學方法對基礎層析介質(zhì)進行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應活化，再與Beta-丙氨酸或l-氨基環(huán)己垸甲酸反應，合成親和分離材料。
第二步，用制備的仿生親和分離材料純化乳鐵蛋白。
用上述合成的親和分離材料制備成親和層析柱,將乳清樣品流經(jīng)該親和層析柱， 乳鐵蛋白吸附在親和層析柱上，未結合的其它蛋白被洗去，改變緩沖液條件將結合 的乳鐵蛋白洗脫下來，得到乳鐵蛋白粗品。
第二步中，所述用制備的仿生親和分離材料純化乳鐵蛋白，其中親和介質(zhì)吸附 乳鐵蛋白的條件為pH 6.0-7.5， NaCl濃度為O.O-O. 2M的緩沖液；洗脫條件為pH 2. 0-3. 0, NaCl濃度為O-O. 15M的緩沖液。
所述的仿生親和分離材料的配體中含有三氮嗪和Beta-丙氨酸或1-氨基環(huán)己垸 甲酸的結構。
所述的乳鐵蛋白，其原料為牛乳、羊乳、人乳和含重組人乳鐵蛋白的轉基因牛 乳中一種。
本發(fā)明仿生親和分離材料結構是通過三氮嗪結構骨架作為間臂固定Beta-丙氨 酸或1-氨基環(huán)己烷甲酸基團。本發(fā)明克服了乳鐵蛋白生產(chǎn)技術中的缺點，在純化乳 鐵蛋白時步驟少，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)效率高，利用乳鐵蛋白專一的親和分離材料， 可快速、簡便、低成本、大批量純化乳鐵蛋白。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進 行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下 述的實施例。
實例l:
一分離材料制備
取NH廠S印harose (500ml)，依次用5倍體積的1 M NaCl， IO倍體積蒸餾水充分 洗滌后，抽干轉移至反應器皿中，在冰水浴中加入丙酮溶解的三氯三氮嗪〔100g)， 攪拌下用飽和NaHC03調(diào)節(jié)pH在6 ~ 7之間，反應3小時后取出，依次用3X10倍體積的 水/丙酮(0:l， 1:3， 1:1， 3:1， l:O)洗滌，得到1-氨基-S印harose-3， 5-二氯-2, 4, 6-三氮嗪(450ml)。
稱取Beta-丙氨酸(100g)用去離子水(300 ml)溶解，與l-氨基-S印harose -3， 5-二氯-2, 4， 6-三氮嗪(300 ml)混勻，用飽和NaHC(Vf呆持pH在6. 5 8. 0之間， 置于5(TC下攪拌反應24小時。反應結束后，依次用3倍體積的lMNaCl， IO倍體積蒸 餾水充分洗滌，得到l一氨基-S印harose — 3—Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4, 6_三氮嗪 (260 ml)，用30%乙醇儲存待用。
二.轉基因牛乳中重組人乳鐵蛋白親和純化
取-7(TC凍存的轉基因牛乳樣品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm離心30niin， 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，以飽和NaCl溶液調(diào)電導率至4. 85ms/cm，上樣至預先用IO 倍體積磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH6. 0，電導率4. 85ms/cm)平衡好的裝有按 實例l步驟一制備的l一氨基S印harose — 3—Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4， 6-三氮嗪親 和分離材料的層析柱(1x5 cm)中，依次用磷酸鈉緩沖液(10mM磷酸鈉，pH 6. 0, 電導率4. 85ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，用甘氨酸一鹽酸緩沖液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分析重組人乳鐵蛋白純度為75呢。
實例2:
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，40。C水浴融化，4。C下4500rpm離心3(Mn，
取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4°C， 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至5. 6ras/cm,上樣至預先用 lO倍體積Tris-HCl緩沖液(50 mM Tris， pH 7.0，電導率5. 6ms/cm)平衡好的裝有 按實例l步驟一制備的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4, 6-三氮嗪 親和分離材料的層析柱(1 x 5 cm)中，依次用Tris-HCl緩沖液(50mMTris， pH 7. 0， 電導率5. 6ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸一鹽酸緩沖液(O. 1M Gly， pH 2. 4) 洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分析重組人乳鐵蛋白純度為85. 1%。 實例3:
取-70'C凍存的轉基因牛乳樣品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm離心30min， 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 5，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至6. Oms/cm,上樣至預先用 lO倍體積Tris-HCl緩沖液(50 mM Tris， pH 7.5，電導率6. Oms/cm)平衡好的裝有 按實例l步驟一制備的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4, 6-三氮嗪 親和分離材料的層析柱(lx5cm)中，依次用Tris-HC1緩沖液(50mMTris， pH7.5， 電導率6. 0ms/cm)洗至280mn光吸收至基線，甘氨酸一鹽酸緩沖液(0. 1MGly，pH 2.4) 洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分析重組人乳鐵蛋白純度為82y"
實例4:
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，4(TC水浴融化，4。C下4500rpm離心30min， 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4。C， 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至6. 85ms/cm，上樣至預先用 10倍體積Tris-HC1緩沖液(50 mM NaCl, 50 mM Tris， pH 7.0，電導率6. 85ms/cm) 平衡好的裝有按實例l步驟一制備的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2， 4， 6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1 x 5 cm)中，依次用Tris-HCI緩沖液(50 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，電導率6. 85ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸一 鹽酸緩沖液(0. 1M， pH 2.4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分析重組人 乳鐵蛋白純度為95%。
實例5: 取-70'C凍存的轉基因牛乳樣品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm離心30min， 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4'C, 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至9. 30ms/cm,上樣至預先用 lO倍體積Tris-HCl緩沖液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，電導率9. 30ms/cm) 平衡好的裝有按實例l步驟一制備的l-氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2， 4， 6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HC].緩沖液(100 mMNaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，電導率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨 酸一鹽酸緩沖液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分 析重組人乳鐵蛋白純度為96. 6%。
實例6:
取-7(TC凍存的轉基因牛乳樣品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm離心30rain， 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6, 4'C， 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至13. 20ms/cm，上樣至預先 用10倍體積Tris-HCl緩沖液(150mMNaCl,50mMTris， pH 7. 0,電導率13. 20ms/cm) 平衡好的裝有按實例l步驟一制備的l-氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2， 4, 6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1 x 5 cm)中，依次用Tris-HCl緩沖液(150mM NaC1，50 raM Tris， pH 7.0，電導率13. 20ms/cm)洗至280咖光吸收至基線，甘氨酸 一鹽酸緩沖液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分析 重組人乳鐵蛋白純度為96%。
實例7.-
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm離心30min, 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至9. 30ms/cm，上樣至預先用 10倍體積Tris-HC1緩沖液(100 mM NaCl， 50慮Tris， pH 7.0，電導率9. 30ms/cra) 平衡好的裝有按實例l步驟一制備的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2, 4， 6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HCl緩沖液(100 mMNaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，電導率9. 30ms/cm)洗至280皿光吸收至基線，甘氨
酸一鹽酸緩沖液(0. 1M Gly， pH 2.0)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分 析重組人乳鐵蛋白純度為83%。 實例8:
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm離心30min， 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4°C， 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至9. 30ms/cm，上樣至預先用 lO倍體積Tris-HCl緩沖液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0，電導率9. 30ms/cm) 平衡好的裝有按實例l步驟一制備的l一氨基S印harose — 3—Beta-丙氨酸一5 —氯一 2,4,6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HCl緩沖液(100 raMNaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，電導率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨 酸一鹽酸緩沖液(0. 1M Gly， pH 3.0)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分 析重組人乳鐵蛋白純度為83. 5%。
實例9:
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，40。C水浴融化，4。C下4500rpm離心30min， 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4°C， 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至9. 30ms/cm，上樣至預先用 lO倍體積Tris-HCl緩沖液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0，電導率9. 30ms/cm) 平衡好的裝有按實例l步驟一制備的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2,4,6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HCl緩沖液(100 mMNaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，電導率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨 酸一鹽酸緩沖液(0.05MNaC1，0. lMGly， pH 2. 4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以 SDS-PAGE分析重組人乳鐵蛋白純度為92呢。
實例10:
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，40。C水浴融化，4'C下4500rpm離心30min， 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4'C, 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至9. 30ms/cm，上樣至預先用 lO倍體積Tris-HCl緩沖液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0，電導率9. 30ms/cm)
平衡好的裝有按實例l步驟一制備的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HC1緩沖液(100 mM NaCl， 50mM Tris， pH 7.0，電導率9. 30ms/cm)洗至280nra光吸收至基線，甘氨 酸一鹽酸緩沖液(0. 1M NaCl， 0. lMGly， pH 2.4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以 SDS-PAGE分析重組人乳鐵蛋白純度為94. 5%。 實例ll:
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，40。C水浴融化，4。C下4500rpm離心30min, 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4.6， 4°C， 12000rpm離心20min，取上清， 以1N Na0H調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至9. 30ms/cm,上樣至預先用 10倍體積Tris-HC1緩沖液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0，電導率9. 30ms/cm) 平衡好的裝有按實例l步驟一制備的l一氨基S印harose — 3 — Beta-丙氨酸一5 —氯一 2， 4, 6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1 x 5 cm)中，依次用Tris-HC1緩沖液(lOOraM NaCl，50raMTris, pH 7. 0，電導率9. 30ms/cm)洗至280咖光吸收至基線，甘氨酸一 鹽酸緩沖液(O. 15MNaC1,0. lMGly， pH 2. 4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE 分析重組人乳鐵蛋白純度為88. 2%。
實例12:
牛乳中牛乳鐵蛋白的親和純化
取-70。C凍存的牛乳樣品，4(TC水浴融化，4t:下4500rpm離心30min，取中間 層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4.6， 4°C， 12000rpm離心20min，取上清，以訓a0H 調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至9. 30ms/cm，上樣至預先用10倍體積 Tris-HC1緩沖液(lOOmM NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0，電導率9. 30ms/cm)平衡好的 裝有按實例l步驟一制備的l一氨基S印harose — 3—Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4， 6_三 氮嗪親和分離材料的層析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HC1緩沖液(100mM NaCl, 50 mMTris， pH 7. 0，電導率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸一鹽酸緩沖 液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分析，牛乳鐵蛋 白純度為85%。
實例13:
羊乳中羊乳鐵蛋白的親和純化
取-70。C凍存的羊乳樣品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm離心30min，取中間 層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4'C, 12000rpm離心20min，取上清，以lNNaOH 調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至9. 30ms/cm,上樣至預先用10倍體積 Tris-HC1緩沖液(100 mM NaCl, 50 mM Tris， pH 7. 0，電導率9. 30ms/cm)平衡好的 裝有按實例l步驟一制備的l一氨基S印harose — 3—Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4， 6-三 氮嗪親和分離材料的層析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HCl緩沖液(100mMNaCl， 50 mMTris， pH 7. 0，電導率9. 30ms/cra)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸—鹽酸緩沖 液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分析，羊乳鐵蛋 白純度為87. 5%。
實例14:
人乳中乳鐵蛋白親和純化
取-70。C凍存的人乳樣品，40。C水浴融化，4。C下4500rpra離心30min，取中間 層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm離心20min,取上清，以lNNaOH 調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至9. 30ms/cm，上樣至預先用10倍體積 Tris-HC1緩沖液(100 raM NaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0，電導率9. 30ms/cm)平衡好的 裝有按實例l步驟一制備的l一氨基S印harose — 3—Beta-丙氨酸一5 —氯一2， 4， 6-三 氮嗪親和分離材料的層析柱(lx5cm)中，依次用Tris-HC1緩沖液(100mMNaCl， 50 mMTris， pH7.0，電導率9. 30ms/cm)洗至280醒光吸收至基線，甘氨酸一鹽酸緩沖 液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分析，人乳鐵蛋 白純度為84%。
實例15:
一分離材料制備
取冊2-S印harose (500ml)，依次用5倍體積的1 MNaCl， 10倍體積蒸餾水充分 洗滌后，抽干轉移至反應器皿中，在冰水浴中攪拌下加入預冷丙酮溶解的三氯三氮 嗪(100 g)，用飽和NaHC03保持pH在6 7之間，反應3小時后取出，依次用3X10 倍體積的水/丙酮(0:1， 1:3， 1:1， 3:1， 1:0)洗滌，得到1-氨基-S印harose-3, 5-
二氯-2，4，6-三氮嗪(450ml )。
稱取1-氨基環(huán)己烷甲酸(l-AMIN0 CYCLOHEXANE CARBOXYLIC ACID) (100 g)， 用去離子水(300 ml)溶解，與l-氨基-S印harose -3， 5-二氯_2， 4, 6-三氮嗪(300 ml) 混勻，用飽和NaHC(Vi周節(jié)pH在6. 5 8. 0之間，5CTC下攪拌反應24小時。反應結束后， 依次用3倍體積的lMNaCl， IO倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1一氨基-S印harose — 3 一1-氨基環(huán)己烷甲酸一5 —氯一2，4，6-三氮嗪(260 ml),用30°/。乙醇儲存待用。
二轉基因牛乳中重組人乳鐵蛋白親和純化
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，40。C水浴融化，4'C下4500rpm離心30min， 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4°C， 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至5. 6ms/cm，上樣至預先用 10倍體積Tris-HCl緩沖液(50 raM Tris， pH 7.0，電導率5. 6ms/cm)平衡好的裝有 按實例14步驟一制備的1 一氨基S印harose — 3_ 1-氨基環(huán)己烷甲酸一5 —氯一2, 4， 6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HC1緩沖液(50mMTris， pH7.0，電導率5. 6ras/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸一鹽酸緩沖液(0. lMGly， pH2.4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分析，重組人乳鐵蛋白純度為70%。
實例16:
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，4(TC水浴融化，4'C下4500rpm離心30min， 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 5，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至6. Oms/cm，上樣至預先用 10倍體積Tris-HCl緩沖液(50 mM Tris， pH 7.5，電導率6. Oms/cm)平衡好的裝有 按實例14步驟一制備的1 一氨基S印harose — 3 — 1-氨基環(huán)己烷甲酸一5 —氯一2, 4, 6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HC1緩沖液(50mMTris， pH7. 5，電導率6. 0ms/cm)洗至280nm光吸收至基線，甘氨酸一鹽酸緩沖液(O. lMGly， pH2.4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE分析，重組人乳鐵蛋白純度為72%。
實例17:
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，40。C水浴融化，4'C下4500rpm離心30min， 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm離心20min，取上清，
以lNNaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至6. 85ms/cm，上樣至預先用 10倍體積Tris-HC1緩沖液(50 mM NaCl， 50 raM Tris, pH 7.0，電導率6. 85ms/cm) 平衡好的裝有按實例14步驟一制備的l一氨基S印harose — 3—l-氨基環(huán)己垸甲酸一5 _氯一2，4,6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HCl緩沖 液(50mMNaCl，50raMTris， pH 7. 0，電導率6. 85ms/cm)洗至280nm光吸收至基線， 甘氨酸一鹽酸緩沖液(0. lMGly， pH2.4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE 分析，重組人乳鐵蛋白純度為79.6%。 實例18:
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，4CTC水浴融化，4。C下4500nM離心30min， 取中間層脫脂乳，以lNHCl調(diào)節(jié)pH值至4.6， 4°C， 12000rpm離心20min，取上清， 以lNNaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至9. 30ms/cm，上樣至預先用 lO倍體積Tris-HCl緩沖液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0，電導率9. 30ms/cm) 平衡好的裝有按實例14步驟一制備的l一氨基S印harose — 3—l-氨基環(huán)己烷甲酸一5 一氯一2，4，6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1x5 cm)中，依次用Tris-HC1緩沖 液(100 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0,電導率9. 30ms/cm)洗至280nm光吸收至基 線，甘氨酸一鹽酸緩沖液(0. 1M Gly， pH 2. 4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE 分析重組人乳鐵蛋白純度為84. 4%。
實例19:
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，40。C水浴融化，4。C下4500rpm離心30min，取 中間層脫脂乳，以1N HCl調(diào)節(jié)pH值至4. 6， 4'C， 12000rpm離心20rain，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至13. 20ms/cm，上樣至預先 用10倍體積Tris-HCl緩沖液(150mMNaCl， 50mMTris， pH 7. 0，電導率13. 20ms/cm) 平衡好的裝有按實例14步驟一制備的1 一氨基S印harose — 3 — 1-氨基環(huán)己垸甲酸一 5 一氯一2,4,6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1 x 5 cm)中，依次用Tris-HC1緩沖 液(150函NaCl， 50 mM Tris， pH 7.0,電導率13. 20ms/cm)洗至280畫光吸收至 基線，甘氨酸一鹽酸緩沖液(0. 1M Gly， pH 2.4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以 SDS-PAGE分析乳鐵蛋白純度為76. 3%。
實例20:
取-70。C凍存的轉基因牛乳樣品，4(TC水浴融化，4。C下4500rpm離心30min，取 中間層脫脂乳，以1N HCl調(diào)節(jié)pH值至4.6, 4'C， 12000rpm離心20min，取上清， 以1N NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，以飽和NaCl溶液將其電導率調(diào)至15. 90ms/cm，上樣至預先 用10倍體積Tris-HCl緩沖液(200mMNaCl， 50mMTris， pH7. 0，電導率15. 90ms/cm) 平衡好的裝有按實例14步驟一制備的1 一氨基S印harose — 3 _ 1-氨基環(huán)己垸甲酸_ 5 一氯一2，4,6-三氮嗪親和分離材料的層析柱(1 x 5 era)中，依次用Tris-HC1緩沖 液(200 mM NaCl， 50 mM Tris， pH 7. 0,電導率15. 90ms/cm)洗至280ntn光吸收至基 線，甘氨酸一鹽酸緩沖液(0. 1M Gly，pH 2. 4)洗脫結合的乳鐵蛋白，收集后以SDS-PAGE 分析乳鐵蛋白純度為83%。
應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各 種改動或修改，如起始材料NH2-S印harose可以更換成葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、 烯丙基葡聚糖和N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡 聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的 硅膠等，這些等價形式同樣落于本發(fā)明的范圍。
權利要求
1、一種乳鐵蛋白的親和分離材料和乳鐵蛋白的親和純化方法，其特征在于，包括如下步驟第一步，合成乳鐵蛋白專一的親和分離材料首先以帶氨基的基礎層析介質(zhì)，或用常規(guī)化學方法對基礎層析介質(zhì)進行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應活化，再與Beta-丙氨酸或1-氨基環(huán)己烷甲酸反應，合成親和分離材料；第二步，用制備的仿生親和分離材料純化乳鐵蛋白。
2、 根據(jù)權利要求1所述的乳鐵蛋白的親和分離材料和乳鐵蛋白的親和純化方 法，其特征是，所述基礎層析介質(zhì)是葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖 和N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共 聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠中一種。
3、 根據(jù)權利要求1所述的乳鐵蛋白的親和分離材料和乳鐵蛋白的親和純化方法， 其特征是，所述用制備的仿生親和分離材料純化乳鐵蛋白，是指用合成的親和分離材料制備成親和層析柱，將乳清樣品流經(jīng)該親和層析柱，乳鐵蛋白吸附在親和層 析柱上，未結合的其它蛋白被洗去，改變緩沖液條件將結合的乳鐵蛋白洗脫下來， 得到乳鐵蛋白粗品。
4、 根據(jù)權利要求1或3所述的乳鐵蛋白的親和分離材料和乳鐵蛋白的親和純化方 法，其特征是，所述用制備的仿生親和分離材料純化乳鐵蛋白，其中親和介質(zhì)吸附 乳鐵蛋白的條件為pH 6.0-7.5， NaCl濃度為0.0-0.2M的緩沖液。
5、 根據(jù)權利要求1或3所述的乳鐵蛋白的親和分離材料和乳鐵蛋白的親和純化方 法，其特征是，所述用制備的仿生親和分離材料純化乳鐵蛋白，其中親和介質(zhì)洗脫 條件為pH 2. 0-3. 0， NaCl濃度為O-O. 15M的緩沖液。
6、 根據(jù)權利要求1或3所述的乳鐵蛋白的親和分離材料和乳鐵蛋白的親和純化 方法，其特征是，所述的仿生親和分離材料的配體中含有三氮嗪和Beta-丙氨酸或 1-氨基環(huán)己烷甲酸的結構。
7、 根據(jù)權利要求1或3所述的乳鐵蛋白的親和分離材料和乳鐵蛋白的親和純化方法，其特征是，所述的乳鐵蛋白，其原料為牛乳，羊奶，人乳或含重組人乳鐵蛋白 的轉基因牛乳中一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)藥技術領域的乳鐵蛋白的親和分離材料和乳鐵蛋白的親和純化方法，包括步驟第一步，合成乳鐵蛋白專一的親和分離材料首先以帶氨基的基礎層析介質(zhì)，或用常規(guī)化學方法對基礎層析介質(zhì)進行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應活化，再與Beta-丙氨酸或1-氨基環(huán)己烷甲酸反應，合成親和分離材料；第二步，用制備的仿生親和分離材料純化乳鐵蛋白。本發(fā)明能夠高效率、低成本的大規(guī)模生產(chǎn)高純度的乳鐵蛋白。
文檔編號C07K1/22GK101362792SQ20081020042
公開日2009年2月11日 申請日期2008年9月25日 優(yōu)先權日2008年9月25日
發(fā)明者任慧娟, 勝 文, 李榮秀, 霍晨晰, 黃飛云 申請人:上海交通大學