專利名稱：：一種海星皂苷類抗腫瘤化合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，是從海洋生物中分離有抗痛活性的化合物，具體地說jt^面包海星中提取分離到的一種海星皂苷類抗腫瘤化合物。
背景技術：
：海星(stofeh)屬觫皮動物門海星綱，現(xiàn)存約1500種，為海生底棲動物，分布廣泛.近二十年來，國外關于海星活性化學成分特別是海星甾體皂苷的研究非?；钴S，對海星皂苷的研究已魏鄰余種結構新穎的化合物的發(fā)現(xiàn)。這些海星皂苷具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、Na+-K、ATP酶抑制、抗澳瘍、溶血等多種多樣的藥理活性。海星皂苷(asterosaponins)為海星甾體皇苷中的一類特定的化合物，其結構特征為具有AW"-3p,6ft-二羥基甾體母核，并在3位硫酸化，6位糖募化》苷元賴鏈至少有1個位置被氧化，寡糖基一般由5或6個單糖構成，并具有相似的連接方式和連接位點，寡糖基由3個單糖構成的情況非常少見(湯海峰，易楊華，張淑l&，等.海星皂苷的研究進展-中國海洋藥物，2004，23(6):48-57和forizziM、DeMarinoS，Zd，oRSteroidal0iig嘴lycosidesfromlhea幼eroidean.CurreatOfgiricChen、2001，5(9):951)。我國南海生物資源極為豐富，是世界上海星集中分布的海域之一，特別是面包海星(C"fctoffiww^uifww)的l^量巨大。我們從采自三亞海域的面包海星中分離鑒定了16種具有生物活性的海星菪苷，包括ll種新化合物，這是國內(nèi)外首次對面包海星中的海星皂苷類化合物進行分離和鑒定》其中一種新化^fCEDS對K-562人白血病和BEL-7402人肝癌等8種腫瘤細胞有明顯的抑制作用，其化學結構和抗胂瘤活性未見有過報道。對l類創(chuàng)新藥物(單體化合物藥物辦制的大量實踐和報道證實化學結構決定藥理作用，新的化學結構預示著更強的生物活性、更低的毒副作用或更適于在臨床使用。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)更多不同類別的新的化合物，以供進一歩開發(fā)為高效低毒的抗癌新藥。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的旨在提供一種具有抗腫瘤作用的、提取分離自面包海星的海星皂苷類化合物a本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，一種海星皂苷類抗腫瘤化合物，其特征是式l所示化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>式I上述結構其化學名稱為(20/2必>601力-[3"0-甲基4-1>吡喃奎諾糖基><1—2沖-EMt喃木糖基<1—3H^EV吡喃葡萄糖基p5ot-膽甾-9(11>烯-3&》二琉酸鈉鹽((20iU45>6cfO-[3^-9(11Hd"3^24^sulfetedisodi咖salt),是從面包海星中提取分離的新的海星皂苷類化合物，以下簡稱其為CEDS所述的從面包海星中提取分離1M式I化合物CEDS的方法，其步驟如下:以新鮮采集的面包海星為原料，,經(jīng)剪碎后，按重量體積比加入35倍原料重的95%乙醇，回流提取3次，每次24小時；合并提取液，回收溶劑，得乙醇提取物，提取物分敢于按重量fl^比3倍的水中，分別用和水等體積的石油醚萃取3次，萃取后的水相再分別用與水等#的正丁醇萃取5次，合并正丁醇萃取液，蒸千得到總苷提取物；總苷提取物應用硅膠柱層析,以體積比為2:1:0-力:6:l的氯仿-水飽和的正丁醇-甲醇混合溶劑洗脫,得到含式l化合物CEDS的海星皂舒混合物-，該海星皂苷混合物應用S^>hadexLH-20凝膠ttJg析和中壓液相柱層析純化，均分別采用^^比為i:l的甲醇-水混合^^i洗脫，合并含式I化合物CEDS的流份，再經(jīng)高效液相色譜儀分離純化，用體積比為48:5249:51的甲醇-水混合溶劑為流動相洗脫，得到式l化合物CEDS的純品。所述的從面包海星中提取分離式I化合物CEDS的方法，除應用常規(guī)的溶劑提取、溶劑萃取和各種色譜分離技術外，在應用硅膠柱層析方法從總苷提取物制備含式I化合物CEDS的海星變-苷混合物時，對該海星皂苷混合物的確定是采用如下手段來檢査的以硅膠薄層層析檢溯，M柳比為12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合溶劑或^lR比為80:18:2的氯仿-甲醇-水混合溶劑展開，收集Rr值在0_20~0_25處顯示紫紅色斑點的流份，即為含式I化合物CEDS的海星皂苷混合物。所述的式1化合物CEDS對K-562人白血病、BE1"402人肝癌等S種不同的腫瘤細胞株均顯示顯著的抑制作用，半數(shù)有效抑,度(IC5o值難0.712_2funol/L之間。所述的式I化^CEDS在采用兩步法微管蛋白聚合篩選模型(HuW,DongH，Li仏HuXT,HanGJ，QuYB.A)righ~throughputmoddforscrewinganti-tumoragentscapableofpromotingpolynierizatkHiof加lMi]ininvitro.ActaPbarmactdSin,2(M>4，25(6):775-782)進行的體外試驗中，顯示顯著的促進微管蛋白聚合作用，在10將/mL濃度時的終點促聚指數(shù)(A值)為4(Bi,動力學促聚指數(shù)(A值)為145%,而陽性對照藥物紫杉醇在10嗎/mL濃度時的戶e值和A值分別為31%和100%,表明CEDS^JT傲管蛋白聚合的作用強于紫杉醇。所述的式I化合物CETO!在作為藥物使用時，可以是單獨使用，也可以是與其他成分混合在臨床應用時，以常規(guī)的制劑工藝，單獨使用或與其他藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物，如注射劑、或散劑、或丸劑、或膠囊劑、或片劑、或微囊劑、或軟膠囊劑、或膜劑、或膏劑、或酊劑、或顆粒劑、或氣霧劑等。本發(fā)明的特點是-式化合物CEDS是從面包海星中提取分離的新的海星皂苷類化合物，而且結構特征非常罕見它是首次發(fā)現(xiàn)的具有硫酸化儺鏈的海星皂苷類化合物，也是非常少見的寡糖基由3個單ttM成的海星阜苷類化合物，它所含有的甲氧基單糖在海星皂苷類化合物中也不多見。式I化^tfCEDS對多種不同腫瘤細胞株的顯著抑制作用也表明其可以迸一步作為新的抗腫瘤藥物進行研究開發(fā)。通過促進徵管蛋白聚合作用機制發(fā)揮抗癌作用的紫杉醇在臨床的成功應用，使得微管穩(wěn)定劑成為國內(nèi)外抗痛藥物研究的主要熱點之一，但目前從天然界發(fā)現(xiàn)的具有該作用的化^J非常少，迫切需要發(fā)現(xiàn)更多不同類別的新的化合物，以供進一步開發(fā)為高效低毒的^t痛新藥.式1化合物CEDS能夠促進微管蛋白聚合，并且該作用強于紫杉醇，顯示其具有良好的開發(fā)潛力。本發(fā)明從面包海星中通過提取、分離純化得到式I化合物CEDS，該化合物可用于制備治療Jl^痛癥的藥物，為研制新的抗腫瘤藥物提供了先導化合物。具體實錄方式下面結合具體實施例來說明本發(fā)明的實質(zhì)，應理解,這些實施例僅用于證實本發(fā)明而不用于跟制本發(fā)明的菘圍-下述實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照SU&廠商所建i交的條件?；痎H的提取和分離制備實施例化合物的原料為采用潛水和拖網(wǎng)手段采集自海南三亞海域的面包海星，原料重KM公斤，共130個面包海星，經(jīng)剪碎后，加入400升濃度為95%的乙醇進行回流提取，共提取3次，每次4小時。合并提取液，減壓回收溶瓶減壓回收即本行業(yè)通常所采用的袖濾方法，下同)，得乙醇提取物4.8公斤。提取物分敢于15升水中，用石油醚萃取3次，每次15升。萃取后的水相再用正丁醇萃取5次，每次15升，合并正丁醇萃取液，蒸干得到總昔提取物170克。將總苷提取物進行硅膠柱層析，以氯仿-水飽和的正丁醇-甲醇混合溶劑進行梯度洗脫，洗脫液的體積比分別為2出0(取下層作為洗脫液)，O:l:O和0:6:1，按750mL為一個流份接收，并用硅膠薄層層析檢測(薄層展開溶劑采用體積比為12:3:5的正丁秦乙酸-水混合溶劑，顯色劑為體枳比為1:4的硫酸-甲醇溶液，噴顯色劑后于105t:加熱顯色)，收集&值在0.20~0.25處顯示紫紅色斑點的流份，即為含如下式I化合物CEDS的海星皂苷混合物，共2.0克。對該海星皂苷混合物采用Sq)hadexLH-20凝膠柱(Pharaiada公司誠行柱層析'用體積比為1:1的甲l水混合溶翻洗脫，按15毫升為一個流份接收，薄層層析檢測，合并含如下式1化合物CEDS的第26鄰流份，減壓蒸干溶劑后得到0.5克樣品。該樣品再采用Merek公司的Lobar柱(LichtoprepRP-18,B塱誠行中壓液相柱層析，柱壓力(K30.4MPa,用體積比為1:1的甲醇-水混合溶劑洗脫，按50毫升為1個流份接收，薄層層析檢測，合并含如下式1化合物CEDS的第510流份，減壓蒸千溶劑后得到0J8克樣品。對該樣品采用高效液相色譜儀(戴安公司灘行分離純化(高效液相色譜條件為大連依利特公司StaoChromODS"BP色譜柱250mmX10mm,48.5%甲酵為流動相，流速2mL/mitt,室溫，206nm紫外檢測)，得到如下式I化合物CEDS的純品170毫克。上述結構其化學名稱為(20/U4S)^6a-(H3力-甲基-P-D-吡喃奎諾糖基"(l-^2)"p-D"吡喃木糖基"(1~>3>^1>吡喃葡萄糖基]>5€1-膽甾-9(11>烯-3隊24<二硫酸鈉鹽((20iU4y>6a"￡M3"O9(11)^1i-3p^34"dfaalfetedisodimn幼！0,是從面包海星中提取分離的海星皂舒類化合物，簡稱其為采用潛水和拖網(wǎng)手段采集自海南三亞海域的面包海星作為原料，原料重67公斤，共88個實施樹2:面包海星，經(jīng)剪碎后，加入330升濃度為95%的乙醇進行回流提取，共提取3次，每次2小時。合取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物3J2公斤。提取物分散于IO升水中，用石油醚萃取3次，每次10升。萃取后的水相再用正丁醇萃取5次，每次10升，合并正丁醇萃取液，蒸干得到總苷提取物148克。將總苷提取物進行硅膠柱層析，以氯仿-水飽和的正丁^甲醇混合溶布誠ffli度洗脫，洗脫液的體積比分別為2:l:0(取下層作為洗脫銜，O:l:O和0:6:1，按500mL為一個流份接收，并用硅膠薄層層析檢測(薄層展開溶劑采用體積比為80:18:2的氯仿-甲醇-水混合溶劑，顯色劑為體積比為1:4的硫酸-甲酵溶液，噴顯色劑后于1051C加熱顯色)，收集Rf值在0J20~O25處顯#紅色斑點的流份，即為含實施例1式l化合物CEDS的海星皂苷混合物，共1.4克對該海星皂苷混合物采用SephadexLH-20凝膠柱(Pharmacia公司鎖行柱層析，用體積比為1:1的甲f水混合溶劑洗脫，按10毫升為一個流份接收，薄層層析檢測，合并含實施例l式I化合物CEDS的第2538流份，減壓蒸干溶劑后得到(U3克樣品。該樣品再采用Merck公司的Lobar柱(UchioprepRP-18,B型誠行中壓液相柱層析，柱壓力030.4MPa,用體積比為1:1的甲f水混合溶劑洗脫，按30毫升為1個流份接收，薄層層析檢測，合并含實施例l式l化合物CEDS的第713流份，減壓蒸干溶劑后得到0_26克樣品。對該樣品采用高效液相色譜儀(戴安公司鎖行分離純化(高效液相色譜條件為大連依利特公司SinoChromODS-BP色譜柱250mmX10mm,48%甲醇為流動相，流速2mL/min,室溫，206mn紫外檢瀕)，得到實施例1式化合物CEDS的純品118毫克。實施併3:從海南三亞海域.紫用潛水和拖網(wǎng)手段采集面包海星作為原料，原料重68公斤，共85個面包海星，經(jīng)剪碎后，加入210升濃度為95%的乙醇迸行回流提取，共提取3次，每次2小時。合*取液，減壓回收溶劑，得乙醇提取物3.1公斤。提取物分散于10升水中，用石油醚萃取3次，每次10升*萃取后的水栩再用正丁醇萃取5次，每次10升，合并正丁醇萃取液，蒸干得到總發(fā)提取物138克將總苷提取物進行硅膠柱層析，以氯仿-水飽和的正丁^甲醇混合溶劑進f灘度洗脫，洗脫液的體積比分別為2.1:0(取下層作為液)，0:1:0和0:6:1，按500mL為—個流份接收，并用鞋膠薄層層析檢測(薄層展開溶劑采用體積比為80:18:2的氯仿-甲醇-水混合溶劑，顯色劑為體積比為1:4的琉酸-甲醇溶液，噴顯色劑后于105r加熱顯色)，收集Rf值在O20~25處顯示紫紅色斑點的流份，即為含實施倒1式I化合物CEDS的海星皂苷混合物，共135克。對該海星皂苷混合物采用SephadexLH-20凝膠柱(Pharaiacia公司)進行柱層析，用體積比為1:1的甲醇-水混合溶劑洗脫，按10毫升為一個流份接收，薄層層析檢測，合并含實施例l式I化合物CEDS的第2436流份，J^E蒸干溶劑后得到031克樣品。該樣品再采用Merek公司的Lobar柱(LichroprepRP-18,B型)進行中壓液相柱層析，柱壓力0.3~0.4MPa,用體積比為1:1的甲,水混合溶劑洗脫，按30毫升為1個流份接收，薄層層析檢測，合并含實施例1式1化合物CEDS的第612流份，^E蒸干溶劑后得到0.24克樣品-對該樣品采用高效液相色譜儀(戴安公司班行分離純化(高效液相色譜條件為大連依利特公司StaoChromOD&BP色譜柱250mmX10mm，49%甲醇為流動相，流速2mL/min,室溫，206nm紫外檢測)，得到實施例1式I化合物CEDS的純品105毫克?；痎4lr的結構鑒定實施例1式I化合物CEDS為無色結晶性粉末，分子式為Q5H74022S2Na2，熔點為231~232°C,+19.8°(c0.85，吡啶),，Liebe加咖-Burehani和Molish反應均為陽性。對化合物進行酸水解和相應分析，具體方法為-取3.0mg樣品，溶于2raoI/LCF3COOHlmL,置2mL安缻中，充氮氣，封管，于烘箱中120r加熱反應2h,40t減壓蒸干，反復加KfeOH(ImLX3)后WE抽干以除去CF3COOHf殘渣以CH2qWHaO(5mL/5mL)分配，CHjCk層鵬蒸干，采用高效液相色譜儀(戴安公司域行分離純化(高效液相色譜緒為大連依利特公司SinoamHnODS"BP色譜柱250mmX10imn,90%甲醇為流動相，流速2mlimin,室溫，206nm紫外檢溯)，得到CEDS的脫琉酸基苷元。該苷元加入新蒸餾的(+)nx-甲氣基w(三氟甲基)"苯乙酰氯10pL和無水吡啶50hL，放置反應I小時，減壓除去溶劑，得到相應的3,24>二<>MW)"MTPA醮，測試其核磁共振復譜(600M取CDC13):fi0.63(3H，M"8X0.84(3!i4/=6,6Hz>Me-27、0.87(3H,4/=6.6取Me德26)^0.93(3H，dlJ^6.6Hz;Me-21、0.95Nfo"19X3-52(1H，取H^6X4-51(1H,m，H-24X(1H，取H-3X532(1H，hnt^=5-4取H-11)-±^試驗結果表明CEDS的苷元鑭鏈具有24S構型，并且在24位連接W^酸鈉基。酸水解后的水層減壓蒸干，加入以下試劑(外1_氨基-2-丙醇/甲醇(體積比1:8)20mU乙膨甲醇(體積比l:4)17nU和3WNa(BH3CN]的甲醇溶液13jiL,在65。C反應1_5小時，冷卻至室溫，用3mol/LCFjCOOH調(diào)整pH值為l2,減壓蒸千，殘渣加入吡啶和療酐各0.5mL，100°<:反應1小時。反應產(chǎn)物用CH^C1^H^)(5mli5mL)分配，CHaCls層依次用飽和NaHCO3溶液0.5mL和水0.5mL(2次)IS;滌后蒸千，得到#^|的I-(S)rAr-acetyK2-hydroxyiHt)pyl咖ino)H"deoxyaklitolacetote衍生-物，溶于CHCb(X3mL,取lML進行GC分析。單糖對照品IX木糖和1>葡，各5mg,分別按相同衍生方法制備單糖衍生物，作為GC分析時的對照。GC分析采用Fi加iganVoyagerGC/MS聯(lián)用儀，配ULTRA-2毛細管色譜柱(50mX02mm),GC對比分析表明實施例1式I化合物CEDS至少含有2種糖基IH^IKfe=40.05min)和D"木糖(1r-29J22min),組成比為:L為鑒定CEDS中的LW^甲基奎諾糖，對CEDS傲了甲醇解和相應衍生及分析，具體方法為取樣品10mg溶于2mol/L無水鹽酸甲醇溶液0.5mL中，在100°C加熱4小時。用Ag^O^中和反應液后離心，上清液蒸干，殘査加入，溴苯甲酰氯l5mg，冬二甲氨基吡啶l鳴和無水蠍啶0.5mL,^氮氣保護的^#下在60°C攪拌過夜，反應液以CHaO/H^(5mL/5mL)分配，CHsq2層依次用飽和NaHC03溶液0.5mL和水0.5mL(2次)洗滌后蒸干，所獲得的產(chǎn)物溶于CHCl3中，進行硅膠柱層析(硅膠柱為l咖X10cm),來用正己烷-乙敏7:3)汰脫，收,先,的30mL溶液，蒸千，采用高效液枏色譜儀(戴安公司)進行分離純化(高效液相色譜條件為-HKaiomeBesLuna3硅自譜柱3l50nunX4.6mm,體積比為1:4的乙勝正己烷作為流動相，流速Iml/min,室溫，260mn紫外檢測)，得到甲基^二^0命溴苯甲酰>"3"0-甲基《-1>吡喃奎諾糖。核磁共振氣譜數(shù)據(jù)(600MHz^CDCI3>:各1.33(3H,4/=6.0私Me^X3.40(OMe),3.45(QMeX《00取H-5X3.98(IHt/=9.0H-3X5.0卜5.10(3H，m，H-l，H-2油dH4)^7.59-7.98(8fi取ArH)。以上試驗結果表明CEDS中含有1>30甲基奎諾糖。通過高分辨質(zhì)譜和核磁共振譜特別是二維核磁共振譜的綜合解析，確定了該化合物的結構。其波譜數(shù)據(jù)如下ESI-MS(正離子模式)mfe1099[M+Nal*,997[M+Na-SOjNa+Hr，979J>f+Na-NaHSOf,鄉(xiāng)IM德-MeQn0859lM+Ha~2xNaHS04;T，819197^MeQui]699[859-MeQui]68819~XyI]477[MeQwi+Xyl+Glc^af，315[MeQai+Xyl+Mar;ESI-MS(負離子模式)1053[M—NaJ",951[M-Na—SQjNa+Hf，柳[M-Na-MeQuir，761r，599t761~GfcnHRESI-MS(正離子模式)1099.3809[M+Naf(計算值C^t^jaSaNaj:1099.3806)。其1H和13C核磁共振數(shù)據(jù)見表1.表1實施樹1式I化合物CEDS的'H和13C核磁共搌數(shù)據(jù)"(測試溶劑氚代吡啶)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>"核磁數(shù)據(jù)經(jīng)由DQCOSY，TOCSXNOESXDEPT，HSQC和HMBC譜的分析得以確定。*括號'內(nèi)為偶合常數(shù)(Hz),饑葡萄糖，Xyl:木糖，MeQoi:3"0甲基奎諾糖。化^體^癍作用的研究對實施例1式1化合物CEDS進行了體外抗腫瘤試驗，；5^^采用的細胞株分別為K-562人白血病，U87MG人惡性膠貭癯、BEL"7402人肝痛，A-549人肺癌、MKN-28人胃癌、HCT-U6人結腸癌、MDA-Mfr435人乳腺痛、HL60人白血病細胞。其中，對前2種腫瘤細胞采用MTT法，對后6種腫瘤細自用SRB法渕試，在測試對K-562人白血病和BEL-7402人肝痛的細胞毒性時采用臨床柳的織藥物10^審樹械作為陽性對照；在測《對U87MG人惡性膠質(zhì)瘤的細跑毒性時采用轔床抗痛藥物鹽酸尼莫司汀作為陽性對照a(1)MTT法瀾試根據(jù)腫瘤細胞生長速率，將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞以4000個細鵬孔接種于96孔培養(yǎng)坂，貼壁生長24小時后，棄去原培養(yǎng)液，加入用DMEM培養(yǎng)液配制好的含不同濃度本發(fā)明化合物的溶液200pL,每個濃度設3個復孔，并設生理鹽水對照和無細胞調(diào)零孔》腫瘤細胞在37C、5%002~95%02條件下培養(yǎng)48小時，然后加入PBS溶解的濃度為10m^mL的Nnr(Signra公司):20ML,在同樣條件下孵育4小時。最后，每孔加入200fiL的二甲基亞砜，混勻，將96孔板置酶標儀上溯定各孔在490nm處的吸爐(OD泡。按下式計算被測物對腫癍細胞生長的抑制率-胂瘤抑制率-(l一洽療組OD值/對照組OD值)X100%半數(shù)有效抑制濃度IC鄰值采用Logit法計算。試驗結果見表2。其中，陽性對照藥物I(MS基蕃樹堿抑制K-562人白血病細胞生長的IC鄰值為0.18±0.05拜d/L,陽性對照藥物鹽酸尼莫司汀神制U87MG人惡性膠蹄細胞生長的ICso值為0鄰土0.06jimol/L。(2)SRB法瀕試根據(jù)腫瘤細胞生長速率，將處于對數(shù)生長期的細胞以90p!7孔接種于鄰，養(yǎng)板，貼壁生長24小時，加不同濃度的本發(fā)明化合物10nU孔，每個濃度設3個復孔，并設生理鹽水對照和無細胞調(diào)零孔。胂瘤細胞在37r;、5%0>2條件下培養(yǎng)7:2小時，然后傾去培養(yǎng)液，用IO齡TCA固定細胞，4'C放置I小時后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然千燥。然后加入由1%冰醋酸配制的濃度為4mg/mL的SRB(Sigma公司)溶液100jiU孔，室溫中染色15分鐘，去上清液，用1%^^洗滌5次，空氣中，，加入150jiL/孔的Tris溶液。將鄰孔板置酶標儀上測定各孔在520nm處的吸光度(OD難。按下式計算被測物對腫瘤細胞生長的抑制率.-腫瘤抑制率-(l—治療組OD傻/對照組OD值)X100%半數(shù)有效抑制濃度IC5o值采用Logh法計算。試驗結果見表2。其中，陽性對照藥物1(K羥基驀樹滅抑制BEL-74C2人肝痛細胞生長的ICs8值為0.40±0.08pmd/L。_表2實施例1式l化合物CEDS對腫瘤細胞的抑制作用__<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>化合物促進微管蛋白聚合作用的研究采用兩步法微管蛋白聚合篩選模型(HuW，DongH,Li仏HuXT,H油GJ，QuYB.Ahigh-IhriHighputnuxidforscreeninganti-tumoragentscapableofpromotingpolymerizationoftubulininvitro.ActaPbannacolSin,2004，25(6):775-782沐研究實施例1式I化合物CEDS對微管蛋白聚合的促進作用，具體方法為(1)制備微管蛋白微管蛋白由豬腦組織制備，取新鮮豬腦，用含lmol/L谷氨酸鈉和O.lmaiol/LGTP的水溶液勻漿，勻漿液在IOOOOO嗜條件下離心1小時，取上清液進行DEAE-Sepbadex柱層析，依次以含0.8moI/L谷氨酸鈉和0.1mmol/LGTP的水溶液以及含lmol/LNaCl、imol/L谷氨酸鈉和(U加加1/LGTP的水溶液汰脫，收集后一種洗脫液，即為DEAE-微管蛋白的溶液》DEAE魂管蛋白混懸于含Inuno!/LGTP的水溶液中，在37。C孵化45分鐘，然后在IQ0000嗜和37"C條件下離心I小時，得到熱聚合的微管沉淀。將沉淀分散于含mol/L谷氨酸鈉和0.1mmol/LGTP的水溶液中，在0。C下放置30分鐘，然后在100000xg和4°C條件下離心40分鐘，得到冷上清液，即為純化的微管蛋白。該微管蛋白儲存于液氣中，可用于下一步的終點促聚i^B將該微管蛋白進行SephadexG-50柱層析'以1mol/L谷氨酸鈉水溶維皿，收集^M液即得到無GDP氾TP的微管蛋白，可用于下一步的動力學促聚試驗。微管蛋白的聚合是通過測定含微管蛋白的溶液在350鵬處的吸M(OD難來反映的。試驗中采用抗癌藥紫杉醇作為陽性對照。(2)終點促聚試驗-溯試溶液含l^L微管蛋白、0.1mmol/LGTP、0.mmd/LCaCl2、10蹄^iL樣品或?qū)φ掌?，總體積O.l!￡(含4%Me2JSO)。按照試驗設計方案，將測試溶液在2°C條件下加入96孔培養(yǎng)板的每一孔中，立即采用酶標儀在2C條件下測定每孔的OD值。然后將培養(yǎng)板移到37C孵箱中,孵育20分鐘，之后再在37°C條件下溯定每孔的OD值?；衔锎龠M微管蛋白聚合的活性以終點促聚指數(shù)(戶。值)表示:A=[(OD^"OD('(OD,"OD/hlxI00%,其中OIX37，OD^，OD^和OD/分別為測試樣品在37。C和2°C以及溶劑陰性對照在37T和2°C測得的平均OD值《試驗結果表明實施例1式1化合物CEDS在10ng/mL濃度時的&值為40%,而陽性對照紫杉醇在10蹄'mL濃度時的&值為31%。(3)動力學促聚試驗測試溶液含1g/L無GTP的微管蛋白、0.1mmol/LCaa2、10略化L樣品或?qū)φ掌?，總體積O.lmL(含4，iMe2SO)。按照試驗設計方案，將測試溶液在2"C條件下加入鄰孔培養(yǎng)板的每一孔中，立即移到酶標儀上，在37^C條件下溯定每孔OD值，并連續(xù)瀕定25分鐘《記錄從6分鐘到16分鐘之間OD值變化的斜率，作為計算活性結果之用?；衔颽jt微管蛋白聚合的話性以動力學促聚指數(shù)(A值)表示A=-JWxI00%,其中fefe和^分別為湄試樣品、溶劑陰性對照和陽性對照的斜率平均值。it驗結果表明-實施例l式I化合物CEIW在10pg/mL濃度時的A值為"5%,而陽性對照紫杉醇在10陶/mL濃度時的±^試驗結果表明-實施例1式I化合物CEDS,促進微管蛋白聚合，并且該作用強于紫杉醇，可望開發(fā)成為一種結構類型與紫杉醇不同的激管穩(wěn)定劑類抗癌藥物。糊的制備汰射劑配方2mgCEDS,50ramol/L磷酸緩沖液，pH7.0,總體積1mL。制法-取實施例1式I化合物CEDS200oig,加50nund/L磷酸緩沖液(pH7.0)100mL,在無菌條件下完全溶解，分別經(jīng)過(B和G6玻砂過濾器過濾，翻于1mL安瓿中，100"C滅菌30分鐘，得100支?？诜乒|方-5毫克CEDS,50毫克甘露醇，100毫克可溶性淀粉，共制得l個單位(包、粒、片等》。制法取實施例1式I化合物CEDS5毫克，加50毫克甘露醇和100毫克可溶性淀粉.充分混勻后制粒，所制顙粒包裝即得顆粒劑所制顆粒裝于空膠囊殼中，即得膠囊劑；所制顆粒直接壓片，包薄膜衣，即得片劑。權利要求1.一種海星皂苷類抗腫瘤化合物，其特征在于化學結構式如下上述式1結構的化學名稱為(20R，24S)-6α-O-[3-O-甲基-β-D-吡喃奎諾糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基]-5α-膽甾-9(11)-烯-3β，24-二硫酸鈉鹽((20R，24S)-6α-O-[3-O-methyl-β-D-quinovopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyransoyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl]-5α-cholest-9(11)-en-3β，24-disulfatedisodiumsalt)，以下簡稱其為CEDS。2.權利要求I所述一種海星皇苷類抗腫瘤化合物，其制備方法是以新鮮采集的面包海星為原料，原料經(jīng)剪碎后，按璽量體積比加入35倍原料重的95%乙醇，回流提取3次，每次24小時；合并提取液，回收^M,得乙醇提取物，提取物分散于縫量f^m比3倍的水中，分別用和水等體積的石油醚^t3次，萃取后的水相再分別用與水等體積的正丁醇萃取5次，合并正丁醇萃取液，蒸千得到總苷提取物總苷提取物應用硅膠柱層析，以體積比為2:1力M):6:1的氯仿-水,的正丁,甲醇混合溶劑洗脫，得到含式l化合物CEDS的海星皂苷混合物；該海星皂皆混合物J^用ScphadexLH-20凝膠柱層析和中壓液相柱層析純化，均分別采用體積比為1:1的甲醇-水混合溶劑艦，合并含式I化合物CEDS的流份，再經(jīng)高效液相色譜儀分離純化，用^!R比為48:524免51的甲醇-水混合溶劑為流動相汰脫，得到式I化合物CEDS的純品。3.根據(jù)權利要求2所述的一種海星皂苷類ttSt瘤化^f的制備方法，其特征在于除應用常規(guī)的溶劑提取、溶劑萃取和各種色譜分離技術外，在應用硅膠柱層析方法從總苷提取物制備含式I化合物CEDS的海星皇苷混^l時，對該海星皂苷混合物的確定是采用如下手段來檢査齣以硅膠薄層層析檢瀬，采用體積比為12:3:5的正丁醇-乙酸-水混合^W或體積比為80:18:2的氣仿-甲"水混合溶劑展開，收集Rf值在0_20~O25處顯示紫紅色斑點的流份，即為含式I化合物CEDS的海星皂苷混^J。4.權利要求1所述一種海星皂苷類,瘤化合物，其特征在于所述的一種海星慈苷類抗腫痛化合物可以在制備抗腫瘤藥物中，使用或與其他藥物配合制備成在臨床上可以使用的各種不同劑型的藥物，如糊劑、或敢劑、或丸劑、或膠囊劑、或片劑、或微囊劑、或軟膠囊劑、或膀劑、或裔劑、或酊劑、或顙粒劑、或氣霧劑。5.權利要求4所述一種海星皂苷類抗腫癯化，，其特征在于所述的式I化，CEDS制備成抗腫癍藥物對K-562人白血病、BEL-7402人肝癌等8種不同的腫瘤細胞株均顯示抑制作用-全文摘要本發(fā)明提供了一種海星皂苷類化合物，分子式為C₄₅H₇₄O₂₂S₂Na₂。采用波譜解析和化學手段，確定該化合物的化學結構為(20R，24S)-6α-O-[3-O-甲基-β-D-吡喃奎諾糖基-(1→2)-β-D-吡喃木糖基-(1→3)-β-D-吡喃葡萄糖基]-5α-膽甾-9(11)-烯-3β，24-二硫酸鈉鹽((20R，24S)-6α-O-[3-O-methyl-β-D-quinovopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl]-5α-cholest-9(11)-en-3β，24-disulfatedisodiumsalt)。體外抗腫瘤試驗表明，該化合物對K-562人白血病和BEL-7402人肝癌等8種腫瘤細胞有明顯的抑制作用。該化合物在體外試驗中還能夠促進微管蛋白聚合。本發(fā)明可為研制新的抗腫瘤藥物提供先導化合物，可望成為治療癌癥的藥物。文檔編號C07J17/00GK101362790SQ20081015108公開日2009年2月11日申請日期2008年9月24日優(yōu)先權日2008年9月24日發(fā)明者軍巫,文愛東,楊志福,湯海峰,光程,趙越平申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學