專利名稱：：眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物的應(yīng)用，屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：蛋白酶抑制劑是動(dòng)植物及微生物體內(nèi)廣泛存在的一種對(duì)蛋白酶水解活性有抑制作用的蛋白質(zhì)或小肽。蛋白酶抑制劑能與蛋白酶的活性部位和/或變構(gòu)部位結(jié)合，從而抑制酶的催化活性和/或蛋白酶與天然底物的結(jié)合，阻止酶原轉(zhuǎn)化為有活性的酶，因此在調(diào)節(jié)蛋白酶活性和物質(zhì)代謝等方面起著重要的作用。在一系列生理病理過(guò)程中也起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用。蛋白酶抑制劑具有能被開發(fā)成為有利于人類健康的新藥的應(yīng)用前景，在治療艾滋病、胰腺炎、出血性疾病、手術(shù)中及創(chuàng)傷后出現(xiàn)的纖溶亢進(jìn)性出血的防治等領(lǐng)域都表現(xiàn)出了很好的療效。來(lái)自于人尿中分離純化的尿胰蛋白酶抑制劑一烏司它丁(Ulinastatin)目前己被廣泛應(yīng)用于臨床上對(duì)胰腺炎、肝病、燒傷、胰島細(xì)胞移植等臨床領(lǐng)域。烏司它丁屬Kunitz型蛋白酶抑制劑，由143個(gè)氨基酸殘基組成，受到翻譯后加工的影響，使得它成為一個(gè)分子量約為67000道爾頓的大分子量糖蛋白。它的二個(gè)活性功能區(qū)均有很廣的抑酶譜并且不完全重疊。同時(shí)，蛋白酶抑制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也得到了廣泛應(yīng)用，其主要應(yīng)用領(lǐng)域涉及抗蟲基因工程。目前已有多種轉(zhuǎn)蛋白酶抑制劑工程植株，這些轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了良好的抗蟲效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。鈉通道是分布于可興奮性細(xì)胞膜上的一種重要的陽(yáng)離子通道，其開放控制著動(dòng)作電位的去極化相，并積極參與了細(xì)胞的興奮、收縮、分泌和突觸傳遞等高度有序的特異性功能。最近研究表明許多困擾人類的家族性遺傳病就是因?yàn)殁c通道發(fā)生了基因突變而引起的，包括高血鉀周期性癱瘓癥(HyperPP)、鉀惡性肌強(qiáng)直癥(PAM)、先天性副肌強(qiáng)直癥(PMC)、LQT3型綜合癥(LQT3)、Brugada綜合癥等(徐妍，肖玉成。鈉通道及其相關(guān)疾病綜合癥。生物學(xué)通報(bào)2006Vol.41,17-19)。蛇毒毒液中富含多種生物活性物質(zhì)，包括蛋白酶抑制劑。目前在蛇毒中己發(fā)現(xiàn)了多種Kunitz型蛋白酶抑制劑，它們能與胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶l:l結(jié)合，只有一個(gè)作用位點(diǎn)。迄今為止，大多數(shù)Kurutz型蛋白酶抑制劑要么作用于胰蛋白酶，要么作用于胰凝乳蛋白酶，很少有同時(shí)作用于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的Kunitz型蛋白酶抑制劑。發(fā)明人從中國(guó)產(chǎn)眼鏡王蛇蛇毒中得到了一個(gè)新穎的Kumtz型胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制劑，它能同時(shí)抑制胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶。同時(shí)，該蛋白酶抑制劑能作用于鈉離子通道。將本發(fā)明的眼鏡王蛇蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制劑的全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。發(fā)明人將本發(fā)明的眼鏡王蛇蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制劑的編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物，與其它天然來(lái)源小分子量蛋白酶抑制劑相比，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因表達(dá)產(chǎn)量高、活性特殊的有益特點(diǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物的應(yīng)用，其具有同時(shí)抑制胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的雙重抑制活性，且對(duì)二種蛋白酶的抑制常數(shù)基本在同一個(gè)數(shù)量級(jí)，還具有鈉通道的抑制活性。本發(fā)明涉及的蛇毒來(lái)源的小分子蛋白酶抑制劑，是從國(guó)產(chǎn)眼鏡王蛇蛇毒中分離得到的，其氨基酸序列如下(SEQIDNO:1):GlyArgProL,ysPhecysGluLeuProAla10ValSerGlyPhecysI」ysAlaTyrliePro20SerPheTy.rTyrAs'nProAspAlaSerAla30CysGinI」ysPhe:L_eT'yrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnl:'ysPheLiysThrlieGlu50GluCysHisArgThrCysValGly58編碼本發(fā)明蛋白酶抑制劑前體的cDNA由411個(gè)核苷酸組成，該抑制劑cDNA的核苷酸序列與對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如下(SEQIDNO:9):MetGlyArgLeuLeuLeuLeuLeuGlyLeuLeuThrLeuTrpAlaGluLeuThrProVal1ATGGGACGTCTTCTTCTCCTGCTGGGACTCCTCACCCTCTGGGCAGAGCTGACCCCCGTC一l'110SerGlyLeuGlyArgProLysPheCysGluLeuProAlaValSerGlyPheCysLysAla61TCCGGCCTGGGCCGTCCAAAGTTCTGTGAACTGCCTGCTGTATCCGGATTCTGCAAAGCC2030Tyr工leProSerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAlaCysGinLysPhelieTyrGly121TATATACCTTCCTTCTACTACAACCCGGATGCAAGTGCATGCCAAAAGTTTATTTATGGT4050GlyCysGlyGlyAsnAlaAsnLysPheLysThr工leGluGluCysHisArgThrCysVal181GGCTGTGGGGGCAATGCCAACAAATTTAAGACCATAGAAGAATGCCACCGCACCTGTGTT58Glyend241GGATGACCAATGAGGAGACCCACCC7VGAATGGATCCAATGTTCCAACTTGACCCAAAGAC301CCTGCTTCTGCCCTGGACCACTTGGAGACCCTCCTCCAAACAACACCCTGGGCTCATTTC361TTTTTCTCTGCAATAAAGCTTTGGTTCCAGCTGCAAAAAAAAAAAAMAAA本發(fā)明的蛇毒蛋白酶抑制劑包括上述多肽中個(gè)別或多個(gè)氨基酸的取代、缺失或加入而得到的功能等同物的多肽。即衍生自上述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替代以及缺失且具有蛋白酶抑制活性的功能等同物，所述蛋白酶抑制劑具有下述序列表中的氨基酸序列SEQIDNO:2ArgProValSerGlyPheTyrCysGinI」ysGlyAsnA1aGluCysHisSEQIDNO:3GlyArgProValSerGlySerPheTyrCysGinLysGlyAsnA.1aGluCysHisI」ysPhecysGluPheCysLysAlaTyrAsnProAspPhe工leTyrGly7\snl,ysPhe"LysA—rgTh工cysValI」ysPhecysLysPheCysLysAlaTyrAsnProAspPhelieTyrGlyAsr)L,ysPhe:l」ysArgThrCysValLeuProAla9TyrliePro19AlaSerAla29GlyCysGly39Thr工leGlu49Gly57LeuProAla10TyrliePro20AlaSerAla30GlyCysGly40ThrlieGlu50Gly58SEQlDNO:4GlyArgProL,ysPheCysGluLeuProLeu10ArglieGly.PheCysLysAlaTyrliePro20SerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAla3.0CysGinLysPhe工]—eTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnA丄aAsnLysPheLysThrlieGlu50'GluCysHisArgThrCysValGly58SE(3IDNO:5GlyArgProLysPheCysG丄uLeuProAla10ValSerGlyProCysLysAlaTyrliePro20SerPheTy:cTyrAsnProAspAlaSerAla30CysGinLysPhe工leTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnLysPheLysThrlieGlu50GluCysHisArgThrCysValGly58SEQIDNO:6GlyArgProLysPheCysGluLeuProAla10ValSerGlyPheCysGinAlaTyrliePro20SerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAla30CysGin:LysPheI:leTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnLysPheLysThrlieGlu50GluCysHisArgTh—rCysValGly58SEQIDNO:7GlyArgl).roLysI:)heCysGluLeuProAla10ValSerGlyPheCysLysArgTyrliePro20SerPheTy:匚TyrAsnProAspAlaSerAla30CysGinLysPhelieTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnLysPheLysThrlieGlu50GluCysHisArgThrCysValGly58SEGIDNO:8GlyArgProLysPheCysGluLeuProAla10ValSerG丄yPheCysLysAlaTyrliePro20SerPheTyrTyrAsnProLysAlaSerAla30CysGl.nLysPheI:leTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAl-aAsn:LysPheLysThrlieGlu50GluCysHisArgTh—rCysValGly58本發(fā)明提供的蛇毒蛋t]酶抑制劑，其制備方法可以通過(guò)生物化學(xué)分離純化方法，由眼鏡王蛇蛇毒中得到；本發(fā)明提供的蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物也可以將蛇毒蛋白酶抑制劑的編碼基因克隆到載體上，然后在宿主細(xì)胞中表達(dá)后獲得。其中表達(dá)載體可以是質(zhì)?；虿《局械囊环N。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，包括大腸桿菌或枯草芽孢桿菌等，宿主細(xì)胞也可以是真核細(xì)胞，包括酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。制備的蛇毒蛋白酶抑制劑可通過(guò)質(zhì)譜鑒定。上面所述眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物在臨床治療上的應(yīng)用。上面所述眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中、特別是抗蟲植物基因工程中的應(yīng)用。下面以制備的具有SE。IDN0:l氨基酸序列的蛋白酶抑制劑進(jìn)行說(shuō)明GlyArgProLysPheCysGluLeuProAla10ValSerGlyPheCysLysAlaTyrliePro20SerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAla30CysGinLysPhelieTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsn.LysPheLysThrlieGlu50GluCys、IisArgThrCysValGly58利用BAEE以及BTEE作為底物分別檢測(cè)該抑制劑對(duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制活性。結(jié)果表明本發(fā)明天然純化蛇毒蛋白酶抑制劑對(duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制常數(shù)!d值均在10—7-l(TM數(shù)量級(jí)，揭示它對(duì)胰蛋Q酶以及胰凝乳蛋白酶均具有很高的抑制活性。同樣對(duì)多肽中氨基酸缺失、突變衍生物也進(jìn)行了制備與蛋白酶抑制劑功能生物活性測(cè)定，結(jié)果表明這些蛋白酶抑制劑也具有較好的蛋白酶抑制活性。將本發(fā)明蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物與目前己被廣泛應(yīng)用于臨床的人尿中分離純化的尿胰蛋白酶抑制劑-烏司它丁進(jìn)行比較，結(jié)果表明蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物與烏司它丁均能抑制胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的活性，揭示本發(fā)明蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物有潛在的臨床應(yīng)用前景。根椐上述內(nèi)容，本發(fā)明提供的這種蛇毒蛋G酶抑制劑及其衍生物。蛇毒蛋白酶抑制劑本身可方便地采用常規(guī)牛物化學(xué)分離純化方法由眼鏡千蛇粗毒進(jìn)行制備，蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物的制備可通過(guò)將抑制劑的編碼基因克隆到載體上，然后在宿主細(xì)胞中表達(dá)后獲得。天然來(lái)源的蛋白酶抑制劑在臨床治疔上有廣泛的應(yīng)用、特別是在艾滋病治療中已有較廣泛的應(yīng)用，鈉通道阻斷劑有著較好的臨床應(yīng)用前景。同時(shí)，天然來(lái)源的蛋白酶抑制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中、特別是抗蟲植物基因工程中也有較大的應(yīng)用的'景。本發(fā)明的有益效果在于蛇毒來(lái)源的蛋白酶抑制劑具有同時(shí)抑制胰蛋白酶以及胰凝乳蛋G酶的雙重抑制活性，且對(duì)二種蛋白酶的抑制常數(shù)基本在同一個(gè)數(shù)量級(jí)，本發(fā)明的蛋白酶抑制劑同時(shí)具有鈉通道的抑制活性。與其它天然來(lái)源小分子量蛋白酶抑制劑相比，該蛇毒蛋白酶抑制劑具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因表達(dá)產(chǎn)量高、活性特殊的有益特點(diǎn)。圖1為本發(fā)明眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑的G-50分子篩層析圖。圖2為本發(fā)明眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑的胰蛋白酶親和柱層析圖。圖3為本發(fā)明眼鏡王蛇毒蛋O酶抑制劑的HPLC反相U柱層析圖。圖4為本發(fā)明眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑基因的核苷酸序列。圖5為本發(fā)明眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑成熟分子的氨基酸序列。圖6為基因表達(dá)本發(fā)明眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑的質(zhì)譜圖。圖7為本發(fā)明眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物與胰蛋白酶相互作用的表面等離子共振圖譜。圖8為本發(fā)明眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物與胰凝乳蛋白酶相互作用的表面等離子共振圖譜。圖9為基因表達(dá)本發(fā)明眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑對(duì)牛蛙坐骨神經(jīng)的作用圖譜。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑的分離純化及活性測(cè)定1、分離純化分離純化過(guò)程中檢測(cè)對(duì)胰蛋白酶和對(duì)胰凝乳蛋白酶的抑制活性來(lái)跟蹤第一歩，分子篩SephadexG-50凝膠過(guò)濾眼鏡王蛇粗毒0.5g溶解于3ml磷酸緩沖液(Na2HP(VNaH2P04，pH5.8，含0.1MNaCl)中，過(guò)S印hadexG-50凝膠。G-50IV峰具有對(duì)胰蛋白酶和對(duì)胰凝乳蛋白酶的雙重抑制活性，附圖1箭頭峰。第二步，胰蛋白酶親和層析進(jìn)一歩分離純化G-50IV峰。在鹽酸洗脫峰中具有對(duì)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的雙重抑制活性，附圖2箭頭峰。第三歩，HPLC-RP-U疏水層析對(duì)胰蛋白酶親和層析洗脫峰的純化。純化的主峰具有對(duì)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性。該主峰合并收集，凍干保存于-20'C。該主峰被命名為0H-TCI，附圖3箭頭峰。2、活性測(cè)定胰蛋白酶抑制劑活性檢測(cè)底物BAEE溶解于Tris-HC1緩沖液(0.05M，PH8.0，含有0.2%CaCl2)中。胰蛋白酶(trypsin)溶解于0.001N的鹽酸中，終濃度為1mg/ml。胰蛋白酶和待檢測(cè)的樣品(該樣品溶解于上述Tris-HC1緩沖液中)在25'C孵育10分鐘后，加入到底物溶液中起始反應(yīng)，在253nm下持續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)2分鐘。酶-抑制劑復(fù)合物的Ki常數(shù)根據(jù)Lineweaver-Burk作圖法求得。胰凝乳蛋白酶抑制劑活性檢測(cè)底物BTEE溶解于Tris-HCl緩沖液(0.08M，pH7.8，含有O.1MCaCl》中。胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)溶解于0.001N的鹽酸中，終濃度為1mg/ml。胰凝乳蛋白酶和待檢測(cè)的樣品(該樣品溶解于所述Tris-HCl緩沖液中)在25'C孵育10分鐘后，加入到底物溶液中起始反應(yīng)，在256nrn下持續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)2分鐘。酶-抑制劑復(fù)合物的Ki常數(shù)根據(jù)Lineweaver-Burk作圖法求得。結(jié)果表明天然純化的眼鏡王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑對(duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制常數(shù)Ki分別為1.895X10—8M和1.698Xl(TM。天然純化的眼鏡王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑顯示了對(duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶相似的高抑制活性，在本發(fā)明中，我們將眼鏡王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑命名為OH-TCI。實(shí)施例2:眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)測(cè)定及分子克隆1、結(jié)構(gòu)測(cè)定N-末端部分氨基酸序列的測(cè)定純化得到的主峰蛋白在全自動(dòng)蛋白質(zhì)序列測(cè)定儀(476A型，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品)上經(jīng)Edman降解法，測(cè)定了該主峰蛋白的N-端20個(gè)氨基酸殘基的序列?；|(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測(cè)純化得到的主峰蛋白采用MALDI-TOF-MS(Bunker)確定其精確分子量。2、分子克隆眼鏡王蛇毒腺cDNA文庫(kù)的構(gòu)建1)眼鏡王蛇毒腺總RNA的提取活體眼鏡王蛇取毒三天后，投入液氮中4小時(shí)后剝離毒腺組織，稱重，取30mg毒腺組織，加入l(M總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國(guó)GIBCO/BRL產(chǎn)品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘，加入等體積的酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4。C，12000rpm離心IO分鐘，棄沉淀，上清液加入等體積的異丙醇，室溫放置IO分鐘，4。C,12000rpm離心10分鐘，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為眼鏡王蛇毒腺總RNA。2)眼鏡王蛇毒腺mRNA的純化采用美國(guó)PROMEGA公司的mRNA分離純化試劑盒，取眼鏡王蛇毒腺總RNA500ug溶于500n1DEPC水中，放入65。C水浴10分鐘，加入3y10ligo(dT)探針和13iU20XSSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液，磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加入O.5XSSC0.3ral，至磁力架吸附30秒，棄上清，最后加入O.1ml0.5XSSC，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用().1ml1XSSC洗漆四次，最后棄上清，加入0.1mlDEPC水懸浮，至磁力架吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入O.15mlDEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，再加入0.15mlDEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，將上清移至新的試管，純化的眼鏡王蛇毒腺mRNA即含于上清中。加入1/10體積的pH5.2的3M乙酸鈉，等體積的異戊醇，于-70。C放置30分鐘，4。C,12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶于10u1DEPC水中。3)眼鏡王蛇毒腺cDNA文庫(kù)的構(gòu)建采用美國(guó)GIBCO/BRL公司的SuperScriptTM質(zhì)粒cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，但操作方法有改進(jìn)。cDNA第一鏈合成(m冊(cè)A反轉(zhuǎn)錄)，于1.5ml試管中加入2y1Notl引物和7y1mRNA,3y1DEPC7尺，70。C保溫10分鐘，立即放入冰浴冷卻，然后加入4y15X第一鏈合成緩沖液，2y10,1MDTT,1ti110mMdNTP混合物，再加入1y1S叩erScriptII反轉(zhuǎn)錄酶，于37。C保溫1小時(shí)后放入冰浴。cDNA第二鏈合成，在第一鏈合成試管中加入95ylDEPC水，30ul5X第二鏈合成緩沖液，3u110mMdNTP混合物，1U1大腸桿菌DNA連接酶，4u1大腸桿菌DNA多聚酶I，1y1大腸桿菌RNA酶，反應(yīng)總體積150u1,混勻后于16'C保溫2小時(shí)；加入2y1TJ)NA多聚酶繼續(xù)保溫5分鐘。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm離心5分鐘，取140y1上層溶液轉(zhuǎn)移到干凈試管中，加入70y17.5M乙酸銨，0.5ml無(wú)水乙醇，12000rptn離心20分鐘，棄上清，沉淀用75%乙醇洗--次，晾干。SalIadapter的連接，上述沉淀溶于25u1DEPC水中，加入lOii15XT扉連接酶緩沖液，10u1SalIadapter,5"1TJ)NA連接酶，反應(yīng)總體積50u1，于16"C保溫16小時(shí)。重復(fù)上述DNA的抽提和乙醇沉淀過(guò)程，沉淀溶解于41u1DEPC水中。NotI酶切，于cDNA溶液中加入5w1酶切緩沖液，1NotI酶，反應(yīng)體積50u1，于37。C保溫2小時(shí)。重復(fù)上述DNA的抽提和乙醇沉淀過(guò)程，沉淀溶解于100y1TEN緩沖液中。將cDNA樣品過(guò)DNA分級(jí)分離柱(試劑盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的組分合并，體積為20u1，加入5u1酵母tRNA，100"17.5M乙酸銨，0.6ml無(wú)水乙醇，12000rpm離心20分鐘，棄上清，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20tUTEN緩沖液中。合成的cDNA連接酶緩沖液，1u1pSPORTl質(zhì)粒(NotI-SalI酶水解，50ng),4ul5XLDNA連接酶，反應(yīng)體積20ul，室溫反應(yīng)3"j、時(shí)，可準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞的制備，挑取單個(gè)HB101菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37'C培養(yǎng)過(guò)夜，次R取上述菌液按比例1:100再接種于50mlLB培養(yǎng)液中，37。C振蕩2小時(shí)，待菌液540腿0.D.值為0.4時(shí),4。C，2000rpm離心8分鐘，棄上清，沉淀用0.1MCaC12重懸，分裝后置冰浴內(nèi)備用。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化取上述連接產(chǎn)物5u1加入50u1感受態(tài)細(xì)胞冰浴20分鐘，42。C熱休克60秒，再置冰浴5分鐘，加入無(wú)氨芐青霉素的SOC培養(yǎng)基0.4ml,37'C培養(yǎng)1小時(shí)，取200u1涂布于含氨芐青霉素的LB平皿(15cm直徑)，37'C培養(yǎng)16小時(shí)，每個(gè)LB平皿用5mlLB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加10%甘油凍存構(gòu)建的cDNA大約含4Xl(T個(gè)單獨(dú)克隆。4)眼鏡王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑的基因克隆在對(duì)所構(gòu)建眼鏡王蛇毒腺cDNA文庫(kù)的隨機(jī)測(cè)序中。通過(guò)提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，使用儀器為美國(guó)AppliedBiosystem373A全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定儀，測(cè)序引物為SP6和T7通用引物，SP6引物序列5-'CATACGATTTAGGTGACACTATAG3-，，T7引物序列:5-'TAATACGACTCTATAGGGA3-'。我們得到了編碼眼鏡王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑的cDNA全序列(SEQIDN0:9)，見(jiàn)附圖4。眼鏡王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑的cDNA序列長(zhǎng)度411個(gè)核苷酸，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓?fù)鋵W(xué)直線鏈狀，序列種類cDNA，來(lái)源眼鏡王蛇毒腺cDNA文庫(kù)，序列特征編碼成熟眼鏡王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑為第70-244位核苷酸，其氨基酸序列見(jiàn)附圖5(SEQIDN0:1)。根據(jù)眼鏡王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑N-末端己測(cè)定20個(gè)氨基酸殘基的序列，以及MALDI-TOF-MS精確分子量的測(cè)定結(jié)果，證明了所得到克隆編碼眼鏡王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑。該克隆成熟肽N-末端推導(dǎo)的20個(gè)氨基酸殘基與天然純化抑制劑的N-末端一致。推導(dǎo)的眼鏡王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑由58個(gè)氨基酸殘基組成。該家族蛋白酶抑制劑的6個(gè)半胱氨酸形成3對(duì)二硫鍵，因此，其理論單同位素分子量[M+H]+為:6339.95道爾頓，MALDI-TOF-MS精確分子量的測(cè)定結(jié)果表明純化抑制劑的單同位素分子量[M+Hr為6339道爾頓(附圖6)。以上結(jié)果充分證明從我們構(gòu)建的眼鏡王蛇蛇毒腺cDNA文庫(kù)中得到的眼鏡王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑cDNA編碼純化得到的天然眼鏡王蛇胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑。實(shí)施例3:重組眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑的原核表達(dá)重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)1、克隆得到的眼鏡王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑(OH-TCI)經(jīng)PCR擴(kuò)增，所用5'-端引物對(duì)應(yīng)成熟多肽的N-末端，3'-引物對(duì)應(yīng)成熟多肽的C-末端，含限制性內(nèi)切酶HindIII剪切位點(diǎn)以及保護(hù)核苷酸。PCR擴(kuò)增采用高保真DNA聚合酶Pyrobest，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。產(chǎn)物回收后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶HindIII酶切，然后與經(jīng)限制性內(nèi)切酶XmnI和HindIII剪切的表達(dá)載體(pMAL-p2X)進(jìn)行平頭-粘性末端的連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a細(xì)胞中。表達(dá)載體pMAL-p2X購(gòu)自NewEnglandBiolabs公司，該表達(dá)載體可使表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入大腸桿菌周質(zhì)，大腸桿菌周質(zhì)中含有二硫鍵異構(gòu)酶，可幫助表達(dá)產(chǎn)物二硫鍵形成正確折疊。2、挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)定其DNA序列。3、篩選具有正確序列的克隆，接種于LB培養(yǎng)基(加有終濃度為100ug/ml的氨芐青霉素)中，37'C過(guò)夜培養(yǎng)。按1:100的比例，將過(guò)夜培養(yǎng)物加到RB培養(yǎng)基(加有終濃度為100ug/ml的氨芐青霉素)中，37"C振蕩培養(yǎng)至0.D.600nm為0.4-0.5時(shí)，'加入IPTG至終濃度為O.3mM，在25"C誘導(dǎo)表達(dá)。冷滲法提取表達(dá)的融合蛋白。4、表達(dá)的融合蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶親和柱純化。純化蛋白質(zhì)凍干濃縮后溶解成濃度為2.5mg/ml，對(duì)第X因子(FactorXa)工作液透析24小時(shí)。5、融合蛋白與FactorXa按質(zhì)量比100:1的比例于室溫下進(jìn)行剪切，剪切6小時(shí)。6、剪切結(jié)束后，以RP-HPLC-C,,純化目的蛋白一重組的OH-TCI。7、表達(dá)蛋白的鑒定。Edman測(cè)序法測(cè)定純化后的目的蛋白的N-末端的氨基酸殘基；MALDI-TOF-MS確定重組蛋白的精確分子量。8、表達(dá)蛋白的活性鑒定。按照實(shí)施例一的方法測(cè)定表達(dá)的重組蛋白對(duì)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性。結(jié)果表明重組OH-TCI對(duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制常數(shù)Ki分別為3.388Xl(TM和1.841X10—7M。重組OH-TCI對(duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制活性基本等同于天然純化的OH-TCI。MALDI-TOF-MS確定重組蛋白的精確分子量結(jié)果表明重組OH-TCI分子量為6339道爾頓，因此，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，重組OH-TCI的二硫鍵形成了正確折疊，天然以及重組OH-TCI均具有對(duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶相似的抑制活性。按照本實(shí)施例所述方法，1升培養(yǎng)基可得到重組OH-TCI約10mg。實(shí)施例4:眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑的真核表達(dá)重組蛋白在酵母細(xì)胞PichiapastorisGS115中的表達(dá)1、克隆得到的眼鏡王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑(OH-TCI)經(jīng)PCR擴(kuò)增，所用5'-端引物對(duì)應(yīng)成熟多肽的N-末端，在成熟多肽的N-末端人工引入第X因子剪切位點(diǎn)lieGluGlyArg位點(diǎn)以及內(nèi)切酶Ec.「」Rl位點(diǎn)，3'-引物對(duì)應(yīng)成熟多肽的C-末端，含限制性內(nèi)切酶NotI剪切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增采用高保真DNA聚合酶Pyrobest，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。產(chǎn)物回收后進(jìn)行A-tarUng反應(yīng)以使產(chǎn)物3'-末端加上腺苷氨酸。2、A-tailing反應(yīng)產(chǎn)物與克隆載體pGEM-T(Promega產(chǎn)品)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)定其DNA序列。3、篩選具有正確序列的克隆，接種于LB培養(yǎng)基(加有終濃度為100ug/ml的氨節(jié)青霉素)中，37'C過(guò)夜培養(yǎng)。按常規(guī)方法抽提質(zhì)粒后進(jìn)行EcoRl與NotI的雙酶切反應(yīng)，回收目的條帶并與限制性內(nèi)切酶EcoRl與NotI剪切的表達(dá)載體(pPIC9K)進(jìn)行連接。表達(dá)載體pPIC9K購(gòu)自Invitrogen公司。4、將上述連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑選陽(yáng)性克隆，利用PCR方法鑒定插入片段并測(cè)定其DNA序列。篩選具有.iH確序列的克隆進(jìn)行質(zhì)粒的純化備用。5、在100ml滅菌三角瓶?jī)?nèi)放10mlYETO培養(yǎng)基，接種酵母宿主菌GS115單菌落，30°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按1:1000的比例，將過(guò)夜培養(yǎng)物加到200mlYEPD培養(yǎng)基30'C振蕩培養(yǎng)至O.D.600nm為1.3-1.5時(shí)，4°C，3000rpm離心5min，分別用100ml及50ml預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌2次，用25ml預(yù)冷的1M山梨醇溶液洗滌1次，離心后盡可能去除上清液，最后用200u1預(yù)冷的1M山梨醇溶液重懸菌體，獲得酵母感受態(tài)細(xì)胞。6、將第4步制備的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pPIC9K-OH-TCI用SalI酶切線性化，約10-20yg質(zhì)粒DNA與80iU冷的酵母感受態(tài)細(xì)胞混合?；旌弦恨D(zhuǎn)移到預(yù)冷的0.2era電轉(zhuǎn)移杯，冰浴預(yù)冷5min后，于1500V、25uF、200條件下電擊，然后迅速加入1ml冷的1M山梨醇溶液，混勻，涂布于MD選擇平板上，30。C培養(yǎng)2-3天，至轉(zhuǎn)化子(pPIC9K-OH-TCI/GS115)長(zhǎng)出。7、依次用含G418濃度為1、2、3、4mg/ml的YEDP平板對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。最終得到的對(duì)G418抗性最高的陽(yáng)性克隆單菌落對(duì)應(yīng)地接種于MD和醒平板，30。C培養(yǎng)3-5天，觀察克隆生長(zhǎng)情況。最終得到的生長(zhǎng)情況良好、對(duì)G418抗性高的克隆進(jìn)行插入片段的PCR方法鑒定并測(cè)定其DNA序列。8、接種上一歩經(jīng)鑒定正確的、對(duì)G418抗性高的單菌落于100mlBMGY培養(yǎng)基，30。C振蕩培養(yǎng)至O.D.600咖為2.0-4.0，3000rpm離心5min,棄去上清液，用1000ralBMMY培養(yǎng)基重懸菌體，使菌體濃度約為O.D.600nm=1.0。每24小時(shí)補(bǔ)充甲醇一次，使其濃度保持在1%。第72小時(shí)時(shí)將菌液于4'C，8000rpm離心20min，收集上清液，此上清液中含有表達(dá)的重組蛋白。9、上清液含有的表達(dá)融合蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶親和柱純化。純化蛋白質(zhì)凍干濃縮后溶解成濃度為2.5mg/ml，對(duì)第X因子(FactorXa)工作液透析24小時(shí)。10、融合蛋白與FactorXa.按質(zhì)量比100:1的比例于室溫下進(jìn)行剪切，剪切6小時(shí)。11、剪切結(jié)束后，以RP-HPLC-C4純化目的蛋白一重組的OH-TCI。12、表達(dá)蛋白的鑒定。Edman測(cè)序法測(cè)定純化后的目的蛋白的N-末端的氨基酸殘基；MALDI-T0F-MS確定重組蛋白的精確分子量。13、表達(dá)蛋白的活性鑒定。按照實(shí)施例一的方法測(cè)定表達(dá)的重組蛋白對(duì)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性。結(jié)果表明重組0H-TCI對(duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制常數(shù)Ki分別為2.34X10—8M和1.701X1CTM。重組0H-TCI對(duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制活性基本等同于天然純化的0H-TCI。MALDI-T0F-MS確定重組蛋白的精確分子量結(jié)果表明重組0H-TCI分子量為6339道爾頓，因此，在酵母表達(dá)系統(tǒng)中，重組0H-TCI的二硫鍵形成了正確折疊，天然以及重組0H-TCI均具有對(duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶相似的抑制活性。按照本實(shí)施例所述方法，1升培養(yǎng)基可得到重組OH-TCI約50mg。實(shí)施例5:眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑功能等同物的研究為深入了解眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，根據(jù)結(jié)構(gòu)模擬，我們沿OH-TCI的e-折疊環(huán)構(gòu)建了六個(gè)點(diǎn)突變體以及一個(gè)N-末端缺失突變體，這些突變體包括缺失、點(diǎn)突變以及多個(gè)氨基酸的替換。突變體的制備采用PCR方法，按照實(shí)施例三所述方法進(jìn)行原核表達(dá)后純化得到，表達(dá)目的產(chǎn)物通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。所構(gòu)建突變體的序列如下OH-TCIE7K(SEQIDNO:3)GlyProT-,ysPheCysLysLeuProAla10ValSer〔;丄yP.hcCys丄」ysAlaTyr工lePro20SerPheTyrTy.r、snProAspAlaSerAla30CysGinL,ysPhe"■e，GlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsn■LysPheLysThrlieGlu50GluCysHisArgThrcysValGly58OH-TCIAVS-LRI(SEQIDNO:4)GlyProL,ysPheCysGluLieuProLeu10Arg工leGlyPheCysLysAlaTyr工lePro20SerPheTyrTy:rAsnProAspAlaSerAla30CysGinLysPheIleTyrGlyGlyCysGly40GlyAsr，AlaAsri:LysPheLysThrlieGlu50GluCysHisArgThrCysValGly58OH-TCIF14P(SEQIDNO:5)GlyArgProl,ysPheCysG1u.L,euP二oAla10ValSerGlyProCysLysAlaTyr工lePro20SerPheTyrTyr/\sn.ProAspA丄aSerAla30CysGinLysPhe工丄eTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnLysPheLysThrlieGlu50GluCysHisA.rgThrCysValGly58OH-TCIK篇(SEQIDNO:6)GlyAxgProLysPheCysGluLeuProAla10ValSerG:lyPheCysGinTy:cliePro20SerPheTyr'1'yr、snProAspAlaSerAla30CysGinLysP:hc〕.1丄eTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnI'ysPheI,ysThrlieGlu50GluCysHisArgThrCysValGly58OH-TCIA17R(SEQIDNO:7)GlyArgProl'ysPhecysGluLeuProAla10ValSerGlyPheCys丁」ysArgTyrliePro20SerPheTyrTy.rAsnProAspAlaSerAla30CysGin:LysPhe工.LeTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnI'ysPheLysThrlieGlu50GluCysHisArgThrCysValGly58OH隱TCID27K(SEQIDNO:8)GlyA:rgPro:LysPheCysGluLeuProAla10ValSerGlyPheCysLysAlaTyrliePro20SerPheTyrTyrAsnPro!LysAlaSerAla30CysGinL,ysPhe丁leTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnA]aAsn]」ysPheLysThrlieGlu50GluCysHisA.rgTh:rCysValGly58OH-TCI57(SEQIDNO:2)A:rgProI.」ysPhecysGluLeuProAla9ValSerGlyPheCysL,ysAlaTyrliePro19SerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAla29CysGin:LysPheI:leTyrGlyGlyCysGly39GlyAsnAlaAsnt'ysPheLysThrlieGlu49GluCysHisArgThrCysValGly57本實(shí)施例中，抑制劑與胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的相互作用通過(guò)表面等離子共振(SPR，Biacore3000，瑞典U卯sala產(chǎn)品)進(jìn)行測(cè)定(附圖7，8)。具體實(shí)驗(yàn)方法為分別將高純度的胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶(Slgma產(chǎn)品)偶聯(lián)到CM5芯片上，用不同濃度的抑制劑溶液流經(jīng)芯片表面。選用BIA數(shù)據(jù)處理軟件自動(dòng)處理所得數(shù)據(jù)，可得到不同抑制劑與胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在系統(tǒng)溫度為25°C，緩沖液pH7.8為的條件下的解離常數(shù)KD，該數(shù)值反映了抑制劑與酶結(jié)合能力的大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明天然純化與原核表達(dá)OH-TCI對(duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶均具有很高的抑制作用，且對(duì)二種酶的解離常數(shù)K"直極為接近，進(jìn)一步證明本發(fā)明所用原核表達(dá)體系可使表達(dá)產(chǎn)物形成正確的空間構(gòu)像。缺失、點(diǎn)突變以及多個(gè)氨基酸的替換突變體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)揭示這些位點(diǎn)對(duì)0H-TCI的胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的雙重抑制作用影響不大。值得注意的是，當(dāng)PI位點(diǎn)16位氨基酸殘基由天然的Lys變?yōu)镚in時(shí)，它喪失了對(duì)胰蛋白酶的抑制活性，同時(shí)對(duì)胰凝乳蛋白酶的抑制活性也有微弱的降低，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1不同抑制劑對(duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶抑制活性的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>上表中的解離常數(shù)Ki,值越小，則表明其蛋白酶抑制活性越強(qiáng)。實(shí)施例6:眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑對(duì)鈉離子通道的作用本實(shí)施例采用大腸桿菌表達(dá)的重組OH-TCI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。重組OH-TCI神經(jīng)毒活性(阻斷鈉離子通道)通過(guò)對(duì)蛙類坐骨神經(jīng)復(fù)合動(dòng)作電位的阻斷來(lái)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)方法參照Stys等(StysPK，RansomBR,Wa觀anSG.Compoundactionpotentialofnerverecordedbysuctionelectrode:atheoreticalandexperimentalanalysis.BrainResearch1991,Vol.546，18-32)。取無(wú)損傷的牛蛙兩腿坐骨神經(jīng)叢(長(zhǎng)5厘米左右)作為實(shí)驗(yàn)材料，兩端固定于神經(jīng)屏蔽盒中，用Ringer溶液濕潤(rùn)防止其干燥。采用成都儀器廠的RM6240生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別將刺激電極和記錄電極與坐骨神經(jīng)兩端相連，按照標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)(神經(jīng)干動(dòng)作電位)參數(shù)給予坐骨神經(jīng)刺激(采用單剌激模式，刺激幅度為0.5V，采樣頻率40kHz，波寬0.3ms，延時(shí)lnis，連續(xù)記錄)，并記錄分析。試驗(yàn)前，預(yù)平衡15分鐘，采用普魯卡因(procaine)和PBS作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，共記錄60分鐘。根據(jù)記錄數(shù)據(jù)，分析計(jì)算藥物對(duì)坐骨神經(jīng)的去極化和復(fù)極化時(shí)間的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組0H-TCI以及普魯卡因均能以時(shí)間依賴的方式降低牛蛙坐骨神經(jīng)的收縮活性。普魯卡因作為一種局部麻醉劑，主要通過(guò)抑制電壓門控鈉離子通道而起作用。重組0H-TCI引起的牛蛙坐骨神經(jīng)的收縮活性的降低程度要弱于普魯卡因。本實(shí)施例的結(jié)果揭示眼鏡王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑能作用于鈉離子通道(附圖9)。實(shí)施例7:眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑與烏司它丁對(duì)人胰蛋白酶以及人胰凝乳蛋白酶抑制活性的比較本實(shí)施例采用大腸桿菌表達(dá)的重組OH-TCI以及實(shí)施例5所述OH-TCIAVS-LRI突變體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。注射用烏司它丁(.10萬(wàn)單位/瓶)購(gòu)自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。胰蛋白酶抑制劑活性以及胰凝乳蛋白酶抑制活性按照實(shí)施例1方法進(jìn)行。所用試劑均為Sigma公司產(chǎn)pao實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組OH-TCI，0H-TCIAVS-LRI以及注射用烏司它丁均能劑量依賴地抑制胰蛋白酶活性以及胰凝乳蛋白酶活性，它們?cè)诟髯韵嗤膭┝肯聦?duì)胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的抑制活性基本在同一數(shù)量級(jí)。其中，lug0H-TCI=11.63單位烏司它丁，證明眼鏡王蛇毒胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶雙功能抑制劑及其衍生物與烏司它丁對(duì)實(shí)驗(yàn)所用酶的作用類似，可望應(yīng)用于臨床。序列表.SEQ<110〉中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所<120〉蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物的應(yīng)用<160〉16<210>1<211〉58〈212〉PRT<213>眼鏡王蛇(Opi叩hagushannah)<400〉1MetGlyArgLeuThrPro-5AlaValSer10LeuLeuLeuLeuLeuGlyLeuLeuThrLeuTrpAlaGlu-20-15-10ValSerGlyLeuGlyArgProLysPheCysGluLeuPro-115G-lyPheCysLysAlaTyrlieProSerPheTyrTyrAsn152025ProAspAsnAlaGlyAla.Ser'AltiCysGinLysPhelieTyrGlyGlyCysGlyGly303540AsnLysPheLysThrlieGluGluCysHisArgThrCysVal455055〈210〉2<211>57〈212〉PRT<213>眼鏡王蛇(Opi叩hagus<400>2ArgProLysPheCysGluLeuProAlaValSerGlyPhe.CysLysAla151015TyrlieProSerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAlaCysGinLys202530PhelieTyrGlyGlyCysGlyGlyAsnAlaAsnLysPheLysThrlie354045GluGluCysHisArgThrCysValGly5055<210〉3<211〉58<212〉PRT<213〉人工序列<400〉3GlyArgProLysPheCysLysLeuProAlaValSerGlyPheCysLys151015Ala'TyrlieProSerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAlaCysGin202530LysPhelieTyrGlyGlyCysGlyGlyAsnAlaAsnLysPheLysThr354045lieGluGluCysHisArgThrCysValGly5055<210〉4<211〉58<212〉PRT<213〉人工序列<400>4GlyArgProLysPheCysGluLeuProLeuArglieGlyPheCysLys151015AlaTyrlieProSerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAlaCysGin202530LysPhelieTyrGlyGlyCysGlyGlyAsnAlaAsnLysPheLysThr354045lieGluGluCysHisArgThrCysValGly5055<210〉5<211〉58<212〉PRT<213〉人工序列<400〉5GlyArgProLysPheCysGluLeuProAlaValSerGlyProCysLys151015AlaTyrlieProSerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAlaCysGin202530LysPhelieTyrGlyGlyCysGlyGlyAsnAlaAsnLysPheLysThr354045lieGluGluCysHisArgThrCysValGly5055<210〉6<211〉58<212〉PRT〈213〉人工序列<400〉6GlyArg1AlaTyrProLysLysPhelieGlu50liePro'20lieTyr35GluCys<210〉7〈211〉58〈212〉PRT〈213〉人工序列<400>7GlyArg1ArgTyrLysPhelieGlu50liePro20lieTyr35GluCysPheCysGlu5SerPheTyr'GlyGlyCysHisArg.Thr55ProLysPheCysGlu5SerPheTyrGlyGlyCysHisArgThr55<210〉8<211>58〈212〉PRT〈213>人工序列<400>8GlyArgProLys1AlaTyrliePro20LysPheI'le'Tyr35lieGluGluCysLeuProAlaValSerGlyPheCysGin1015TyrAsnProAspAlaSerAlaCysGin2530GlyGlyAsnAlaAsnLysPheLysThr4045CysValGlyLeuProAlaValSerGlyPheCysLys1015TyrAsnProAspAlaSerAlaCysGin2530GlyGlyAsnAlaAsnLysPheLysThr4045CysValGlyPheCysGlu5.SerPheTyrGlyGlyCysHis'ArgThrLeuProAlaValSerGlyPheCysLys1015TyrAsnProLysAlaSerAlaCysGin2530GlyGlyAsnAlaAsnLysPheLysThr4045CysValGly5055<210>9<211>411〈212>薩<213>眼鏡王蛇(Opiophagushannah)<400>9atgggacgtxttxttctcct.gctgggactcctcaccctctgggc卿gctgacccccgtc60tccggcctgggCCgtCC6UUlgttct.gtgaactgcctgctgtatccggattctgcaaagcc120tatataccttccttctactaca,acccggatgcaagtgcatgccaaaagtttatttatggt180ggctgtggggaccatagaagaatgccsccgcacctgtgtt240ggatgaccaatgagg卿ccca.cccagaatggatccaatgttccaacttgetcccaaagfic300cctgcttctgccctggacca.cttggagacccaaceiccctgggctcatttc360tttttctctgcaattaaagctttggttccag411〈210〉10〈211>174〈212>腦〈213>眼鏡工蛇(Opiophagushannah)〈400〉丄0cgtcc犯agttctgtgaa,ctgCCtgCtgtSitccggattctgcaaagcctatataccttcc60ttctacta.catttatggtggctgtgggggc120aatgcc朋caaattta,eigfic.tgccaxxgc己cctgtgtt,gga丄gti174〈210〉11〈211>177〈212〉DM〈213〉人工序列〈400>11ggccgtccagieictgcctgctgtatccggattctgcaaagcctatatacct60tccttctactacaacccgga.tgc肌gtgcatgccaaaagtttatttatggtggctgtggg120ggcaatgccag￡LCC￡ltt"lg￡iagaatgccaccgcacctgtgttggstgs177<210>12〈211〉177〈212>DNA<213>人工J字列〈400>12ggccgtcca3agttctgtgaactgcctcttcgcatcggattctgcaaagcctatatacct60tccttctactacaacccggatgC￡l￡lgtgC￡Ltgccaaaagtttatttatggtggctgtggg120ggcaatgccaacaaatttaagaccatagaagaatgccaccgcacctgtgttggatga177〈210〉13<211>177<212>■〈213〉人工序列〈400〉13ggccgtccaaagt.tctgtgaactgcctgcttccttctactaca.acccggatgcaagtgcaggcaatgccaacaaatttaaga,ccatagaagtatccggactgccaaaagtgaatgccacccatgcaaagcttatttatgggcacctgtgtctatataccttggctgtgggtggatga60120177<210>14〈211〉177〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>14ggccgtccaaagttctgtgt飛actgcctgcttccttctactacaacccggatgcaagtgcaggcaatgccaacaaatttaagaccatagaagtatccggattgccaaaagtgaatgccacctctgcaatgcttatttatgggcacctgtgtctatataccttggctgtgggtggatga60120177〈210〉15<211>177〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>15ggccgtccaaagttxtgtgaactgcctgcttccttctactacaacccggatgcaagtgcaggcaatgccaacaaattt,aa.gaccatagaagtatccggattgccaaaagtgaatgccacctctgcaaacgttatttatgggcacctgtgtctatataccttggctgtgggtggatga60120177<210>16<211〉177<212>腿<213>人工序列<400>16ggccgtccaaagttctgtgaactgcctgct.tccttctactacaacccgaaagcaagtgcaggcaatgccaacaaa.tttaagaccata,gaagtatccggattgccaaaagtgaatgccacctctgcaaagcttatttatgggcacctgtgtctatataccttggctgtgggtggatga6012017權(quán)利要求1、一種眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑，其特征在于所述蛋白酶抑制劑具有下述序列表中的氨基酸序列(SEQIDNO1)GlyArgProLysPheCysGluLeuProAla10ValSerGlyPheCysLysAlaTyrIlePro20SerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAla30CysGlnLysPheIleTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnLysPheLysThrIleGlu50GluCysHisArgThrCysValGly58。2、衍生自權(quán)利要求1所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替代以及缺失且具有蛋白酶抑制活性的功能等同物，其特征在于所述蛋白酶抑制劑具有下述序列表中的氨基酸序列SEQIDNO:2ArgProL,ysPheCysGluLeuProAla9ValSerGlyPheCysLysAlaTyr工lePro19SerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAla29CysGinLysPhelieTyrGlyGlyCysGly39GlyAsnAlaAsnLysPheLysThr工leGlu49GlucysHisArgThrCysValGly57SEQIDNO:3GlyArgProLysPheCysLysLeuProAla10ValSerGlyPheCysLysAlaTyr工lePro20SerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAla30CysG丄nLysPhe工leTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnLiysPheILysThrlieGlu50GlucysHisA—rgThrCysValGly58SEQIDNO:4GlyArgPro—LysPheCysGluLeuProlieu10ArglieGlyPheCysLysAlaTyrliePro20SerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAla30CysGinLysPhelieTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnLysPheLysThrlieGlu50GluCysHisArgThrCysValGly58SE(3IDNO:5GlyArgProI」ysPheCysGluLeuProAla10ValSerGlyProCysLysAlaTyrliePro20SerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAla30CysGin!LysPhelieTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnL>ysPhe"LysThrlieGlu50GluCysHisArgThrCysValGly58SEQIDNO:6GlyArgProI」ysPheCysGluLeuProAla10ValSerG丄yPheCysGinAlaTyrliePro20SerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAla30CysGinI」ysPheI丄eTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnI」ysPheLysThrlieGlu50GluCysHisArgThrCysValGly58SEQIDNO:7GlyArgProLysPheCysGluLeuProAla10ValSerGlyPheCysLysArgTyr工lePro20SerPheTyrTyrAsnProAspAlaSerAla30CysGinLysPhelieTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnLysPheLysThrlieGlu50GluCysHisArgThrCysValGly58SEQIDNO:8GlyArgProLysPheCysGluLeuProAla10ValSerGlyPheCysLysAlaTyrliePro20SerPheTyrTyrAsnProLysAlaSerAla30CysGinLysPhe—lieTyrGlyGlyCysGly40GlyAsnAlaAsnI」ysPheI」ysThr工leGlu50GluCysHisThrCysValGly583、權(quán)利要求1所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑的制備方法，其特征在于可從眼鏡王蛇蛇毒中分離得到。4、權(quán)利要求1或2所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物的制備方法，其特征在于將編碼所述蛋白酶抑制劑的基因克隆到載體上，然后進(jìn)入宿主細(xì)胞中表達(dá)后獲得所述蛋白酶抑制劑。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物的制備方法，其特征在于所述的載體是質(zhì)?；虿《局械囊环N。6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物的制備方法，其特征在于所述的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，它是大腸桿菌或枯草芽孢桿菌。7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物的制備方法，其特征在于所述的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，它是酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。8、權(quán)利要求1或2所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白酶抑制劑及其衍生物在臨床治療上的應(yīng)用。9、權(quán)利要求1所述的眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白酶抑制劑及其衍生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中、特別是抗蟲植物基因工程中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物，與其它天然來(lái)源小分子量蛋白酶抑制劑相比，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因表達(dá)產(chǎn)量高、活性特殊的有益特點(diǎn)。本發(fā)明眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑的制備方法可以是從蛇毒粗毒進(jìn)行分離純化獲得，也可以通過(guò)基因工程表達(dá)獲得。本發(fā)明還提供眼鏡王蛇毒蛋白酶抑制劑及其衍生物的應(yīng)用，其具有同時(shí)抑制胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶的雙重抑制活性，且對(duì)二種蛋白酶的抑制常數(shù)基本在同一個(gè)數(shù)量級(jí)，還具有鈉通道的抑制活性。文檔編號(hào)C07K14/81GK101186646SQ200710066320公開日2008年5月28日申請(qǐng)日期2007年10月26日優(yōu)先權(quán)日2007年10月26日發(fā)明者何英英,劉樹柏,云張,李文輝申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所