專(zhuān)利名稱(chēng)：針對(duì)n-鈣黏著蛋白的完全人抗體的制作方法
針對(duì)N-鈣黏著蛋白的完全人抗體相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2008年11月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/113，042的優(yōu)先權(quán)， 該申請(qǐng)通過(guò)引用納入本文。對(duì)于聯(lián)邦資助研發(fā)作出發(fā)明的權(quán)利的聲明NIH/NCI SOMI 培訓(xùn)基金(Training Grant), R25 CA 098010，Μ· Phelps/A. Wu，指導(dǎo)人 NIH/NCI UCLA 前列腺 SPORE，P50 CA 092131，R. Reiter/A. Wu.政府對(duì)本發(fā)明享有一定權(quán)利。以光盤(pán)形式提交的序列表、表格或計(jì)算機(jī)程序列表附件的引用不適用。
背景技術(shù)：
前列腺癌是美國(guó)男性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤和癌癥相關(guān)死亡的第二大主要原因。前列腺癌在生物學(xué)和臨床上是異質(zhì)性疾病?；即朔N惡性腫瘤的大部分男性攜帶緩慢生長(zhǎng)的腫瘤，這些腫瘤可能不影響個(gè)體的自然壽命，然而某些人則患進(jìn)展快速的轉(zhuǎn)移性腫瘤。PSA篩選受限于缺乏特異性和不能預(yù)測(cè)哪些患者具有發(fā)生激素難治轉(zhuǎn)移性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。近年研究提倡降低PSA的診斷閾值，這樣可能增加前列腺癌診斷數(shù)量，更難于鑒定患有無(wú)痛和侵襲性癌癥的患者(Punglia等.，N Engl J Med, 349 =335-342 (2003)) 急需與臨床結(jié)局相關(guān)的或可鑒定潛在侵襲性前列腺癌疾病患者的新的血清和組織標(biāo)記物(Welsh等.,Proc Natl Acad Sci U S A，100 :3410-3415(2003))。近年來(lái)表達(dá)模式研究提示，原發(fā)性腫瘤中可能存在轉(zhuǎn)移性與非轉(zhuǎn)移性腫瘤的表達(dá) (Ramaswamy φ . ,Nat Genet, 33 :49-54(2003) ；Sotiriou^. ，Proc Natl Acad Sci U
S A, 100 :10393-10398 000 )。原發(fā)性腫瘤中也有一定頻率的腫瘤具有傾向轉(zhuǎn)移至特定器官的其它特征(Kang等.,Cancer Cell，3 :537-549 ^00 )。這些最近的觀(guān)察提示可在早期疾病中鑒定到轉(zhuǎn)移前或激素難治前列腺癌的新型標(biāo)記物。生物學(xué)中這些標(biāo)記物也可能對(duì)轉(zhuǎn)移性或激素難治前列腺癌的發(fā)展有所作用。存在于原發(fā)性腫瘤中與結(jié)局相關(guān)在前列腺癌發(fā)展的生物學(xué)中有所作用的基因的最新例子包括EZH2和LIM激酶(Varambally等.,Nature, 419 :624-629(2002) ；Yoshioka 等·，Proc Natl Acad Sci U S A，100 :7247-7252 (2003))。 然而，這兩種基因均為非分泌型。為鑒定激素難治前列腺癌的新的候選血清或組織標(biāo)記物，我們以前曾比較過(guò)配對(duì)的激素依賴(lài)性與激素難治性前列腺癌的異種移植物的基因表達(dá)模式。免疫缺陷小鼠去勢(shì)后，從成骨細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移灶建立的LAPC-9異種移植物即從雄激素依賴(lài)性發(fā)展成不依賴(lài)性 (Craft等.，Cancer Research, In Press (1999))。曾利用其鑒定前列腺癌的候選治療靶標(biāo)。 驗(yàn)證了表達(dá)有差異的基因，然后檢查它們與分泌蛋白或細(xì)胞表面蛋白的序列同源性。N-鈣黏著蛋白(N-cad)已鑒定為癌癥的標(biāo)記物。已有報(bào)道鑒定到激素難治前列腺癌和膀胱癌均表達(dá)N-鈣黏著蛋白、并對(duì)其作了表征和初步驗(yàn)證(W0/2007/109347)。胚胎發(fā)生中觀(guān)察到一類(lèi)細(xì)胞的移動(dòng)需要喪失細(xì)胞間接觸，才能使單個(gè)細(xì)胞或一小組細(xì)胞通過(guò)胞外基質(zhì)遷移。該過(guò)程稱(chēng)為上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)。EMT也發(fā)生在病理學(xué)狀況時(shí)，例如上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞獲得能動(dòng)性和侵襲性表型。EMT的標(biāo)志是喪失E-鈣黏著蛋白和N-鈣黏著蛋白分子的重頭表達(dá)。N-鈣黏著蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活、遷移和侵襲，高水平的N-鈣黏著蛋白表達(dá)常與預(yù)后差相關(guān)。N-鈣黏著蛋白也在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在正常血管和腫瘤相關(guān)新生成血管的成熟和穩(wěn)定中起實(shí)質(zhì)性作用。不斷增加的實(shí)驗(yàn)證據(jù)提示N-鈣黏著蛋白是癌癥的潛在治療靶標(biāo)。已在分子水平上研究了 N-鈣黏著蛋白的功能。N-鈣黏著蛋白的N-末端胞外區(qū)域 (160-724a. a)含5個(gè)結(jié)構(gòu)域(ECD1-ECD5)。ECDl和ECD2是細(xì)胞胞間粘附所需的最小結(jié)構(gòu)域，但如果所有胞外結(jié)構(gòu)域都參與時(shí)，則粘附水平增強(qiáng)。此外，研究顯示ECD4的69個(gè)氨基酸部分是遷移和運(yùn)動(dòng)所必須的，但對(duì)細(xì)胞粘附?jīng)]有作用(Kim等.J Cell Biol 2000)。因此，本發(fā)明提供診斷、預(yù)后和治療表達(dá)N-鈣黏著蛋白癌癥的靶向N-鈣黏著蛋白的組合物和方法，所述癌癥包括但不限于前列腺癌和膀胱癌。本文也報(bào)告了針對(duì)N-鈣黏著蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的特異性抗體及其片段。發(fā)明概述本發(fā)明提供針對(duì)N-鈣黏著蛋白的完全人抗體以供癌癥，例如前列腺癌和膀胱癌的治療和診斷方法。附圖簡(jiǎn)述

圖1.通過(guò)連續(xù)多輪淘選富集抗N-鈣黏著蛋白噬菌體展示抗體。圖2.PC3 細(xì)胞的 A14、C7、E4 和 D4 雙抗體(diabody)染色。圖3. C7雙抗體與N-鈣黏著蛋白陰性細(xì)胞結(jié)合。圖4. E4和D4雙抗體與表達(dá)N-鈣黏著蛋白的細(xì)胞特異性結(jié)合。圖5. 124I標(biāo)記D4 Db在LAPC9 AI腫瘤中的腫瘤定位。圖6. N-鈣黏著蛋白活化NF- κ B。圖7. N-鈣黏著蛋白活化NF- κ B。圖8. N-鈣黏著蛋白在Cl細(xì)胞的細(xì)胞表面表達(dá)。圖9. NF- κ B定位于N-鈣黏著蛋白陽(yáng)性細(xì)胞(Cl)的細(xì)胞核。圖10. N-鈣黏著蛋白表達(dá)導(dǎo)致誘導(dǎo)IL-6、IL-8、TGF β 2和bcl_2。圖11.被誘導(dǎo)基因與N-鈣黏著蛋白水平的相關(guān)性。圖12. N-鈣黏著蛋白基因敲減導(dǎo)致IL-6和IL-8下調(diào)。圖13. N-鈣黏著蛋白抗體處理后的NF- κ B活性。圖14. PC3細(xì)胞中的Ncad 抗體溫育48小時(shí)后。圖15. N-鈣黏著蛋白基因敲減導(dǎo)致活化Akt下調(diào)。圖16. N-鈣黏著蛋白特異性抗體活化，然后下調(diào)Akt的活化。發(fā)明詳述在此，我們報(bào)道了治療癌癥患者的方法和鑒定癌癥干細(xì)胞的方法，其中所述癌細(xì)胞中N-鈣黏著蛋白以正?；蜉^低水平表達(dá)，或者由癌細(xì)胞的亞組表達(dá)且不過(guò)表達(dá)。在此， 我們也報(bào)道了 N-鈣黏著蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的特異性抗體及其片段。N-鈣黏著蛋白的表達(dá)可促進(jìn)前列腺和膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移以及前列腺癌發(fā)展成激素難治疾病。可單獨(dú)或與其它小分子抑制劑mTOR和EGFR聯(lián)用治療性靶向N-鈣黏著蛋白。 靶向N-鈣黏著蛋白有助于預(yù)防或控制發(fā)生侵襲性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌。
本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)，即與正常組織相比，N-鈣黏著蛋白無(wú)需過(guò)表達(dá)即可作為治療和診斷的靶標(biāo)。其可以是低水平表達(dá)，也可僅由細(xì)胞亞組表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)即使靶向5%前列腺癌細(xì)胞的N-鈣黏著蛋白也足以阻斷前列腺癌發(fā)展成為去勢(shì)耐受性。本發(fā)明也涉及作為癌癥干細(xì)胞靶標(biāo)的N-鈣黏著蛋白。我們發(fā)現(xiàn)靶向5%或更少細(xì)胞的N-鈣黏著蛋白足以阻斷腫瘤發(fā)展。該發(fā)現(xiàn)與N-鈣黏著蛋白是癌癥干細(xì)胞的標(biāo)記物以及抑制這些干細(xì)胞的N-鈣黏著蛋白足以全面阻斷腫瘤生長(zhǎng)的假設(shè)相一致。本發(fā)明還涉及以下發(fā)現(xiàn)，即表達(dá)N-鈣黏著蛋白的細(xì)胞比不表達(dá)N-鈣黏著蛋白的細(xì)胞更具有致瘤性，這與其作為癌癥干細(xì)胞標(biāo)記物相一致。N-鈣黏著蛋白陽(yáng)性細(xì)胞可產(chǎn)生 N-鈣黏蛋白陰性細(xì)胞，也與N-鈣黏著蛋白是癌癥干細(xì)胞的新型標(biāo)記物的理論相一致。最后，腫瘤必須上調(diào)或獲得N-鈣黏著蛋白才能生長(zhǎng)。即腫瘤干細(xì)胞必須獲得上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變的特性才有致瘤性。因此，N-鈣黏著蛋白是一種特別有希望的治療靶標(biāo)。發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞表面，在許多上皮腫瘤中表達(dá)，并與侵襲性、轉(zhuǎn)移性相關(guān)，還可能不依賴(lài)雄激素。因此，抗N-鈣黏著蛋白的抗體特別優(yōu)選用于治療上皮癌癥，包括但不限于泌尿生殖道(膀胱、前列腺)癌癥，更具體地說(shuō)，它們是侵襲性或轉(zhuǎn)移癌癥的治療藥物。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選抗N-鈣黏著蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，這些癌癥的治療優(yōu)選N-鈣黏著蛋白的第四胞外結(jié)構(gòu)域，第一到第三結(jié)構(gòu)域，或第一和第二結(jié)構(gòu)域的諸部分，第一胞外結(jié)構(gòu)域(ECl)。 在一些實(shí)施方式中，特別優(yōu)選在這些治療中采用抗胞外結(jié)構(gòu)域4的抗體，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域?qū)Υ龠\(yùn)動(dòng)性(pro-motility)和侵襲潛能至關(guān)重要(參見(jiàn)Kim等，J Cell Biol. 151(6) 1193-206 0000)，關(guān)于各種N-鈣黏著蛋白結(jié)構(gòu)域的定義，通過(guò)引用全文納入本文)。在此，我們描述了兩種獨(dú)立N-鈣黏著蛋白重組蛋白的特異性人scFv的選擇和表征N-鈣黏著蛋白胞外結(jié)構(gòu)域l-3(ECDl-3)和N-鈣黏著蛋白第四結(jié)構(gòu)域(ECD4)。設(shè)計(jì)了兩個(gè)獨(dú)立的篩選(方法)以期產(chǎn)生能影響該分子的粘附和遷移表型的特異性制劑以及產(chǎn)生靶向表達(dá)N-鈣黏著蛋白的細(xì)胞的試劑。通過(guò)ELISA和流式細(xì)胞術(shù)表征第4輪淘選后的各噬菌體克隆。測(cè)定了特異性結(jié)合物的序列，取一些選擇的克隆重新組成二價(jià)抗體小片段(雙抗體)。這種雙抗體顯示與表達(dá)N-鈣黏著蛋白的細(xì)胞特異性結(jié)合。本文所述的抗-N-鈣黏著蛋白片段是一種基礎(chǔ)構(gòu)建模塊，在此基礎(chǔ)上可構(gòu)成形狀和大小各異的全人抗體或工程改造抗體，此抗體的基本屬性是能特異性結(jié)合N-鈣黏著蛋白?？捎眠@些抗體治療或診斷表達(dá)N-鈣黏著蛋白的前列腺癌、膀胱癌或其它癌癥。至關(guān)重要的是注意到N-鈣黏著蛋白可由腫瘤細(xì)胞本身或任何周?chē)|(zhì)(肌肉、成纖維細(xì)胞、血管等)表達(dá)。我們以前曾證明N-鈣黏著蛋白是前列腺癌、膀胱癌和其它癌癥發(fā)生侵襲、生長(zhǎng)、 轉(zhuǎn)移和發(fā)展的生物學(xué)重要決定因素，是診斷、預(yù)后和治療的至關(guān)重要靶標(biāo)?？筃-鈣黏著蛋白的小鼠單克隆抗體在癌癥動(dòng)物模型中能阻斷腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲和發(fā)展成雄激素不依賴(lài)性。已發(fā)現(xiàn)不難將人scFv重新組成全抗體或工程改造抗體，從而能夠靶向癌癥而不刺激針對(duì)這種抗體的免疫應(yīng)答。據(jù)我們所知，我們描述了以診斷和治療前列腺癌和其它癌癥為目的而制備的抗 N-鈣黏著蛋白的第一種人抗體片段。本發(fā)明是基礎(chǔ)是我們課題組開(kāi)發(fā)的N-鈣黏著蛋白涉及前列腺和膀胱及其它癌癥進(jìn)展的現(xiàn)有技術(shù)以及治療性靶向其的概念。噬菌體展示描述了分離抗體片段的已良好建立的技術(shù)。本文所用的非免疫噬菌體文庫(kù)由加利福尼亞州舊金山分校的JD Marks博士所開(kāi)發(fā)。本發(fā)明描述了能識(shí)別N-鈣黏著蛋白的單鏈抗體片段的分離和表征。這些片段可用作單鏈片段或重新組成較大片段，例如全I(xiàn)gG，用于診斷或治療癌癥。如本文所述，本發(fā)明描述了具有推定的診斷和治療應(yīng)用價(jià)值的許多候選片段，這些片段可重新組成較大構(gòu)建物用于識(shí)別前列腺癌和其它癌癥的N-鈣黏著蛋白?？刹捎眠@些抗體本身(裸抗體)或可偶聯(lián)于放射性同位素、納米顆粒、脂質(zhì)體、病毒或任何其它“有效負(fù)載”以便為治療、成像或其它目的而遞送至腫瘤?？衫眠@些片段來(lái)提高表達(dá)N-鈣黏著蛋白的腫瘤的治療或成像模式的特異性。據(jù)我們所知，我們首次證明抗N-鈣黏著蛋白的抗體具有治療活性，優(yōu)于靶向此類(lèi)腫瘤的任何其它已知方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于所述抗體片段無(wú)免疫原性，是人抗體，不作其它修飾即可用于患者。識(shí)別N-鈣黏著蛋白的片段具有靈活優(yōu)點(diǎn)，S卩，不難為任何目的而工程改造它們?！癗-鈣黏著蛋白和E-鈣黏著蛋白”指具有以下特征的核酸，例如基因、前-mRNA、 mRNA和多肽、多態(tài)性變體、等位基因、突變體和種間同源物(1)所含的氨基酸序列優(yōu)選在至少約25、50、100、200、500、1000個(gè)或更多個(gè)氨基酸的區(qū)域上，與各參比核酸編碼的多肽， 或本文所述的氨基酸序列(分別如圖7、8和9所示)的氨基酸序列相同性，大于約60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%，優(yōu)選 91 %、92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 % 或 99%或更高；(2)特異性結(jié)合用包含參比氨基酸序列(分別如圖7、8和9所示)的免疫原、 它們各自的免疫原性片段及其各自的保守性修飾變體所產(chǎn)生的抗體，例如多克隆抗體；(3) 在嚴(yán)格雜交條件下特異性雜交編碼參比氨基酸序列(分別如圖7、8和9所示)的核酸及其保守性修飾變體；(4)所含的核酸序列優(yōu)選在至少約25、50、100、150、200、250、500、1000個(gè)或更多個(gè)核苷酸的區(qū)域上，與圖7、8和9分別顯示的參比核酸序列的核苷酸序列相同性大于約95 %，優(yōu)選大于約96 %、97%、98 %、99%或更高。多核苷酸或多肽序列通常來(lái)自哺乳動(dòng)物，包括但不限于靈長(zhǎng)類(lèi)，例如人；嚙齒類(lèi)，例如大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠；奶牛、豬、馬、綿羊或任何哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)包括天然產(chǎn)生或重組的分子?！鞍┌Y”指人癌癥和癌瘤、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括實(shí)體瘤和淋巴癌、腎癌、乳腺癌、肺癌、腎癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、腦癌、頭頸癌、皮膚癌、子宮癌、睪丸癌、食道癌和肝癌；淋巴瘤，包括非霍奇金和霍奇金淋巴瘤、白血病和多發(fā)性骨髓瘤?！懊谀蛏车腊┌Y”指尿道和生殖組織的人癌癥，包括但不限于腎癌、膀胱癌、 泌尿道癌、尿道癌、前列腺癌、陰莖癌、睪丸癌、陰門(mén)癌、宮頸癌和卵巢組織癌。本文要治療的癌癥的特征是N-鈣黏著蛋白過(guò)度活化?；蛘撸疚囊委煹陌┌Y可以是N-鈣黏著蛋白在正?；虻退奖磉_(dá)，或N-鈣黏著蛋白由細(xì)胞亞組表達(dá)，并且N-鈣黏著蛋白未過(guò)表達(dá)的癌癥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，進(jìn)行診斷或預(yù)后試驗(yàn)以確定患者癌癥的特征是否為N-鈣黏著蛋白表達(dá)。考慮了測(cè)定此類(lèi)擴(kuò)增/表達(dá)的各種試驗(yàn)，包括免疫組化、FISH和脫落抗原試驗(yàn)(shed antigen assay)、Southern印跡或PCR技術(shù)。此外，可采用體內(nèi)診斷試驗(yàn)評(píng)估N-鈣黏著蛋白表達(dá)或擴(kuò)增，例如通過(guò)給予能結(jié)合待檢測(cè)分子并用可檢測(cè)標(biāo)記物(例如，放射性同位素)作標(biāo)記的分子(例如，抗體)，再外部掃描患者該標(biāo)記物的定位。在一些實(shí)施方式中，待治療的癌癥尚無(wú)侵襲性，但表達(dá)N-鈣黏著蛋白。
“治療耐受的”癌癥、腫瘤細(xì)胞和腫瘤，指對(duì)凋亡介導(dǎo)(例如，通過(guò)死亡受體細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，例如Fas配體受體、TRAIL受體、TNF-Rl、化療藥物、放療)和非凋亡介導(dǎo)的(例如， 毒性藥物、化學(xué)品)的癌癥治療，包括化療、激素治療、放療和免疫治療變得耐受或難治的癌癥?！斑^(guò)表達(dá)”指測(cè)試組織樣品中N-鈣黏著蛋白、LY6-E和E-鈣黏著蛋白的RNA或蛋白質(zhì)表達(dá)分別明顯高于對(duì)照組織樣品中的N-鈣黏著蛋白、LY6-E和E-鈣黏著蛋白的RNA或蛋白質(zhì)表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組織樣品是自體樣品。與不大可能發(fā)展成轉(zhuǎn)移的患者的癌癥組織或與正常(即，非癌癥)組織樣品相比，與侵襲性、轉(zhuǎn)移性、激素不依賴(lài)性(例如，雄激素不依賴(lài))、或?qū)χ委熌褪芑蚧及┛赡苄栽黾酉嚓P(guān)的測(cè)試癌組織樣品(例如，膀胱、 前列腺)的N-鈣黏著蛋白或LY6-E mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)通常至少高2倍，常高最多3、4、5、 8、10倍或更高。當(dāng)觀(guān)察用測(cè)試和對(duì)照樣品作大致類(lèi)似加載的凝膠條帶時(shí)，不難看到此類(lèi)差異。N-鈣黏著蛋白或Ly6-E表達(dá)量增加的前列腺癌更可能變得具有侵襲性、轉(zhuǎn)移或發(fā)展成雄激素不依賴(lài)性或難治癌癥。各種截?cái)嘀蹬cN-鈣黏著蛋白或Ly6-E陽(yáng)性相關(guān)，因?yàn)樵l(fā)性腫瘤中存在少量百分比的N-鈣黏著蛋白或Ly6-E陽(yáng)性細(xì)胞就可鑒定為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高的腫瘤。術(shù)語(yǔ)“過(guò)表達(dá)”或“過(guò)表達(dá)的”可互換使用，指與正常細(xì)胞相比，在高于可檢測(cè)水平轉(zhuǎn)錄或翻譯的基因，通常在癌細(xì)胞中。因此，過(guò)表達(dá)指蛋白質(zhì)和RNA 二者過(guò)表達(dá)(由于轉(zhuǎn)錄、 轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工、穩(wěn)定性改變和蛋白質(zhì)降解改變所致)以及蛋白質(zhì)運(yùn)送模式改變(核定位增加)和功能活性增強(qiáng)，例如由于底物的酶水解增加所致的局部過(guò)表達(dá)。與正常細(xì)胞或比較細(xì)胞(例如，BPH細(xì)胞)相比，過(guò)表達(dá)也可以是增加50%、60%、70%、80%、 90%或更高。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)N-鈣黏著蛋白的癌癥”和“N-鈣黏著蛋白表達(dá)相關(guān)癌癥”可互換，指以上定義的表達(dá)N-鈣黏著蛋白的癌細(xì)胞或組織。術(shù)語(yǔ)“癌癥-相關(guān)抗原”或“腫瘤特異性標(biāo)記物”或“腫瘤標(biāo)記”可互換，指相比于正常細(xì)胞，優(yōu)先在癌癥細(xì)胞中表達(dá)的分子(通常是蛋白質(zhì)、碳水化合物或脂質(zhì))，可利用這種分子使藥理學(xué)制劑優(yōu)先靶向癌細(xì)胞。標(biāo)記物或抗原可在細(xì)胞表面或胞內(nèi)表達(dá)。癌癥相關(guān)抗原是相比于正常細(xì)胞在癌癥細(xì)胞中常表達(dá)穩(wěn)定或極少降解的分子，例如相比于正常細(xì)胞表達(dá)高2-倍、表達(dá)高3-倍或更高。癌癥相關(guān)抗原常是癌癥細(xì)胞中不適當(dāng)合成的分子，例如相比于正常細(xì)胞表達(dá)的分子含有缺失、添加或突變的分子。癌癥相關(guān)抗原常僅在癌細(xì)胞中表達(dá)，而在正常細(xì)胞中不合成或表達(dá)。示范性的細(xì)胞表面腫瘤標(biāo)記物包括乳腺癌的蛋白質(zhì) c-erbB-2和人表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)，前列腺癌的PSMA，和包括乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸直腸癌在內(nèi)的許多癌癥中的碳水化合物粘蛋白。示范性的胞內(nèi)腫瘤標(biāo)記物包括，例如突變的腫瘤抑制蛋白或細(xì)胞周期蛋白，包括P53。相反，E-鈣黏著蛋白通常在癌癥患者的癌性組織樣品中表達(dá)不足 (imderexpression)，這些癌癥可能變成侵襲性、轉(zhuǎn)移或發(fā)展成雄激素不依賴(lài)性或難治癌癥。這種表達(dá)不足可以是低兩倍、三倍、四倍或至少五倍。觀(guān)察采用測(cè)試和對(duì)照樣品作大致類(lèi)似加載的凝膠條帶時(shí)，不難看到此類(lèi)差異。因此，在可能變成侵襲性、轉(zhuǎn)移或發(fā)展成雄激素不依賴(lài)性或難治癌癥的癌癥中，組合的N-鈣黏著蛋白/E-鈣黏著蛋白值甚至更高，可以高至少兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或二十倍。各種截?cái)嘀蹬cN-鈣黏著蛋白陽(yáng)性/E-鈣黏著蛋白陰性相關(guān)，因?yàn)樵l(fā)性腫瘤中存在少量百分比的N-鈣黏著蛋白陽(yáng)性細(xì)胞就可鑒定為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高的腫瘤?！凹?dòng)劑”指能結(jié)合本發(fā)明多肽或多核苷酸，刺激、提高、活化、促進(jìn)、增強(qiáng)活化、致敏或上調(diào)本發(fā)明多肽或多核苷酸活性或表達(dá)的制劑?！稗卓箘敝改芤种票景l(fā)明多肽或多核苷酸表達(dá)，或能結(jié)合、部分或完全阻斷刺激、 降低、阻止、延遲活化、滅活、脫敏或下調(diào)本發(fā)明多肽或多核苷酸活性的制劑。表達(dá)或活化的“抑制劑”、“活化劑”和“調(diào)節(jié)劑”分別指采用體外和體內(nèi)試驗(yàn)鑒定， 對(duì)表達(dá)或活化具有抑制、激活或調(diào)節(jié)作用的分子，例如配體、激動(dòng)劑、拮抗劑和它們的同源物及模擬物。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)劑”包括抑制劑和活化劑。抑制劑是，例如，能抑制本發(fā)明多肽或多核苷酸表達(dá)，或者能結(jié)合、部分或完全阻斷刺激或酶活性、降低、防止、延遲激活，滅活、脫敏或下調(diào)本發(fā)明多肽或多核苷酸活性的制劑，如拮抗劑?；罨瘎┦?，例如，能誘導(dǎo)或活化本發(fā)明多肽或多核苷酸的表達(dá)，或者能結(jié)合、刺激、提高、打開(kāi)、激活、促進(jìn)、增強(qiáng)活化或酶活性、 致敏或上調(diào)本發(fā)明多肽或多核苷酸活性的制劑，如激動(dòng)劑。調(diào)節(jié)劑包括天然產(chǎn)生的和合成的配體、拮抗劑、激動(dòng)劑、小化學(xué)分子等。鑒定抑制劑和活化劑的試驗(yàn)包括例如，在存在或不存在本發(fā)明多肽或多核苷酸時(shí)將推定的調(diào)節(jié)化合物施加于細(xì)胞，然后測(cè)定對(duì)本發(fā)明多肽或多核苷酸活性的功能影響。將用潛在的活化劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑處理的包含本發(fā)明多肽或多核苷酸的樣品或試驗(yàn)結(jié)果與沒(méi)有該抑制劑、活化劑或調(diào)節(jié)劑的對(duì)照樣品作比較，以檢測(cè)影響程度。將對(duì)照樣品(未用調(diào)節(jié)劑處理)的相對(duì)活性值指定為100%。當(dāng)本發(fā)明多肽或多核苷酸的活性值為對(duì)照的約80%，任選50%或25-1%時(shí)，實(shí)現(xiàn)了抑制。當(dāng)本發(fā)明多肽或多核苷酸的活性值為對(duì)照的110 %，任選150 %，任選200-500 %，或1000-3000 %或更高時(shí)， 實(shí)現(xiàn)了激活。本文所用術(shù)語(yǔ)“測(cè)試化合物”或“候選藥物”或“調(diào)節(jié)劑”或其語(yǔ)法等同形式描述了天然產(chǎn)生或合成的任何分子，如蛋白質(zhì)、寡肽(如長(zhǎng)約5-25個(gè)氨基酸，優(yōu)選長(zhǎng)約10-20個(gè)或12-18個(gè)氨基酸，優(yōu)選長(zhǎng)12、15或18個(gè)氨基酸)，有機(jī)小分子、多糖、脂質(zhì)、脂肪酸、多核苷酸、RNAi、siRNA、抗體、寡核苷酸等。所述測(cè)試化合物可以是測(cè)試化合物的文庫(kù)形式，例如能提供足夠多樣性的組合文庫(kù)或隨機(jī)文庫(kù)。任選將測(cè)試化合物連接于融合伴侶，如靶向化合物、拯救化合物、二聚化合物、穩(wěn)定性化合物、可尋址化合物和其它功能分子。通常，通過(guò)鑒定具有某些所需特性或活性，如抑制活性的測(cè)試化合物(稱(chēng)為“先導(dǎo)化合物”)，產(chǎn)生先導(dǎo)化合物的變體，并評(píng)估這些化合物變體的特性和活性，從而產(chǎn)生具有有用特性的新化學(xué)實(shí)體。 這種分析中常常采用高通量篩選(HTQ方法?！坝袡C(jī)小分子”指分子量大于約50道爾頓小于約2500道爾頓，優(yōu)選小于約2000道爾頓，優(yōu)選約100-1000道爾頓之間，更優(yōu)選約200-500道爾頓之間的天然產(chǎn)生或合成的有機(jī)分子。細(xì)胞毒性制劑包括“細(xì)胞周期特異性”或“抗有絲分裂”或“細(xì)胞骨架相互作用”藥物。這些術(shù)語(yǔ)可互換，指能阻斷細(xì)胞有絲分裂的任何藥理學(xué)制劑。此類(lèi)制劑可用于化療。細(xì)胞周期特異性藥物通常能結(jié)合細(xì)胞骨架微管蛋白而阻斷微管蛋白聚合成微管的能力，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停滯在中期。示范性的細(xì)胞周期特異性藥物包括長(zhǎng)春花生物堿、紫杉烷類(lèi)、秋水仙素和鬼白毒素。示范性長(zhǎng)春花生物堿包括長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞濱。示范性紫杉烷類(lèi)包括紫杉醇和多西他賽。細(xì)胞骨架相互作用藥物的另一實(shí)例包括2-甲氧基雌
“siRNA”或“RNAi”指形成雙鏈RNA的核酸，當(dāng)siRNA在基因或靶基因相同的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，所述雙鏈RNA能降低或抑制所述基因或靶基因的表達(dá)。因此，“siRNA”或“RNAi” 指由互補(bǔ)鏈所形成的雙鏈RNA0雜交形成雙鏈分子的siRNA的互補(bǔ)部分通常基本上或完全相同。在一個(gè)實(shí)施方式中，siRNA指與靶基因基本上或完全相同而形成雙鏈siRNA的核酸。 所述siRNA通常長(zhǎng)至少約15-50個(gè)核苷酸，例如雙鏈siRNA的各互補(bǔ)序列長(zhǎng)15-50個(gè)核苷酸，所述雙鏈siRNA長(zhǎng)約15-50個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選約20-30個(gè)核苷酸堿基，優(yōu)選約20-25或約 24-29 個(gè)核苷酸，例如長(zhǎng) 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個(gè)核苷酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知siRNA分子和載體的設(shè)計(jì)和制備。例如，設(shè)計(jì)合適siRNA 的有效方法是始于mRNA轉(zhuǎn)錄的AUG起始密碼子(例如，參見(jiàn)圖5)和掃描AA 二核苷酸序列(參見(jiàn)Elbashir等· EMBO J 20 :6877-6888(2001) 每個(gè)AA禾口 3'毗連核苷酸是潛在的siRNA靶位點(diǎn)。此毗連位點(diǎn)序列的長(zhǎng)度將決定siRNA的長(zhǎng)度。例如，19個(gè)毗連位點(diǎn)可產(chǎn)生21核苷酸長(zhǎng)的siRNA。含3’突出UU 二核苷酸的siRNA通常最有效。該方法與利用RNA pol III來(lái)轉(zhuǎn)錄發(fā)夾siRNA也相容。RNA pol III在4_6個(gè)核苷酸的多聚(T)段處終止轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生含短的多聚(U)尾的RNA分子。然而，含有其它3’末端突出二核苷酸的siRNA也能有效誘導(dǎo)RNAi，可憑經(jīng)驗(yàn)選擇這種序列。對(duì)于選擇性，可進(jìn)行BLAST檢索以避免與其它編碼序列同源的含16-17個(gè)以上毗連堿基對(duì)的靶序列(參見(jiàn)www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)?？芍苯咏o予這種siRNA或者利用不同設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)的siRNA表達(dá)載體，誘導(dǎo)RNAi。載體可插入短間隔臂序列分開(kāi)的編碼用于終止轉(zhuǎn)錄的T串的兩個(gè)反向重復(fù)(序列)。預(yù)計(jì)表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物將折疊成短發(fā)夾siRNA。siRNA靶序列的選擇，編碼推定發(fā)夾的莖干的反向重復(fù)序列的長(zhǎng)度，該反向重復(fù)序列的順序，編碼該發(fā)夾環(huán)的間隔臂序列的長(zhǎng)度和組成，5’ -突出物的存在與否可有所不同。此siRNA表達(dá)盒的優(yōu)選順序是有義鏈、短間隔臂序列和反義鏈。含不同長(zhǎng)度莖干(例如，15-30)的發(fā)夾siRNA可能是合適的。連接發(fā)夾siRNA的有義和反義鏈的環(huán)可具有不同長(zhǎng)度(例如，3-9個(gè)核苷酸或更長(zhǎng))。所述載體可包含操作性連接于編碼siRNA的核苷酸序列的啟動(dòng)子和表達(dá)增強(qiáng)子或其它調(diào)控元件。表達(dá)“調(diào)控序列”指在特定宿主生物體中表達(dá)操作性連接的編碼序列所需的DNA序列。適合原核生物的調(diào)控序列，例如包括啟動(dòng)子，任選的操縱序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知道真核細(xì)胞能利用的啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子?？稍O(shè)計(jì)這些調(diào)控元件使臨床醫(yī)師能通過(guò)加入或控制(調(diào)控元件對(duì)其起反應(yīng)的)外部因素而關(guān)閉或打開(kāi)所述基因的表達(dá)。構(gòu)建含有所需治療基因編碼序列和控制序列的合適載體可采用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)連接和限制性技術(shù)(參見(jiàn)Maniatis等.，刊于《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約(1982))。切割、改進(jìn)分離的質(zhì)粒、DNA 序列或合成的寡核苷酸，并重新連接成所需形式。當(dāng)將某核酸與另一核酸序列置于功能相關(guān)位置時(shí)，其是“操作性連接的”。例如，如果將前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA操作性連接于某多肽的DNA，可表達(dá)成參與該多肽分泌的前蛋白；如果將啟動(dòng)子或增強(qiáng)子操作性連接于編碼序列，可影響該編碼序列的轉(zhuǎn)錄；或者如果將核糖體結(jié)合位點(diǎn)操作性連接于編碼序列則能促進(jìn)其翻譯。“操作性連接于”通常表示連接的DNA序列彼此鄰近，以分泌性前導(dǎo)序列為例，是毗連并在閱讀框中。然而，增強(qiáng)子不必毗連，可在方便的限制性位點(diǎn)處進(jìn)行連接。如果不存在此類(lèi)位點(diǎn)，可根據(jù)常規(guī)操作采用合成的寡核苷酸適體或接頭。
“測(cè)定功能效應(yīng)”指檢測(cè)直接或間接受本發(fā)明多核苷酸或多肽影響的化合物的參數(shù)提高或降低，例如檢測(cè)對(duì)物理和化學(xué)或表型的影響。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法檢測(cè)此類(lèi)功能影響，例如蛋白質(zhì)的光譜學(xué)(如熒光、吸光度、折射率)、流體動(dòng)力學(xué)(如形狀)、色譜或溶解度特性的變化；檢測(cè)蛋白質(zhì)的可誘導(dǎo)標(biāo)記物或轉(zhuǎn)錄激活；檢測(cè)結(jié)合活性或結(jié)合試驗(yàn)，例如能否結(jié)合抗體；檢測(cè)配體結(jié)合親和力的變化；檢測(cè)鈣流入；檢測(cè)本發(fā)明多肽酶促產(chǎn)物的累積或底物的消耗；酶促活性，例如激酶活性的變化；檢測(cè)本發(fā)明多肽的蛋白質(zhì)水平變化；檢測(cè)RNA穩(wěn)定性；G-蛋白質(zhì)結(jié)合；GPCR磷酸化或脫磷酸；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如受體-配體相互作用，第二信使(例如，cAMP、IP3或胞內(nèi)Ca2+)的濃度；鑒定下游或報(bào)道基因 (CAT、螢光素酶、β -gal,GFP等)的表達(dá)，例如通過(guò)化學(xué)發(fā)光、熒光、比色反應(yīng)、抗體結(jié)合、可誘導(dǎo)標(biāo)記和配體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)。將用潛在的活化劑、抑制劑或調(diào)節(jié)劑處理的包含本發(fā)明核酸或蛋白質(zhì)的樣品與沒(méi)有這類(lèi)抑制劑、活化劑或調(diào)節(jié)劑的對(duì)照樣品作比較，或用試驗(yàn)檢測(cè)影響程度。將對(duì)照樣品 (未用抑制劑處理)的相對(duì)蛋白質(zhì)活性值指定為100 %。當(dāng)與對(duì)照相比，該活性值為約80 %， 優(yōu)選50%，更優(yōu)選25-0%時(shí)，實(shí)現(xiàn)了抑制。當(dāng)與對(duì)照(未用活化劑處理)相比，該活性值為 110%,優(yōu)選150%,更優(yōu)選200-500% (即比對(duì)照高2-5倍)，更優(yōu)選1000-3000%或更高時(shí)， 實(shí)現(xiàn)了活化。“生物學(xué)樣品”包括組織切片，例如活檢或尸檢樣品，以及為組織學(xué)目的獲取的冰凍切片。此類(lèi)樣品包括血液和血液組分或產(chǎn)物(例如，血清、血漿、血小板、紅細(xì)胞等)，痰， 組織，培養(yǎng)的細(xì)胞，例如原代培養(yǎng)物，外植體和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，糞便、尿液等。生物學(xué)樣品通常獲自真核生物，最優(yōu)選哺乳動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類(lèi)，如黑猩猩或人；奶牛；犬；貓；嚙齒類(lèi)，如豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鳥(niǎo)類(lèi)；爬行動(dòng)物；或魚(yú)類(lèi)?！盎顧z”指為診斷或預(yù)后評(píng)估目的取出組織樣品的過(guò)程，也指組織標(biāo)本自身。可將本領(lǐng)域已知的任何活檢技術(shù)應(yīng)用于本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法。應(yīng)用的活檢技術(shù)取決于待評(píng)估組織的類(lèi)型(即，前列腺、淋巴結(jié)、肝臟、骨髓、血細(xì)胞)、腫瘤的大小和類(lèi)型(即，實(shí)體或懸浮(即血液或腹水))等因素。代表性的活檢技術(shù)包括切除活檢、切開(kāi)式活檢、針吸活檢、 外科手術(shù)活檢和骨髓活檢?！扒谐顧z”指取出整個(gè)腫瘤塊及其周?chē)纳倭窟吘壵＝M織。 “切開(kāi)式活檢”指取出包括腫瘤截面直徑的楔形組織。通過(guò)內(nèi)窺鏡檢查或熒光法進(jìn)行診斷或預(yù)后可能需要腫瘤塊的“芯針活檢”或“細(xì)針抽吸活檢”，通?？色@得腫瘤塊內(nèi)的細(xì)胞懸液。 活檢技術(shù)的討論可參見(jiàn)，例如《哈里森內(nèi)科學(xué)原理》(Harrison’ s Principles of Internal Medicine)，Kasper等編·，第16版.，2005，第70章和整個(gè)第V部分。對(duì)于兩條或多條核酸或多肽序列，術(shù)語(yǔ)“相同，，或“相同性百分?jǐn)?shù)”指采用默認(rèn)參數(shù)的BLAST或BLAST 2. 0序列比較算法檢測(cè)，或通過(guò)手工比對(duì)和目測(cè)，檢查到兩條或多條序列或子序列含有相同的或一定百分?jǐn)?shù)相同的氨基酸殘基或核苷酸(即，當(dāng)在比較窗口或指定區(qū)域上比較和比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，在指定區(qū)域上約有60 %相同，優(yōu)選65 %、70 %、75 %、 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高相同)(參見(jiàn)， 例如NCBI網(wǎng)址http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/等)。然后稱(chēng)此類(lèi)序列“基本相同”。 該定義也指或適用于測(cè)試序列的互補(bǔ)序列。該定義還包括含有缺失和/或添加的序列以及含取代的那些序列。如下所述，該優(yōu)選算法考慮了空位等。優(yōu)選在長(zhǎng)度至少約25個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上存在相同性，或者更優(yōu)選在長(zhǎng)50-100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上存在相同性。對(duì)于序列比較，一般將一條序列用作與測(cè)試序列相比的參比序列。采用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參比序列均輸入計(jì)算機(jī)，如果必要指定子序列坐標(biāo)，指定序列算法程序的參數(shù)。優(yōu)選采用默認(rèn)的程序參數(shù)，或者可指定另選的參數(shù)。然后，該序列比較算法根據(jù)程序參數(shù)計(jì)算出測(cè)試序列相對(duì)于參比序列的序列相同性百分?jǐn)?shù)。本文所用的“比較窗口”包括參比選自20-600個(gè)，通常約50-200個(gè)，更常約 100-150個(gè)毗連位置任一數(shù)量的區(qū)段，其中對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行最優(yōu)比對(duì)后，將序列與毗連位置數(shù)量相同的參比序列作比較。本領(lǐng)域熟知比對(duì)序列比較的方法?？捎靡韵滤惴▽?duì)所比較的序列進(jìn)行最佳比對(duì)，例如Smith和Waterman, Adv. App 1. Math. 2 :482(1981)的局部同源性算法，Needleman 和 Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443(1970)的同源性比對(duì)算法，Pearson 和 Lipman, Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA 85 :2444(1988)的檢索相似性的算法，用計(jì)算機(jī)執(zhí)行這些算法(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康星遺傳學(xué)軟件包(Wisconsin Genetics Software Package),遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(Genetics Computer Group), 575 Science Dr.,麥迪遜，威斯康星州)或手工比對(duì)和目測(cè)觀(guān)察(參見(jiàn)，例如《最新分子生物學(xué)方案》(Current Protocols in Molecular Biology) (Au sub el 等編.1995 ± 曾補(bǔ)))。適合測(cè)定序列相同性和序列相似性百分比的優(yōu)選算法的例子是BLAST和BLAST 2. 0 算法，它們的描述分別見(jiàn) Altschul 等·，Nuc. Acids Res. 25 :3389-3402 (1977)和 Altschul 等.，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990)。采用 BLAST 和 BLAST 2. 0 及本文所述參數(shù)可確定本發(fā)明核酸和蛋白質(zhì)的序列相同性百分?jǐn)?shù)。進(jìn)行BLAST分析的軟件可從公眾渠道國(guó) it^^ii^ffE^^^ (National Center for Biotechnology Information) (http:// ncbi. nlm. nih. gov/)。該算法包括，首先通過(guò)鑒定查詢(xún)序列中長(zhǎng)度W的短字來(lái)鑒定高評(píng)分序列對(duì)(HSP)，該短字與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字排列比對(duì)時(shí)，能匹配或滿(mǎn)足一些正閾值評(píng)分Τ。T稱(chēng)為相鄰字評(píng)分閾值(Altschul等，同上)。將這些命中的初始相鄰字用作啟動(dòng)搜索，以尋找含有它們的更長(zhǎng)的HSP種子。沿各序列兩個(gè)方向上延伸該字命中，直到累積的比對(duì)評(píng)分增加。對(duì)于核苷酸序列，采用參數(shù)M(—對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分；總是>0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；總是<0)計(jì)算出累積評(píng)分。對(duì)于氨基酸序列，用評(píng)分矩陣計(jì)算累積評(píng)分。在以下情況出現(xiàn)時(shí)中止字命中在各個(gè)方向上的延伸累積比對(duì)評(píng)分從其最大獲得值跌落X時(shí)； 由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)評(píng)分殘基比對(duì)的累積，累積評(píng)分變?yōu)榱慊蛄阋韵聲r(shí)；或者到達(dá)兩序列的末端。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定了比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)采用的默認(rèn)值如下字長(zhǎng)(W) = 11，期望值(E) = 10,M = 5,N = -4，以及比較兩條鏈。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序采用的默認(rèn)值為字長(zhǎng)=3，期望值(E) = 10，BL0SUM62 評(píng)分矩陣(參見(jiàn) Henikoff 和 Henikoff，Proc. Natl. AcacUci. USA 89 :10915(1989))比對(duì) (B) =50，期望值(E) = 10，M = 5，N = -4，以及比較兩條鏈?！昂怂帷敝竼捂溁螂p鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物和互補(bǔ)體。 該術(shù)語(yǔ)包括含有已知的核苷酸同類(lèi)物或修飾的主鏈殘基或連接鍵的核酸，它們是合成、天然產(chǎn)生的和非天然產(chǎn)生的，它們的結(jié)合特性與參比核酸類(lèi)似，代謝方式與參比核苷酸類(lèi)似。 此種同類(lèi)物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有說(shuō)明，具體核酸序列也包括其保守性修飾變體(如，簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指出的序列。具體說(shuō)，可通過(guò)在一個(gè)或多個(gè)所選(或所有)密碼子的第三位置用混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代產(chǎn)生的序列，而實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)并密碼子取代(Batzer 等，Nucleic Acid Res. 19:5081(1991) ；Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608 (1985)； Rossolini 等，Mol. Cell. Probes 8 :91-98 (1994))。術(shù)語(yǔ)核酸與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸
和多核苷酸可互換使用。具體核酸序列還隱含包括“剪接變體”。類(lèi)似地，核酸編碼的具體蛋白質(zhì)隱含包括該核酸剪接變體編碼的任何蛋白質(zhì)。如其名稱(chēng)所提示的那樣，“剪接變體”是基因另路剪接的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄后，可剪接最初的核酸轉(zhuǎn)錄物，從而產(chǎn)生不同的(交替)剪接核酸產(chǎn)物編碼的不同多肽。產(chǎn)生剪接變體的機(jī)制可有所不同，但包括外顯子的交替剪接。該定義還包括通過(guò)通讀轉(zhuǎn)錄從同一核酸產(chǎn)生的其它多肽，包括剪接反應(yīng)的任何產(chǎn)物，包括剪接產(chǎn)物的重組形式。鉀通道剪接變體的例子見(jiàn) Leicher 等，J. Biol. Chem. 273 (52) :35095-35101 (1998)。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)適用于一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然產(chǎn)生氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物和非天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然產(chǎn)生的和合成的氨基酸，以及以類(lèi)似于天然產(chǎn)生氨基酸的方式起作用的氨基酸同類(lèi)物和氨基酸模擬物。天然產(chǎn)生的氨基酸是遺傳密碼編碼的氨基酸， 以及隨后修飾的氨基酸，如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和0-磷酸絲氨酸。氨基酸同類(lèi)物指與天然產(chǎn)生的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，即α碳結(jié)合于氫、羧基、氨基和R基團(tuán)的化合物，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。此類(lèi)同類(lèi)物含有修飾的R基團(tuán)(如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留了天然產(chǎn)生氨基酸的相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指結(jié)構(gòu)不同于氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)，但功能類(lèi)似于天然產(chǎn)生氨基酸的化學(xué)化合物。在本文中，氨基酸用IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的通用三字母碼或單字母碼表示。同樣，核苷酸用其普遍接受的單字母碼表示?！氨Ｊ匦孕揎椬凅w”適用于氨基酸和核酸序列。對(duì)于特定的核酸序列，保守性修飾變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者當(dāng)核酸不編碼氨基酸序列時(shí)， 指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量功能相同的核酸可編碼任何一種給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在密碼子確定為丙氨酸的每個(gè)位置上，可將密碼子改變?yōu)樗龅娜魏蜗鄳?yīng)密碼子而不會(huì)改變編碼的多肽。此類(lèi)核酸變異是“沉默變異”，是保守性修飾變異的一種。本文所述的編碼多肽的每種核酸序列也描述了該核酸的每種可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可修飾核酸中的各密碼子(除了 AUG和TGG外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，TGG通常是色氨酸的唯一密碼子)，而產(chǎn)生功能相同的分子。因此，就表達(dá)產(chǎn)物而非實(shí)際探針序列而言，編碼多肽的核酸的各沉默變異隱含在所述各序列中。對(duì)于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，可對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行單個(gè)取代、缺失或加入，而改變、加入或刪除所編碼序列中一個(gè)氨基酸或少量百分比的氨基酸，是“保守性修飾變體”，其中所述改變導(dǎo)致某氨基酸被化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸所取代。本領(lǐng)域熟知可提供功能相似氨基酸的保守性取代表。此類(lèi)保守性修飾的變體包括但不排除本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因。
以下八組各含有彼此可保守性取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴(lài)氨酸(K) ；5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)； 7)絲氨酸⑶、蘇氨酸⑴；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參見(jiàn)，例如Creighton，《蛋白質(zhì)》(1984))?！皹?biāo)記物，，或“可檢測(cè)部分”是可用光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其它物理方法檢測(cè)的組份。例如，有用的標(biāo)記物包括32P、熒光染料、電子致密試劑、酶(例如， ELISA中常用的)、生物素、地高辛或半抗原和可制成可檢測(cè)試劑的蛋白質(zhì)，例如將放射性標(biāo)記物摻入肽中，或用于檢測(cè)能與該肽特異性反應(yīng)的抗體。用于(例如)細(xì)胞或核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組”表示該細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體已通過(guò)引入異源核酸或蛋白質(zhì)而被修飾，或天然核酸或蛋白質(zhì)已被改變，或者該細(xì)胞衍生自如此修飾的細(xì)胞。因此，例如重組細(xì)胞可表達(dá)天然(非重組)形式細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的基因，或異常表達(dá)、表達(dá)不足或根本不表達(dá)天然基因。當(dāng)用于核酸諸部分時(shí)，術(shù)語(yǔ)“異源”指該核酸包含在天然狀態(tài)下彼此沒(méi)有關(guān)系的兩個(gè)或多個(gè)子序列。例如，重組產(chǎn)生的核酸一般含有兩個(gè)或多個(gè)無(wú)關(guān)基因的序列，例如一個(gè)來(lái)源的啟動(dòng)子和另一來(lái)源的編碼區(qū)，它們排列構(gòu)成了新的功能性核酸。相似地，異源蛋白表示該蛋白包含天然狀態(tài)下彼此沒(méi)有關(guān)系的兩個(gè)或多個(gè)子序列(如融合蛋白)。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”指通常在核酸的復(fù)雜混合物中，探針與其目標(biāo)子序列雜交，但不與其他序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴(lài)性的，不同情況下不同。較長(zhǎng)的序列能在較高溫度下特異性雜交。核酸雜交的詳細(xì)指南參見(jiàn)Tijssen，《生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)一與核酸探針雜交》(Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes)，“核酸測(cè)定的雜交原理和方案綜述，，(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays) (1993)。嚴(yán)格條件通常選擇比特定序列在指定離子強(qiáng)度、pH下的解鏈溫度(Tm)低約5-10°C。Tm是50%靶標(biāo)互補(bǔ)探針與靶序列雜交平衡時(shí)的溫度(在指定離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)(由于靶序列過(guò)量，在Tm時(shí)50%探針平衡地占據(jù))。也可加入去穩(wěn)定劑，如甲酰胺獲得嚴(yán)格條件。對(duì)于選擇性或特異性雜交，陽(yáng)性信號(hào)至少是背景信號(hào)的兩倍，優(yōu)選10 倍。示范性的嚴(yán)格雜交條件如下50%甲酰胺、5x SSC和SDS，42°C培育，或者切SSC、 1% SDS、65°C培育，用 0. hSSC 和 0. 1% SDS 在 65°C洗滌。如果編碼的多肽基本相同，那么在嚴(yán)格條件下彼此不雜交的核酸仍然基本相同。 例如，利用遺傳密碼子所允許的最大密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生核酸拷貝時(shí)可能發(fā)生這種情況。在這種情況下，所述核酸一般能在中等嚴(yán)格的雜交條件下雜交。示范性“中等嚴(yán)格雜交條件” 包括37°C，在40%甲酰胺、IMNaClU% SDS的緩沖液中雜交，45°C，IX SSC洗滌。陽(yáng)性雜交信號(hào)至少是背景的兩倍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難認(rèn)識(shí)到，可利用其他雜交和洗滌條件提供類(lèi)似嚴(yán)格性的條件。測(cè)定雜交參數(shù)的其它指南可參見(jiàn)許多參考文獻(xiàn)，例如《最新分子生物學(xué)方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel 等編·，約翰韋利父子公司(John ffiley&Sons)。對(duì)于PCR，低嚴(yán)格性擴(kuò)增的典型溫度約為36°C，但退火溫度可根據(jù)引物長(zhǎng)度在約 320C _48°C之間變動(dòng)。對(duì)于高嚴(yán)格性PCR擴(kuò)增，典型溫度約為62V，但高嚴(yán)格性退火溫度根據(jù)引物長(zhǎng)度和特異性范圍可以是約50°C _65°C。高嚴(yán)格性和低嚴(yán)格性擴(kuò)增的典型循環(huán)條件包括變性階段90°C -95°C，30秒-2分鐘，退火階段持續(xù)30秒-2分鐘，72°C延伸階段約1_2 分鐘。低和高嚴(yán)格性擴(kuò)增反應(yīng)的方案和指南可參見(jiàn)，例如化??！化等.(1990)《PCR方案方法和應(yīng)用指南》(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications)，學(xué)術(shù)出版社 (Academic Press, Inc.)紐約)。“抗體”指能特異性結(jié)合并識(shí)別抗原，包含來(lái)自免疫球蛋白基因框架區(qū)的多肽或其片段。公知的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類(lèi)為κ或λ。重鏈分類(lèi)為Y、μ、α、δ或ε，進(jìn)而分別定義了免疫球蛋白類(lèi)型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE?？贵w的抗原結(jié)合區(qū)通常對(duì)結(jié)合的特異性和親和力至關(guān)重要。示范性的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。每個(gè)四聚體由相同的兩對(duì)多肽鏈組成，各對(duì)有一條“輕鏈”(約25kD)和一條“重鏈”(約50-70kD)。各鏈的N末端為約 100-110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)語(yǔ)輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)(Vh)分別指這些輕鏈和重鏈。存在的抗體可以是完整的免疫球蛋白，或它們的用不同肽酶消化產(chǎn)生的許多特征已知的片段。因此，例如，胃蛋白酶可在鉸鏈區(qū)中二硫鍵下方消化抗體產(chǎn)生F(ab' )2, Fab 的二聚體，其本身是由二硫鍵連接于Vh-ChI的輕鏈?？稍跍睾蜅l件下還原F(ab' )2打斷鉸鏈區(qū)的二硫鍵，將F(ab' )2 二聚體轉(zhuǎn)變?yōu)镕ab'單體。Fab’單體主要是含部分絞鏈區(qū)的 Fab (參見(jiàn)《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(Fundamental Immunology) (Paul編·，第3版1993)。雖然根據(jù)完整抗體的消化定義了各種抗體片段，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，也可用化學(xué)方法或通過(guò)重組DNA方法從頭合成此類(lèi)片段。因此，本文所用的術(shù)語(yǔ)抗體還包括通過(guò)修飾完整抗體產(chǎn)生的抗體片段，或采用重組DNA方法從頭合成的那些片段(例如，單鏈Fv)或利用噬菌體展示文庫(kù)鑒定的那些片段(參見(jiàn)，例如McCafferty等·，Nature 348 :552-554 (1990))。為制備本發(fā)明的適合抗體和本發(fā)明的應(yīng)用，可采用本領(lǐng)域已知的許多技術(shù)制備(例如)重組的單克隆或多克隆抗體(參見(jiàn)，例如Kohler和Milstein，Nature 256 495-497(1975) ；Kozbor 等.，Immunology Today 4:72(1983) ；Cole 等·，第 77-96 頁(yè)，刊于 《多克隆抗體禾口癌癥治療》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy), Alan R. Liss, Inc. (1985) ；Coligan，《免疫學(xué)最新方法》(Current Protocols in Immunology) (1991)； Harlow 和 Lane,《抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Antibodies, A Laboratory Manual) (1988)；和 Goding，《多克隆抗體原理和實(shí)踐》(Monoclonal Antibodies principles and Practice) (第2版.1986))?？煽寺〖?xì)胞的編碼感興趣抗體的重鏈和輕鏈的基因，例如可克隆雜交瘤的編碼多克隆抗體的基因，用于產(chǎn)生重組單克隆抗體。也可從雜交瘤或漿細(xì)胞制備編碼單克隆抗體的重鏈和輕鏈的基因文庫(kù)。重鏈和輕鏈基因產(chǎn)物的隨機(jī)組合可產(chǎn)生具有不同抗原特異性的抗體集合(參見(jiàn)，例如Kuby，《免疫學(xué)》(Immunology)(第3版.1997))?？刹杉{產(chǎn)生單鏈抗體或重組抗體的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利4，946，778，美國(guó)專(zhuān)利4，816，567)來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明多肽的抗體。也可用轉(zhuǎn)基因小鼠或其它生物，例如其它哺乳動(dòng)物來(lái)表達(dá)人源化抗體或人抗體(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，M5，807 ；5, 545,806 ；5, 569,825 ；5, 625, 126 ； 5，633，425 ；5，661，016 ；Marks 等·，Bio/Technology 10 :779-783(1992) ；Lonberg 等·， Nature 368 :856-859(1994) ；Morrison,Nature 368 :812-13(1994) ；Fishwild^. ,NatureBiotechnology 14 :845-51 (1996) ；Neuberger, Nature BiotechnologyH :826(1996)； Lonberg 和 Huszar Jntern. Rev. Immunol. 13 :65-93 (1995))。或者，可采用噬菌體展示技術(shù)鑒定能特異性結(jié)合所選抗原的抗體和異質(zhì)Fab片段(參見(jiàn)，例如McCafTerty等.，Nature 348 :552-554(1990) ；Marks 等·，Biotechnology 10 :779-783 (1992))。還可將抗體制成雙特異性抗體，即能識(shí)別兩種不同抗原的抗體(參見(jiàn)，例如WO 93/08829,Traunecker等.， EMBO J. 10 :3655-3659(1991)；和 Suresh 等·，Methods in Enzymology 121:210(1986))。 所述抗體也可以是異質(zhì)偶聯(lián)物，例如兩個(gè)共價(jià)連接的抗體或免疫毒素(參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，676，980 ；WO 91/00360 ；WO 92/200373 ；和 EP 03089)。本領(lǐng)域熟知人源化或靈長(zhǎng)類(lèi)化非人抗體的方法。人源化抗體中通常含有引入的非人來(lái)源的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常稱(chēng)為輸入殘基，通常取自輸入的可變區(qū)?；旧峡砂凑誛inter和同事的方法(參見(jiàn)，例如Jones等.，Nature 321 522-525(1986) ；Riechmann 等.，Nature332 :323-327(1988) ；Verhoeyen 等.，Science 239 :1534-1536(1988)和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596 (1992))，用嚙齒類(lèi)的 CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列進(jìn)行人源化。因此，此類(lèi)人源化抗體是嵌合型抗體 (美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，816，567)，其中明顯小于完整的人可變區(qū)被非人物種的相應(yīng)序列取代。實(shí)際上，人源化抗體通常是一些CDR殘基和可能一些FR殘基被嚙齒類(lèi)抗體中同類(lèi)位點(diǎn)的殘基取代的人抗體。“嵌合型抗體”是一種抗體分子，其中(a)其恒定區(qū)或一部分經(jīng)過(guò)改變、替換或交換，使其抗原結(jié)合位點(diǎn)(可變區(qū))連接于類(lèi)別、效應(yīng)功能和/或物種不同或改變的恒定區(qū)， 或連接于能賦予該嵌合型抗體新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生長(zhǎng)因子、藥物等；或(b)其可變區(qū)或一部分經(jīng)過(guò)改變、替換或交換，使其可變區(qū)具有不同的或改變的抗原特異性。本發(fā)明的優(yōu)選抗體和應(yīng)用包括人源化和/或嵌合型單克隆抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，將所述抗體偶聯(lián)于“效應(yīng)”部分。效應(yīng)部分可以是任何數(shù)量的分子，包括標(biāo)記部分，例如放射性標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物，或者可以是治療分子。一方面，所述抗體可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性。此類(lèi)效應(yīng)分子包括但不限于抗腫瘤藥物、毒素、放射性試劑、細(xì)胞因子、二抗或酶。此外，本發(fā)明提供一種實(shí)施方式，其中將本發(fā)明抗體連接于能將前藥轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒制劑的酶?？衫盟雒庖吲悸?lián)物使效應(yīng)器靶向N-鈣黏著蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，特別是表達(dá)N-鈣黏著蛋白或Ly6的細(xì)胞。當(dāng)觀(guān)察大致類(lèi)似加載量的測(cè)試和對(duì)照樣品的凝膠條帶時(shí)，不難看出此種差異。細(xì)胞毒制劑的例子包括但不限于蓖麻毒蛋白、阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇、溴化乙錠、絲裂霉素、依托泊甙、替諾泊甙(tenoposide)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、二羥炭疽菌素二酮、放線(xiàn)菌素D、白喉毒素、假單胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白和糖皮質(zhì)激素及其它化療劑和放射性同位素。合適的可檢測(cè)標(biāo)記包括但不限于放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合劑或酶。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供N-鈣黏著蛋白的抗體?？蓡为?dú)或與效應(yīng)器偶聯(lián)， 全身性應(yīng)用N-鈣黏著蛋白抗體以治療癌癥(例如前列腺癌或膀胱癌)。偶聯(lián)毒性試劑，例如蓖麻毒蛋白的N-鈣黏著蛋白抗體，以及未偶聯(lián)的抗體可以是天然靶向攜帶N-鈣黏著蛋白的前列腺癌細(xì)胞的有用治療劑?？捎么祟?lèi)抗體來(lái)阻斷侵襲性。用于本發(fā)明的合適N-鈣黏著蛋白抗體包括但不限于GC41H7、1F12、2B3。
此外，可用包含本發(fā)明任何單克隆抗體的抗原結(jié)合區(qū)的本發(fā)明重組蛋白來(lái)治療癌癥。在此類(lèi)情況中，該重組蛋白的抗原結(jié)合區(qū)連接于具有治療活性的第二蛋白的至少一個(gè)功能活性部分。所述第二蛋白質(zhì)可包括但不限于酶、淋巴因子、抑瘤素或毒素。合適的毒素包括阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇、溴化乙錠、絲裂霉素、依托泊甙、替諾泊甙、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、二羥炭疽菌素二酮、放線(xiàn)菌素D、白喉毒素、假單胞菌外毒素(PE)A、PE40、 蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、糖皮質(zhì)激素和放射性同位素。將治療劑偶聯(lián)于抗體的技術(shù)是熟知的(參見(jiàn)，例如Arnon等.，“癌癥治療中用于藥物免疫革巴向的單克隆抗體(Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)“，刊于《單克隆抗體和癌癥治療》(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy) ,Reisfeld等·(編)，第243-56頁(yè)(Alan R. Liss,Inc. 1985) ；Hellstrom等·，〃 用于藥物遞送的抗體(Antibodies For Drug Delivery)‘‘刊于《受控藥物遞送》(Controlled Drug Delivery)(第 2 版)，Robinson 等.(編)，第 623-53 頁(yè)(Marcel Dekker, Inc. 1987)； Thorpe,“癌癥治療中細(xì)胞毒性劑的抗體運(yùn)載體綜述(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review)“刊于《單克隆抗體，84 :生物學(xué)和臨床應(yīng)用》 (Monoclonal Antibodies ‘ 84 :Biological And Clinical Applications), Pinchera 等.(編)，第475-506頁(yè)(198 ；和Thorpe等.，“抗體-毒素偶聯(lián)物的制備和細(xì)胞毒特性(The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates)", Immunol. Rev.，62 :119-58(1982))。短語(yǔ)“特異性(或選擇性)結(jié)合”于抗體或與之“特異性(或選擇性)免疫反應(yīng)” 指蛋白質(zhì)或肽時(shí)，指測(cè)定蛋白質(zhì)是否存在的結(jié)合反應(yīng)，常是在蛋白質(zhì)和其它生物物質(zhì)的異質(zhì)群體中的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的免疫試驗(yàn)條件下，指定抗體與特定蛋白質(zhì)的結(jié)合(信號(hào))至少是背景的兩倍，更常超過(guò)背景10倍到100倍。在此類(lèi)條件下特異性結(jié)合于抗體要求所選抗體對(duì)特定蛋白質(zhì)具有特異性。例如，可選擇多克隆抗體，從而僅獲得能與所選抗原而非其他蛋白質(zhì)特異性免疫反應(yīng)的那些多克隆抗體?？赏ㄟ^(guò)扣除能與其他分子交叉反應(yīng)的抗體而實(shí)現(xiàn)這種選擇。可采用各種形式的免疫測(cè)定以選擇能與特定蛋白質(zhì)特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，常規(guī)采用固相ELISA免疫測(cè)定來(lái)選擇能與蛋白質(zhì)特異性免疫反應(yīng)的抗體(參見(jiàn)，例如可用于測(cè)定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定形式和條件的描述見(jiàn)Harlow和Lane， “利用抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(Using Antibodies, A Laboratory Manual) (1998))。本文的“治療有效劑量或用量”表示給予的劑量產(chǎn)生了所需效應(yīng)。精確劑量和制劑取決于治療目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可用已知技術(shù)確定這種劑量(參見(jiàn)，例如Lieberman，《藥物劑型》(Pharmaceutical Dosage Forms)(第1-3卷，1992) ；Lloyd，《藥物配制的領(lǐng)域、科學(xué)禾口技術(shù)〉〉(The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding) (1999)； 《雷明頓藥學(xué)的科學(xué)和實(shí)踐》(Remington :The Science and Practice of Pharmacy)，第 20 版，Gennaro 編，(2003)，和 Pickar，《劑量計(jì)算》(Dosage Calculations) (1999))。術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的鹽"或"藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體"表示包括根據(jù)本文所述化合物上發(fā)現(xiàn)的具體取代基，用相對(duì)無(wú)毒的酸或堿制備的活性化合物的鹽。當(dāng)本發(fā)明化合物含有相對(duì)酸性的官能團(tuán)時(shí)，可使中性形式的此類(lèi)化合物接觸足量的所需堿來(lái)獲得堿加成鹽，所述堿可以是純堿或溶于合適的惰性溶劑中。藥學(xué)上可接受的堿加成鹽的例子包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、銨鹽、有機(jī)氨基酸鹽或鎂鹽，或類(lèi)似鹽。本發(fā)明化合物含有相對(duì)堿性的官能團(tuán)時(shí)，可使中性形式的此類(lèi)化合物接觸足量的所需酸來(lái)獲得酸加成鹽，所述酸可以是純酸或溶于合適的惰性溶劑中。藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的例子包括衍生自無(wú)機(jī)酸的鹽， 如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽，磷酸鹽、磷酸氫鹽，磷酸二氫鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、氫碘酸鹽或亞磷酸鹽等，以及衍生自相對(duì)無(wú)毒的有機(jī)酸的鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、異丁酸鹽、馬來(lái)酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、延胡索酸鹽、乳酸鹽、扁桃酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲基苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽等。也包括氨基酸如精氨酸等的鹽，和有機(jī)酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的鹽(參見(jiàn)例如，Berge等， Journal of Pharmaceutical Science 66 :1-19 (1977))。本發(fā)明的某些特定化合物含有能夠使該化合物轉(zhuǎn)變?yōu)閴A或酸加成鹽的堿性和酸性官能團(tuán)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道適合用于本發(fā)明的其它藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體?？墒顾鳆}與堿或酸接觸，以常規(guī)方法分離母體化合物，而再生中性形式的該化合物。該化合物母體形式的某些物理特性(例如在極性溶劑中的溶解度)與各種形式的鹽有別，但對(duì)于本發(fā)明的目的，這種鹽等同于該化合物的母體形式。除鹽形式外，本發(fā)明還提供前藥形式的化合物。本文所述化合物的前藥是在生理學(xué)條件下不難通過(guò)化學(xué)改變而提供本發(fā)明化合物的那些化合物。此外，在離體環(huán)境下，可通過(guò)化學(xué)或生化方法將前藥轉(zhuǎn)變?yōu)楸景l(fā)明化合物。例如，放置在含有合適酶或化學(xué)試劑的透皮貼片儲(chǔ)庫(kù)中時(shí)，前藥可緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸景l(fā)明化合物。本發(fā)明的某些化合物可存在非溶劑化形式以及溶劑化形式，包括水合形式。通常， 溶劑化形式等同于非溶劑化形式，均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明某些化合物可存在多晶型或無(wú)定形形式。通常，在本發(fā)明所考慮的應(yīng)用中所有物理形式等價(jià)，均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明的某些化合物可含有不對(duì)稱(chēng)碳原子(光學(xué)中心)或雙鍵；其外消旋物、非對(duì)映體、幾何異構(gòu)體和單個(gè)異構(gòu)體均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)指上皮腫瘤細(xì)胞獲得了基質(zhì)特征。在癌癥中，EMT與侵襲性和能動(dòng)行為(motile behavior)相關(guān)，可能是癌轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)核心過(guò)程。EMT與預(yù)后不良相關(guān)，由多種轉(zhuǎn)錄因子，例如SNAIL、SLUG和TWIST介導(dǎo)。E-鈣黏著蛋白是參與上皮細(xì)胞間粘附的一種細(xì)胞表面蛋白，它在侵襲性和轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤中常丟失。詳細(xì)實(shí)施方式本發(fā)明提供治療癌癥患者的方法。所述方法通常包括以下步驟(a)獲得有患表達(dá)N-鈣黏著蛋白癌癥風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的測(cè)試組織樣品；(b)測(cè)定所述測(cè)試組織樣品中N-鈣黏著蛋白存在與否或含量，與已知該癌癥陰性的個(gè)體的對(duì)照組織樣品作比較；藉此診斷表達(dá) N-鈣黏著蛋白的所述癌癥，其中N-鈣黏著蛋白以正?；虻退奖磉_(dá)，或由細(xì)胞亞組表達(dá)和未過(guò)表達(dá)；和(c)將有效量的N-鈣黏著蛋白抗體給予具有患表達(dá)N-鈣黏著蛋白的癌癥風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。所述組織樣品通常是血清，但也可以是活檢組織，特別是泌尿生殖道組織，包括前列腺組織或膀胱組織。所述抗體通常是單克隆抗體。診斷為表達(dá)N-鈣黏著蛋白或mRNA 轉(zhuǎn)錄物的癌癥陽(yáng)性，表示與已知未患癌癥個(gè)體的對(duì)照組織樣品相比，測(cè)試組織樣品中檢測(cè)到較高水平的N-鈣黏著蛋白，例如高10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%, 100%、2_倍、3-倍、4-倍或更高?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)實(shí)施這種檢測(cè)(綜述見(jiàn) Gosling，《免疫測(cè)定實(shí)用方案》(Immunoassays :A Practical Approach)，2000，牛津大學(xué)出版社)。通過(guò)采用，例如放射性同位素、熒光標(biāo)記物、酶或本領(lǐng)域已知的任何其他可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記一抗或二抗來(lái)實(shí)現(xiàn)這種檢測(cè)。在另一實(shí)施方式中，通過(guò)以下方式實(shí)施這種檢測(cè)方法使表達(dá)N-鈣黏著蛋白或 mRNA轉(zhuǎn)錄物的患者測(cè)試組織樣品接觸各自與N-鈣黏著蛋白核酸特異性雜交的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的引物組；擴(kuò)增所述樣品中的N-鈣黏著蛋白核酸；和測(cè)定該測(cè)試組織樣品中是否存在N-鈣粘著蛋白核酸，與已知的表達(dá)N-鈣黏著蛋白或mRNA轉(zhuǎn)錄物癌癥為陰性個(gè)體的對(duì)照組織樣品作比較。所述組織樣品通常也是血清，但也可以是活檢組織，特別是泌尿生殖道組織，包括前列腺或膀胱組織。診斷為表達(dá)N-鈣黏著蛋白或mRNA轉(zhuǎn)錄物的癌癥陽(yáng)性，表示與已知未患癌癥個(gè)體的對(duì)照組織樣品相比，測(cè)試組織樣品中檢測(cè)到較高水平的 N-鈣黏著蛋白轉(zhuǎn)錄RNA。這些方法尤其可應(yīng)用于治療前列腺癌和膀胱癌。在某些實(shí)施方式中，所述方法可應(yīng)用于激素難治或治療耐受的癌癥。在某些實(shí)施方式中，所述方法可應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性癌。例如，可利用N-鈣黏著蛋白和/或mRNA差異性表達(dá)的比較來(lái)測(cè)定患有表達(dá)N-鈣黏著蛋白或 mRNA轉(zhuǎn)錄物癌癥個(gè)體的癌癥所處階段。治療通常包括通過(guò)可接受的給藥途徑，例如靜脈內(nèi)注射(IV)反復(fù)給予有效劑量的抗-N-鈣黏著蛋白抗體。劑量取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員通常知道的各種因素，包括但不限于癌癥類(lèi)型和嚴(yán)重程度，癌癥的等級(jí)或階段、所用制劑的結(jié)合親和力和半衰期，患者的 N-鈣黏著蛋白表達(dá)程度，脫落的循環(huán)性N-鈣黏著抗原的含量，所需的穩(wěn)態(tài)抗體濃度水平， 治療頻率和與本發(fā)明治療方法聯(lián)用的化療劑的影響。每日劑量范圍約0. l-100mg/kg，每周劑量范圍約為10-500mg的mAb可能有效和良好耐受，雖然甚至更高的每周劑量也可能適合和/或良好耐受。決定合適劑量的主要決定因素是具體情況中有效治療所需的特定制劑的用量?？赡苄枰磸?fù)給藥以實(shí)現(xiàn)腫瘤的抑制或消退。初始負(fù)荷劑量可能較高。可輸注給予初始負(fù)荷劑量?？深?lèi)似地給予周期維持劑量，只要初始劑量良好耐受。也可直接給予所述制劑，在某些情況下可能有利。例如，對(duì)于治療膀胱癌，可將所述制劑直接注射入膀胱。由于直接給予膀胱的制劑可被患者快速清除，采用非人抗體或嵌合型抗體可能有效，而沒(méi)有抗原性導(dǎo)致的明顯并發(fā)癥。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療癌癥，特別是表達(dá)N-鈣黏著蛋白的癌癥，或抑制表達(dá)N-鈣黏著蛋白的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法通過(guò)用抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)有效量的能識(shí)別/結(jié)合N-鈣黏著蛋白的抗體或其片段治療對(duì)象，或使癌細(xì)胞與抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)有效量的能識(shí)別/結(jié)合N-鈣黏著蛋白的抗體或其片段接觸。在一些實(shí)施方式中，所述癌細(xì)胞是前列腺癌細(xì)胞或膀胱癌細(xì)胞。所述接觸的抗體可以是單克隆抗體和/或嵌合型抗體。在一些實(shí)施方式中，所述嵌合型抗體包含人免疫球蛋白恒定區(qū)。在一些實(shí)施方式中，所述抗體是人抗體或包含人免疫球蛋白恒定區(qū)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述抗體片段包括Fab、 F (ab) 2或Fv。在其它實(shí)施方式中，所述片段包括含有抗原結(jié)合區(qū)的重組蛋白。在任何一種上述實(shí)施方式中，也可給予化療藥物和/或放療。在一些實(shí)施方式中， 患者還接受激素拮抗劑治療?？蓪⑺隹贵w經(jīng)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)或真皮內(nèi)給予患者，而使患者與所述抗體或抗體片段接觸。在一些實(shí)施方式中，所述患者患有泌尿生殖道癌癥(例如，膀胱癌、前列腺癌)。在上述一些實(shí)施方式中，所述患者患有前列腺癌，任選患者接受激素消融治療(patient hormone ablation therapy)。在一些實(shí)施方式中，所述接觸包括將所述抗體直接給予注射入癌癥或癌轉(zhuǎn)移灶。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療癌癥患者的方法。該方法通常包括(a)獲得有患表達(dá)N-鈣粘蛋白癌癥風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的測(cè)試組織樣品；(b)測(cè)定所述測(cè)試組織樣品中N-鈣黏著蛋白存在與否或含量，與已知該癌癥陰性個(gè)體的對(duì)照組織樣品作比較；藉此診斷表達(dá) N-鈣黏著蛋白的所述癌癥，其中N-鈣黏著蛋白以正常或低水平表達(dá)，或由細(xì)胞亞組表達(dá)和未過(guò)表達(dá)；(c)測(cè)定癌癥是否可能變?yōu)榍忠u性、轉(zhuǎn)移、激素不依賴(lài)性或難治；(d)按照該癌癥變?yōu)榍忠u性、轉(zhuǎn)移、激素不依賴(lài)性或難治的可能性確定是否增加給予化療劑、免疫治療劑、 激素治療或放療。在一些實(shí)施方式中，所述化療劑可選自蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A鏈、阿霉素、 柔紅霉素、紫杉醇、溴化乙錠、絲裂霉素、依托泊甙、替諾泊甙(tenoposide)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、二羥炭疽菌素二酮、放線(xiàn)菌素D、白喉毒素、假單胞菌外毒素(PE)A、PE40、 相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲菌素、白樹(shù)毒素、邁托毒素 (mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、依諾霉素、麻瘋樹(shù)逆境蛋白(curicin，)、巴豆毒蛋白、 刺孢霉素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、類(lèi)美坦西醇和糖皮質(zhì)激素。本發(fā)明還提供鑒定癌癥干細(xì)胞的方法。所述方法通常包括以下步驟(a)獲得具有患表達(dá)N-鈣粘蛋白癌癥風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的測(cè)試組織樣品；(b)測(cè)定該測(cè)試組織樣品中癌癥干細(xì)胞存在與否，與已知癌癥陰性個(gè)體的對(duì)照組織樣品作比較；其中N-鈣黏著蛋白以正?；虻退奖磉_(dá)，或者由所述干細(xì)胞的亞組表達(dá)和未過(guò)表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括能結(jié)合N-鈣黏著蛋白胞外結(jié)構(gòu)域4的單克隆抗體或其片段，其包含以下氨基酸序列SEQ ID NO 1 :MAQVQLVQSGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSRHAMIWVRQAPGKGLEWVSSISGSS DSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCAKATGYSYYYGMDVWGPGTTVTVSSGGGGSGGGGSG GGGSDIQMTQSPSSLSASL⑶RVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGATTLQHGVPSRFSGSGSGTDFSL TISSLQPEDFAIYFCQQAHSFPPTFGGGTKLEIKR。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明包括能結(jié)合N-鈣黏著蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域1-3的單克隆抗體或其片段，其包含選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO 2 :MAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCQASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGFEWMGIINPSG GSASYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELRSLRSEQ ID NO 3 :MAQVQLQESGWYFDLWGRGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSASVG DRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYN GffTFGQGTKVEIKRSEQ ID NO 4 :MAQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDG RVKSYADAVKGRFTISRDNSENILYVQIDSLRVEDTAVYYCARRG⑶HAAGMDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGG GGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGGRSDIGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVGNRPSGVSNRFSGSKSGNTSEQ ID NO 5 :MAPGAAGGVGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDG SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTXVYYCARLEYSSSSRAFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSG GGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTI TGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO 6 :MAQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSEQ ID NO 7 :MAQVQLVQSGAEVKRPGASVRISCKASGYPFTTYPIHWVRQAPGQGLEWMGGINPNS GATKNVQKFQGRVTMTADTSIRTAYMELSRLTSDDTAVYYCARGEGDTGSYLGGYWGLGTLVTVSSGGGGSGGGGSG GGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGRAPLLVIYGKNIRPSGIPDRFSGSSSGNSASLTI TGAQAEDEADYYCNSRDRSGNYLFGVGTKVTVLGSEQ ID NO 8 :MAQVQLVQSGAEVKKPGESLEISCKGSGYSFANNWIGWVRQMPGKGLEWMGSIYP⑶ SDVRYSRSFQGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHRVAYSGYDAFDIWGQGTMVTVS SGGGGSGGGG SGGGGSSVLTQDPAVSVALGQTVRITCQ⑶SLRSYYPSWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASL TITGAQAEDEADYYCHSRDRSGNQVLFGGGTKVTVLGSEQ ID NO 9 :MAQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIffYDG SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGGEGGVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSD IVMTQSPSTLSAS。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供能結(jié)合N-鈣黏著蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域1-3或N-鈣黏著蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域4的抗體片段，其中所述片段是scFv。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供能結(jié)合N-鈣黏著蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域1-3或N-鈣黏著蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域4的抗體片段， 其中所述片段是雙抗體。為產(chǎn)生雙抗體，用SGGGGS替換接頭SGGGGSGGGGSGGGGS。給藥和配制方法按照已知方法，例如經(jīng)靜脈內(nèi)給藥(如推注)或輸注一段時(shí)期，經(jīng)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、 腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入途徑將抗-N-鈣黏著蛋白抗體或免疫偶聯(lián)物給予人患者。優(yōu)選靜脈內(nèi)或皮下給予所述抗體。給藥可以是局部或全身性給藥。給予的組合物通常包含溶解于藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體，優(yōu)選水性運(yùn)載體的本文所述制劑(例如，N-鈣黏著蛋白抑制劑、N-鈣黏著蛋白抗體和免疫偶聯(lián)物，N-鈣黏著蛋白 siRNA和其載體)?？刹捎酶鞣N水性運(yùn)載體，例如緩沖鹽水等。這些溶液應(yīng)無(wú)菌，通常不含有害物質(zhì)。這些組合物可用常規(guī)的熟知滅菌技術(shù)滅菌。該組合物可含有模擬生理?xiàng)l件所需的藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，如PH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如，乙酸鈉、氯化鈉、 氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等。這些制劑中的活性劑濃度可有很大不同，主要根據(jù)液體體積、粘度、體重等因素，按照所選的具體給藥方式和患者需要而選擇。因此，靜脈內(nèi)給予的典型藥物組合物根據(jù)藥物而不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道胃腸道外給予組合物的實(shí)際制備方法，這些方法在例如《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington' s Pharmaceutical Science),H 15 .，馬克出片反公司(Mack Publishing Company)，伊Jff頓， 賓夕法尼亞州.(1980)等出版物中有更詳細(xì)描述。根據(jù)給藥方法，可給予各種單位劑型的所述藥物組合物。例如，適合口服給予的單位劑型包括但不限于粉末、片劑、丸劑、膠囊和錠劑?？诜o予時(shí)，應(yīng)明白要保護(hù)抗體免遭消化。這通?？赏ㄟ^(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)用能賦予分子耐受酸水解和酶水解的組合物將所述分子配制成復(fù)合物，或?qū)⑺龇肿影b在適當(dāng)耐受的運(yùn)載體，例如脂質(zhì)體或保護(hù)屏障中。本領(lǐng)域熟知保護(hù)制劑免遭消化的方法。具體地說(shuō)，將具有所需純度的抗體與任選的藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，制備包含本發(fā)明所用的抗體和免疫偶聯(lián)物及抑制劑的藥物制劑。此類(lèi)制劑可以是凍干制劑或水性溶液?？山邮艿倪\(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑所用的劑量和濃度應(yīng)對(duì)受者無(wú)毒。可接受的運(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑可以是乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸鹽； 抗氧化劑(例如，抗壞血酸)、防腐劑、低分子量多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白或明膠，或親水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinylpyllolidone)；和氨基酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑；離子和非離子表面活性劑(例如，聚山梨酯)；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬?gòu)?fù)合物(例如，Zn-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子型表面活性劑。可將所述抗體配制成0. 5-200mg/ml或10_50mg/ml濃度。所述制劑也可提供其它活性化合物，包括化療劑、細(xì)胞毒性劑、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)抑制劑和抗-激素劑。也可將所述活性成分制備成緩釋制品(例如，固體疏水性聚合物(例如，聚酯，水凝膠(如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯的半通透基質(zhì))。還可將所述抗體和免疫偶聯(lián)物包裹在用(例如)凝聚技術(shù)或界面聚合技術(shù)制備的微膠囊中，例如分別包裹在羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中，包裹在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)中或包裹在大乳液(macroemulsion)中?？山o予所述組合物作治療性或預(yù)防性處理。在治療應(yīng)用中，將“治療有效劑量”的組合物給予疾病(例如，癌癥)患者。該應(yīng)用的有效量取決于疾病的嚴(yán)重程度和患者的總體健康狀況?？筛鶕?jù)所需和患者的耐受劑量和頻率一次或多次給予所述組合物。對(duì)于本發(fā)明的目的，“患者”或“對(duì)象”包括人和其它動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物。因此，這些方法適用于人治療和獸醫(yī)應(yīng)用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述患者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選靈長(zhǎng)類(lèi)，在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述患者是人。其它已知的癌癥治療可與本發(fā)明方法聯(lián)用。例如，也可用本發(fā)明所用的組合物靶向其它癌細(xì)胞或使之對(duì)治療劑，例如5FU、長(zhǎng)春堿、放線(xiàn)菌素D、順鉬、氨甲喋呤等敏感。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明方法可與其它癌癥治療(例如，根治性前列腺切除術(shù))、放療(外線(xiàn)束或近距離放療)、激素治療(例如，睪丸切除術(shù)，LHRH-類(lèi)似物治療以抑制睪酮產(chǎn)生，抗-雄激素治療)或化療聯(lián)用。根治性前列腺切除術(shù)包括切除整個(gè)前列腺加上一些周?chē)M織。當(dāng)認(rèn)為癌癥不會(huì)擴(kuò)散到該組織外時(shí)通常采用這種治療。放療常用于治療局限于前列腺或已擴(kuò)散到鄰近組織的前列腺癌。如果該疾病已到晚期，可利用射線(xiàn)減少腫瘤的大小。激素治療常用于前列腺癌擴(kuò)散到前列腺以外或復(fù)發(fā)的患者。激素治療的目的是降低雄性激素(雄激素)水平，藉此導(dǎo)致前列腺癌縮小或生長(zhǎng)更慢。促黃體激素釋放激素 (LHRH)激動(dòng)劑能減少睪酮的產(chǎn)生?？擅吭禄蚋L(zhǎng)的間隔注射這些制劑。兩種此類(lèi)類(lèi)似物是亮丙瑞林和戈舍瑞林。還可采用抗-雄激素(例如，氟他米特、比卡魯胺和尼魯米特)藥物。雄激素全阻斷指聯(lián)用抗-雄激素與睪丸切除術(shù)或LHRH類(lèi)似物，稱(chēng)為s組合。對(duì)于前列腺癌擴(kuò)散到前列腺以外和激素治療失效的患者，化療是一種選擇。不指望破壞所有的癌細(xì)胞，但可能減緩腫瘤生長(zhǎng)并減輕疼痛?？捎糜谥委熂に刂委熀髲?fù)發(fā)或繼續(xù)生長(zhǎng)并擴(kuò)散的前列腺癌的一些化療藥物包括阿霉素(亞德里亞霉素)、雌莫司汀、依托泊甙、米托蒽醌、長(zhǎng)春堿和紫杉醇。常一起給予兩種或多種藥物以降低癌細(xì)胞對(duì)化療產(chǎn)生耐受的可能性。小細(xì)胞癌是更可能對(duì)化療而非激素治療起反應(yīng)的罕見(jiàn)前列腺癌類(lèi)型。在一些實(shí)施方式中，也可與本發(fā)明所用N-鈣黏著蛋白抗體、N-鈣黏著蛋白結(jié)合抑制劑或N-鈣黏著蛋白siRNA分子聯(lián)合給予“心臟保護(hù)劑”(參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，949，245)。 心臟保護(hù)劑是能防止或降低(例如)蒽環(huán)類(lèi)抗生素藥物給予患者時(shí)發(fā)生相關(guān)心肌功能失常(即，心肌病和/或充血性心力衰竭)的化合物或組合物。所述心臟保護(hù)劑可以， 例如阻斷或降低自由基介導(dǎo)的心臟毒作用和/或防止或降低氧化應(yīng)激損傷。本定義包括的心臟保護(hù)劑的例子包括鐵螯合劑右雷佐生(ICRF-187) Geifert等.The Annals of Pharmacotherapy 28:1063-1072(1994))；降脂劑和/或抗氧化劑，例如普羅布考(Singal 等.J. Mol. Cell Cardiol. 27 :1055-1063(1995))；氨磷丁 (氨基巰基 2_[ (3-氨基丙基) 氨基]乙硫醇-二氫磷酸酯，也稱(chēng)為WR-2721，及其去磷酸細(xì)胞攝取形式，稱(chēng)為WR-1065) 和S-3-(3-甲基氨基丙基氨基)丙基磷-硫代酸(WR-151327)，參見(jiàn)Green等.Cancer Research 54:738-741(1994)；地高辛(Bristow, Μ. R.刊于Bristow M R 等，“藥物誘導(dǎo)的心臟病”(DrugHnduced Heart Disease).紐約Elsevier 191-215 (1980)) ； β -阻斷劑,例如美托洛爾(Hjalmarson 等· Drugs 47 增干U 4 :31-9(1994)；禾口 Shaddy 等· Am. Heart J. 129 :197-9(1995))；維生素Ε;抗壞血酸(維生素C)；自由基清除劑，例如齊墩果醇酸、熊果酸和N-乙酰半胱氨酸(NAC)；自旋捕獲化合物，例如α-苯基-叔丁基硝酮 (PBN) ； (Paracchini 等·，Anticancer Res. 13 :1607-1612(1993))；硒代有機(jī)化合物，例如 P251 (Elbesen)；等。聯(lián)合給藥考慮采用不同制劑或單一藥物制劑共同給藥和任一順序的連續(xù)給藥，其中優(yōu)選一段時(shí)期同時(shí)給予兩種(或全部)活性劑而發(fā)揮它們的生物學(xué)活性。鑒定到的能間接或直接調(diào)節(jié)N-鈣黏著蛋白表達(dá)和/或功能的分子和化合物可用于治療各自表達(dá)N-鈣黏著蛋白的癌癥?？蓡为?dú)給予或與常規(guī)化療、放療或免疫治療以及目前開(kāi)發(fā)的治療共同給予N-鈣黏著蛋白調(diào)節(jié)劑。適合口服給予的制劑可包括(a)液體溶液，例如懸浮在稀釋劑，例如水、鹽水或 PEG 400中的有效量包裝核酸；(b)膠囊、小囊或片劑，各自含有預(yù)定量的活性成分，例如液體、固體、顆?；蛎髂z；(c)合適液體配制的懸液；和(d)合適的乳液。藥片劑型可包含以下一種或多種藥學(xué)上相容的運(yùn)載體乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸鈣、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、明膠、膠體二氧化硅、滑石粉、硬脂酸鎂、硬脂酸、和其它賦形劑、著色劑、填充劑、粘合劑、稀釋劑、緩沖劑、潤(rùn)濕劑、防腐劑、調(diào)味劑、色素、崩解劑。錠劑劑型可包含調(diào)味劑，例如蔗糖配制的活性成分，以及含惰性基料，例如明膠和甘油或蔗糖及阿拉伯膠乳液、 凝膠等配制的活性成分的軟錠劑，除活性成分外，還含有本領(lǐng)域已知的運(yùn)載體。可將所選的化合物單獨(dú)或與其它合適的組分混合制成經(jīng)吸入給藥的氣溶膠制劑 (即它們可“霧化”)。可將氣溶膠制劑裝在可接受的加壓推進(jìn)劑，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾戎小Ｖ蹦c給藥的合適制劑包括，例如栓劑，其由包裝的核酸與栓劑基料組成。合適的栓劑基料包括天然或合成的甘油三酯或石蠟烴。此外，也可采用所選化合物與基料組成的明膠直腸膠囊，所述基料包括，例如液體甘油三酯、聚乙二醇和石蠟烴。適合胃腸道外給藥，例如通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)(關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腫瘤內(nèi)、真皮內(nèi)、 腹膜內(nèi)和皮下途徑給藥的制劑包括水性和非水性等滲無(wú)菌注射液，它們可含有抗氧化劑、 緩沖劑、殺菌劑和使制劑與受者血液等滲的溶質(zhì)；水性和非水性無(wú)菌懸液可包含懸浮劑、增溶齊 、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。實(shí)施本發(fā)明時(shí)，可通過(guò)，例如靜脈內(nèi)輸注、口服、局部、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)或鞘內(nèi)給予組合物。胃腸道外給藥、口服給藥和靜脈內(nèi)給藥是優(yōu)選給藥方法。所述化合物制劑可放在單劑量或多劑量密封容器，例如安瓿和小瓶中。
可從上述類(lèi)型的無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備注射溶液和懸液。也可通過(guò)上述靜脈內(nèi)或胃腸道外給予經(jīng)核酸轉(zhuǎn)導(dǎo)作離體治療的細(xì)胞。所述藥物制品優(yōu)選為單位劑型。在此劑型中，所述制品再分成含有合適量活性組分的單位劑量。此單位劑型可以是包裝制品，該包裝含有離散量的制品，例如包裝在小瓶或安瓿中的片劑、膠囊和粉末。此單位劑型也可以是膠囊、片劑、小囊或錠劑本身，或者可以是適當(dāng)數(shù)量的任何包裝形式。如果需要，所述組合物還可含有其它相容的治療劑。在緩釋制劑中，優(yōu)選的藥物制品可遞送一種或多種活性N-鈣黏著蛋白調(diào)節(jié)劑，任選與一種或多種化療劑或免疫治療劑組合。通常治療性給予N-鈣黏著蛋白調(diào)節(jié)劑作為致敏劑，可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)其它細(xì)胞毒性癌癥治療，包括化療、放療、免疫治療和激素治療的敏感性。在癌癥治療的治療性應(yīng)用中，本發(fā)明藥學(xué)方法中所用的N-鈣黏著蛋白調(diào)節(jié)劑或抑制劑的初始給予劑量范圍是每日約0. 001mg/kg-1000mg/kg?？刹捎梅秶s0. Olmg/ kg-500mg/kg、或約 0. lmg/kg_200mg/kg、或約 lmg/kg-100mg/kg、或約 10mg/kg_50mg/kg 的日劑量。然而，此劑量視患者的要求、所治疾病的嚴(yán)重程度和所用化合物而不同。例如，考慮具體患者所診斷的癌癥類(lèi)型和階段可憑經(jīng)驗(yàn)決定劑量。就本發(fā)明而言，給予患者的劑量應(yīng)足以隨時(shí)間推移在患者中產(chǎn)生有益的治療反應(yīng)。給予特定載體或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞類(lèi)型在具體患者中伴隨產(chǎn)生的任何不良副作用的性質(zhì)和程度也決定了此劑量的大小。本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力確定具體情況的合適劑量。一般開(kāi)始時(shí)以低于所述化合物最佳劑量的較低劑量治療。 隨后，小量遞增劑量直至獲得在該情況下的最佳效果。如果需要，為方便起見(jiàn)，可將每日總劑量分成多份在一天內(nèi)給予。通常將本發(fā)明所用的藥物制品(例如，N-鈣黏著蛋白siRNA、N_鈣黏著蛋白抗體、 N-鈣黏著蛋白疫苗、N-鈣黏著蛋白抑制劑和免疫偶聯(lián)物)遞送給哺乳動(dòng)物，包括人和非人哺乳動(dòng)物。采用本發(fā)明方法可治療的非人哺乳動(dòng)物包括家養(yǎng)動(dòng)物(即，犬、貓、鼠、嚙齒目和兔形目)和農(nóng)業(yè)動(dòng)物(牛、馬、綿羊、豬)。
實(shí)施例提供以下實(shí)施例是為了說(shuō)明而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1 人N-鈣黏著蛋白的特異性人scFv的分離和表征材料與方法N-鈣黏著蛋白重組蛋白的表達(dá)和細(xì)胞系制備了兩個(gè)獨(dú)立的N-鈣黏著蛋白重組蛋白(Z ffainberg) :N_鈣黏著蛋白胞外結(jié)構(gòu)域1-3 (ECD1-3)和N-鈣黏著蛋白第四結(jié)構(gòu)域(ECD4)。采用RT-PCR從mRNA制品克隆其 cDNA序列。將E⑶1-3的核酸160-497和核酸489-603與6個(gè)組氨酸標(biāo)簽同框克隆入細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中，并與GST標(biāo)簽同框克隆入載體中。誘導(dǎo)表達(dá)數(shù)小時(shí)后分離周質(zhì)組分，用Ni-NTA 層析純化重組蛋白質(zhì)。用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的大小和純度。產(chǎn)生LNCap N-鈣黏著蛋白轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將完整的N-鈣黏著蛋白cDNA克隆入載體并通過(guò)感染轉(zhuǎn)染入LNCap細(xì)胞。利用兩種前列腺細(xì)胞系PC3細(xì)胞和DU145細(xì)胞表征分離的抗-N-鈣黏著蛋白抗體片段。噬菌體文庫(kù)淘選我們淘選了展示人單鏈Fv(ScFv)的非免疫噬菌體文庫(kù)，如以前所述(SieetsM. D. PNAS 1998)，該文庫(kù)含有JD Marks實(shí)驗(yàn)室制備的8. 2 X IO8個(gè)成員。選擇對(duì)N-鈣黏著蛋白重組蛋白有親和力的噬菌體。將E⑶1-3和E⑶4分別吸附在兩個(gè)免疫試管上(Nunc)。 然后用PBS洗滌免疫試管，室溫下用PBS配制的4%牛奶封閉2小時(shí)，隨后用PBS洗滌3次。 取Iml噬菌體展示scFv文庫(kù)試樣(8. IO11Pfu)與Iml 8% MPBS混合，加入上述抗原包被的免疫試管中。室溫下溫育免疫試管1小時(shí)。然后用PBS配制的0. 05%吐溫20洗滌免疫試管1次，用PBS洗滌3次。用Iml IOOmM三乙胺洗脫噬菌體5分鐘，用0. 5ml IM Tris-Hcl PH 7. 4中和。凍存各輪次的一半洗脫噬菌體，將另一半用于感染TGl細(xì)胞。如以前所述 (Sheets Μ. D. PNAS 1998)進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增和純化。選擇包括類(lèi)似于第一輪的另三輪淘選。 第一輪和第二輪用2ml (40 μ 1/ml)包被免疫試管，而第三輪和第四輪用20 μ 1/ml包被免疫試管。在第二、三和四輪中逐漸增加洗滌次數(shù)。如前所述(參考Marks JD J Mol Biol. 1991 Dec 5 ；222 (3) :581-97)，用ELISA評(píng)估第一、二和三輪的多克隆噬菌體抗體和第四輪淘選得到的95個(gè)克隆。ELISA篩選各克隆用ELISA測(cè)定95個(gè)克隆與它們靶蛋白的結(jié)合(Marks JD J Mol Biol. 1991年12 月 5;222(3) :581-97) (Poul M 等，JMB 第 301 卷，第 5 版，第 1149-1161 頁(yè))。采用選擇用的靶蛋白包被96孔ELISA板。用限制性酶BstNI對(duì)scFv基因作酶解圖譜(fingerprinting) 來(lái)測(cè)定獨(dú)特scFv的數(shù)量，并經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)。將scFv重新組成雙抗體利用NcoI和NotI限制性酶切去scFv插入物的pHEW，利用同一限制性酶切位點(diǎn)將其克隆入PSyn載體中。為將scFv重新組成雙抗體，采用了通過(guò)重疊延伸PCR(SOE-PCR) 剪接得到15-5個(gè)氨基酸的接頭(Yazaki PJ等，PEDS 2004年5月；17(5) :481-9)。將 SOE-PCR產(chǎn)物克隆入TOPO載體(英杰公司(invitrogen))中并測(cè)序證實(shí)PCR未產(chǎn)生突變。 最終利用NcoI和NotI限制性位點(diǎn)將該雙抗體構(gòu)建物克隆入pSynl載體中。scFv和雙抗體的表達(dá)和純化將克隆入pSynl的scFv和雙抗體轉(zhuǎn)染入TGl細(xì)菌中以表達(dá)蛋白質(zhì)。先培養(yǎng)細(xì)菌至密度0. 50. D6tltlnm,然后用ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)4小時(shí)后，離心細(xì)菌，制備周質(zhì)組分。 用Ni-NTA柱純化6HIS標(biāo)簽蛋白。用PBS透析洗脫的蛋白質(zhì)、濃縮并過(guò)濾。生物化學(xué)表征用非還原條件下的SDS-PAGE分析純化的蛋白質(zhì)。利用尺寸排阻柱(Superdex 75) (法瑪西亞公司(Wiarmacia))測(cè)定天然結(jié)構(gòu)的大小。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以評(píng)估噬菌體抗體克隆和雙抗體與細(xì)胞N-鈣黏著蛋白的結(jié)合。 對(duì)于噬菌體抗體染色，采用濃縮20倍的上清液。各噬菌體克隆在20ml 2TY中培養(yǎng)至密度 0. 50. D6tltlnm,此時(shí)用輔助噬菌體拯救該噬菌體。培養(yǎng)過(guò)夜后，用PEG/NaCl沉淀收集上清液中的單克隆噬菌體，重懸于lmlPBS/1 % BSA中。對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)染色，在冰上溫育切105細(xì)胞與100 μ 1 20x PEG濃縮的噬菌體抗體克隆1小時(shí)。用流動(dòng)緩沖液(PBS 1 % FBS, ImMEDTA, 0.02%疊氮鈉)洗滌細(xì)胞，用單克隆抗-M13抗體(AB公司(Amersham Biosciences))檢測(cè)噬菌體抗體克隆。洗滌細(xì)胞，用R-PE偶聯(lián)的抗-小鼠抗體染色。對(duì)于雙抗體染色，在冰上溫育切105細(xì)胞與流動(dòng)緩沖液配制的2 μ g/ml濃度的雙抗體1小時(shí)。用流動(dòng)緩沖液洗滌細(xì)胞，用1/100抗-c-Myc-生物素抗體檢測(cè)雙抗體。最后，用流動(dòng)緩沖液洗滌細(xì)胞，用1/40鏈霉親和素-R-PE(西格瑪公司(SIGMA))染色。體內(nèi)研究用124I標(biāo)記D4Db蛋白后，注射入攜帶LAPC9AI腫瘤的SCID小鼠和攜帶PC3腫瘤的裸鼠尾靜脈。注射后4和20小時(shí)進(jìn)行MicroPET成像。注射后20小時(shí)進(jìn)行生物分布(試驗(yàn))。淘選分別用ECDl-3_6His或ECD4-6HIS重組蛋白淘選展示人單鏈Fv抗體(scFv)的同一非免疫噬菌體文庫(kù)，該文庫(kù)含有8. 2 X IO8個(gè)成員。淘選結(jié)果包括輸入、輸出、回收和富集， 見(jiàn)表1。從第二輪開(kāi)始，用ECD1-3淘選實(shí)現(xiàn)初步富集，然而僅在ECD4最后一輪淘選時(shí)富集度大于1。這些結(jié)果與多克隆ELISA的結(jié)果相一致，在用E⑶1-3的第二輪淘選出現(xiàn)了信號(hào)， 但僅在用E⑶4的第三輪淘選的樣品顯示信號(hào)。如圖1所示，通過(guò)ELISA分析第1、2和3輪淘選獲得的多克隆噬菌體抗體。采用淘選輪次所用靶蛋白包被ELISA平板。用HRP偶聯(lián)的抗-M13抗體檢測(cè)結(jié)合的噬菌體抗體。表1a) ECD1-權(quán)利要求
1.一種包含SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的單克隆抗體或其片段，所述單克隆抗體或其片段能結(jié)合N-鈣黏著蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域4。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述片段是scFv。
3.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述片段是雙抗體。
4.一種包含SEQ ID N0:2、3、4、5、6、7、8或9所示氨基酸序列的單克隆抗體或其片段， 所述單克隆抗體或其片段能結(jié)合N-鈣黏著蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域1-3。
5.如權(quán)利要求4所述的抗體，其特征在于，所述片段是scFv。
6.如權(quán)利要求4所述的抗體，其特征在于，所述片段是雙抗體。
7.一種治療癌癥患者的方法，包括以下步驟(a)獲得具有患表達(dá)N-鈣黏著蛋白癌癥風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的測(cè)試組織樣品；(b)測(cè)定所述測(cè)試組織樣品中N-鈣黏著蛋白存在與否或含量，與已知所述癌癥陰性個(gè)體的對(duì)照組織樣品作比較；其中N-鈣黏著蛋白以正常或低水平表達(dá)，或者由一個(gè)細(xì)胞的亞組表達(dá)，或過(guò)表達(dá)；和(c)將有效量的權(quán)利要求1或4所述的N-鈣黏著蛋白抗體或其片段給予具有患表達(dá) N-鈣黏著蛋白癌癥風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述組織樣品是前列腺或膀胱組織。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述癌癥是前列腺癌。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述癌癥是膀胱癌。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述癌癥是激素難治的前列腺癌。
12.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗體阻斷激素難治的前列腺癌。
13.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗體阻斷癌癥干細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述癌癥是轉(zhuǎn)移性癌癥。
15.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
16.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗體是scFV。
17.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗體是雙抗體。
18.—種診斷癌癥患者的方法，包括以下步驟(a)獲得具有患表達(dá)N-鈣黏著蛋白癌癥風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的測(cè)試組織樣品；(b)通過(guò)使樣品與有效量的權(quán)利要求1或4所述的N-鈣黏著蛋白抗體或其片段接觸來(lái)測(cè)定所述測(cè)試組織樣品中N-鈣黏著蛋白存在與否或含量，與已知所述癌癥陰性個(gè)體的對(duì)照組織樣品作比較；藉此診斷表達(dá)N-鈣黏著蛋白的所述癌癥，其中N-鈣黏著蛋白以正?；虻退奖磉_(dá)，或者由細(xì)胞的亞組表達(dá)，或過(guò)表達(dá)。
19.一種鑒定癌癥干細(xì)胞的方法，包括以下步驟(a)獲得具有患表達(dá)N-鈣黏著蛋白癌癥風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的測(cè)試組織樣品；(b)利用權(quán)利要求1或4所述的抗體，測(cè)定所述測(cè)試組織樣品中癌癥干細(xì)胞存在與否， 與已知所述癌癥陰性的個(gè)體的對(duì)照組織樣品作比較；其中N-鈣黏著蛋白以正?；虻退奖磉_(dá)，或者由所述干細(xì)胞的亞組表達(dá)并且未過(guò)表達(dá)。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述組織樣品是前列腺或膀胱組織。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述癌癥是前列腺癌。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述癌癥是膀胱癌。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述癌癥是激素難治的前列腺癌。
24.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述癌癥是轉(zhuǎn)移性癌癥。
25.一種分離的核酸，其包含編碼權(quán)利要求1或4所述序列的核苷酸序列。
26.一種分離的載體，其包含權(quán)利要求25所述的核酸。
27.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求沈所述的載體。
全文摘要
本申請(qǐng)?zhí)峁┛捎糜诎┌Y治療和診斷方法的針對(duì)N-鈣黏著蛋白的完全人抗體。
文檔編號(hào)G01N33/574GK102300873SQ200980154469
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日
發(fā)明者A·M·吳, E·萊皮恩, R·E·賴(lài)特爾 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)