專利名稱：生物可降解白蛋白衍生物及其藥學組合物的制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物制劑領域，涉及一種生物可降解性白蛋白衍生物作為藥物載體，本發(fā)明還涉及該載體的制備方法及其應用。

背景技術：
難溶性藥物的給藥(特別是注射給藥)的最大障礙是溶解度低，難于制備適宜的制劑。往往需要采取各種增加溶解度的方法，如將藥物制備成鹽、加入潛溶劑、加入助溶劑以及加入表面活性劑增溶。由于成鹽往往需要強酸或強堿條件，對許多藥物往往不適用，生理安全的潛溶媒很少，且用量有所限制；通過與藥物形成絡合物而增加藥物溶解度的助溶劑的安全性不易保證，因此，通過表面活性劑膠束增溶往往成為首選。例如紫杉醇是一種作用很強的抗腫瘤藥物，體外實驗表明紫杉醇對各種腫瘤均具有明顯的抑制作用，臨床上適用于治療乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等。然而紫杉醇在水中溶解度極低(＜1μg/ml)，口服幾乎不吸收，目前臨床用制劑，如Taxol_[美國Bristol Myers Squibb(BMS)公司]、Anzatax_(澳大利亞Faulding公司)以及國產(chǎn)的紫素_、泰素_等均以聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)-無水乙醇(50∶50，v/v)作為紫杉醇復合溶媒，該增溶方法存在以下的缺陷①Cremophor EL的臨界膠束濃度(Critical micellar concentration，CMC)較高，臨床稀釋時膠束容易解離，導致藥物析出，因此輸液管必須有在線濾過裝置；②處方中的Cremophor EL會引起體內(nèi)組織胺釋放，給藥后數(shù)分鐘，部分病人會出現(xiàn)藥物性皮疹、呼吸急促、支氣管痙攣、低血壓等過敏反應，即使同時使用氫化可地松，過敏反應的發(fā)生率仍達到10％～30％，另外Cremophor EL還會引起腎毒性、神經(jīng)毒性、心臟毒性等副反應；③注射液中的Cremophor EL與聚氯乙烯塑料管和輸液袋接觸可浸提出大量的塑化劑鄰苯二甲酸二乙基乙酯(DEHP)，引起毒性。同樣的情況也出現(xiàn)在喜樹堿、依托泊苷等抗腫瘤藥物的注射液中，例如依托泊苷注射劑由乙醇、丙二醇、聚山梨酯80組成，用前稀釋，注射時刺激性較大。
鑒于普通表面活性劑膠束的高CMC和可能的毒副作用，聚合物膠束是近年來發(fā)展起來的藥物載體，由兩親性高分子在水中自組裝形成，其疏水部分互相纏繞形成“內(nèi)核”，而親水性部分則環(huán)繞在外，形成柔韌的親水性“外殼”，疏水性的內(nèi)核作為藥物的載體或儲庫為疏水性藥物提供了一個穩(wěn)定的微環(huán)境，親水性的外殼使納米膠束能夠穩(wěn)定地存在于水溶液中和體液中，能夠避免MPS吞噬系統(tǒng)的吞噬，具有長循環(huán)特征。另外，聚合物膠束還可利用腫瘤組織的EPR效應滯留于腫瘤組織。如Nakanishi T等(Nakanishi T，F(xiàn)ukushima S，K O.Development ofthe polymer micelle carrier system for doxorubicin[J].J. Control.Release，2001，74(1-3)295-302)制備的阿霉素PEO-b-P(Asp)-DOX制劑，血漿AUC可提高高達28.9倍，腫瘤AUC可提高3.4倍，抗腫瘤活性顯著提高。
目前對生物降解聚合物膠束的研究主要集中在合成高分子材料，主要是兩親性A-B嵌段、A-B-A嵌段共聚物或接枝共聚物。A為親水性組分，B為疏水性組分。由于可供共聚A、B組分及可生物降解的組分較少，在選擇時存在較大困難，故疏水性組分通常為聚內(nèi)酯，如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-乙交酯)(PLGA)或聚氨基酸如聚天冬氨酸、聚谷氨酸等；親水性組分則多為聚乙二醇(PEG)。
然而，現(xiàn)有的載藥聚合物膠束存在載藥量低、穩(wěn)定性差的問題，且隨著載藥量的增加，穩(wěn)定性呈降低趨勢，這限制了聚合物膠束的進一步推廣和應用。以紫杉醇為例，Le Garrec D等(Le Garrec D，Gori S，Luo L，et al.Poly(N-vinylpyrrolidone)-block-poly(D，L-lactide)as a newpolymeric solubilizer for hydrophobic anticancer drugsin vitro and in vivo evaluation[J].J ControlRelease，2004，99(1)83-101)合成的PDLLA-b-PVP作為紫杉醇增溶載體，載藥量最高為5％，24h即出現(xiàn)沉淀。Zhang，Z.(Zhang，Z.，F(xiàn)eng，S.S，Biomaterials，2006，27(2)，262-70)等合成的poly(lactide)/Vitamin E TPGS copolymer，其紫杉醇最高載藥量僅為5％(w/w)。D.LeGarrec(Le Garrec，D.，Gori，S.，J Control Res，99(1)，83-101)制備了poly(N-vinylpyrrolidone)-block-poly(D，L-lactide)，其紫杉醇最高載藥量也僅為5％(w/w)。Burt HM等(Burt HM，ZhangX，Toleikis P，et al.Development of copolymers of poly(d，l-actide)and methoxypolyethyleneglycol as micellar carriers of paclitaxel[J].Colloids and Surfaces BBiointerfaces，1999，16(1-4)161.)制備的PGACL-MePEG作為紫杉醇載體，雖然載藥量可以達到22％(w/w)，但是穩(wěn)定時間＜5h。
目前，解決載藥聚合物膠束載藥量和穩(wěn)定性的方法主要是選擇更加合適的聚合物材料。
白蛋白是一種天然的水溶性高分子，分子量為66500道爾頓，由584個氨基酸殘基組成。白蛋白在藥物制劑領域中的一個重要應用就是作為藥物的載體材料，這主要是基于以下優(yōu)越性白蛋白化學性能穩(wěn)定、無免疫原性、生物相容性好，在體內(nèi)分子鏈中的肽鍵可被酶降解為小分子而被吸收，且白蛋白分子鏈上帶有較多的極性基團，對很多藥物離子具有高度的親和力，能和藥物可逆的結合，為其高負載藥物提供可能；白蛋白二級結構中含有約48％的α-螺旋結構，15％β-折疊片結構，其余為無規(guī)線團結構，因此具有很多的網(wǎng)狀空隙，為攜帶藥物創(chuàng)造了有利的空間條件；另外，白蛋白是正常向細胞輸送營養(yǎng)的蛋白質，快速生長的腫瘤可攝取和儲備白蛋白，白蛋白作為抗腫瘤藥物載體，可與腫瘤細胞膜上的白蛋白受體Gp60結合，顯著提高腫瘤細胞中藥物的分布，為其腫瘤靶向性提供了可能。
目前，對于白蛋白在藥物遞送系統(tǒng)中的應用主要集中于以下兩個方面 ①制備白蛋白納米粒作為藥物載體。
CN 1994291A公開的乳化加熱固化法制備白蛋白納米粒，需使用油、表面活性劑及較高的溫度(100～120℃)，且需使用大量有機溶劑洗除油性殘余物和表面活性劑，不僅易引起有機溶解的殘留，為納米粒的純化帶來困難，另外，加熱對于熱不穩(wěn)定的藥物也不利。
CN 1306955C公開的乳化化學交聯(lián)法不僅使用有機溶劑或油，而且使用較多的化學交聯(lián)劑如甲醛、戊二醛等，其殘留也將給制劑的使用帶來安全隱患。
Arnedo A等(Int J Pharm.2002，244(1-2)59-72)報道的凝聚-化學交聯(lián)法，除了使用化學交聯(lián)劑的缺陷外，粒徑同樣較難控制，且需進行pH值調(diào)節(jié)，在高濃度蛋白質存在條件下，以玻璃電極測定pH值的可靠性有限。
EP1348431，CN 1448128A公開的紫杉醇白蛋白納米顆粒的制備方法，通過向人血清白蛋白(HSA)與氯仿水溶液中加入粉末狀紫杉醇，得到的混合物進行高壓均質處理，然后真空蒸發(fā)除去有機溶劑，此方法可能造成制劑產(chǎn)品有機溶劑殘留，而且臨床稀釋穩(wěn)定性＜24小時。
US5439686、US549842、US5560933公開的采用超聲技術制備紫杉醇和HSA，得到的納米粒平均粒徑＜10μm，該粒徑不適合于血管內(nèi)給藥。
US5916596、US6096331公開的制備方法是分別制備紫杉醇的溶液和含有HSA的水溶液，然后二相混合，高壓下進行均質處理，蒸去有機溶劑，過濾，凍干即得。該方法制備的納米粒粒徑＜0.2μm，放置12h即有沉淀傾向。
②通過化學修飾將藥物化學鍵合到白蛋白分子鏈上 邱曉航等(高等學?；瘜W學報，1999，20(7)，1073-76)采用活性酯法和混合酸酐法將紫杉醇通過化學鍵結合到白蛋白分子鏈上，一個分子鏈可修飾1～9個紫杉醇分子，可顯著提高紫杉醇的水溶性。
可見，目前制備白蛋白納米粒的方法不可避免的使用較多的表面活性劑、有機溶劑、化學交聯(lián)劑等，而且所形成的納米載體包載藥物有限，穩(wěn)定性不佳。若將藥物化學鍵合到白蛋白分子鏈上，則存在產(chǎn)品收率低，原料藥損失嚴重，純化困難等缺陷。
白蛋白分子鏈上有大量的游離氨基和羧基，發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)，若在白蛋白分子鏈中引入合適的疏水基團，一方面使白蛋白具有兩親性性質，在水溶液中自組裝形成納米膠束，避免了有機溶劑、表面活性劑、交聯(lián)劑或加熱條件的使用；另一方面，在疏水基團和白蛋白分子鏈與藥物的雙重作用下，與未修飾的白蛋白相比，兩親性白蛋白可顯著提高藥物的載藥量，穩(wěn)定時間也非常顯著的延長。白蛋白自組裝納米膠束尚未見任何文獻和專利報道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生物可降解的疏水改性的白蛋白兩親性衍生物。該衍生物在水介質中可自組裝形成納米粒，可避免化學交聯(lián)劑、大量有機溶劑、加熱條件的使用，制備工藝簡單；并可利用白蛋白分子鏈以及疏水基團和藥物的雙重作用包載藥物。該載體具有載藥量高、穩(wěn)定性好、緩釋靶向的特征。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述載體的制備方法。
本發(fā)明還有一個目的是提供上述載體在制藥中的應用。
為達到上述目的，本發(fā)明提供一種生物可降解白蛋白兩親性衍生物，其結構包括至少一種以下化學式所示的改性白蛋白氨基酸單元 AL_NH-M]p (I) AL_NH-CO-M]p(II) AL_CO-NH-M]p(III) AL_NH-CO-R]p(IV) 其中，AL為白蛋白分子鏈，主要包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、豬血清蛋白。M為包括C2-18烴基，R為脫氧膽酸或膽酸，白蛋白衍生物分子鏈含有至少一種化學式為I～IV的氨基酸，P為3～70的整數(shù)。
生物可降解白蛋白衍生物的制備方法，包括下列步驟將白蛋白溶于或分散于水或水有機溶劑的混合溶劑中，采用提供疏水基團的物質與白蛋白骨架上的氨基或羧基進行取代反應，即具有良好兩親性，在水介質中可自發(fā)形成納米膠束。
所述的制備方法，其中提供疏水基團的物質是碳原子數(shù)均不小于2的鹵代烴、烷基醛、脂肪酸酐、脂肪酰鹵、脂肪酸和脫氧膽酸及膽酸。
所述的生物可降解白蛋白衍生物作為藥學活性或藥理活性分子載體的應用。其中該藥學活性或藥理活性分子主要包括紫杉烷類、環(huán)孢素類、喜樹堿類、黃酮類、二氫吡啶類、小蘗堿類、長春堿類、蒽醌類、鬼臼毒素類抗腫瘤藥、甾體類或非甾體抗炎藥物、心血管藥物、抗生素、抗真菌藥物、抗病毒藥物、免疫調(diào)節(jié)劑中的任一物質或其衍生物，可以用于血管內(nèi)或肌肉注射或口服、外用。
該藥物增溶載體的制備方法操作步驟如下將所述兩親性白蛋白衍生物與水按重量比為1～50∶1000的比例溶解，得到白蛋白衍生物的納米膠束；將治療有效量的難溶或微溶于水的有機藥物用藥學上可接受溶劑溶解后，與所述兩親性白蛋白衍生物納米膠束混合后，經(jīng)超聲或高壓均質法處理，溶液用截留分子量為12000～14000的透析袋透析或蒸餾法除去有機溶劑，凍干制得粒徑為10～1000nm的納米膠束即可。
具體方案如下 在白蛋白的氨基或羧基引入疏水烷基或脂肪酰基或(脫氧)膽酸，使其具有兩親性，在水介質中可組裝成膠束，相對疏水的烷基或脂肪?；?脫氧)膽酸聚集成內(nèi)核，白蛋白形成親水性的外殼，具有穩(wěn)定膠束、有效躲避生物體網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕捉的作用。因此這類高分子材料是一類優(yōu)良的藥物載體，尤其對于難溶性抗腫瘤藥物及其它難溶于水的非抗腫瘤藥物。該衍生物作為藥物載體，粒徑在10～1000nm可控，表面光滑，均勻度好，顆粒規(guī)則無粘連，再分散性好，載藥量和包封率高。該藥物載體可用于血管內(nèi)或肌肉注射、口服、腔道和外用。
生物可降解白蛋白衍生物的合成及藥學或生理活性組合物制備方法詳細說明如下 一、生物可降解白蛋白衍生物的合成 1烷(酰)基修飾白蛋白的制備 1)與烷基醛反應 白蛋白配成水溶液，加入烷基醛，反應0.5～8h后，加入NaBH4水溶液，繼續(xù)攪拌12h，HCl液調(diào)pH7，純凈水透析3d，凍干即得烷基修飾的白蛋白。
合成路線圖解如下 2)與鹵代烷反應 白蛋白配成水溶液，攪拌下加入鹵代烴，40～70℃反應4～12h，調(diào)反應液pH7，純凈水透析3d，凍干即得烷基修飾的白蛋白。
合成路線圖解如下 AL-NH2+M-X→AL_NH-M]p 3)與酸酐反應 脂肪酸通過分子間脫水而得到酸酐，將白蛋白分散在一定比例的水和醇混合液中，攪拌下加入脂肪酸酐丙酮溶液，室溫反應5～15h，旋轉蒸發(fā)，反應溶液透析3d，凍干即得烷?；揎椀陌椎鞍住?br> 合成路線圖解如下 2M-COOH→(MCO)2O AL-NH2+(MCO)2O→AL_NH-CO-M]p 4)與酰鹵反應 脂肪酸與二氯亞砜、三氯化磷、五氯化磷、三溴化磷、五溴化磷中的一種反應，制得脂肪酰鹵。將白蛋白分散在二甲亞砜中，攪拌下低價脂肪酰鹵，40～50℃反應5～12h，旋轉蒸發(fā)，反應溶液透析袋透析3d，凍干即得烷?；揎椀陌椎鞍住?br> 合成路線圖解如下 M-COOH+SOCl2→MCOCl AL-NH2+MCOCl→AL_NH-CO-M]p 5)與脂肪酸反應 方法1白蛋白配成水溶液，加入脂肪酸，加入EDC催化劑，反應1～24h，NaOH調(diào)節(jié)pH7，反應液透析3d，凍干即得烷?；揎椀陌椎鞍?。
方法2在DCC催化下制備脂肪酸N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯，加入自蛋白溶液，反應1～24h，NaOH調(diào)節(jié)pH7，反應液透析3d，凍干即得烷?；揎椀陌椎鞍住?br> 合成路線圖解如下 6)與烷基胺反應 方法1白蛋白配成水溶液，加入烷基胺，加入EDC催化劑，反應1～24h，NaOH調(diào)節(jié)pH7，反應液透析3d，凍干即得烷?；揎椀陌椎鞍?。
方法2在DCC催化下制備白蛋白NHS活性酯，加入烷基胺，反應1～24h，NaOH調(diào)節(jié)pH7，反應液透析3d，凍干即得烷?；揎椀陌椎鞍住?br> 合成路線圖解如下 2(脫氧)膽酸修飾白蛋白的制備 1)脫氧膽酸修飾白蛋白的制備 方法1白蛋白配成水溶液，加入脫氧膽酸，加入EDC催化劑，反應1～24h，調(diào)節(jié)pH7，反應液透析3d，凍干即得脫氧膽酸修飾白蛋白。
方法2在DCC催化下制備脫氧膽酸NHS活性酯，加入白蛋白溶液，反應1～24h，調(diào)pH7，反應液透析3d，溶液凍干即得脫氧膽酸修飾白蛋白。
合成路線圖解如下
2)膽酸修飾白蛋白的制備 方法1白蛋白配成水溶液，加入膽酸，加入EDC催化劑，反應1～24h，NaOH調(diào)節(jié)pH7，反應液透析3d，凍干即得膽酸修飾白蛋白。
方法2在DCC催化下制備膽酸NHS活性酯，加入白蛋白溶液，反應1～24h，調(diào)pH7，反應液透析3d，溶液凍干即得膽酸修飾白蛋白。
合成路線圖解如下
二、白蛋白納米膠束的制備方法 按每1ml水中溶解3～20mg的兩親性白蛋白衍生物的比例，將制得的兩親性白蛋白衍生物溶于水中，經(jīng)超聲或高壓均質處理，制備成粒徑為10～1000nm的白蛋白膠束。
三、以白蛋白衍生物作為載體，制備含難溶藥物的藥物組合物 白蛋白衍生物溶于水，濃度0.1％～5％(w/w)，將難溶性藥物如紫杉醇用適當溶劑溶解，經(jīng)超聲或高壓均質處理，通過透析或減壓蒸餾的方法除去有機溶劑，制得粒徑為10～1000nm的納米膠束。所謂適當溶劑，指藥學上使用的能溶解該藥物的溶劑。
四、采用白蛋白衍生物作為載體制備藥物組合物，可對藥物有效負載。
可使用該兩親性白蛋白衍生物作為載體的藥物有紫杉醇、環(huán)孢素、替尼泊甙、羥基喜樹堿、喜樹堿、長春酰胺、依托泊甙、尼莫地平、阿霉素、多西紫杉醇，燈盞花素、銀杏內(nèi)酯、水飛薊素、柔紅霉素、絲裂霉素、氨甲喋呤、吲哚美辛、布洛芬、酮洛芬、萘普生、硝異梨酯、二氫吡啶、尼莫地平、非諾貝特、伊曲康唑、兩性霉素B、聯(lián)苯雙酯、孕酮、二氫睪酮、氟哌啶醇、利哌利酮等，但并不局限于這些所列藥物。
本發(fā)明較現(xiàn)有技術所具有的優(yōu)點 一、自組裝技術制備白蛋白納米膠束較目前文獻專利報道的制備白蛋白納米粒的方法，如乳化熱固化法和乳化化學交聯(lián)法，可避免交聯(lián)劑和大量有機溶劑或油的使用，后處理簡單，安全性高。
二、較低的臨界膠束濃度(Critical micelle concentrations，CMC)實施例1～7中白蛋白衍生物的CMC皆在1～100mg/L范圍內(nèi)，預示它有極好的稀釋穩(wěn)定性。
三、對有機藥物、水不溶性或難溶性藥物和兩親性藥物具有較好的負載，例如，對紫杉醇的負載高達33.5％(w/w)，對吲哚美辛的負載高達18.9％(w/w)，對伊曲康唑的負載高達24.2％(w/w)，對尼莫地平的負載高達19.2％(w/w)，對環(huán)孢素A的負載高達25.2％(w/w)，對氟哌啶醇的負載高達19.5％(w/w)，對阿奇霉素的負載高達16.5％(w/w)。
四、良好的穩(wěn)定性實施例9～14中所制備的紫杉醇、吲哚美辛、伊曲康唑、尼莫地平、環(huán)孢素A、氟哌啶醇、阿奇霉素白蛋白納米膠束，稀釋至1～3mg/ml，置于25℃，穩(wěn)定性分別＞3d，其中紫杉醇白蛋白納米粒膠束穩(wěn)定性＞7d?？梢?，白蛋白膠束不僅具有極高的載藥量，還具有非常優(yōu)越的穩(wěn)定性。
五、本發(fā)明輔料亦可用于血管內(nèi)或肌肉注射和口服。本載體材料具有高度安全性，比如人血清白蛋白在臨床上作為血漿代用品，單劑量為5g，載體本身粒徑可控制在10～1000nm，不僅可肌肉注射、口服、外用等，還符合靜脈注射要求。
綜上所述，本發(fā)明用可生物降解的白蛋白作為原料，進行化學結構修飾，在水介質中自發(fā)形成納米膠束，在體內(nèi)具有良好的生物相容性、生物可降解性和稀釋穩(wěn)定性，對藥物有較好的負載。
本發(fā)明研究的兩親性的白蛋白衍生物，可以在水中自發(fā)形成納米膠束，不但可用于藥物的包載，控制藥物釋放，而且由于其親水的殼和疏水的核組成的納米膠束結構，可以延長體內(nèi)循環(huán)、減少網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞的吞噬，增加腫瘤靶向，達到減少毒副作用，增加療效的目的。
本發(fā)明提供的兩親性白蛋白衍生物的臨界聚集濃度低，載藥量高、藥物包封率高，納米膠束穩(wěn)定。本輔料毒性小、可作為難溶性有機藥物的載體，以納米級分散體系用于注射、口服和外用。本發(fā)明制備方法簡單，工藝成熟，適于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)。



圖1N-辛基人血清白蛋白的粒徑圖譜。
圖2載有紫杉醇的N-辛基人血清白蛋白的粒徑圖譜。
圖3載有紫杉醇的N-辛基人血清白蛋白的TEM圖譜。

具體實施例方式 下面通過實施例對本發(fā)明加以進一步的說明，但下述實施例并不限制本專利的權利范圍。
實施例1 N-辛基人血清白蛋白的制備 1g人血清白蛋白溶于水中，加入1.02g正辛醛，反應1h后，加入NaBH4水溶液，繼續(xù)攪拌12h，HCl液調(diào)pH7，蒸餾水透析3d(MWCO＝12000～14000)，凍干即得。元素分析測得P為35，即一個白蛋白分子鏈有35個游離氨基發(fā)生化學反應。
實施例2 N-辛基人血清白蛋白的制備 反應條件同實施例1，辛醛反應時間延長至8h，所得產(chǎn)物元素分析測得P為67，即一個白蛋白分子鏈有67個游離氨基發(fā)生化學反應。
實施例3 N-辛酰基人血清白蛋白的制備 3.6g正辛酸(0.05mol)，滴入4ml醋酸酐，120℃蒸出醋酸，得到正辛酸酐。將白蛋白1g分散在水/甲醇中，攪拌下滴加正辛酸酐，40℃反應8h，反應液透析，凍干即得。元素分析測得P為24，即一個白蛋白分子鏈有24個游離氨基發(fā)生化學反應。
實施例4 辛基酰胺人血清白蛋白的制備 白蛋白配成水溶液，加入正辛胺，加入EDC催化劑，反應8h，調(diào)節(jié)pH7，反應液透析3d，凍干即得烷基氨酰白蛋白。元素分析測得P為19，即一個白蛋白分子鏈有19個游離羧基發(fā)生化學反應。
實施例5 N-十二烷基人血清白蛋白的制備 1g人血清白蛋白溶于水中，加入1.47g十二烷基醛，反應1h后，加入NaBH4水溶液，繼續(xù)攪拌12h，HCl液調(diào)pH7，蒸餾水透析3d(MWCO＝12000～14000)，凍干即得。元素分析測得P為28，即一個白蛋白分子鏈有28個游離氨基發(fā)生化學反應。
實施例6 N-脫氧膽酸人血清白蛋白的制備 1g人血清白蛋白配成水溶液，加入脫氧膽酸，加入EDC催化劑，反應12h，NaOH調(diào)節(jié)pH7，反應液透析3d，凍干即得脫氧膽酸修飾白蛋白。元素分析測得P為15，即一個白蛋白分子鏈有15個游離氨基發(fā)生化學反應。
實施例7 N-膽酸人血清白蛋白的制備 1g人血清白蛋白配成水溶液，加入膽酸，加入EDC催化劑，反應12h，NaOH調(diào)節(jié)pH7，反應液透析3d，凍干即得膽酸修飾白蛋白。元素分析測得P為13，即一個白蛋白分子鏈有13個游離氨基發(fā)生化學反應。
實施例8 白蛋白衍生物納米膠束的制備和表征 1、白蛋白納米粒的制備白蛋白兩親性衍生物40mg溶解在7ml水中于50℃攪拌2h，然后冰浴下超聲或高壓均質后，0.45μm濾膜過濾，即得。
2、粒徑Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光測定樣品粒徑，結果見表1。
3、CMC采用最為靈敏的熒光探針法測定CMC。以芘為熒光探針，芘是一種疏水性芳香化合物，對環(huán)境極性極敏感。當兩親性分子的濃度低于CMC時，溶液中不會形成膠束，芘溶解在極性的水中；隨著兩親性分子的濃度高于CMC，膠束形成。芘相向膠束內(nèi)核的疏水部分分配，從而進入非極性環(huán)境，繼而在其熒光廣譜中可以觀察到一系列變化，如熒光強度將增加，放射光譜中振動精細結構(the vibrational fine structure of the emission spectra)發(fā)生變化，激光光譜中(0，0)波段紅移。因此，通過以芘的發(fā)射光譜中的I1/I3比(在固定的激發(fā)波長下掃描，I1、I3分別代表發(fā)射光譜中第一和第三強峰的熒光強度比)或激發(fā)光譜中I338/I333比(激發(fā)光譜中波長分別為338nm和333nm的熒光強度比)對兩親分子的濃度作圖即可獲得兩親性分子的表觀CMC，結果見表1。
表1白蛋白衍生物納米膠束的表征 實施例9 包含紫杉醇兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒組合物的制備和表征 1、制備工藝 (1)探頭超聲法 人血清白蛋白衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃攪拌2h。紫杉醇30mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者溶液混合，冰浴超聲30min后，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸餾水中室溫透析12h或減壓蒸除有機溶劑，離心3000rpm 5min，用0.45μm濾膜過濾，冷凍干燥。
(2)高壓均質法 人血清白蛋白衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃攪拌2h。紫杉醇30mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者溶液混合，高壓均質，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸餾水中室溫透析12h或減壓蒸除有機溶劑，離心3000rpm 5min，用0.45μm濾膜過濾，冷凍干燥。
(3).溶劑揮發(fā)法 人血清白蛋白衍溶液混合，繼續(xù)攪拌過夜，使氯仿?lián)]發(fā)，離心(3000rpm)5min，用0.22μm濾膜過濾，冷凍干燥。
2、兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒中紫杉醇含量的測定 用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法進行含量測定。流動相為甲醇∶水＝75∶25(v/v)，色譜柱為Lichrospher C18(150×4.6mm)，柱子粒徑為5μm。流速為1.0mL/min，檢測波長為227 nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱溫為30℃，注射樣品體積為20μl。以公式(1)計算樣品的載藥量。

3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光測定樣品粒徑。
4、穩(wěn)定性考察 凍干樣品稀釋至藥物濃度1mg/ml，于室溫考察其穩(wěn)定性。
實施例1～6載有紫杉醇的白蛋白自組裝納米粒的理化性質見表2。
表2載有紫杉醇的白蛋白自組裝納米粒的表征 實施例10 包含吲哚美辛兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒組合物的制備和表征 1、制備工藝 人血清白蛋白衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃攪拌2h。吲哚美辛30mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者溶液混合，冰浴超聲30min后，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸餾水中室溫透析12h或減壓蒸除有機溶劑，離心3000rpm 5min，用0.45μm濾膜過濾，冷凍干燥。
2、兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒中吲哚美辛含量的測定 用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法進行含量測定。流動相為甲醇∶水∶乙酸＝75∶25∶0.1(v/v)，色譜柱為Lichrospher C18(150×4.6mm)，柱子粒徑為5μm。流速為1.0mL/min，檢測波長為260nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱溫為25℃，注射樣品體積為20μl。以公式(1)計算樣品的載藥量。
3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光測定樣品粒徑。
4、穩(wěn)定性考察 凍干樣品稀釋至藥物濃度1mg/ml，于室溫考察其穩(wěn)定性。
實施例1～6載有吲哚美辛的白蛋白自組裝納米粒的理化性質見表3。
表3載有吲哚美辛的白蛋白自組裝納米粒的表征 實施例11 包含伊曲康唑兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒組合物的制備和表征 1、制備工藝 人血清白蛋白衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃攪拌2h。伊曲康唑30mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者溶液混合，冰浴超聲30min后，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸餾水中室溫透析12h或減壓蒸除有機溶劑，離心3000rpm 5min，用0.45μm濾膜過濾，冷凍干燥。
2、兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒中伊曲康唑含量的測定 用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法進行含量測定。流動相為甲醇∶水＝75∶25(v/v)，色譜柱為Lichrospher C18(150×4.6mm)，柱子粒徑為5μm。流速為1.0mL/min，檢測波長為263nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱溫為25℃，注射樣品體積為20μl。以公式(1)計算樣品的載藥量。
3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光測定樣品粒徑。
4、穩(wěn)定性考察 凍干樣品稀釋至藥物濃度3mg/ml，于室溫考察其穩(wěn)定性。
實施例1～6載有伊曲康唑的白蛋白自組裝納米粒的理化性質見表4。
表4載有伊曲康唑的白蛋白自組裝納米粒的表征 實施例12 包含尼莫地平兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒組合物的制備和表征 1、制備工藝 人血清白蛋白衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃攪拌2h。尼莫地平30mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后二者溶液混合，冰浴超聲30min后，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸餾水中室溫透析12h或減壓蒸除有機溶劑，離心3000rpm 5min，用0.45μm濾膜過濾，冷凍干燥。
2、兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒中尼莫地平含量的測定 用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法進行含量測定。流動相為甲醇∶水＝65∶35(v/v)，色譜柱為Lichrospher C18(150×4.6mm)，柱子粒徑為5μm。流速為1.0mL/min，檢測波長為237nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱溫為25℃，注射樣品體積為20μl。以公式(1)計算樣品的載藥量。
3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光測定樣品粒徑。
4、穩(wěn)定性考察 凍干樣品稀釋至藥物濃度3mg/ml，于室溫考察其穩(wěn)定性。
實施例1～6載有尼莫地平的白蛋白自組裝納米粒的理化性質見表5。
表5載有尼莫地平的白蛋白自組裝納米粒的表征 實施例13 包含環(huán)孢素A兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒組合物的制備和表征 1、制備工藝 人血清白蛋白衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃攪拌2h。環(huán)孢素A30mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈、氯仿)中。然后二者溶液混合，冰浴超聲30min后，用透析袋(MWCO12000～14000)在蒸餾水中室溫透析12h或減壓蒸除有機溶劑，離心3000rpm 5min，用0.45μm濾膜過濾，冷凍干燥。
2、兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒中環(huán)孢素A含量的測定 用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法進行含量測定。流動相為乙腈∶甲醇∶水∶異丙醇＝900∶450∶50∶0.5(v/v)，色譜柱為Lichrospher C18(150×4.6mm)，柱子粒徑為5μm。流速為1.0mL/min，檢測波長為225nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱溫為70℃，注射樣品體積為20μl。以公式(1)計算樣品的載藥量。
3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光測定樣品粒徑。
4、穩(wěn)定性考察 凍干樣品稀釋至藥物濃度2mg/ml，于室溫考察其穩(wěn)定性。
實施例1～6載有環(huán)孢素A的白蛋白自組裝納米粒的理化性質見表6。
表6載有環(huán)孢素A的白蛋白自組裝納米粒的表征 實施例14 包含氟哌啶醇兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒組合物的制備和表征 1、制備工藝 人血清白蛋白衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃攪拌2h。氟哌啶醇30mg溶解在氯仿中。然后二者溶液混合，冰浴超聲30min后，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸餾水中室溫透析12h或減壓蒸除有機溶劑，離心3000rpm 5min，用0.45μm濾膜過濾，冷凍干燥。
2、兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒中氟哌啶醇含量的測定 用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法進行含量測定。流動相為乙腈∶甲醇∶0.025mol/L磷酸二氫鉀＝45∶5∶50(v/v)，色譜柱為Lichrospher C18(150×4.6mm)，柱子粒徑為5μm。流速為1.0mL/min，檢測波長為248nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱溫為25℃，注射樣品體積為20μl。以公式(1)計算樣品的載藥量。
3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光測定樣品粒徑。
4、穩(wěn)定性考察 凍干樣品稀釋至藥物濃度1mg/ml，于室溫考察其穩(wěn)定性。
實施例1～6載氟哌啶醇的白蛋白自組裝納米粒的理化性質見表7。
表7載有氟哌啶醇的白蛋白自組裝納米粒的表征 實施例15 包含阿奇霉素兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒組合物的制備和表征 1、制備工藝 人血清白蛋白衍生物51mg溶解在9ml水中于50℃攪拌2h。阿奇霉素30mg溶解在氯仿中。然后二者溶液混合，冰浴超聲30min后，用透析袋(MWCO 12000～14000)在蒸餾水中室溫透析12h或減壓蒸除有機溶劑，離心3000rpm 5min，用0.45μm濾膜過濾，冷凍干燥。
2、兩親性白蛋白衍生物自組裝納米粒中阿奇霉素含量的測定 用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法進行含量測定。流動相為乙腈0.1％三乙胺水溶液＝30∶70(v/v)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0，色譜柱為Lichrospher C18(150×4.6mm)，柱子粒徑為5μm，流速為1.2mL/min，檢測波長為205nm(SPD-10A，UV detector，Shimadzu，Japan)，柱溫為40℃，注射樣品體積為20μl。以公式(1)計算樣品的載藥量。
3、用Zetasizer 3000 HS instrument(Malvern Instruments，Malvern，UK)在633nm、25℃、He-Ne激光測定樣品粒徑。
4、穩(wěn)定性考察 凍干樣品稀釋至藥物濃度1mg/ml，于室溫考察其穩(wěn)定性。
實施例1～6載阿奇霉素的白蛋白自組裝納米粒的理化性質見表8。
表8載有阿奇霉素的白蛋白自組裝納米粒的表征
權利要求
1.一種生物可降解白蛋白衍生物，其結構包括至少一種以下化學式所示的改性白蛋白氨基酸單元
AL_NH-M]p (I)
AL_NH-CO-M]p(II)
AL_CO-NH-M]p(III)
AL_NH-CO-R]p(IV)
其中AL為白蛋白分子鏈，M為包括C2-18烴基，R為脫氧膽酸或膽酸，P為3-70的整數(shù)。
2.如權利要求1所述的生物可降解性白蛋白衍生物，其特征在于所述白蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、豬血清蛋白。
3.如權利要求1所述的生物可降解性白蛋白衍生物，其特征在于所述M包括C2-18烷基。
4.如權利要求1所述的生物可降解性白蛋白衍生物，其特征在于所述R包括脫氧膽酸或膽酸。
5.如權利要求1所述的生物可降解性白蛋白衍生物，其特征在于白蛋白衍生物分子鏈含有至少一種化學式為I～IV的氨基酸，P為3-70的整數(shù)。
6.權利要求1所述的生物可降解白蛋白衍生物的制備方法，其特征在于包括下列步驟將白蛋白溶于或分散于水或水有機溶劑的混合溶劑中，采用提供疏水基團的物質與白蛋白骨架上的氨基或羧基進行取代反應，即具有良好兩親性，在水介質中可自發(fā)形成納米膠束。
7.根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于提供疏水基團的物質是碳原子數(shù)均不小于2的鹵代烴、烷基醛、脂肪酸酐、脂肪酰鹵、脂肪酸和脫氧膽酸及膽酸。
8.權利要求1所述的生物可降解白蛋白衍生物的應用，其特征在于可以用于血管內(nèi)或肌肉注射或口服、外用的藥學活性或藥理活性分子的載體。
9.根據(jù)權利要求8所述的應用，其特征在于所述的藥學活性或藥理活性分子選自紫杉烷類、環(huán)孢素類、喜樹堿類、黃酮類、二氫吡啶類、小蘗堿類、長春堿類、蒽醌類、鬼臼毒素類抗腫瘤藥、甾體類或非甾體抗炎藥物、心血管藥物、抗生素、抗真菌藥物、抗病毒藥物、免疫調(diào)節(jié)劑中的任一物質或其衍生物。
10.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于該藥物增溶載體的制備方法包括以下步驟兩親性白蛋白衍生物與水按重量比為1～50∶1000的比例溶解，得到白蛋白衍生物的納米膠束；將治療有效量的難溶或微溶于水的有機藥物用藥學上可接受溶劑溶解后，與所述兩親性白蛋白衍生物納米膠束混合后，經(jīng)超聲或高壓均質處理，溶液用截留分子量為12000～14000的透析袋透析或蒸餾法除去有機溶劑，凍干制得粒徑為10～1000nm的納米膠束。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物可降解白蛋白衍生物及其藥學組合物。這類衍生物在白蛋白骨架引入烷基或脂肪?；?脫氧)膽酸，使其具有兩親性，在水中自組裝形成納米膠束，并可通過疏水基團和白蛋白分子鏈與藥物的雙重作用將藥物包裹，顯著提高白蛋白包裹藥物的能力，且穩(wěn)定時間顯著延長。該輔料可作為有機藥物、水不溶性或難溶性藥物和兩親性藥物的載體，用于血管內(nèi)或肌肉注射和口服途徑給藥。本發(fā)明制備方法簡單，工藝成熟，適于大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)。
文檔編號C07K14/435GK101220093SQ200810018740
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月22日 優(yōu)先權日2008年1月22日
發(fā)明者周建平, 霍美蓉, 勇 張, 建 龔, 迪 于, 霖 呂 申請人:中國藥科大學