專利名稱：一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法
一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法技術(shù)領(lǐng)域一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景全氟辛酸，英文名稱Perfluorooctanoic acid (PFOA)， CAS號335-67-l ，分 子式為<:8昍1502。全氟辛酸(PFOA)及其鹽是一種常用的氟表面活性劑，具有很強(qiáng)的疏水性和疏油性，其化學(xué)結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)較其它表面活性劑穩(wěn)定。由于它優(yōu)異的耐 熱、耐低溫、自潤滑性及化學(xué)穩(wěn)定性等，被應(yīng)用在航天、電子、化學(xué)和消防領(lǐng)域， 并被用在生活部門如不粘鍋具、防水透氣材料(如防水衣物)、皮革、汽車部件及微波爐爆玉米花袋等。PFOA難以降解，在環(huán)境中具有積累性和持久性，但其 對人及環(huán)境的影響至今還沒得出明確的結(jié)論。PFOA可通過攝取、吸入、皮膚 接觸而被吸收，從而誘發(fā)癌癥、肝腫大等疾病。 一些動物實(shí)驗(yàn)表明，PFOA能夠 擾亂脂肪酸的新陳代謝，影響生殖系統(tǒng)，可能與乳腺、睪丸、胰和肝腫瘤有關(guān)。 PFOA的生物毒性作用還包括對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，干擾線粒體代謝，導(dǎo)致 肝細(xì)胞損傷，疾病感染致死等。由于其疏水疏油的特點(diǎn)，PFOA全氟有機(jī)物被生 物攝取后一般不在脂肪組織中積累，其大部分與血漿蛋白結(jié)合存在于血液中， 其余一部分則蓄積在動物的肝臟組織和肌肉組織中。由于它的這種分布特點(diǎn)以 及沒有很好的檢測方法，使得PFOA的污染問題很長時間沒有受到科學(xué)家的重 視。全氟表面活性劑的研究在國際上已然成為環(huán)境科學(xué)和毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)， 國內(nèi)研究還尚屬起步階段?，F(xiàn)有的儀器檢測法樣品前處理復(fù)雜，所需的儀器昂 貴，成本高，檢測時間長，很難實(shí)現(xiàn)對PFOA進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，有必要研 究針對PFOA的快速、便攜的免疫檢測技術(shù)。這就需要合成能產(chǎn)生簇特異性抗體 的免疫原。目前為止，國內(nèi)外尚沒有針對全氟辛酸PFOA的免疫檢測方法的報道， 為了彌補(bǔ)這一空白，設(shè)計合成了直接以全氟辛酸(Perfluorooctanoic acid)為半 抗原的用于全氟有機(jī)物檢測的完全抗原。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法。所制 備的產(chǎn)品用于全氟辛酸的免疫分析方法研究，為今后人們的研究提供了必需的 免疫原。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法，以全氟辛酸PFOA為半抗原，用碳二亞胺法將其與載體蛋白牛血清蛋白BSA偶聯(lián)， 用紫外掃描儀(UNICO,UV-2802pcs)測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比，制備全氟辛酸類藥物通用人工抗原，即全氟辛酸-牛血清蛋白；步驟為(1) 人工抗原的合成全氟辛酸、牛血清蛋白以摩爾比為40:1的比例反應(yīng)， 取全氟辛酸、牛血清蛋白溶于0.1mol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，充分溶 解后逐滴加入現(xiàn)配的水溶性碳二亞胺的甲醇溶液，室溫輕柔攪拌反應(yīng)3小時， 即得偶聯(lián)物PFOA-BSA人工抗原混合液；透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離 子水沖洗3min，保存在4"C去離子水中備用；將人工抗原混合液移入透析袋中，用3X2L的0.01M的pH7.4的磷酸鹽緩 沖溶液和3X2L的去離子水透析3天，每天三次換液；(2) 人工抗原的鑒定全氟辛酸-牛血清蛋白采用紫外掃描測定其偶聯(lián)比， 在吸收波長223nm處測吸光值，并計算其偶聯(lián)比。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明成功合成了 PFOA的免疫原，合成步驟簡潔， 有效，完全可用于免疫分析當(dāng)中，為以后人們的研究提供了方便的途徑，可以 滿足國內(nèi)對其研究的需要。


圖1PF0A、 BSA及其偶聯(lián)物的紫外掃描組合圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1(1) 人工抗原的制備稱取全氟辛酸2mg (0.00483mmo1)、牛血清蛋白BSA 8 mg(0.000121mmo1) 溶于lmL PBS(0.1mol/L)溶液中，充分溶解后逐滴加入現(xiàn)配的水溶性碳二亞胺 EDC的甲醇溶液(40pL EDC溶于50pL甲醇)，室溫輕柔攪拌反應(yīng)3小時。即 得偶聯(lián)物PFOA-BSA混合液。透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去離 子水沖洗3min，保存在4"C去離子水中備用。將反應(yīng)液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次換液。(2) 全氟辛酸人工抗原的鑒定偶聯(lián)比測定，即估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方 法，雖然種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對 含量)的原理建立起來的.分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃度呈比例 關(guān)系的原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩 種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。摩爾吸收系數(shù)s:取全氟辛酸(PFOA)純品配制濃度為lmg，mL"的超純水 溶液，通過紫外掃描可知PFOA的最大吸收波長為209nm，在209nm處的吸光 值為0.760。摩爾吸光系數(shù)計算為^=吸光值/摩爾濃度。本實(shí)驗(yàn)計算得￡扁=314.05 L'mol。偶聯(lián)物蛋白濃度測定配制濃度為0， 40， 60， 80， 100， 120， 160， 200嗎'mL—1 的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)染色液，立即混勻，30'C水浴 溫?zé)?分鐘，每個濃度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光 值的關(guān)系曲線。將偶聯(lián)物溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定PFOA-牛血清 蛋白抗原溶液的吸光值，從曲線上得到偶聯(lián)物溶液的相應(yīng)的蛋白濃度。本實(shí)驗(yàn) 計算得偶聯(lián)物溶液的蛋白濃度為4.1016mg'mL—1。偶聯(lián)比測定分別配制濃度O.Smg.mL-1的PFOA-BSA及0.5mg.ml/1的牛血 清蛋白(BSA)，通過紫外掃描可知PFOA-BSA的最大吸收波長為223 nm，在最 大吸收波長223 nm處的最大吸光值為2.2465; BSA在223 nm處的最大吸光值 為2.2024。2.2465與2.2024的差0.0441可代表偶聯(lián)物PFOA-BSA中的PFOA的 紫外吸收值(即偶聯(lián)物的吸光值一蛋白質(zhì)的吸光值)。根據(jù)上述差值和PFOA的 摩爾吸光系數(shù)，可算得PFOA-BSA中的PFOA的摩爾濃度為0.0001404mol/L， 再轉(zhuǎn)成嗎'mL"濃度為58.14(ig'rnL"。由已知的PFOA-BSA的質(zhì)量濃度減去這 個PFOA濃度，得到PFOA-BSA中的BSA質(zhì)量濃度，同樣轉(zhuǎn)化為摩爾濃度。則 偶聯(lián)比為PFOA-BSA中的PFOA的摩爾濃度與PFOA-BSA中的BSA的摩爾濃 度之比值。本實(shí)驗(yàn)計算得偶聯(lián)比r"21.03。
權(quán)利要求
1.一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法，其特征是以全氟辛酸PFOA為半抗原，用碳二亞胺法將其與載體蛋白牛血清蛋白BSA偶聯(lián)，用紫外掃描儀測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比，制備全氟辛酸類藥物通用人工抗原，即全氟辛酸-牛血清蛋白；步驟為((1)人工抗原的合成全氟辛酸、牛血清蛋白以摩爾比為40∶1的比例反應(yīng)，取全氟辛酸、牛血清蛋白溶于0.1mol/L的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，充分溶解后逐滴加入現(xiàn)配的水溶性碳二亞胺的甲醇溶液，室溫輕柔攪拌反應(yīng)3小時，即得偶聯(lián)物PFOA-BSA人工抗原混合液；透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；將人工抗原混合液移入透析袋中，用3×2L的0.01M的pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液和3×2L的去離子水透析3天，每天三次換液；(2)人工抗原的鑒定全氟辛酸-牛血清蛋白采用紫外掃描測定其偶聯(lián)比，在吸收波長223nm處測吸光值，并計算其偶聯(lián)比。
全文摘要
一種全氟辛酸類藥物通用人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以全氟辛酸PFOA為半抗原，用碳二亞胺將其與載體蛋白牛血清蛋白BSA偶聯(lián)，用紫外掃描儀測定偶聯(lián)物的偶聯(lián)比。本發(fā)明成功合成了全氟辛酸的人工抗原全氟辛酸-牛血清蛋白，合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了必需的人工抗原，可以滿足國內(nèi)對其研究的需要。
文檔編號C07K1/00GK101328216SQ20081002110
公開日2008年12月24日 申請日期2008年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月24日
發(fā)明者彭池方, 徐麗廣, 李灼坤, 胥傳來, 媛 袁, 謝會玲, 偉 馬 申請人:江南大學(xué)