專利名稱：一種使用羧甲基離子交換色譜純化貽貝粘蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)純化方法，具體地是涉及一種使用羧甲基離子交換色譜純 化貽貝粘蛋白的方法。
背景技術(shù)：
貽貝粘蛋白(Mussel Adhesive Protein, MAP),也叫紫貽貝足絲蛋白(Mytilus edulis foot protein, Mefp)來自海洋貝類紫貽貝，M^/7^e^to，它有在近海耐受波浪影響的 能力，它在特殊腺體內(nèi)生成和儲(chǔ)存一種蛋白膠，通過足絲釋放到巖石一類的固體表面 上，形成抗水的結(jié)合，從而將自己固定。在玻璃上的研究顯示，蛋白膠形成了斑，從 斑延伸開，有很強(qiáng)的抗張強(qiáng)度(106- 107 newtoivmeter—2)，而斑內(nèi)物質(zhì)包含了貽貝粘蛋 白MAP。
貽貝粘蛋白含有L-3,4-二羥基苯丙氨酸(L-Dopa)，它由酪氨酸酶對(duì)酪氨酸殘基的 作用形成。L-DOPA殘基由于氧化反應(yīng)而相互交聯(lián)，交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致了貽貝和特殊表面 纖維內(nèi)強(qiáng)而持久的膠接，其生物粘附的機(jī)理很有趣。貽貝粘蛋白粘附對(duì)人沒有毒性和 免疫原性，結(jié)合能力和壽命不受水的影響，作為醫(yī)用手術(shù)尤其是眼科手術(shù)膠已經(jīng)引起 注意。
全世界每年進(jìn)行1100萬例白內(nèi)障手術(shù)，我國(guó)白內(nèi)障的發(fā)病率非常高，50歲以上 人群中白內(nèi)障發(fā)病率29.64%， 70歲以上人群發(fā)病率高達(dá)60%。隨著社會(huì)老齡化的加 劇，這一數(shù)字還會(huì)上升。目前醫(yī)生可以用兩種閉和方式結(jié)束眼科手術(shù)讓傷口自行愈 合或是用尼龍線縫合切口，每種閉合方法都各有缺點(diǎn)自愈有感染和眼內(nèi)液體泄露的 危險(xiǎn)；縫合會(huì)有感染發(fā)炎及血管發(fā)育異常的危險(xiǎn)。而貽貝粘蛋白貽貝粘蛋白能在低濃
度下交聯(lián)，并形成可注射到不規(guī)則形狀部位的低粘性液體，這種溶液可凝固而填充到 指定空間，在幾分鐘內(nèi)可封閉切口，少于縫合所需時(shí)間。貽貝粘蛋白還形成了一個(gè)不
可破壞的封條，在大于正常人眼壓12倍的壓力下不會(huì)使眼內(nèi)液體發(fā)生泄露。貽貝粘蛋
白具有和眼角膜近似的折射率，不會(huì)干擾光線到達(dá)視網(wǎng)膜。
另外，貽貝粘蛋白的生物降解性質(zhì)使其對(duì)環(huán)境很友好，也可用于其他領(lǐng)域，如通
用的生化粘接試劑、醫(yī)用組織粘接及密封劑，醫(yī)用愈傷基質(zhì)，牙醫(yī)粘接和密封劑，醫(yī) 用設(shè)備表面涂層試劑，水下作業(yè)設(shè)備涂層等。
貽貝粘蛋白中L-DOPA含量高于11%，富含多酚基團(tuán)，被認(rèn)為是多酚蛋白質(zhì)，它 適宜作為氫鍵色譜吸附劑的理想純化目標(biāo)，這種高選擇性的反應(yīng)使從紫貽貝足絲粗提 取物中一步純化貽貝粘蛋白蛋白質(zhì)成為可能。
貽貝粘蛋白純化通常將以下技術(shù)組合應(yīng)用提取、鹽析、示差沉淀、離子交換色 譜、疏水相互作用色譜、反相色譜、親和色譜和分子排阻色譜，但活性蛋白質(zhì)收率低 僅為15%。工藝復(fù)雜，規(guī)模制備成本高、周期長(zhǎng)，對(duì)pH值和鹽濃度敏感而導(dǎo)致穩(wěn)定 性難控制，有必要研究新的色譜方法獲取高純度、高活性的貽貝粘蛋白。
貽貝粘蛋白由于L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)的含量高達(dá)11%而富含多酚基 團(tuán)被認(rèn)為是多酚蛋白質(zhì)。L-DOPA在膠纖維形成過程中的反應(yīng)性暴露在表面，其酚羥 基是氫鍵供體，可使用包含適當(dāng)氫鍵受體吸附劑的氫鍵色譜進(jìn)行分離；其苯環(huán)結(jié)構(gòu)可 形成疏水鍵，可利用疏水相互作用進(jìn)行分離；其賴氨酸氨基的正電荷，可形成靜電鍵。 可利用貽貝粘蛋白結(jié)構(gòu)中的這些特點(diǎn)，以上述氫鍵吸附、疏水作用、靜電吸附三種原 理進(jìn)行分離。
蛋白質(zhì)這類生物藥物或生物醫(yī)學(xué)材料的分離純化主要通過色譜技術(shù)及其組合，所 用介質(zhì)材料主要是凝膠過濾、離子交換、疏水相互作用、親和、反相介質(zhì)，其基質(zhì)材 料有瓊脂糖、葡聚糖、聚苯乙烯和硅膠等。瓊脂糖介質(zhì)是目前生物醫(yī)藥研發(fā)和生產(chǎn)中 使用最為普遍的規(guī)模制備用分離介質(zhì)，該基質(zhì)具有高孔度(卯-96%)，即使在高濃度 下也能保持高的孔度；具有連接纖維的開放的結(jié)構(gòu)；高的連通性有效保證了分子內(nèi)物 質(zhì)傳遞；大比表面積可提供了很高的吸附能力易制備成不同瓊脂糖濃度、不同尺寸的 球形顆粒以滿足不同領(lǐng)域的需求；在氫氧化鈉中穩(wěn)定可滿足苛刻的在位清洗步驟；低 的非特異性吸附使應(yīng)用面較廣；具有彈性及非脆性(較易實(shí)現(xiàn)柱子的再裝填)又可通 過足夠的交聯(lián)步驟使介質(zhì)具有剛性(有較高的耐壓性能)；可用不同的活化步驟進(jìn)行共 價(jià)交聯(lián)而活化，可被大量配基取代而應(yīng)用于多種吸附色譜技術(shù)。本發(fā)明所涉及分離純 化的核心技術(shù)采用瓊脂糖基質(zhì)介質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服使用傳統(tǒng)的離子交換和凝膠過濾方法純化貽貝粘蛋白收率
低的問題，采用瓊脂糖基質(zhì)的羧甲基離子交換凝膠CM Sepharose FF或CM S印harose HP結(jié)合凝膠過濾介質(zhì)Superdex 200或Sephacryl S-200分離純化貽貝粘蛋白，提高分 離純化的選擇性，提高活性貽貝粘蛋白的收率。 本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明提供的使用以羧甲基離子交換色譜結(jié)合凝膠過濾色譜為核心的分離純化貽
貝粘蛋白的方法，包括如下步驟
1) 以0.5-2.5%高氯酸或/和1-10%乙酸為提取溶齊1」，100 g貽貝足絲加300-1000 ml 提取溶劑，10-25。C浸提10-20 min，使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲高速打碎使其均勻 懸浮于提取溶劑中；
2) 以10000-16000 r/min離心30-50 min或以45 濾膜過濾去除殘?jiān)?，保留?br> 清；
3) 用S印hadex G-25或G-50去除小分子化合物，流動(dòng)相為pH 2.0-6.0的10-80 mM 的醋酸鈉緩沖液，添加0.1-0.6 M氯化鈉，收集穿透峰；
4) 以Millipore CENTRIPLUS超濾膜濃縮餾分；
5) 采用CM Sepharose FF或CM S印harose HP羧甲基離子交換介質(zhì)，流動(dòng)相 pH3-6，吸附流動(dòng)相為0-0.5 M氯化鈉，洗脫采用10-20柱體積內(nèi)0.5-1.2 M氯化鈉線 性梯度洗脫；
6) 以Millipore CENTRIPLUS超濾膜濃縮餾分；
7) 采用Superdex 200或Sephacryl S-200凝膠過濾介質(zhì)，以0.1-0.6 M氯化鈉和 0.5-4%檸檬酸或1-5%乙酸為流動(dòng)相；
8) 以Millipore CENTRIPLUS超濾膜濃縮餾分；
9) 用0.5-3。/。的檸檬酸4。C透析，4。C保存；
10) 從分子量的角度鑒定貽貝粘蛋白采用12-20%濃度十二垸基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),硝酸銀染色，10-25 。C染色2-4 h，以高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋 白質(zhì)標(biāo)記，確認(rèn)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量為130kD;
11) 四氮唑藍(lán)(NBT)特異性染色采用12-20%濃度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea) 聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native PAGE),染色液采用四氮唑藍(lán)-氨基乙酸溶液(pHlO)， 10-25 °C染色1-3 h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色。
本發(fā)明提供的使用以羧甲基離子交換色譜結(jié)合凝膠過濾色譜為核心的分離純化貽 貝粘蛋白的方法，首次在貽貝粘蛋白的分離純化中使用CM系列這種連接了羧甲基 (0-CH2COCT)的離子交換介質(zhì)，較其他種類離子交換介質(zhì)的選擇性高、活性目標(biāo)蛋 白質(zhì)收率高。


圖1為實(shí)施例1采用CM Sepharose FF介質(zhì)結(jié)合Superdex 200介質(zhì)分離貽貝粘蛋 白，使用紫外檢測(cè)器280 nm進(jìn)行在線檢測(cè)的色譜圖。
圖2為實(shí)施例2采用CM Sepharose HP結(jié)合Sephacryl S-200介質(zhì)分離貽貝粘蛋白， 使用紫外檢測(cè)器280 nm進(jìn)行在線檢測(cè)的色譜圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 、采用CM Sepharose FF介質(zhì)結(jié)合Superdex 200介質(zhì)分離純化貽貝粘蛋白
1) 以0.5%高氯酸和2%乙酸為提取溶劑，100 g貽貝足絲加400 ml提取溶劑， 18°C浸提12 min，使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲高速打碎使其均勻懸浮于提取溶劑 中；
2) 以12000 r/min離心35 min，保留上清；
3) 用Sephadex G-25去除小分子化合物，流動(dòng)相為pH 2.5的20 mM的醋酸鈉緩 沖液，添加0.15M氣化鈉，收集穿透峰-，
4) 以Millipore CENTRIPLUS超濾膜濃縮餾分；
5) 采用CM Sepharose FF離子交換介質(zhì)，流動(dòng)相pH4，吸附流動(dòng)相為0.1 M氯 化鈉，洗脫采用10-20柱體積內(nèi)0.5-1.2 M氯化鈉線性梯度洗脫；
6) 以Millipore CENTRIPLUS超濾膜濃縮餾分；
7) 采用Superdex 200凝膠過濾介質(zhì)，以0.2 M氯化鈉和0.5%檸檬酸為流動(dòng)相；
8) 以Millipore CENTRIPLUS超濾膜濃縮餾分；
9) 用0,5y。的檸檬酸4。C透析，4。C保存；
10) 從分子量的角度鑒定貽貝粘蛋白采用18%濃度十二垸基磺酸鈉(SDS)-聚 丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),硝酸銀染色，15。C染色2h，以高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo) 記，確認(rèn)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量為130kD;
11) 四氮唑藍(lán)(NBT)特異性染色采用15%濃度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea) 聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native PAGE),染色液采用四氮唑藍(lán)-氨基乙酸溶液(pHlO)， 15。C染色2h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色。
得到純度99%的貽貝粘蛋白。
實(shí)施例2、采用CM Sepharose HP結(jié)合Sephacryl S-200介質(zhì)分離純化貽貝粘蛋白
1) 以1%高氯酸為提取溶劑，100 g貽貝足絲加300 ml提取溶劑，15 °C浸提15 min，使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲高速打碎使其懸浮于提取溶劑中；
2) 以45pm濾膜過濾去除殘?jiān)?，保留上清?br> 3) 用Sephadex G-50去除小分子化合物，流動(dòng)相為pH 3.0的30 mM的醋酸鈉緩 沖液，添加0.2M氯化鈉，收集穿透峰；
4) 以Millipore CENTRIPLUS超濾膜濃縮餾分；
5) 采用CM Sepharose HP離子交換介質(zhì)，流動(dòng)相pH5，吸附流動(dòng)相為0.3 M氯 化鈉，洗脫采用10-20柱體積內(nèi)0.5-1.2 M氯化鈉線性梯度洗脫；
6) 以Millipore CENTRIPLUS超濾膜濃縮餾分；
7) 采用Sephacryl S-200凝膠過濾介質(zhì)，以0.4 M氯化鈉和1.5%檸檬酸為流動(dòng)相；
8) 以Millipore CENTRIPLUS超濾膜濃縮餾分；
9) 用1.5%的檸檬酸4 °C透析，4 °C保存；
10) 從分子量的角度鑒定貽貝粘蛋白采用15%濃度十二垸基磺酸鈉(SDS)-聚 丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),硝酸銀染色，20。C染色2h，以高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo) 記，確認(rèn)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量為130kD;
11) 四氮唑藍(lán)(NBT)特異性染色采用12.5%濃度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea) 聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native PAGE)，染色液采用四氮唑藍(lán)-氨基乙酸溶液(pHlO)， 20。C染色1.5h,貽貝粘蛋白將被特異性顯色。
得到純度98%的貽貝粘蛋白。
權(quán)利要求
1、一種使用羧甲基離子交換色譜純化貽貝粘蛋白的方法，結(jié)合凝膠過濾色譜，提供一種高收率的貽貝粘蛋白純化方法。
2、 如權(quán)利要求1所述的使用羧甲基離子交換色譜純化貽貝粘蛋白的方法，包括如下的步驟1) 以0.5-2.5%高氯酸或/和1-10%乙酸為提取溶劑，100 g貽貝足絲加300-1000 ml 提取溶劑，10-25。C浸提10-20 min，使用攪拌器將冷凍的貽貝足絲高速打碎使其懸浮 于提取溶劑中；2) 以10000-16000 r/min離心30-50 min或以45 濾膜過濾去除殘?jiān)?，保留上清?) 用S印hadex G-25或G-50去除小分子化合物，流動(dòng)相為pH 2.0-6.0的10-80 mM 的醋酸鈉緩沖液，添加0.1-0.6 M氯化鈉，收集穿透峰；4) 以Millipore CENTRIPLUS超濾膜濃縮餾分；5) 采用CM Sepharose FF或CM Sepharose HP離子交換介質(zhì)，流動(dòng)相pH3-6之 間，吸附流動(dòng)相為0-0.5 M氯化鈉，洗脫采用10-20柱體積內(nèi)0.5-1.2 M氯化鈉線性梯 度洗脫；6) 以Millipore CENTRIPLUS超濾膜濃縮餾分；7) 采用Superdex 200或Sephacryl S-200凝膠過濾介質(zhì)，以0.1-0.6 M氯化鈉和 0.5-4%檸檬酸或1-5%乙酸為流動(dòng)相；8) 以Millipore CENTRIPLUS超濾膜濃縮餾分；9) 用0.5-3。/。的檸檬酸4。C透析，4。C保存；10) 從分子量的角度鑒定貽貝粘蛋白采用12-20%濃度十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，硝酸銀染色，10-25 。C染色2-4 h，以高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋 白質(zhì)標(biāo)記，確認(rèn)目標(biāo)蛋白質(zhì)分子量為130kD;11) 四氮唑藍(lán)(NBT)特異性染色采用12-20%濃度乙酸-尿素(Acetic acid-Urea) 聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native PAGE),染色液采用NBT-氨基乙酸溶液(pH10)， 10-25 。C染色l-3h，貽貝粘蛋白將被特異性顯色。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用羧甲基離子交換色譜純化貽貝粘蛋白的方法。貽貝粘蛋白中含有L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)基團(tuán)，其賴氨酸帶有強(qiáng)正電荷，可形成靜電鍵。采用CM系列這種連接了羧甲基(O-CH₂COO^-)的離子交換介質(zhì)分離純化貽貝粘蛋白，較其他種類離子交換介質(zhì)的選擇性高、收率高。采用強(qiáng)酸提取，以脫鹽柱去除小分子化合物，利用瓊脂糖基質(zhì)的羧甲基離子交換介質(zhì)結(jié)合凝膠過濾介質(zhì)分離純化貽貝粘蛋白，采用乙酸-尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過四氮唑藍(lán)特異性顯色鑒別貽貝粘蛋白，提高了活性貽貝粘蛋白的收率。
文檔編號(hào)C07K4/00GK101348518SQ20071017949
公開日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2007年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月14日
發(fā)明者孟桂鳳, 邢思亮 申請(qǐng)人:北京康銘優(yōu)盛生化技術(shù)有限公司