專利名稱：：抗ox40l抗體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般意義上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及抗OX40L抗體及其用途。
背景技術(shù)：
：人OX40配體(OX40L)，一種膜結(jié)合的腫瘤壞死因子超家族成員，主要在活化的抗原呈遞細(xì)胞例如樹突狀細(xì)胞上表達(dá)，在B細(xì)胞表達(dá)程度稍低。參見Sugamura,K等人,NatureReviewsImmunology4:420(2004);WeinbergAD,TrendsImmunol.23(2):102(2002)。OX40L，亦稱為ACT國4受體，TNF4-Human,GP34和CD134L,結(jié)合OX40受體(0X40)，所述OX40受體又稱為CD134,ACT-4，CD134抗原，ACT35抗原和TNR4-Human。OX40是一種T細(xì)胞活化蛋白，在T細(xì)胞受體(TCR)參與后表達(dá)。CD40通過活化抗原呈遞細(xì)胞的參與增加OX40L的表達(dá)。OX40通過OX40L的參與對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞是共刺激性的，該共刺激上調(diào)T輔助細(xì)胞1和T輔助細(xì)胞2的細(xì)胞因子產(chǎn)生。OX40-OX40L相互作用對(duì)記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生也很重要，在抗原致敏后促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞的存活。在動(dòng)物模型中體內(nèi)阻斷OX40L降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、實(shí)驗(yàn)性自身免疫病(EAE)、急性移植物抗宿主疾病(GVHD)、炎癥性腸病、實(shí)驗(yàn)性利什曼病和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重禾呈度。參見Sugamura,K等人，NatureReviewsImmunology4:420(2004);WeinbergAD，TrendsImmunol.23(2):102(2002)。抗-OX40L和識(shí)別OX40L的抗體在下面提及，例如WO95/12673;WO95/21915;WO99/15200;Baum，RR.,等人，EMBOJ.13(1994)3992-4001;Imura，A.,等人,Blood89(1997)2951-2958;Imura，A.，等人，J.Exp.Med.183(1996)2185-2195;Kjaergaard,J"等人，J.Immunol.167(2001)6669-6677;Lane:P"J.Exp.Med.191GOOO)201-206;Mallett,S.,andBarclay,A.N.,Immunol.Today12(1991)220-223;Mallett,S"等人，EMBOJ.9(1990)1063-1068;Ndhlovu,L.C.，等人，J.Immunol.167(2001)2991-2999;Oyhshima，Y"等人，J.Immunol.159(1997)3838-3848;Rogers,P.R.，等人，Immunity15(2001)445-455;Stiiber,E.,andStrober,W"J.Exp.Med.183(1996)979-989;Sttiber,E.等人，Gastroenterology115(1998)1205-1215;Takahashi，&"等人，J.Virol.75(2001)6748-6757;Takasawa，N"等人，Jpn.J,CancerRes.92(2001)377-382;Taylor,L，andSchwarz,H.，J.Immunol.Meth.255(2001)67-72;Weinberg,A.D"等人，NatureMedicine2(1996)183-189;Weinberg,A.D"等人，Semin.Immunol.10(1998)471-480;Weinberg,A.D.，TrendsImmunol.23(202)102-109;Wu，T.,等人，Transplant.Proc.33(2001)217-218;Higgins,L.M.,等人，J.Immunol.162(1999)486-493;Yoshioka,T.,等人，Eur.J.Immunol.30(2000)2815-2823;和Wang,Q"等人TissueAntigens64:566-574(2004)。MBLInternationalCorp.(TAG-34)和RandDCorp(克隆159403和159408)商品化供應(yīng)小鼠抗人OX40L抗體。顯然仍然需要一種具有臨床效果的試劑，所述試劑適合用作治療劑的開發(fā)。此處描述的發(fā)明滿足這種需要并提供其它益處。所有本文引用的參考文獻(xiàn)，包括專利申請(qǐng)和出版物，均在此完整引入作為參考。發(fā)明概述本發(fā)明部分基于各種OX40L結(jié)合劑(例如抗體和其片段)的鑒定。OX40L表現(xiàn)為一種重要的和有利的治療靶標(biāo)，本發(fā)明提供基于結(jié)合OX40L的組合物和方法。本文描述的本發(fā)明OX40L結(jié)合劑提供重要的治療和診斷劑，在針對(duì)與OX40L-OX40受體途徑的表達(dá)和/或活性相關(guān)的病理病癥中使用。因此，本發(fā)明提供與OX40L結(jié)合有關(guān)的方法、組合物、試劑盒和制品。一方面，本發(fā)明提供一種分離的抗OX40L抗體，其中該抗體的全長(zhǎng)IgG形式特異結(jié)合人OX40L,其結(jié)合親和力為大約10nM或者更好。如同本領(lǐng)域已經(jīng)清楚確定的，可以利用各種測(cè)定法中的任意一種檢測(cè)配體與其受體的結(jié)合親和力，并以各種數(shù)值的術(shù)語表示。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合親和力可以表示為Kd值并反映內(nèi)在的結(jié)合親和力(例如，具有最低的親和力效測(cè)量結(jié)合親和力，不論是在無細(xì)胞或者細(xì)胞相關(guān)環(huán)境中。本領(lǐng)域已知的多種測(cè)定法中的任意一種，包括本文描述的那些，可用于實(shí)現(xiàn)結(jié)合親和力測(cè)量，包括，例如，Biacore、放射免疫測(cè)定(RIA)和ELISA。一方面，本發(fā)明提供一種分離的抗體，所述抗體結(jié)合OX40L的OX40受體結(jié)合域。在一些實(shí)施方式中，分離的抗體結(jié)合多肽，所述多肽包含、包括人OX40L胞外結(jié)構(gòu)域或者由人OX40L胞外結(jié)構(gòu)域組成。一方面，本發(fā)明提供一種分離的抗OX40L抗體，所述抗體與OX40受體竟?fàn)幗Y(jié)合OX40L。一方面，本發(fā)明提供一種分離的抗OX40L抗體，所述抗體抑制、降低和/或阻斷OX40L活性。一方面，本發(fā)明提供一種抗OX40L抗體斷T細(xì)胞增殖。一方面，本發(fā)明提供一種抗OX40L抗體斷活化T細(xì)胞的存活。一方面，本發(fā)明提供一種抗OX40L抗體斷T記憶細(xì)胞的IL-2分泌。一方面，本發(fā)明提供一種抗OX40L抗體，包括選自由以下序列組成的組中的至少l種、2種、3種、4種、5種和/或6種高變區(qū)(HVR)序列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQIDNO:l)，RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQIDNO:2),RVSNRFS(SEQIDNO:3),KVSNRFS(SEQIDNO:4),FQGSHVPYT(SEQIDNO:5)，SQSTHIPWT(SEQIDNO:6)，SYWLN(SEQIDNO:7)，SYWMH(SEQIDNO:8)，MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQIDNO:9),EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQIDNO:10)，GRGNFYGGSHAMEY(SEQIDNO:1l)和ERSPRYFDV(SEQIDNO:12)。一方面，本發(fā)明提供一種抗OX40L抗體，包括選自由以下序列組成的組中的至少l種、2種、3種、4種、5種和/或6種高變區(qū)(HVR)序列(a)包括序列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQIDNO:l)或者RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQIDN0:2)的HVR-L1;(b)包括序列RVSNRFS(SEQIDNO:3)或者KVSNRFS(SEQIDNO:4)的HVR-L2;(c)包括序列FQGSHVPYT(SEQIDNO:5)或者SQSTHIPWT(SEQIDNO:6)的HVR-L3;(d)包括序列SYWLN，所述抗體抑制、降低和/或阻，所述抗體抑制、減少和/或阻，所述抗體抑制、減少和/或阻(SEQIDN0:7)或者SYWMH(SEQIDN0:8)的HVR-H1;(e)包括序列MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQIDNO:9)或者EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQIDNO:10)的HVR-H2;和(f)包括序列GRGNFYGGSHAMEY(SEQIDNO:11)或者ERSPRYFDV(SEQIDNO:12)的HVR-H3。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括具有以下序列的輕鏈可變域FGGGTKVEIKR(SEQIDNO:13)或者WTFGGGTKVEIKR(SEQIDNO:14);和包括具有以下序列的重鏈可變域:RGNFYGGSHAMEYWGQGTLLTVSS(SEQIDNO:15)或者SPRYFDVWGAGTTLTVSS(SEQIDNO:16)。一方面，本發(fā)明提供一種抗OX40L抗體，包括選自由以下序列組成的組中的至少l種、2種、3種、4種、5種和/或6種高變區(qū)(HVR)序列(a)包括序列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQIDNO:l)的HVR-L1或者包括序列RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQIDNO:2)的HVR-L1;(b)包括序列的HVR-L2;(c)包括序列FQGSHVPYT(SEQIDNO:5)的HVR-L3或者包括序列SQSTHIPWT(SEQIDNO:6)的HVR-L3;(d)包括序列SYWLN(SEQIDNO:7)的HVR-Hl或者包括序列SYWMH(SEQIDNO:8)的HVR-Hl;(e)包括序列MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQIDNO:9)的HVR-H2或者包括序列EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQIDNO:IO)的HVR-H2;和(f)包括序列GRGNFYGGSHAMEY(SEQIDNO:11)的HVR-H3或者包括序列ERSPRYFDV(SEQIDNO:12)的HVR畫H3。一方面，本發(fā)明提供一種抗OX40L抗體，包括選自由以下序列組成的組中的至少l種、2種、3種、4種、5種和/或6種高變區(qū)(HVR)序列(a)包括序列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQIDNO:l)的HVR-Ll;(b)包括序列RVSNRFS(SEQIDNO:3)的HVR-L2;(c)包括FQGSHVPYT(SEQIDNO:5)的HVR-L3;(d)包括序列SYWLN(SEQIDN0:7)的HVR-H1;(e)包括序列MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQIDNO:9)的HVR-H2;和(f)包括序列GRGNFYGGSHAMEY(SEQIDNO:11)的HVR-H3。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括輕鏈，所述輕鏈包括選自由以下序列組成的組中的至少1種、至少2種或者所有3種HVR序列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQIDNO:l),RVSNRFS(SEQIDNO:3)和FQGSHVPYT(SEQIDNO:5)。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括具有氨基酸序列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQIDNO:l)的輕鏈HVR-Ll。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括具有氨基酸序列RVSNRFS(SEQIDNO:3)的輕鏈HVR-L2。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括具有氨基酸序列FQGSHVPYT(SEQIDNO:5)的輕鏈HVR-L3。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括重鏈，所述重鏈包括選自由以下序列組成的組中的至少1種、至少2種或者所有3種HVR序列SYWLN(SEQIDNO:7),MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQIDNO:9)和GRGNFYGGSHAMEY(SEQIDNO:11)。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括具有氨基酸序列SYWLN(SEQIDNO:7)的重鏈HVR-Hl。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括具有氨基酸序列MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQIDNO:9)的重鏈HVR-H2。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括具有氨基酸序列GRGNFYGGSHAMEY(SEQIDNO:ll)的重鏈HVR-H3。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括重鏈和輕鏈，所述重鏈包括選自由以下序列組成的組中的至少1種、至少2種或者所有3種HVR序列SYWLN(SEQIDNO:7),MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQIDNO:9)和GRGNFYGGSHAMEY(SEQIDNO:ll)，所述輕鏈包括選自由以下序列組成的組中的至少l種、至少2種或者所有3種HVRyf列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQIDNO:l),RVSNRFS(SEQIDNO:3)和FQGSHVPYT(SEQIDNO:5)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括具有以下序列的輕鏈可變域FGGGTKVEIKR(SEQIDNO:13)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括具有以下序列的重鏈可變RGRGNFYGGSHA廳YWGQGTLLTVSS(SEQIDNO:15)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括具有以下序列的輕鏈可變域:FGGGTKVEIKR(SEQIDNO:13);和包括具有以下序列的重鏈可變域:RGNFYGGSHAMEYWGQGTLLTVSS(SEQIDNO:15)。一方面，本發(fā)明提供一種抗OX40L抗體，包括選自由以下序列組成的組中的至少l種、2種、3種、4種、5種和/或6種高變區(qū)(HVR)序列(a)包括序列RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQIDNO:2)的HVR-Ll;(b)包括序列KVSNRFS(SEQIDNO:4)的HVR-L2;(c)包括序列SQSTHIPWT(SEQIDNO:6)的HVR-L3;(d)包括序列SYWMH(SEQIDNO:8)的HVR-Hl;(e)包括序列EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQIDNO:10)的HVR-H2;和(f)包括序列ERSPRYFDV(SEQIDNO:12)的HVR畫H3。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括輕鏈，所述輕鏈包括選自由以下序列組成的組中的至少1種、至少2種或者所有3種HVR序列RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQIDNO:2)，KVSNRFS(SEQIDNO:4)和SQSTHIPWT(SEQIDNO:6)。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括具有氨基酸序列RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQIDN0:2)的輕鏈HVR-L1。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括具有氨基酸序列KVSNRFS(SEQIDNO:4)的輕鏈HVR-L2。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括具有氨基酸序列SQSTHIPWT(SEQIDNO:6)的輕鏈HVR-L3。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括重鏈，所述重鏈包括選自由以下序列組成的組中的至少l種、至少2種或者所有3種HVR序列SYWMH(SEQIDNO:8),EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQIDNO:IO)和ERSPRYFDV(SEQIDNO:12)。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括具有氨基酸序列SYWMH(SEQIDNO:8)的重鏈HVR-Hl。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括具有氨基^f列EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQIDNO:10)的重鏈HVR-H2。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體包括具有氨基酸序列ERSPRYFDV(SEQIDNO:12)的重鏈HVR-H3。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括重鏈和輕鏈，所述重鏈包括選自由以下序列組成的組中的至少l種、至少2種或者所有3種HVR^列SYWMH(SEQIDNO:8),EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQIDNO:10)和ERSPRYFDV(SEQIDNO:12),所述輕鏈包括選自由以下序列組成的組中的至少1種、至少2種或者所有3種HVR序列RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQIDNO:2),KVSNRFS(SEQIDNO:4)和SQSTHIPWT(SEQIDNO:6)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括具有以下序列的輕鏈可變域WTFGGGTKVEIKR(SEQIDNO:14)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括具有以下序列的重鏈可變域:SPRYFDVWGAGTTLTVSS(SEQIDNO:16)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體包括具有以下序列的輕鏈可變域:WTFGGGTKVEIKR(SEQIDNO:14);和包括具有以下序列的重鏈可變域:SPRYFDVWGAGTTLTVSS(SEQIDNO:16)。如本領(lǐng)域已知，并且在下文中更詳細(xì)的描述，描繪抗體高變區(qū)的氨基酸位置/邊界可能有所變化，取決于所處的情況和本領(lǐng)域已知的不同定義(如下所述)。位于可變域內(nèi)的一些位置可以看作混合(hybrid)高變位置，因?yàn)樵谝唤M標(biāo)準(zhǔn)下這些位置被認(rèn)為在高變區(qū)內(nèi)而在一組不同的標(biāo)準(zhǔn)下被認(rèn)為在高變區(qū)外。在延伸的高變區(qū)(如下面的進(jìn)一步定義)還可以發(fā)現(xiàn)一種或者多種這些位置。在一些實(shí)施方式中，抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方式中，抗體是多克隆抗體。在一些實(shí)施方式中，抗體選自由以下抗體組成的組嵌合抗體，親和力成熟的抗體(affinitymaturedantibody),人源化抗體和人抗體。在一些實(shí)施方式中，抗體是抗體片段。在一些實(shí)施方式中，抗體是Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)ab'-SH,F(ab')2或者scFv。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體是嵌合抗體，例如，包括從非人供體移植到異源的非人、人或者人源化序列(例如，骨架和/或恒定區(qū)序列)的抗原結(jié)合序列的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，非人供體是小鼠。在一個(gè)實(shí)施方式中，抗原結(jié)合序列是合成的，例如通過誘變獲得(例如，噬菌體展示篩選，等等)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的嵌合抗體具有小鼠V區(qū)和人C區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠輕鏈V區(qū)被融合到人kappa輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方式中，小鼠重鏈V區(qū)被融合到人IgGlC區(qū)。本發(fā)明的人源化抗體包括在FR中有氨基酸取代的抗體和移植的CDR中有變化的親和成熟變異體。CDR或者FR中取代的氨基酸不限于存在于供體或者受體抗體中的那些。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體還包括Fc區(qū)氨基酸殘基的變化，這導(dǎo)致提高的效應(yīng)器功能包括增強(qiáng)的CDC和/或ADCC功能和B在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體還包括Fc區(qū)氨基酸殘基的變化，這導(dǎo)致降低的效應(yīng)器功能，例如降低的CDC和/或ADCC功能和/或降低的B細(xì)胞殺傷。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體的特征為與人補(bǔ)體因子Clq和/或天然殺傷(NK)細(xì)胞上人Fc受體減弱的結(jié)合(例如結(jié)合的缺失)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體的特征為與人FcyRI,FcyRIIA和/或FcYRinA減弱的結(jié)合(例如結(jié)合的缺失)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體屬于IgG型(例如，IgGl或者IgG4)，并在E233,L234，G236,D265，D270,N297,E318,K320，K322，A327,A330，P331和/或P329(根據(jù)EU索引編號(hào))中包括至少1個(gè)突變。在一些實(shí)施方式中，抗體包括突變L234A/L235A或者D265A/N297A。一方面，本發(fā)明提供抗OX40L多肽，所述多肽包括此處列出的任意一個(gè)抗原結(jié)合序列，其中抗OX40L多肽特異結(jié)合OX40L。一方面，本發(fā)明提供一種免疫偶聯(lián)物(可以互換稱為"抗體藥物偶聯(lián)物，，或者"ADC")，所述免疫偶聯(lián)物包括此處公開的任意一種抗OX40L抗體與試劑，例如藥物的偶聯(lián)。本發(fā)明的抗體結(jié)合(在一些實(shí)施方式中，特異結(jié)合)OX40L,并且在一些實(shí)施方式中，可以調(diào)節(jié)與OX40L相關(guān)作用的一個(gè)或者多個(gè)方面，包括但不限于OX40L活化，OX40L下游分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，OX40受體活化，OX40受體下游分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，OX40受體結(jié)合OX40L的破壞，OX40L多聚化，和/或任意生物學(xué)相關(guān)的OX40L和/或OX40受體生物學(xué)途徑的破壞，和/或免疫病癥(例如哮喘，特應(yīng)性皮炎，過敏性鼻炎，炎癥性腸病，多發(fā)性硬化，移植物抗宿主疾病(GVHD)和/或系統(tǒng)性紅斑狼皰)的治療或者預(yù)防；和/或與OX40L表達(dá)和/或活性(例如增加的OX40L表達(dá)和/或活性)相關(guān)的病癥的治療或者預(yù)防。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體特異結(jié)合OX40L。在一些實(shí)施方式中，抗體特異結(jié)合OX40L的OX40受體結(jié)合區(qū)。在一些實(shí)施方式中，分離的抗體結(jié)合這樣的多肽，所述多肽包含人OX40L胞外結(jié)構(gòu)域，由人OX40L胞外結(jié)構(gòu)域組成或者基本上由人OX40L胞外結(jié)構(gòu)域組成。在一些實(shí)施方式中，抗體特異結(jié)合OX40L，其Kd為大約lnM或者結(jié)合力更強(qiáng)。在一些實(shí)施方式中，抗體特異結(jié)合OX40L，其Kd為大約10nM或者結(jié)合力更強(qiáng)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體在體內(nèi)和/或體外降低、抑制和/或阻斷OX40L活性。在一些實(shí)施方式中，抗體與OX40L竟?fàn)幗Y(jié)合OX40受體(減少和/或阻斷OX40受體結(jié)合OX40L)。一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于病癥的治療性和/或預(yù)防性治療，所述病癥例如免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，所述病癥是自身免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，所述病癥是哮喘，特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis),過敏性鼻炎，炎癥性腸病，多發(fā)性硬化，GVHD和/或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。在一些實(shí)施方式中，所述病癥是與病毒、細(xì)菌或者其它感染源相關(guān)的疾病，例如病毒誘導(dǎo)的免疫病理狀況，例如，流感病毒或者RSV或者相關(guān)病毒感染誘導(dǎo)的病理狀況，例如，肺部的疾病。一般參見US2005/0069548Al。在有些實(shí)施方案中，所述病癥是關(guān)節(jié)炎(急性的和慢性的，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，包括幼發(fā)型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(juvenile-onsetrheumatoidarthritis)和關(guān)節(jié)炎的各個(gè)階^殳諸如類風(fēng)濕性滑膜炎、痛風(fēng)或痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性免疫性關(guān)節(jié)炎、慢性炎性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、II型膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、萊姆(Lyme)關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、斯提耳氏(stm)病、脊推關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎、變形性關(guān)節(jié)炎、慢性原發(fā)性多關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、絕經(jīng)期關(guān)節(jié)炎、雌激素消減性關(guān)節(jié)炎、和強(qiáng)直性脊柱炎/類風(fēng)濕性脊推炎)，自身免疫性淋巴細(xì)胞增生性疾病，炎性過度增殖性皮膚病，銀屑病諸如斑塊狀銀屑病、滴狀銀屑病、膿皰性銀屑病和指曱銀屑病，特應(yīng)性包括特應(yīng)性疾病諸如干草熱和喬布氏(Job)綜合征，皮炎包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、剝脫性皮炎、變應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、蕁麻滲、皰滲樣皮炎、錢幣狀皮炎、脂溢性皮炎、非特異性皮炎、原發(fā)性刺激性接觸性皮炎和特應(yīng)性皮炎，X連鎖的高IgM綜合征，變應(yīng)性眼內(nèi)炎性疾病，蕁麻滲諸如慢性變應(yīng)性蕁麻滲和慢性特發(fā)性蕁麻滲(包拾漫性自身免疫性蕁麻滲)，肌炎，多肌炎/皮肌炎，青少年型皮肌炎，中毒性表皮壞死松解癥，硬皮病(包括系統(tǒng)性硬皮病)，硬化諸如系統(tǒng)性硬化、多發(fā)性硬化(MS)諸如脊髓-眼(spino-optical)MS、原發(fā)性進(jìn)行性MS(PPMS)和復(fù)發(fā)性消退性(relapsingremitting)MS(RRMS)、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化、動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)脈硬化、播散性硬化、共濟(jì)失調(diào)性(ataxic)硬化，視神經(jīng)脊髓炎(NMO)，炎癥性腸病(IBD)(例如克羅恩氏(Crohn)病、自身免疫介導(dǎo)的胃腸病、胃腸炎癥、結(jié)腸炎諸如潰瘍性結(jié)腸炎(colitisulcerosa),微觀結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉狀結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和透壁性結(jié)腸炎、和自身免疫性炎癥性腸病)，腸炎，壞疽性膿皮癥，結(jié)節(jié)性紅斑，原發(fā)性硬化性膽管炎，呼吸窘迫綜合征包括成人型或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),腦膜炎，整個(gè)或部分葡萄膜的炎癥，虹膜炎，脈絡(luò)膜炎，自身免疫性血液學(xué)病癥，移植物抗宿主疾病，血管性水腫諸如遺傳性血管性水腫，腦神經(jīng)損傷像腦膜炎中的，妊娠皰滲，妊娠性類天皰瘡，陰嚢瘙癬(pruritisscroti),自身免疫性早熟性卵巢衰竭，因自身免疫性疾患引起的突發(fā)性聽覺喪失，IgE介導(dǎo)的疾病諸如過敏反應(yīng)和變應(yīng)性和特應(yīng)性鼻炎，腦炎諸如拉斯默森氏(Rasmussen)腦炎和邊緣系和/或腦干腦炎，葡萄膜炎(諸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和沒有腎病綜合征的腎小球腎炎(GN)諸如慢性或急性腎小球腎炎諸如原發(fā)性GN、免疫介導(dǎo)的GN、膜性GN(膜性腎病)、特發(fā)性膜性GN或特發(fā)性膜性腎病、膜增殖性或膜性增殖性GN(MPGN)(包括I型和II型)、和急進(jìn)性GN(RPGN)，增殖性腎炎，自身免疫性多腺體內(nèi)分泌衰竭，龜頭炎包括漿細(xì)胞性局限性龜頭炎，龜頭包皮炎，離心性環(huán)狀紅斑，持久性色素異常性紅斑，多形性紅斑，環(huán)狀肉芽腫，光澤苔蘚，硬化萎縮性苔蘚，慢性單純苔蘚，小棘苔蘚，扁平苔蘚，片層狀魚鱗癬，表皮松解性角化過度，惡變前角化，壞疽性膿皮癥，變應(yīng)性疾患和應(yīng)答，食物過敏，藥物過敏，昆蟲過敏，罕見的過敏性病癥諸如肥大細(xì)胞增生病，過敏反應(yīng)，濕滲包括變應(yīng)性或特應(yīng)性濕滲、干性濕滲、汗皰和水泡性掌跖濕滲(vesicularpalmoplantareczema),哮喘諸如支氣管哞喘(asthmabronchiale)，自身免疫性哮喘，變應(yīng)性哮喘，和兒科哮喘，涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎性應(yīng)答的疾患，針對(duì)外來抗原諸如妊娠期間胎兒A-B-O血型的免疫反應(yīng)，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白細(xì)胞粘附缺陷，狼癡包括狼癡腎炎、狼瘡腦炎、兒科狼瘡、非腎狼瘡、腎外狼瘉、盤狀狼瘙和盤狀紅斑狼瘡、狼瘡脫發(fā)、SLE(諸如皮膚SLE或亞急性皮膚SLE)、新生兒狼痦綜合征(NLE)、和播散性紅斑狼瘡，幼發(fā)型(I型)糖尿病包括兒科IDDM，成人期發(fā)作的糖尿病(II型糖尿病)，自身免疫性糖尿病，特發(fā)性尿崩癥，糖尿病視網(wǎng)膜病變，糖尿病腎病，糖尿病結(jié)腸炎，糖尿病大動(dòng)脈病癥，與細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答，結(jié)核病，結(jié)節(jié)病，肉芽腫病包括淋巴瘤樣肉芽胂病、韋格納氏(Wegener)肉芽肺病，粒細(xì)胞缺乏，血管炎病包括血管炎、大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(高安氏(Takayasu))動(dòng)脈炎)、中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎/結(jié)節(jié)性動(dòng)脈周圍炎)、微觀多動(dòng)脈炎、免疫血管炎、CNS血管炎、皮膚性血管炎、超敏感性血管炎、壞死性血管炎(諸如系統(tǒng)性壞死性血管炎)、和ANCA相關(guān)血管炎諸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或綜合征(CSS)和ANCA相關(guān)小血管血管炎，顳動(dòng)脈炎，再生障礙性貧血，自身免疫性再生障礙性貧血，庫姆斯(Coombs)陽性貧血，戴-布二氏(DiamondBlackfan)貧血，溶血性貧血或免疫性溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA),惡性貧血(anemiaperniciosa),阿狄森氏(Addison)病，單純紅細(xì)胞性貧血或再生障礙(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A,自身免疫性嗜中性粒細(xì)胞減少癥，細(xì)胞減少癥諸如全血細(xì)胞減少癥，白細(xì)胞減少癥，涉及白細(xì)胞滲出的疾病，CNS炎性病癥，阿耳茨海默氏(Alzheimer)病，帕金森氏(Parkinson)病，多器官損傷綜合征諸如那些膿毒癥、外傷或出血繼發(fā)的，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基底膜病，抗磷脂抗體綜合征，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)炎，變應(yīng)性神經(jīng)炎，貝切特氏(Beh9et)病/綜合征，卡斯?fàn)柭?Castleman)綜合征，古德帕斯丘氏(Goodpasture)綜合征，雷諾氏(Reynaud)綜合征，斯耶格倫氏(Sj6gren)綜合征，史-約二氏(Stevens-Johnson)綜合征，類天皰瘡諸如大皰性類天皰瘡和皮膚類天皰瘡，天皰瘡包括尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、粘膜類天皰掩型天皰齊和紅斑性天皰瘡，自身免疫性多內(nèi)分泌病，萊特氏(Reiter)病或綜合征，由自身免疫性疾患引起的熱傷，先兆子癇，免疫復(fù)合物病癥諸如免疫復(fù)合物腎炎，抗體介導(dǎo)的腎炎，神經(jīng)炎性病癥，多神經(jīng)病，慢性神經(jīng)病諸如IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病，血小板減少癥(例如心肌梗死患者發(fā)生的)包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、輸血后紫癜(PTP)、肝素誘發(fā)的血小板減少癥、和自身免疫或免疫介導(dǎo)的血小板減少癥(包括例如特發(fā)性血小板減少性紫瘕(ITP)包括慢性或急性ITP),鞏膜炎諸如特發(fā)性角膜-鞏膜炎、鞏膜外層炎，睪丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎，原發(fā)性曱狀腺功能減退癥，曱狀旁腺功能減退，自身免疫性內(nèi)分泌病包括曱狀腺炎(諸如自身免疫性曱狀腺炎、橋本氏(Hashimoto)病、慢性曱狀腺炎(橋本氏(Hashimoto)曱狀腺炎)或亞急性曱狀腺炎)、自身免疫性甲狀腺病、特發(fā)性曱狀腺功能減退癥、格雷夫斯氏(Graves)病，多腺性綜合征諸如自身免疫性多腺體綜合征例如I型(或多腺性內(nèi)分泌病綜合征)，瘤外綜合征包括神經(jīng)學(xué)瘤外綜合征諸如蘭伯特-伊頓(Lambert-Eaton)肌無力綜合征或伊頓-蘭伯特(Lambert-Eaton)綜合征，僵體或僵人綜合征，腦脊髓炎諸如變應(yīng)性腦脊髓炎(encephalomyelitisallergica)和實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE),重癥肌無力諸如胸腺瘤相關(guān)重癥肌無力，小腦變性，神經(jīng)性肌強(qiáng)直，視性眼陣攣或視性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS),和感覺神經(jīng)病，多病灶運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病，席漢氏(Sheehan)綜合征，自身免疫性肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細(xì)胞性肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎或自身免疫性慢性活動(dòng)性肝炎，肺炎諸如淋巴樣間質(zhì)性肺炎(LIP)，梗阻性細(xì)支氣管炎(非移植物)對(duì)NSIP，格-巴二氏(Guillain-Barr6)綜合征，貝格爾氏(Berger)病(IgA腎病)，特發(fā)性IgA腎病，線性IgA皮膚病，急性熱性嗜中性白細(xì)胞皮膚病，角質(zhì)層下膿皰皮膚病，一過性棘層松解性皮膚病，硬化諸如原發(fā)性膽汁性肝硬化和肺硬變，自身免疫性腸病綜合征，乳糜瀉，腹腔或腹部疾病，口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病)，頑固性口炎性腹瀉，特發(fā)性口炎性腹瀉，冷球蛋白血癥諸如混合型冷球蛋白血癥、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)(盧格里克氏(LouGehrig)病)，冠狀動(dòng)脈病，自身免疫性耳病諸如自身免疫性內(nèi)耳病(AIED)、自身免疫性聽覺喪失，多軟骨炎諸如頑固性或復(fù)發(fā)的或復(fù)發(fā)性多軟骨炎，肺泡蛋白沉著癥，寇甘氏(Cogan)綜合征/非梅毒性間質(zhì)性角膜炎，貝耳氏(Bell)麻痹，斯威特氏(Sweet)病/綜合征，自身免疫性酒糟鼻，帶狀皰滲相關(guān)疼痛，淀粉樣變，非癌性淋巴細(xì)胞增多，原發(fā)性淋巴細(xì)胞增多包括單克隆B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多(例如良性單克隆丙種球蛋白病和性質(zhì)未確定的單克隆丙種球蛋白病(MGUS))，周圍神經(jīng)病，瘤外綜合征，通道病諸如癲癇、偏頭痛、心率失常、肌肉病癥、失聰、失明、周期性癱瘓和CNS的通道病，孤獨(dú)癥，炎性肌病，局灶性或節(jié)段性或局灶性節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)，內(nèi)分泌性眼病，葡萄膜視網(wǎng)膜炎，脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎，自身免疫性肝臟病學(xué)病癥，纖維肌痛，多發(fā)性內(nèi)分泌衰竭，施密特氏(Schmidt)綜合征，腎上腺炎，胃萎縮，早老性癡呆，脫髓鞘病諸如自身免疫性脫髓鞘病和慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病，德雷斯勒氏(Dressler)綜合征，斑禿，全禿，CREST綜合征(鈣質(zhì)沉著癥、雷諾氏(Raynaud)現(xiàn)象、食道運(yùn)動(dòng)功能障礙、指端硬化和毛細(xì)管擴(kuò)張)，男性和女性自身免疫性不孕不育例如由于抗精蟲抗體的，混合性結(jié)締組織病，恰加斯氏(Chagas)病，風(fēng)濕熱，習(xí)慣性流產(chǎn)，農(nóng)民肺，多形紅斑，心臟切開術(shù)后綜合征，柯興氏(Cushing)綜合征，養(yǎng)鳥者肺，變應(yīng)性肉芽腫性血管炎，良性淋巴細(xì)胞性血管炎，阿爾波特氏(Alport)綜合征，肺泡炎諸如變應(yīng)性肺泡炎和纖維化肺泡炎，間質(zhì)性肺病，輸血反應(yīng)，麻風(fēng)，癡疾，寄生蟲病諸如利什曼病、錐蟲病(kypanosomiasis)、血吸蟲病、蛔蟲病，曲霉病，Sampter氏綜合征，卡普蘭氏(Caplan)綜合征，登革，心內(nèi)膜炎，心內(nèi)膜心肌纖維化，彌漫性肺間質(zhì)纖維化，間質(zhì)性肺纖維化，纖維性縱隔炎，肺纖維化，特發(fā)性肺纖維化，嚢性纖維化，眼內(nèi)炎，持久隆起性紅斑，胎兒成紅細(xì)胞增多癥，嗜曙紅細(xì)胞性筋膜炎(faciitis)、舒爾曼氏(Shulman)綜合征，費(fèi)爾提氏(Felty)綜合征，flariasis，睫狀體炎諸如慢性睫狀體炎、異時(shí)性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎(急性或慢性)、或Fuch氏睫狀體炎，亨諾-許蘭二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，SCID,獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS),艾柯病毒感染，膿毒癥(系統(tǒng)性炎性應(yīng)答綜合征(SIRS))，內(nèi)毒素血癥，胰腺炎，曱狀腺毒癥(thyroxicosis),細(xì)小病毒感染，風(fēng)滲病毒感染，種痘后綜合征，先天性風(fēng)滲感染，愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒感染，腮腺炎，埃文斯(Evans)綜合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病，鏈球菌后腎炎，閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)，曱狀腺毒癥，脊髓癆，脈絡(luò)膜炎，巨細(xì)胞性多肌痛，慢性超敏感性肺炎，結(jié)膜炎，諸如春季卡他、干燥性角膜結(jié)膜炎、和流行性角膜結(jié)膜炎，特發(fā)性腎炎綜合征，微小病變腎病，良性家族性和缺血-再灌注損傷，移植器官再灌注，視網(wǎng)膜自身免疫，關(guān)節(jié)炎癥，支氣管炎，慢性阻塞性氣道/肺部疾病，硅沉著病，口瘉，口皰性口炎，動(dòng)脈硬化性病癥(大腦血管功能不全)諸如動(dòng)脈^更化性腦病和動(dòng)脈硬化性^見網(wǎng)膜病，無精子發(fā)生(aspermiogenese)，自身免疫性溶血，伯克氏(Boeck)病，冷球蛋白血癥，杜普伊特倫氏(Dupuytren)攣縮，晶體過敏性眼內(nèi)炎(endophthalmiaphacoanaphylactica),變應(yīng)性小腸炎(enteritisallergica),麻風(fēng)節(jié)結(jié)性紅斑，特發(fā)性面癱，慢性疲乏綜合征，風(fēng)濕熱(febrisrheumatica),哈-里二氏(Hamman-Rich)病，感覺神經(jīng)性聽覺喪失，陣發(fā)性血紅蛋白尿(haemoglobinuriaparoxysmatica),'l"生&泉功能;咸退，局卩艮寸生回腸炎(ileitisregionalis)，白細(xì)胞減少癥，傳染性單核細(xì)胞增多癥，橫貫性(traverse)脊髓炎，原發(fā)性特發(fā)性粘液水腫，腎病，交感性眼炎(ophthalmiasymphatica)，肉芽腫性睪丸炎(orchitisgranulomatosa)，胰腺炎，急性多神經(jīng)根炎，壞疽性膿皮癥，奎爾萬氏(Quervain)曱狀腺炎，獲得性脾萎縮，非惡性胸腺瘤，淋巴濾泡性胸腺炎，白癜風(fēng)，中毒性休克綜合征，食物中毒，涉及T細(xì)胞浸潤的疾患，白細(xì)胞粘附缺陷，與細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答，涉及白細(xì)胞滲出的疾病，多器官損傷綜合征，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基底膜病，自身免疫性多內(nèi)分泌病，卵巢炎，原發(fā)性粘液水腫，自身免疫性萎縮性胃炎，交感性眼炎，風(fēng)濕病，混合性結(jié)締組織病，腎病綜合征，胰島炎，多內(nèi)分泌衰竭，自身免疫性多腺性綜合征，包括多腺性綜合征I型，成人期發(fā)作的特發(fā)性曱狀旁腺功能減退(AOIH),心肌病諸如擴(kuò)張型心肌病，獲得性大皰性表皮松解(epidermolisisbullosaacquisita,EBA)，血色素沉著，心肌炎，腎病綜合征，原發(fā)性硬化性膽管炎，化膿性或非化膿性鼻竇炎，急性或慢性鼻竇炎，篩竇炎，額竇炎，上頜竇炎或蝶竇炎，變應(yīng)性鼻竇炎，嗜曙紅細(xì)胞相關(guān)病癥諸如嗜曙紅細(xì)胞增多癥、肺嗜曙紅細(xì)胞增多性浸潤、嗜曙紅細(xì)胞增多-肌痛綜合征、呂弗勒氏(Loffler)綜合征、慢性嗜曙紅細(xì)胞性肺炎、熱帶肺嗜曙紅細(xì)胞增多、支氣管肺曲霉病、曲霉腫、或含有嗜曙紅細(xì)胞的肉芽腫，過敏反應(yīng)，脊推關(guān)節(jié)病，血清陰性脊堆關(guān)節(jié)炎病，多內(nèi)分泌自身免疫病，硬化性膽管炎，鞏膜、鞏膜外層、慢性粘膜皮膚假絲酵母病，布魯頓氏(Bruton)綜合征，嬰兒期一過性低丙種球蛋白血癥，威斯科特-奧爾德里齊(Wiskott-Aldrich)綜合征，共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)管擴(kuò)張綜合征，血管擴(kuò)張，與以下各項(xiàng)有關(guān)的自身免疫性病癥膠原病、風(fēng)濕病諸如慢性關(guān)節(jié)風(fēng)濕病、淋巴結(jié)炎、血壓應(yīng)答降低(reductioninbloodpressureresponse)、血管功能障礙、組織損傷、心血管缺血、痛覺過敏、腎缺血、腦缺血和伴隨血管化的疾病，變應(yīng)性超敏感性病癥，腎小J求腎炎病，再灌注損傷，缺血再灌注病癥，心肌或其它組織的再灌注損傷，淋巴瘤氣管支氣管炎，炎性皮膚病，具有急性炎性成分的皮膚病，多器官衰竭，大皰病，腎皮質(zhì)壞死，急性化膿性腦膜炎或其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性病癥，眼和眶炎性病癥，粒細(xì)胞輸血相關(guān)綜合征，細(xì)胞因子誘發(fā)的中毒，發(fā)作性睡病，急性重度炎癥，慢性頑固性炎癥，腎盂炎，動(dòng)脈內(nèi)增生，消化性潰瘍，心瓣炎，和子宮內(nèi)膜異位癥。其它例子(在有些情況中，涵蓋上文所列的)包括但不限于自身免疫性風(fēng)濕病學(xué)病癥(諸如例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、斯耶格倫氏綜合征、硬皮病、狼瘡諸如SLE和狼齊腎炎、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血癥、抗磷脂抗體綜合征、和銀屑病關(guān)節(jié)炎)、自身免疫性胃腸和肝病癥(諸如例如炎癥性腸病(例如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病)、自身免疫性胃炎和惡性貧血、自身免疫性肝炎.原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎)、血管炎(諸如例如ANCA相關(guān)血管炎，包括丘-施二氏血管炎、韋格納氏肉芽胂病、和多動(dòng)脈炎)、自身免疫性神經(jīng)學(xué)病癥(諸如例如多發(fā)性硬化、視性眼陣攣-肌陣攣綜合征、重癥肌無力、視神經(jīng)脊髓炎、帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、和自身免疫性多神經(jīng)病)、腎病癥(諸如例如腎小球腎炎、古德帕斯丘氏綜合征、和貝格爾氏病)、自身免疫性皮膚病學(xué)病癥(諸如例如銀屑病、蕁麻滲(urticaria，hives)、尋常型天皰痦、大皰性類天皰癡、和皮膚紅斑狼掩)、血液病學(xué)病癥(諸如例如血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、輸血后紫癜、和自身免疫性溶血性貧血)、動(dòng)脈粥樣硬化、葡萄膜炎、自身免疫性聽力病(諸如例如內(nèi)耳病和聽力喪失)、貝切特氏病、雷諾氏綜合征、器官移植、GVHD、和自身免疫性內(nèi)分泌病癥(諸如例如糖尿病相關(guān)自身免疫病諸如胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病、和自身免疫性曱狀腺病(例如格雷夫斯氏病和曱狀腺炎))。一方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的一種或者多種抗體和載體的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體是藥學(xué)上可接受的。一方面，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明抗OX40L抗體的核酸。一方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明核酸的載體。一方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的一種或者多種核酸和載體的組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體是藥學(xué)上可接受的。一方面，本發(fā)明提供包括本發(fā)明核酸或者載體的宿主細(xì)胞。載體可以是任意類型，例如重組載體例如表達(dá)載體?？梢允褂酶鞣N宿主細(xì)胞中的任意一種。在一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如，大腸桿菌。在一個(gè)實(shí)施方式中，宿主細(xì)月包是真核細(xì)^^例如哺乳動(dòng)物細(xì)^^例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。一方面，本發(fā)明提供制備本發(fā)明抗體的方法。例如，本發(fā)明提供制備抗OX40L抗體(所述抗體此處定義為包括其全長(zhǎng)和片段)的方法，所述方法包括在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述抗體的本發(fā)明重組載體，并回收所述抗體。一方面，本發(fā)明提供一種包括容器的制品；和包含在容器中的組合物，其中組合物包括本發(fā)明的一種或者多種抗OX40L抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物包括本發(fā)明的核酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含抗體的組合物還包括載體，所述載體在一些實(shí)施方式中是藥學(xué)上可接受的。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的制品還包括用于給患者施用組合物(例如，抗體)的說明書(例如用于此處描述的任意一種方法的說明書)。一方面，本發(fā)明提供一種包括第一容器和第二容器的試劑盒，所述第一容器包括包含本發(fā)明一種或者多種抗OX40L抗體的組合物，所述第二容器包含緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方式中，緩沖液是藥學(xué)上可接受的。在一個(gè)實(shí)施方式中，包括抗體的組合物還包括載體，所述載體在一些實(shí)施方式中是藥學(xué)上可接受的。在一個(gè)實(shí)施方式中，試劑盒還包括用于給患者施用組合物(例如，抗體)的說明書。一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗OX40L抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于病癥的治療性和/或預(yù)防性治療，所述病癥例如免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，病癥是自身免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，病癥是哮喘，特應(yīng)性皮炎，過敏性鼻炎，炎癥性腸病，多發(fā)性硬化，GVHD和/或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的核酸在制備藥物中的用途，所述藥物用于病癥的治療性和/或預(yù)防性治療，所述病癥例如免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，病癥是自身免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，病癥是哮喘，特應(yīng)性皮炎，過敏性鼻炎，炎癥性腸病，多發(fā)性硬化，GVHD和/或系統(tǒng)性紅斑狼齊。一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的表達(dá)載體在制備藥物中的用途，所述藥物用于病癥的治療性和/或預(yù)防性治療，所述病癥例如免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，病癥是自身免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，病癥是譯喘，特應(yīng)性皮炎，過敏性鼻炎，炎癥性腸病，多發(fā)性硬化，GVHD和/或系統(tǒng)性紅斑狼療。一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的宿主細(xì)胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于病癥的治療性和/或預(yù)防性治療，所述病癥例如免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，病癥是自身免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，病癥是哮喘，特應(yīng)性皮炎，過敏性鼻炎，炎癥性腸病，多發(fā)性硬化，GVHD和/或系統(tǒng)性紅斑狼癡。一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的制品在制備藥物中的用途，所述藥物用于病癥的治療性和/或預(yù)防性治療，所述病癥例如免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，病癥是自身免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，病癥是哞喘，特應(yīng)性皮炎，過敏性鼻炎，炎癥性腸病，多發(fā)性硬化，GVHD和/或系統(tǒng)性紅斑狼瘙。一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的試劑盒在制備藥物中的用途，所述藥物用于病癥的治療性和/或預(yù)防性治療，所述病癥例如免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，病癥是自身免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，病癥是哞喘，特應(yīng)性皮炎，過敏性鼻炎，炎癥性腸病，多發(fā)性硬化，GVDH和/或系統(tǒng)性紅斑狼^。和組合物，所述疾病狀態(tài)例如與增加的表達(dá)和/或活性或者不希望的表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病狀態(tài)。本發(fā)明的方法可作用于任意合適的病理狀態(tài)。示范性的病癥在本文中描述，包4舌免疫病癥。本發(fā)明的方法還包括額外治療步驟。一方面，本發(fā)明提供包括給藥有效量的抗OX40L抗體以及有效量的另一種治療劑的方法。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括另外的步驟，其中靶細(xì)胞和/或組織接受類固醇處理?？筄X40L抗體可以與另一種治療劑在同一組合物或者分離的組合物中順序或者共同給藥，所述治療劑對(duì)那些目的是有效的?？筄X40L抗體和另外的治療劑的給藥可以同時(shí)進(jìn)行，例如，作為單一組合物或者作為兩種或更多種不同的組合物，利用相同的或者不同的給藥途經(jīng)?？蛇x地，或者另外，給藥可以采用任何順序連續(xù)進(jìn)行?？蛇x地，或者另外，可以采用任意次序順序組合給藥或同時(shí)組合進(jìn)行給藥。在某些實(shí)施方式中，兩種或更多種組合物給藥之間可以存在從數(shù)分鐘到數(shù)天、數(shù)周到數(shù)月的間隔。例如，可以首先給藥另一種治療劑，然后給藥抗OX40L抗體。但是，還希望同時(shí)給藥抗OX40L抗體或者首先給藥抗OX40L抗體。在某些實(shí)施方式中，兩種或更多種組合物給藥之間可以存在從數(shù)分鐘到數(shù)天、數(shù)周到數(shù)月的間隔。另一方面，本發(fā)明提供用于OX40L檢測(cè)的方法，該方法包括檢測(cè)樣品中的OX40L-抗OX40L抗體復(fù)合物。本文使用的術(shù)語"檢測(cè)，，包括參考對(duì)照或者不參考對(duì)照的定性和/或定量^r測(cè)(測(cè)量水平)。該方法包括檢測(cè)生物樣品中的OX40L-抗OX40L抗體復(fù)合物，所述生物樣品來自患有或者懷疑患有所述病癥的患者。在一些實(shí)施方式中，OX40L表達(dá)是增加的表達(dá)或者異常的表達(dá)。在一些實(shí)施方式中，所述病癥是免疫病癥。另一方面，本發(fā)明提供任意一種本文描述的抗OX40L抗體，其中抗OX40L抗體包括可檢測(cè)的標(biāo)記。另一方面，本發(fā)明提供本文描述的任意一種抗OX40L抗體和OX40L的復(fù)合物。在一些實(shí)施方式中，復(fù)合物是體內(nèi)或者體外的。在一些實(shí)施方式中，抗OX40L抗體被可檢測(cè)的標(biāo)記。附圖簡(jiǎn)述圖1A和1B:顯示小鼠抗人OX40L單克隆抗體8E12可變區(qū)的氨基酸序列。A,8E12輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:13)。B,8E12重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:15)。根據(jù)Kabat編號(hào)氨基酸。圖2A和2B:顯示小鼠抗人OX40L單克隆抗體13G5可變區(qū)的氨基酸序列。A，13G5輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:14)。B,13G5重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:16)。根據(jù)Kabat編號(hào)氨基酸。圖3:圖解顯示抗OX40L單克隆抗體8E12和13G5的給藥竟?fàn)幮砸种迫薕X40受體與人OX40L的結(jié)合。圖4:圖解顯示在基于細(xì)胞的測(cè)定中抗OX40L單克隆抗體8E12和13G5的給藥抑制T細(xì)胞增殖。圖5:圖解顯示抗OX50L單克隆抗體8E12和13G5的給藥抑制T記憶細(xì)胞的IL-2產(chǎn)生。圖6:圖解顯示抗OX40L單克隆抗體8E12和13G5的給藥抑制活化的T細(xì)胞的存活。發(fā)明詳述本發(fā)明此處提供抗OX40L抗體，其可用于，例如，與OX40L的表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病狀態(tài)的治療或者預(yù)防，所述疾病狀態(tài)例如與增加的表達(dá)和/或活性或者不希望的表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病狀態(tài)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體用于治療免疫病癥(例如哮喘，特應(yīng)性皮炎，過敏性鼻炎，炎癥性腸病，多發(fā)性硬化，GVHD和/或系統(tǒng)性紅斑狼齊)。另一方面，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的抗OX40L抗體可用作OX40L檢測(cè)和/或分離的試劑，例如OX40L在不同組織和細(xì)胞類型中的滯留。本發(fā)明還提供制備抗OX40L抗體、編碼抗OX40L抗體的多核苷酸和包含編碼抗OX40L抗體的多核苷酸的細(xì)胞的方法。通用技術(shù)本文中描述或提到的技術(shù)和規(guī)程一般得到了本領(lǐng)域技術(shù)人員的充分理解，而且通常是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)采用的，諸如例如以下文獻(xiàn)記載的廣泛應(yīng)用的方法Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual3rd.edition(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y,;CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel，etal.eds"(2003));叢書METHODSINENZYMOLOGY(AcademicPress,Inc.):PCR2:APRACTICALAPPROACH(M.J.MacPherson，B.D,HamesandG.R.Tayloreds.(1995))，HarlowandLane,eds.(1988)AN丁IBODffiS,ALABORATORYMANUAL,及ANIMALCELLCULTURE(R.I.Freshney,ed.(1987))。定義"分離的"抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指將會(huì)干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將抗體純化至(l)才艮據(jù)Lowry法的測(cè)定，抗體重量超過95%，最優(yōu)選重量超過99%,(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的>4-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選的銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個(gè)純化步驟來制備。"分離的"核酸分子指已經(jīng)鑒定且與抗體核酸的天然來源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時(shí)的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中時(shí)的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達(dá)該抗體的細(xì)胞中所包含的核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時(shí)。術(shù)語"依照Kabat的可變域殘基編號(hào)，，或"依照Kabat的氨基酸位置編號(hào)"及其變體4旨Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991)中的抗體編輯用于重鏈可變域或輕鏈可變域的編號(hào)系統(tǒng)。使用此編號(hào)系統(tǒng)，實(shí)際的線性氨基酸序列可包含較少或另外的氨基酸，對(duì)應(yīng)于可變域FR或CDR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照Kabat為殘基52a)及重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat為殘基82a、82b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號(hào)可通過將抗體序列與"標(biāo)準(zhǔn)"Kabat編號(hào)序列對(duì)比同源區(qū)來確定。"結(jié)合親和力"通常指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有說明，在用于本文時(shí)，"結(jié)合親和力，，指反映結(jié)合對(duì)的成員(例如抗體與抗原)之間l:l相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子X對(duì)其配偶體Y的親和力通常可用解離常數(shù)(Kd)來表述。親和力可通過本領(lǐng)域知道的常用方法來測(cè)量，包括本文中所描述的。低親和力抗體通常緩慢的結(jié)合抗原且趨于容易解離，而高親和力抗體通常更快速的結(jié)合抗原且趨于保持更長(zhǎng)時(shí)間的結(jié)合。本領(lǐng)域知道測(cè)量結(jié)合親和力的多種方法，其中任一種都可用于本發(fā)明的目的。下文描述了具體的示例性實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的"Kd"或"Kd值"是通過如下測(cè)定法所來測(cè)量的i^過在存在未標(biāo)記抗原的滴定系列的條件下，'用最小濃度的1251標(biāo)記抗原平衡，然后用抗Fab抗體包被的平板捕捉結(jié)合的抗原來測(cè)量Fab對(duì)抗原的溶液結(jié)合親和力(Chen,etal.,JMolBiol293:865-881(1999))。為了確定測(cè)定條件，用S0mM碳酸鈉(pH9.6)中的5嗎/ml捕捉用抗Fab抗體(CappelLabs)包被微量滴定板(Dynex)過夜，隨后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白在室溫(約23°0封閉2-5小時(shí)。在非吸附平板(Nunc^696M)中，將100pM或26pM[1251]-抗原與連續(xù)稀釋的目的Fab混合(例如與Prestaetal.，CancerRes.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗體，F(xiàn)ab-12的評(píng)估一致)。然后將目的Fab保溫過夜；不過，保溫可持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間(例如65個(gè)小時(shí))以保證達(dá)到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕捉板以進(jìn)行室溫保溫(例如l小時(shí))。然后除去溶液，并用含0.1%Tween-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150^1/孔閃爍液(MicroScint-20;Packard)，然后在Topcount伽馬計(jì)數(shù)器(Packard)上對(duì)平板計(jì)數(shù)10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結(jié)合之20%的濃度用于竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定法。依照另一實(shí)施方案，Kd或Kd值是通過表面等離振子共振測(cè)定法使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway，NJ)在25。C使用固定化抗原CM5芯片在約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)測(cè)量的。簡(jiǎn)而言之，依照供應(yīng)商的說明書用鹽酸N-乙基-N，-(3-二曱基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥BIAcoreInc.)。用10mM乙酸鈉pH4.8將抗原稀釋至5ng/ml(約0.2nM)，然后以5pl/分鐘的流速注入至獲得約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25。C以約25(il/分鐘的流速注入在含0.05%Tween-20的PBS(PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab(0.78nM至500nM)。使用簡(jiǎn)單一對(duì)一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcoreEvaluationSoftwareversion3.2)通過同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖計(jì)算結(jié)合速率(kon)和解離速率(koff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率koff/kon計(jì)算。參見例如Chen,Y,,etal.,JMolBiol293:865-881(1999)。如果根據(jù)上文表面等離振子共振測(cè)定法，結(jié)合速率超過106]^1S"，那么結(jié)合速率可使用熒光淬滅技術(shù)來測(cè)定，即根據(jù)分光計(jì)諸如配備了斷流裝置的分光光度計(jì)(astop-flow叫uippedspectrophometer)(AvivInstruments)或8000系歹寸SLM-Aminco分光光度計(jì)(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測(cè)量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測(cè)量PBS,pH7.2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25。C的焚光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)-295nm;發(fā)射-340nm，16nm帶通)的升高或降低。依照本發(fā)明的"結(jié)合速率，，(on-rate，rateofassociation,associationrate)或"k。n"也可通過上文所述相同的表面等離振子共振技術(shù)使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25。C使用固定化抗原CM5芯片在約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)來測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，依照供應(yīng)商的說明書用鹽酸N-乙基-N，-(3-二曱基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧曱基化右旋糖苦生物傳感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)。用10mM乙酸鈉pH4.8將抗原稀釋至5pg/ml(約0.2ioM)，然后以5pl/分鐘的流速注入至獲得約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25。C以約25nl/分鐘的流速注入在含0.050/0Tween-20的PBS(PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab(0.78nM至500nM)。使用簡(jiǎn)單一對(duì)一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合才莫型(BIAcoreEvaluationSoftwareversion3.2)通過同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖計(jì)算結(jié)合速率(k。n)和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率koff/k。n計(jì)算。參見例如Chen,Y"etal.，JMolBiol293:865-881(1999)。然而，如果根據(jù)上文表面等離振子共振測(cè)定法，結(jié)合速率超過106M"S-',那么結(jié)合速率優(yōu)選使用熒光淬滅技術(shù)來測(cè)定，即根據(jù)分光計(jì)諸如配備了斷流裝置的分光光度計(jì)(AvivInstruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度計(jì)(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測(cè)量，在存在濃度漸增的抗原的條件下，測(cè)量PBS，pH7.2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25。C的熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)二295nm;發(fā)射-340nm，16nm帶通)的升高或降低。術(shù)語"載體"在用于本文時(shí)意指能夠運(yùn)輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類載體是"質(zhì)粒"，指其中可連接另外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是噬菌體載體。另一類載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能夠在其所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)可在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì)胞的基因組中，由此隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的基因表達(dá)。此類載體在本文中稱為"重組表達(dá)載體，，(或筒稱為"重組載體，，)。通常，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體常常是質(zhì)粒形式。在本說明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式。"多核苷酸"或"核酸"在本文中可互換使用，指任何長(zhǎng)度的核苦酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苦酸、經(jīng)過修飾的核香酸或堿基、和/或其類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)過修飾的核苷酸，諸如曱基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在裝配聚合物之前或之后進(jìn)行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在合成后進(jìn)一步修飾，諸如通過與標(biāo)記物偶聯(lián)。其它類型的修飾包括例如"帽"，將一個(gè)或多個(gè)天然存在的核芬酸用類似物替代，核苦酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接(例如膦酸曱酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基曱酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendantmoiety)諸如例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有烷化劑的修飾、具有經(jīng)修飾連接(例如a端基異構(gòu)核酸(anomericnucleicacid)等)的修飾、以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團(tuán)、磷酸(phosphate)基團(tuán)替換，用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或活化以制備與別的核苷酸的別的連接，或者可偶聯(lián)至固體和半固體支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20個(gè)碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)模塊取代。其它羥基也可衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸還可含有本領(lǐng)域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如2'-氧-曱基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物，a-端基異構(gòu)糖，差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物諸如曱基核糖核苷?？捎脗溥x連接基團(tuán)替換一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯連接。這些備選連接基團(tuán)包括但不限于以下實(shí)施方案，其中磷酸酯用P(O)S("硫代酸酯"(thioate))、P(S)S("二硫代酸酯"(dithioate))、(0)NR2("酰胺酯"(amidate))、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2("曱縮醛"(formacetal))替代，其中R或R'各自獨(dú)立為H或者取代或未取代的烷基(l-20個(gè)C)，任選含有醚(-O-)連接、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。"寡核苦酸，，在用于本文時(shí)一般指短的多核苷酸，一般是單鏈，一般是合成的，長(zhǎng)度一般但不是必需小于約200個(gè)核苷酸。術(shù)語"寡核苷酸"與"多核苷酸"并不互相排斥。上文關(guān)于多核苷酸的描述平等且完全適用于寡核苦酸。術(shù)語"OX40配體"(可互換的稱為"OX40L")，在用于本文時(shí)，除非另有明確說明或者上下文另有說明，指任何天然的或變異的(無論是天然的或合成的)OX40L多肽。術(shù)語"天然序列"明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式(例如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然存在的變異形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。術(shù)語"野生型OX40L，，一般指包含天然存在OX40L蛋白的氨基酸序列的多肽。術(shù)語"野生型OX40L序列"一般指在天然存在OX40L中找到的氨基酉M列。術(shù)語"OX40受體"(可互換的稱為"OX40")，在用于本文時(shí)，除非另有明確說明或者上下文另有說明，指任何天然的或變異的(無i侖是天然的或合成的)OX40多肽。術(shù)語"天然序列"明確涵蓋天然存在的截短或分泌形式(例如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然存在的變異形式(例如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。術(shù)語"野生型OX40"—般指包含天然存在OX40蛋白的氨基酸序列的多肽。術(shù)語"野生型OX40序列"一般指在天然存在OX40中找到的氨基酸序列。術(shù)語"抗體"和"免疫球蛋白"以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例如全長(zhǎng)或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價(jià)抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中更為詳細(xì)描述的)?？贵w可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的。術(shù)語"可變的，，指可變域中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每種特定抗體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段。可變域中較保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)FR,它們大多采取P-折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成P-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)CDR連接。每條鏈中的CDR通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的CDR—起促成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見Kabat&a/.,5^we"ceso/尸rafe/rao//mmw"o/og7.ca//"&res/，第5片反，NationalInstituteofHealth,Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞的(細(xì)胞)毒性中抗體的參與。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為"Fab"片段，各自具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，及一個(gè)剩余的"Fc，，片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個(gè)F(ab')2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原。"Fv"是包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，此區(qū)由緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv種類中，一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價(jià)相連，使得輕鏈和重鏈在與雙鏈Fv種類類似的"二聚體"結(jié)構(gòu)中相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中，各可變域的三個(gè)CDR相互作用而在VH-VL二聚體表面上確定了抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)CDR共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變域(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)CDR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對(duì)其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為在Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊推動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的"輕鏈"可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(dá)(人)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基s臾序列，免疫球蛋白可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作a、S、s、y和P。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。"抗體片段"只包含完整抗體的一部分，其中所述部分優(yōu)選保留該部分存在于完整抗體中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)、優(yōu)選大多數(shù)或所有功能?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如此保留結(jié)合抗原的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段，例如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體片段，保留通常與Fc區(qū)存在于完整抗體中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)生物學(xué)功能，諸如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)控、ADCC功能和補(bǔ)體結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段是體內(nèi)半衰期與完整抗體基本上相似的單價(jià)抗體。例如，這樣的抗體片段可包含一個(gè)抗原結(jié)合臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定性的Fc序列相連。術(shù)語"高變區(qū)"、"HVR"或"HV"在用于本文時(shí)指抗體可變域中序列上高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個(gè)高變區(qū)三個(gè)在VH中(Hl、H2、H3)，三個(gè)在VL中(Ll、L2、L3)。本文中使用且涵蓋許多高變區(qū)的敘述。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是以序列變異性為基礎(chǔ)的，而且是最常用的(Kabatefa/"5^we"ceso/尸ra&z7wo//附mwo/og/ca//"femst,5thEd,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(ChothiaandLesk,/Mo/.5/o/.196:901-917(1987))。AbM高變區(qū)代表KabatCDR與Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而且得到OxfordMolecular的AbM抗體建模軟件的使用。"接觸(contact)"高變區(qū)是以對(duì)可獲得的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為1^出的。高變區(qū)可包括如下"延伸的高變區(qū)"VL中的24-36(Ll)、46-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35(Hl)、47-66或49-66或50-66(H2)和93畫101或93-102(H3)。對(duì)于這些定義中的每一個(gè)，可變區(qū)殘基是依照Kabat等，見上文編號(hào)的。"框架，，或"FR"殘基指可變域中除本文中所定義的高變區(qū)殘基外的那些殘基。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下可變域，其中整個(gè)或基本上整個(gè)高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且整個(gè)或基本上整個(gè)FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見Jones^a/"淑匿321:522-525(1986);Riechmannefa/.，Atowre332:323-329(1988》Presta,CwtCjp.所o/.2:593-596(1992)。還可參見以下綜述及其引用的參考文獻(xiàn)VaswaniandHamilton,爿〃ergy'爿W/wzg<fe/www"o/.1:105-115(1998);Harris,5bc.7hmya"/o/w23:1035-1038(1995);HurleandGross,CwkOp.5/她c/z.5:428-433(1994)。"嵌合"抗體(免疫球蛋白)中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專矛jNo.4,816,567;Morrison"iV^/.Jcaa.5W.t/5^81:6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗體是嵌合抗體的一個(gè)子集。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的Vh和VJ吉構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。一般而言，scFv多肽在VH與Vt結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv能夠形成結(jié)合抗原所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Pluckthun,在RosenburgandMoore編的《772ej°/z<armaco/ogyo/Mcwoc/owa/」""6o力&》第113巻中，Springer-Verlag，NewYork,pp.269-315(1994)。"抗原，，指抗體可選擇性結(jié)合的預(yù)定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂質(zhì)、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。優(yōu)選的是，耙抗原是多肽。術(shù)語"雙抗體(diabody)"指具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VO。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)，迫使這些結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。雙抗體更完整的記載于例如EP404,097;WO93/11161;Hollinger等A^/.爿cad5W.90:6444-6448(1993)。"人抗體，，指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和/定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。"親和力成熟的"抗體指在抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR中具有一處或多處改變、導(dǎo)致該抗體對(duì)抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進(jìn)的抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將具有納摩爾或甚至皮摩爾量級(jí)的對(duì)靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體可通過本領(lǐng)域已知規(guī)程來生成。Marks"a/.,10:779-783(1992)記載了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進(jìn)行的親和力成熟。以下文獻(xiàn)記載了CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變Barbas"a/.，/Voc.A^f.^cad5W.t/SJ91:3809-3813(1994);SchierWa/.,Gewe169:147-155(1995);Yeltonda/.,J!/mmw"o/.155:1994-2004(1995);Jacksonaa/.，乂/www"o/.154(7):3310-9(1995);Hawkins"a/"J！Mo/.所o/.226:889-896(1992)?？贵w"效應(yīng)器功能"指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基斷列變體Fc區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)下調(diào)；和B細(xì)胞活化。"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"或"ADCC"指其中結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的把細(xì)胞，隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性形式。該抗體"武裝，，(arm)細(xì)胞毒性細(xì)胞，而且是此類殺傷作用絕對(duì)要求的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)Fc7Rin,而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、FcyRII和FcyRIII。RavetchandKinet,/4"ww.Zev.7Vwww"o/.9:457-92(1991)第464頁表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR^達(dá)。為了評(píng)估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體外ADCC測(cè)定法，諸如美國專利No.5,500,362或5,821，337或Presta美國專利No.6，737,056中所記載的?？捎糜诖祟悳y(cè)定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。或者/另外，可在體內(nèi)評(píng)估目的分子的ADCC活性，例如在動(dòng)物模型中，諸如Clynes"a/.，iWAS(77iS4)95:652-656(1998)中所披露的。"人效應(yīng)細(xì)胞"指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)FcyRffl并行使ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來源分離，例如血液。"Fc受體，，或"FcR"描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR(Y受體)，包括Fcr/RI、FcyRII和FcYRIII亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括Fc丫RIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體")，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中?；罨荏wFcyRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcYRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見綜述Dagron，Wev./wmw"o/.15:203-234(1997))。FcR的綜述參見RavetchandKinet，jw肌Tev./wmwwo/.9:457-492(1991);Capel"a/.,Immunomethods4:25-34(1994);deHaas&a/.，/丄W.C//".MW.126:330-41(1995)。術(shù)語"FcR，，在本文中涵蓋其它FcR，包括那些未來將會(huì)鑒定的。該術(shù)語還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn,它負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(GuyerWa/.，《//mmw"o/.117:587(1976)和Kim"a/.,//wrnwo/.24:249(1994))并調(diào)節(jié)免疫球蛋白的動(dòng)態(tài)平衡。WO00/42072(Presta)記載了對(duì)FcR的結(jié)合提高或降低的抗體變體。在此明確收入該專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見Shieldsa/.，歷o/.CTzem.9(2):6591-6604(2001)。測(cè)量對(duì)FcRn的結(jié)合的方法是已知的(參見例如Ghetie1997，Hinton2004)。可測(cè)定人FcRn高親和力結(jié)合多肽與人FcRn的體內(nèi)結(jié)合和血清半衰期，例如在表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠或經(jīng)轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞系中，或者在施用了Fc變體多肽的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中。"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性"或"CDC，，指存在補(bǔ)體時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的溶解。經(jīng)典補(bǔ)體途徑的激活是由補(bǔ)體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原所結(jié)合的抗體(適宜亞類的)起始的。為了評(píng)估補(bǔ)體激活，可進(jìn)行CDC測(cè)定法，例如如Gazzano-Santoroa/.，《7/wmimo/.MeAods202:163(1996)中所記載的。具有更改的Fc區(qū)氨基酸序列及提高或降低的Clq結(jié)合能力的多肽變體記載于美國專利No.6,194,551Bl和WO99/51642。在此明確收入那些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見Idusogieda/.，/mm腳/.164:4178-4184(2000)。"阻斷性"抗體或"拮抗性"抗體指抑制或降低其所結(jié)合的抗原的生物學(xué)活性。"病癥'，或"疾病"指任何會(huì)受益于本發(fā)明的物質(zhì)/分子或方法的治療的疾患。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括那些使哺乳動(dòng)物傾向于所討論病癥的病理狀況。本文中待治療的病癥的非限制性例子包括哮喘、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性鼻炎(allergicrhinitis)、炎癥性腸病、多發(fā)性硬化(multiplesclerosis)、和系統(tǒng)性紅斑狼掩。"自身免疫病，，在本文中指源于且針對(duì)個(gè)體自身組織或器官的疾病或紊亂或其共分離(co-segregate)或表現(xiàn)或由其導(dǎo)致的狀況。在這些自身免疫病和炎癥紊亂的許多例子中，可以存在許多臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)志，包括但不限于高丙種球蛋白血癥、高水平自身抗體、組織中抗原-抗體復(fù)合物沉積、得益于皮質(zhì)類固醇或免疫抑制治療、及受侵害組織中的淋巴樣細(xì)胞集合體。在用于本文時(shí)，"治療"或"處理，，指試圖改變所治療個(gè)體或細(xì)胞的自然進(jìn)程的臨床干預(yù)，可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中進(jìn)行。治療的期望效果包括預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、減緩疾病*的速率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及免除或改善預(yù)后。在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于延遲疾病或病癥的發(fā)生/發(fā)展。"個(gè)體"指脊推動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。哺乳動(dòng)物包括，但不限于，牲畜(諸如牛)、運(yùn)動(dòng)用動(dòng)物、寵物(諸如貓、犬、和馬)、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠和大鼠。為了治療的目的，"哺乳動(dòng)物"指歸入哺乳類的任何動(dòng)物，包括人，家畜和牲畜，及動(dòng)物園、運(yùn)動(dòng)或?qū)櫸飫?dòng)物，諸如犬、馬、貓、牛、等。優(yōu)選的是，哺乳動(dòng)物指人。"有效量"指在必需的劑量和時(shí)間上有效實(shí)現(xiàn)期望的治療或預(yù)防效果的量。本發(fā)明的物質(zhì)/分子、拮抗劑或激動(dòng)劑的"治療有效量"可根據(jù)諸如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重及該物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拮抗劑在個(gè)體中引發(fā)期望應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量還指該物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拮抗劑的治療有益效果勝過任何有毒或有害后果的量。"預(yù)防有效量，，指在必需的劑量和時(shí)間上有效實(shí)現(xiàn)期望的預(yù)防效果的量。通常而非必然，由于預(yù)防劑量是在疾病發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預(yù)防有效量將低于治療有效量。術(shù)語"細(xì)胞毒劑"在用于本文時(shí)指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素，例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素；化療劑，例如曱氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、長(zhǎng)春花生物堿類(vincaalkaloids)(長(zhǎng)春新石成(vincristine)、長(zhǎng)春石威(vinblastine)、依托泊苦(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤藥或抗癌藥。下文記載了其它細(xì)胞毒劑。殺腫瘤藥引起腫瘤細(xì)胞的破壞。"化療劑"指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?alkylatingagents),諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);磺酸烷基酯類(alkylsulfonates)，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和p底泊舒凡(piposulfan);氮丙p定類(aziridines)，諸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines)，包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙4掌石克^R石舞酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);番菡枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));S_9-四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL);卩-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素類(colchicines);白樺脂酸(betulinicacid);喜樹石咸(camptothecin)(包4舌合成類似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan),CAMPTOSAR)、乙酰喜樹堿、東萊菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苦(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(特另'J是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海纟帛承卩素(spongistatin);氛芥類(nitrogenmustards)，^者長(zhǎng)口笨丁酸氛芥(chlorambucil)、蔡氛芥(chlornaphazine)、月旦石舞醜胺(cholophosphamide)、站偉莫司汀(estramustine)、異環(huán)石舞酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥月旦甾醇(phenesterine)、〉發(fā)尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧咬氮芥(uracilmustard);亞硝脲類(nitrosoureas),諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司'汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素yll和加利車霉素coil(參見例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994));蒽環(huán)類抗生素(dynemicin)，包括dynemicinA;埃斯波霉素(espemmicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán))、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地4乇比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、噤呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類，諸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，諸如二曱葉酸(den叩terin)、曱氨蝶p令、蟲策酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物，諸如氟達(dá)4立濱(fludarabine)、6-好l基噪p令(mercaptopurine)、石克口米噪口令(thiamiprine)、硫鳥噪呤(thioguanine);嘧咬類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofUr)、阿糖胞苦(cytarabine)、雙脫氧尿苦(dideoxyuridine)、去氧氟尿香(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苦(floxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他力,酮(dromostanolonepropionate)、表石克力,醇(epitiostanol)、美#^烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米4乇坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙臥復(fù)(aminolevulinicacid);恩尿n密口定(eniluracil);安吖p定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達(dá)曲沙、(edatraxate);地石癢酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋銨(elliptiniumacetate);^矣》皮霉素(epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼達(dá)明(lonidamine);美登木素生物石威類(maytansinoids),i者如美登素(maytansine)和美登酉孚(maytansinol);安絲菌素(ansamitocin);米托脈蹤(mitoguazone);米托蒽酉昆(mitoxantrone);莫旅達(dá)醇(mopidamol);二胺硝吖"定(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);p比柔比星(pirarubicin);洛索蒽敏(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖復(fù)合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲蘭(sizofiran);蟲茅J走鍺(spirogermanium);纟田交《連孑包菌酉同酸(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2，2'，2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疾孑包菌素(verrucarin)A、4干孑包菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長(zhǎng)春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);達(dá)卡巴。秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);旅泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)("Ara-C");塞替派(thiotepa);類紫杉醇(taxoids),例如TAXOL⑧紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄)、ABRAXANETM不含克列莫佛(Cremophor)，清蛋白改造的納米顆4立齊寸型紫杉醇(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE⑧多西他塞(doxetaxel)(Rh6ne-PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR);6-石克鳥噪呤(thioguanine);好L基噪p令(mercaptopurine);曱氨蟲萊p令(methotrexate);4白類似物，諸如順鉑(cisplatin)和卡鉑(carboplatin);長(zhǎng)春堿(vinblastine)(VELBAN);鉑；依托泊苦(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長(zhǎng)春新石咸(vincristine)(ONCOVIN);奧沙利鉑(oxaliplatin);亞葉酸(leucovorin);長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE);能滅瘤(novantrone);依達(dá)曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氛基蝶呤(ami加pterin);伊本膦酸鹽(ibandronate);拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);類維A酸(retinoids),諸如維A酸(retinoicacid);卡培他濱(capecitabine)(XELODA⑧)；任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或書f生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長(zhǎng)春新堿和潑尼^^龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。該定義還包括作用為調(diào)節(jié)、降低、阻斷、或抑制可促進(jìn)癌生長(zhǎng)的激素效果的抗激素劑，且常常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可以是激素。實(shí)例包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、EVISTA⑧雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene);抗孕酮類；雌激素受體下調(diào)劑類(ERD);功能為抑制或關(guān)閉卵巢的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動(dòng)劑，諸如LUPRON⑧和ELIGARD醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelinacetate)和曲普瑞林(triptorelin);其它抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE⑧醋酸曱地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR⑧伏羅唑(vorozole)、FEMARA來曲唑(letrozole)和ARIMIDEX⑧阿那曲唑(anastrozole)。另外，化療劑的這種定義包才舌二膦酸鹽類(bisphosphonates),"i者如氯膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS⑧或OSTAC㊣)、DIDROCAL⑧依替膦酸鈉(etidronate),NE-58095、ZOMETA⑧唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronicacid/zoledronate)、FOSAMAX阿倫膦酸鹽(alendronate)、AREDIA⑧帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKELID⑧替魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL⑧利塞膦酸鹽(risedronate);以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉粘著細(xì)胞增殖的信號(hào)途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE⑧疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和VAXID⑧疫苗；LURTOTECAN⑧拓樸異構(gòu)酶l抑制劑；ABARELIXrmRH;lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016);及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。"生長(zhǎng)抑制劑，，在用于本文時(shí)指在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞(諸如表達(dá)OX40L的細(xì)胞)生長(zhǎng)的化合物或組合物。因此，生長(zhǎng)抑制劑可以是顯著降低處于S期的細(xì)胞(諸如表達(dá)OX40L的細(xì)胞)百分比的藥劑。生長(zhǎng)抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(jìn)(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長(zhǎng)春藥類(vincas)(長(zhǎng)春新堿(vincristine)和長(zhǎng)春堿(vinblastine))、紫杉烷類(taxanes)、和拓樸異構(gòu)酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔紅霉素(daunorubicin)、依托泊苦(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯G1的藥劑也溢出進(jìn)入S期停滯，例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達(dá)卡巴。秦(dacarbazine)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、曱氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見《TheMolecularBasisofCancer》，Mendelsohn和Israel編，第1章，題為"Cellcycleregulation,oncogenes,andantieioplasticdrugs",Murakaini等人，WBSaunders,Philadelphia,1995，尤其是第13頁。紫杉烷類(紫杉醇(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))是衍生自紫杉樹的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE⑧，Rhone-PoulencRorer)是紫杉醇(TAXOL⑧，Bristol-MyersSquibb)的半合成類似物。紫杉醇和多西他賽促進(jìn)由微管蛋白二聚體裝配成微管并通過防止解聚使微管穩(wěn)定，導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞中有絲分裂的抑制。"多柔比星(Doxorubicin)，，是蒽環(huán)類抗生素。多柔比星的完整化學(xué)名是(8S-順式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脫氧-a-L-來蘇-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9，10-四氬-6,8，11-三羥基-8-(輕基乙?；?-1-曱氧基-5，12-萘二酮。(8S-cis)-10-[(3-amino-2，3,6-trideoxy-a-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7，8，9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1國methoxy畫5，12-naphthacenedi含"Fc區(qū)多肽，，指包含F(xiàn)c區(qū)的多肽，諸如抗體或免疫粘附素(見下文定義)。Fc區(qū)的C-末端賴氨酸(依照EU編號(hào)系統(tǒng)的殘基447)可以消除，例如在純化多肽的過程中或者通過重組改造編碼多肽的核酸。因此，依照本發(fā)明包含具有Fc區(qū)的多肽的組合物可包含具有K447的多肽、消除了所有K447的多肽、或具有與沒有K447殘基的多肽的混合物。本發(fā)明的組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涵蓋包含抗OX40L抗體的組合物，包括藥用組合物；及包含抗OX40L抗體編碼序列的多核苷酸。在用于本文時(shí)，組合物包含一種或多種結(jié)合OX40L的抗體，和/或一種或多種包含編碼一種或多種結(jié)合OX40L的抗體的序列的多核苷酸。這些組合物可進(jìn)一步包含合適的載體，諸如藥學(xué)可接受的賦形劑，包括緩沖劑，它們是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明還涵蓋分離的抗體和多核苷酸的實(shí)施方案。本發(fā)明還涵蓋基本上純的抗體和多核苦酸的實(shí)施方案。本發(fā)明的抗OX40L抗體優(yōu)選是單克隆的。本發(fā)明的范圍還涵蓋本文中所提供的抗OX40L抗體的Fab、Fab'、Fab'-SH和F(ab')2。這些抗體片段可通過常規(guī)方法來制備，諸如酶促消化，或者可以通過重組技術(shù)來生成。此類抗體片段可以是嵌合的或人源化的。這些片段可用于下文所列的診斷和治療目的。單克隆抗體是由一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的，即構(gòu)成群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變。由此，修飾語"單克隆，，指明抗體的特征，即不是不同抗體的混合物。本發(fā)明的抗OX40L單克隆抗體可使用最初由Kohlerefa/.,A^we256:495(1975)記栽的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法(美國專利No.4，816，567)來制備。在雜交瘤方法中，免疫小鼠或其它適宜的宿主動(dòng)物，諸如倉鼠，以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)。OX40L的抗體一般通過在動(dòng)物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射OX40L和佐劑來生成。OX40L可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法來制備，其中有些方法在本文中有描述。例如，OX40L的重組生產(chǎn)在下文中有描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，將動(dòng)物用包含OX40L胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)且其融合至免疫球蛋白重鏈Fc部分的OX40L衍生物免疫。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將動(dòng)物用OX40L-IgGl融合蛋白免疫。通常將動(dòng)物針對(duì)OX40L的免疫原性偶聯(lián)物或衍生物和單碌酰脂質(zhì)A(MPL)/海藻糖trehalosedicrynomycolate(TDM)(RibiImmunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)進(jìn)行免疫，將溶液皮內(nèi)注射于多個(gè)部位。2周后，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。7-14天后，對(duì)動(dòng)物采血，并測(cè)定抗OX40L滴度。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滴度達(dá)到平臺(tái)(plateaus)?；蛘?，可以在體外免疫淋巴細(xì)胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Mo"oc/o"a/y4"幼Ww/V/w一/es尸rac"ce,pp.59-103，AcademicPress,1986)。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，若親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏酶次黃嘌呤鳥噪呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基典型的將含有次黃噪呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長(zhǎng)。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平生成抗體、并對(duì)諸如HAT培養(yǎng)基樣培養(yǎng)基敏感的。在這些細(xì)胞中，優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細(xì)胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego，California,USA)獲得的MOPC-21和MPC-ll小鼠腫瘤及可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Maryland,USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653細(xì)胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也已描述用于生成人單克隆抗體(Kozbor,/m薩wo/.133:3001(1984》Brodeura/"Mcwoc/owa/v4加'6o辦7VWwc",ow7fec/7m々w&sand^p/Zcaf/om1,pp.51-63，MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)。可對(duì)雜交瘤細(xì)胞正在其中生長(zhǎng)的培養(yǎng)液測(cè)定針對(duì)OX40L的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測(cè)定法，諸如放射免疫測(cè)定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA),測(cè)定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如Munsona/.，^"a/.107:220(1980)的Scatchard分析來測(cè)定。在鑒定得到生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞后，該克隆可通過有限稀釋規(guī)程進(jìn)行亞克隆并通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding，Mowoc/owo/」w幼o(hù)^s:尸">2">/&5朋d尸rac"ce，pp.59-103，AcademicPress,1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動(dòng)物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)?？赏ㄟ^常規(guī)免疫球蛋白純化規(guī)程，諸如例如蛋白A-Sepharose、輕磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)液、腹水或血清適當(dāng)分開。本發(fā)明的抗OX40L抗體可以通過使用組合庫篩選具有期望活性的合成抗體克隆來制備。在原理上，通過篩選噬菌體文庫來選擇合成抗體克隆，所述噬菌體文庫含有展示融合至噬菌體外殼蛋白的各種抗體可變區(qū)片段(Fv)的噬菌體。通過針對(duì)所需抗原的親和層析淘選此類噬菌體文庫。表達(dá)能夠結(jié)合所需抗原的FV片段的克隆被吸附至抗原，從而與文庫中不結(jié)合的克隆分開。然后將結(jié)合的克隆從抗原上洗脫，而且可以通過額外的抗原吸附/洗脫循環(huán)進(jìn)一步富集。本發(fā)明的任何抗OX40L抗體可以如下獲得，即設(shè)計(jì)合適的抗原篩選規(guī)程來選擇感興趣的噬菌體克隆，接著使用來自感興趣的噬菌體克隆的Fv序列和Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NIHPublication91-3242，BethesdaMD(1991)，vols,l-3中記載的合適的恒定區(qū)(Fc)序列構(gòu)建全長(zhǎng)抗OX40L抗體克隆?？贵w的抗原結(jié)合域由兩個(gè)約110個(gè)氨基酸的可變(V)區(qū)形成，分別來自重鏈(VL)和輕鏈(VH),都呈現(xiàn)三個(gè)高變環(huán)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？勺冇蚩梢怨δ苄缘恼故驹谑删w上，或是作為單鏈Fv(scFv)片段(其中VH和VL通過短的、柔性的接頭共價(jià)相連)，或者作為Fab片段(其中它們各自與恒定域融合且非共價(jià)相互作用)，如Winteretal.，Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。在用于本文時(shí)，編碼scFv的噬菌體克隆和編碼Fab的噬菌體克隆統(tǒng)稱為"Fv噬菌體克隆"或"Fv克隆"。VH和VL基因的全集可以通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分開克隆，并在噬菌體文庫中隨才幾重組，然后可以^臾索抗原結(jié)合克隆，如Winteretal.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。來自經(jīng)免疫來源的文庫能提供對(duì)免疫原有高親和力的抗體，無需構(gòu)建雜交瘤?；蛘?，可以克隆未免疫的全集，用于為廣泛的非自身的及自身的抗原提供單一人抗體來源，無需任何免疫，如Griffithsetal.,EMBOJ，12:725-734(1993)所述。最后，未免疫的文庫還可以以合成方式來構(gòu)建，即從干細(xì)胞克隆未重排的V基因片段，使用包含隨機(jī)序列的PCR引物來編碼高度可變的CDR3區(qū)并在體外實(shí)現(xiàn)重排，如HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。通過與次要外殼蛋白pIII融合，使用絲狀噬菌體來展示抗體片段?？贵w片段可以展示為單鏈Fv片段，其中VH與VL結(jié)構(gòu)域通過柔性多肽間隔物在同一多肽鏈上相連，例如如Marksetal.，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)所述，或者展示為Fab片段，其中一條鏈與pIII融合，另一條鏈分泌到細(xì)菌宿主細(xì)胞周質(zhì)中，在此裝配Fab-外殼蛋白結(jié)構(gòu)，其通過取代一些野生型外殼蛋白而展示在p笙菌體表面上，侈寸^口^口Hoogenboometal.,Nucl,AcidsRes.，19:4133-4137(1991)所述。一般而言，從收獲自人或動(dòng)物的免疫細(xì)胞獲得編碼抗體基因片段的核酸。如果希望文庫偏向抗OX40L克隆，那么可以給受試者免疫OX40L以產(chǎn)生文庫構(gòu)建。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如下得到了偏向抗人OX40L克隆的人抗體基因片段文庫，即在攜帶功能性人免疫球蛋白基因陣列(且缺乏功能性內(nèi)源抗體生成系統(tǒng))的轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生抗人OX40L抗體應(yīng)答，使得OX40L免疫產(chǎn)生生成針對(duì)OX40L的人抗體的B細(xì)胞。生成人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠的生成在下文中有描述?？梢匀缦芦@得抗OX40L反應(yīng)性細(xì)胞群的進(jìn)一步富集，即使用合適的篩選規(guī)程來分離表達(dá)OX40L特異性膜結(jié)合抗體的B細(xì)胞，例如通過用OX40L親和層析進(jìn)行的細(xì)胞分離或者細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記的OX40L的吸附及后續(xù)的熒光激活細(xì)胞分選(FACS)?；蛘撸瑏碜晕疵庖吖w的脾細(xì)胞和/或B細(xì)胞或其它PBL的使用提供了可能的抗體全集的更佳展現(xiàn)，而且還容許使用OX40L在其中沒有抗原性的動(dòng)物(人或非人的)物種構(gòu)建抗體文庫。為了構(gòu)建摻入體外抗體基因的文庫，從受試者收獲干細(xì)胞以提供編碼未重排抗體基因區(qū)段的核酸?？梢詮亩喾N動(dòng)物物種(諸如人、小鼠、大鼠、兔類、luprine、犬、貓、豬、牛、馬、和禽類等)獲得感興趣的免疫細(xì)胞。從感興趣的細(xì)胞回收編碼抗體可變基因區(qū)段(包括VH和VL區(qū)段)的核酸并擴(kuò)增。就重排的VH和VL基因文庫而言，可以如下獲得所需DNA,即從淋巴細(xì)胞分離基因組DNA或mRNA，接著用與重排的VH和VL基因的5'和3'末端匹配的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),如Orlandietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，86:3833-3837(1989)所述,由此構(gòu)建多樣性V基因全集供表達(dá)?？梢詮腸DNA和基因組DNA擴(kuò)增V基因，反向引物位于編碼成熟V結(jié)構(gòu)域的外顯子的5'末端，正向引物基于J區(qū)段內(nèi)部，如Orlandietal.(1989)和Wardeta1.，Nature,341:544-546(1989)所述。然而，為了從cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，反向引物還可基于前導(dǎo)外顯子內(nèi)，如Jonesetal.,Biotechnol"9:88-89(1991)所述，正向引物基于恒定區(qū)內(nèi)，如Sastryetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:5728-5732(1989)所述。為了使互補(bǔ)性最大化，引物中可以摻入簡(jiǎn)并性，如Orlandietal.(1989)或Sastryeta1.(1989)所述。優(yōu)選的是，如下將文庫多樣性最大化，即使用靶向每個(gè)V基因家族的PCR引物來擴(kuò)增免疫細(xì)胞核酸樣品中存在的所有可獲得的VH和VL重排，例如如Marksetal.,J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)或Orumetal.，NucleicAcidsRes.，21:4491-4498(1993)所述。為了將所擴(kuò)增的DNA克隆到表達(dá)載體中，可以在PCR引物的一端引入罕見的限制性位點(diǎn)作為標(biāo)簽，如Orlandietal.(1989)所述，或者用帶標(biāo)簽的引物進(jìn)行進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增，如Clacksonetal.,Nature,352:624-628(1991)所述。人工合成的重組的V基因全集可以在體外從V基因區(qū)段衍生。大多數(shù)人VH基因區(qū)段已經(jīng)克隆和測(cè)序(Tomlinsonetal.，J.Mol.Biol"227:776-798(1992)),并定位(Matsudaetal.，NatureGenet"3:88-94(1993));這些克隆的區(qū)段(包括H1和H2環(huán)的所有主要構(gòu)型)可用于生成多樣性VH基因全集，用到編碼序列和長(zhǎng)度多樣性的H3環(huán)的PCR引物，如HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol.，227:381-388(1992)所述。VH全集還可如下生成，所有序列多樣性集中于單一長(zhǎng)度的長(zhǎng)H3環(huán)，如Barbasetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4457-4461(1992)所述。人VK和VX區(qū)段已經(jīng)克隆和測(cè)序(WilliamsandWinter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993))，而且可用于生成合成的輕鏈全集。基于一系列VH和VL折疊的范圍及L3和H3長(zhǎng)度的合成的V基因全集將編碼具有可觀結(jié)構(gòu)多樣性的抗體。擴(kuò)增編碼V基因的DNA后，依照HoogenboomandWinter,J.Mol.Biol"227:381-388(1992)的方法，可以在體外重排種系V基因區(qū)段?？贵w片段全集可以如下構(gòu)建，即以數(shù)種方式將VH與VL基因全集聯(lián)合在一起。可以在不同載體中創(chuàng)建各個(gè)全集，并在體外重組載體，例如如Hogrefeetal,,Gene,128:119-126(1993)所述，或者在體內(nèi)外通過組合感染來重組載體，例如Waterhouseetal.,Nucl.AcidsRes.，21:2265-2266(1993)中記載的loxP系統(tǒng)。體內(nèi)重組方法利用Fab片段的雙鏈性質(zhì)來克服因大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率施加的庫容量限制。分別克隆未免疫的VH和VL全集，一個(gè)克隆入噬菌粒，另一個(gè)克隆入噬菌體載體。然后通過用噬菌體感染含噬菌粒的細(xì)菌使得每個(gè)細(xì)胞包含不同的組合來聯(lián)合兩種文庫，庫容量只受細(xì)胞存在數(shù)的限制(約1012個(gè)克隆)。兩種載體都包含體內(nèi)重組信號(hào)，使得VH與VL基因重組到單一復(fù)制子上，并共包裝成噬菌體病毒粒。這些巨型文庫提供了大量的具有優(yōu)良親和力(KcT1為約1(T8M)的多樣性抗體?；蛘撸梢詫⑷来慰寺∪胪惠d體，例如如Barbasetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)所述，或者通過PCR裝配到一起，然后克隆，如Clacksonetal.，Nature,352:624-628(1991)所述。PCR裝配還可用于將VH和VLDNA與編碼柔性肽間隔物的DNA連接以形成單鏈Fv(scFv)全集。在另一種技術(shù)中，"細(xì)胞內(nèi)PCR裝配"用于通過PCR在淋巴細(xì)胞內(nèi)聯(lián)合VH與VL基因，然后克隆所連接基因的全集，如Embletonetal.,Nucl.AcidsRes.，20:3831-3837(1992)所述。未免疫文庫(naivelibrary)(天然的或合成的)生成的抗體可具有中等親和力(Kd"為約106-107]^-1)，但還可以如下在體外模擬親和力成熟，即構(gòu)建和再次選擇次生文庫，如Winteretal.(1994),見上文所述。例如，在Hawkinsetal.,J.Mol.Biol.，226:889-896(1992)的方法或Grametal.，Proc.Natl.Acad.SciUSA，89:3576-3580(1992)的方法中，使用易錯(cuò)聚合酶在體外隨機(jī)引入突變(Leungetal.，Technique,1:11-15(1989))。另外，可以通過隨沖幾突變一個(gè)或多個(gè)CDR來進(jìn)行親和力成熟，例如在選定的個(gè)別Fv克隆中使用攜帶跨越感興趣CDR的隨機(jī)序列的引物進(jìn)行PCR并篩選更高親和力的克隆。WO9607754(公開于1996年3月14日)記載了用于在免疫球蛋白輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)中誘導(dǎo)誘變以創(chuàng)建輕鏈基因文庫的方法。另一種高效方法是將通過噬菌體展示選出的VH或VL結(jié)構(gòu)域與得自未免疫供體的天然存在V結(jié)構(gòu)域變體組合，并在數(shù)輪鏈改組中篩選更高親和力，如Marksetal.,Biotechnol.，10:779-783(1992)所述。此技術(shù)容許生成親和力在10一M范圍的抗體和抗體片段。編碼OX40L的核酸序列可以使用所需OX40L區(qū)域，例如胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列來設(shè)計(jì)。或者，可以使用cDNA序列(或其片段)。別的OX40L序列進(jìn)一步披露于例如SwissProt登錄號(hào)P23510。編碼OX40L的DNA可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法來制備。這些方法包括但不限于通過Engdsetal.，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,28:716-734(1989)中記載的任何方法，諸如三酯、亞磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidite)和H-膦酸酯法進(jìn)行的化學(xué)合成。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼OX40L的DNA的設(shè)計(jì)中使用表達(dá)宿主細(xì)胞所優(yōu)選的密碼子?；蛘?，編碼OX40L的DNA可以從基因組或cDNA文庫分離。構(gòu)建編碼OX40L的DNA后，將DNA分子與表達(dá)載體，諸如質(zhì)粒中的表達(dá)控制序列可操作連接，其中所述控制序列受到該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的識(shí)別。一般而言，質(zhì)粒載體包含復(fù)制和控制序列，其衍生自與宿主細(xì)胞相容的物種。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及編碼能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的蛋白質(zhì)的序列。適于在原核和真核宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體是本領(lǐng)域已知的，有些在本文中有進(jìn)一步描述?？梢允褂谜婧松矬w，諸如酵母或衍生自多細(xì)胞生物體諸如哺乳動(dòng)物的細(xì)胞。任選的是，編碼OX40L的DNA與分泌前導(dǎo)序列可操作連接，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物被宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。分泌前導(dǎo)序列的例子包括stll、ecotin、lamB、皰滲GD、lpp、堿性磷酸酶、轉(zhuǎn)化酶、和a-因子。適用于此處的還有蛋白A的36個(gè)氨基酸的前導(dǎo)序歹iJ(Abrahmsenetal.，EMBOJ.,4:3901(1985))。宿主細(xì)胞用上文所述本發(fā)明的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染，優(yōu)選轉(zhuǎn)化,并在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基可以為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子、或擴(kuò)增編碼所需序列的基因而適當(dāng)修改。轉(zhuǎn)染指宿主細(xì)胞攝取表達(dá)載體，無論編碼序列事實(shí)上是否表達(dá)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員直到許多轉(zhuǎn)染方法，例如CaP04沉淀和電穿孔。若宿主細(xì)胞內(nèi)存在此載體運(yùn)轉(zhuǎn)的任何指示，則認(rèn)為轉(zhuǎn)染成功。用于轉(zhuǎn)染的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，有些在本文中有描述。轉(zhuǎn)化指將DNA導(dǎo)入生物體，使得DNA可進(jìn)行復(fù)制，或是作為染色體外元件，或是通過染色體整合。根據(jù)所用宿主細(xì)胞，使用適于所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，有些在本文中有描述。用于生成OX40L的原核宿主細(xì)胞可以如Sambrooketal.，見上文一般所述進(jìn)行培養(yǎng)。用于生成OX40L的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基是本領(lǐng)域眾所周知的，有些在本文中有描述。此公開書中涉及的宿主細(xì)胞涵蓋體外培養(yǎng)的細(xì)胞以及宿主動(dòng)物內(nèi)的細(xì)胞。OX40L的純化可以使用本領(lǐng)域7>認(rèn)的方法來實(shí)現(xiàn)。純化的OX40L可以附著于合適的基質(zhì)，諸如瓊脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纖維素、各種丙烯酸共聚物、幾基曱基丙烯酸酯凝膠、聚丙烯酸和聚曱基丙烯酸共聚物、尼龍、中性和離子載體、諸如此類，用于噬菌體展示克隆的親和層析分離。OX40L蛋白對(duì)基質(zhì)的附著可以通過MethodsinEnzymology，vol.44(1976)中記載的技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。將蛋白質(zhì)配體附著于多糖基質(zhì)，例如瓊脂糖、右旋糖苷或纖維素的常用技術(shù)牽涉用卣化氰活化載體，隨后將肽配體的脂肪族伯胺或芳香族伯胺偶聯(lián)至活化后的基質(zhì)?；蛘?，OX40L可用于包被吸附板的孔，在附著至吸附板的宿主細(xì)胞上表達(dá)，或用于細(xì)胞分選，或者偶聯(lián)至生物素以用鏈霉親合素包被的珠捕捉，或者用于本領(lǐng)域已知的用于淘選噬菌體展示庫的任何其它方法。在適于至少部分噬菌體顆粒結(jié)合吸附劑的條件下，使噬菌體文庫樣品接觸固定化的OX40L。正常情況下，選擇包括pH、離子強(qiáng)度、溫度等等的條件來模擬生理學(xué)條件。對(duì)結(jié)合至固相的噬菌體進(jìn)行清洗，然后用酸洗脫，例如如Barbasetal.，Proc.Natl.Acad.SciUSA,88:7978-7982(1991)所述，或者用堿洗脫，例如如Marksetal.，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者通過OX40L抗原竟?fàn)幭疵?，例如在與Clacksonetal.，Nature,352:624-628(1991)的抗原竟?fàn)幏愃频囊?guī)程中。噬菌體在單輪選擇中可以富集20-l,000倍。此外，富集的噬菌體可以在細(xì)菌培養(yǎng)物中進(jìn)行培養(yǎng)，并進(jìn)行更多輪選擇。選擇的效率取決于許多因素，包括清洗過程中解離的動(dòng)力學(xué)，及單個(gè)噬菌體上的多個(gè)抗體片段是否能同時(shí)結(jié)合抗原。具有較快解離動(dòng)力學(xué)(和弱結(jié)合親和力)的抗體可以通過使用短時(shí)間的清洗、多價(jià)噬菌體展示、及固相中的高抗原包被密度來保留。高密度不僅通過多價(jià)相互作用而穩(wěn)定了噬菌體，而且有利于已解離的噬菌體的再結(jié)合。具有較慢解離動(dòng)力學(xué)(和強(qiáng)結(jié)合親和力)的抗體的選擇可以通過使用長(zhǎng)時(shí)間的清洗和單價(jià)噬菌體展示(如Bassetal.，Proteins,8:309-314(1990)和WO92/09690所述)及低抗原包被密度(如Marksetal.，Biotechnol.,10:779-783(1992)所述)來促進(jìn)。有可能在對(duì)OX40L具有不同親和力的噬菌體抗體之間進(jìn)行選擇，甚至是親和力略有差異的。然而，選定抗體的隨機(jī)誘變(例如如有些上文所述親和力成熟技術(shù)進(jìn)行)有可能產(chǎn)生許多突變體，多數(shù)結(jié)合抗原，少數(shù)具有更高的親和力。通過限制OX40L，罕見的高親和力噬菌體能竟?fàn)巹俪觥榱吮Ａ羲休^高親和力的突變體，可以將噬菌體與過量的生物素化OX40L—起溫育，但是生物素化OX40L的摩爾濃度低于OX40L的目標(biāo)摩爾親和常數(shù)。然后用鏈霉親合素包被的順磁珠捕捉高親和力的結(jié)合噬菌體。此類"平衡捕捉"容許依照結(jié)合親和力來選擇抗體，其靈敏性容許從大大過量的低親和力噬菌體中分離出親和力低得只有原值2倍的突變體克隆。還可以操作清洗結(jié)合至固相的噬菌體的條件來進(jìn)行基于解離動(dòng)力學(xué)的區(qū)分?？筄X40L克隆可以進(jìn)行活性選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了阻斷OX40受體與OX40L之間的結(jié)合但不阻斷OX40與第二蛋白質(zhì)結(jié)合的抗OX40L抗體。對(duì)應(yīng)于此類抗OX40L抗體的Fv克隆可以如下選出(1)如上所述從噬菌體文庫分離抗OX40L克隆，并任選通過在合適的細(xì)菌宿主中培養(yǎng)來擴(kuò)增所分離的噬菌體克隆群；(2)選出分別想阻斷和不阻斷其活性的OX40L和第二蛋白質(zhì)；(3)使抗OX40L噬菌體克隆吸附至固定化的OX40L;(4)使用過量的第二蛋白質(zhì)來洗脫任何不想要的、識(shí)別OX40L結(jié)合決定簇(其與第二蛋白質(zhì)的結(jié)合決定簇交疊或共享)的克??；并(5)洗脫在步驟(4)后仍然吸附的克隆。任選的是，具有期望的阻斷/不阻斷特性的克隆可以通過一次或多次重復(fù)本文所述選擇規(guī)程來進(jìn)一步富集。編碼本發(fā)明雜交瘤衍生單克隆抗體或噬菌體展示Fv克隆的DNA易于使用常規(guī)規(guī)程分離和測(cè)序(例如通過使用設(shè)計(jì)成自雜交瘤或噬菌體DNA模板特異性擴(kuò)增感興趣的重鏈和輕鏈編碼區(qū)的寡核苷酸引物)。一旦分離，可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到原本不生成免疫球蛋白蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得所需單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述性論文包括Skerraetal.,Curr.OpinioninImmunol"5:256(1993)及Pluckthun，Immunol.Revs,130:151(1992)。編碼本發(fā)明Fv克隆的DNA可以聯(lián)合編碼重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的已知DNA序列(例如適宜的DNA序列可得自Kabatetal.，見上文)以形成編碼全長(zhǎng)或部分重鏈和/或輕鏈的克隆。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，任何同種型的恒定區(qū)都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定區(qū)，而且此類恒定區(qū)可以得自任何人或動(dòng)物物種。衍生自一種動(dòng)物(諸如人)物種的可變域DNA,然后與另一動(dòng)物物種的恒定區(qū)DNA融合以形成"雜合的，，全長(zhǎng)重鏈和/或輕鏈的編碼序列的Fv克隆包括在本文所用"嵌合"和"雜合"抗體的定義中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，衍生自人可變DNA的Fv克隆與人恒定區(qū)DNA融合以形成完全人的、全長(zhǎng)或部分重鏈和/或輕鏈的編碼序列。還可以修飾編碼衍生自本發(fā)明雜交瘤的抗OX40L抗體的DNA，例如通過替代，即用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列代替衍生自雜交瘤抗體的同源鼠源序歹'J(例如如Morrisonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984)中的方法)。可以進(jìn)一步修飾編碼雜交瘤或Fv克隆^f汙生抗體或片段的DNA，通過共價(jià)接合免疫球蛋白編碼序列或非免疫球蛋白多肽的整個(gè)或部分編碼序列?？梢砸栽摲绞街苽渚哂斜景l(fā)明的Fc克隆或雜交瘤克隆衍生抗體的結(jié)合特異性的"嵌合"或"雜合"抗體?？贵w片段本發(fā)明涵蓋抗體片段。在某些情況中，使用抗體片段，而不是完整抗體有優(yōu)勢(shì)。片段的較小尺寸容許快速清除，而且可導(dǎo)致更易于接近實(shí)體瘤。已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimotoetal.，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992);Brennanetal"Science229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達(dá)及由大腸桿菌分泌，如此容許容易的生成大量的這些片段。可從上文討論的噬菌體抗體庫中分離抗體片段。或者，可直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab')2片段(Carteretal.，Bio/Technology10:163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab')2片段。包含補(bǔ)救受體結(jié)合表位殘基、具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期的Fab和F(ab')2片段記載于美國專利No.5,869,046。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對(duì)于熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。在其它實(shí)施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO93/16185;美國專利No.5,571,894;及5,587,458。Fv和sFv是具有完整結(jié)合位點(diǎn)、缺少恒定區(qū)的唯一類型；如此，它們適于在體內(nèi)使用時(shí)降低非特異性結(jié)合?？蓸?gòu)建sFv融合蛋白以生成效應(yīng)物蛋白質(zhì)在sFv的氨基或羧基末端的融合。參見AntibodyEngineering,Borrebaeck編，supra?？贵w片段還可以是"線性抗體"，例如如美國專利No.5,641,870中所記載的。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。人源化抗體本發(fā)明涵蓋人源化抗體。本領(lǐng)域知道用于人源化非人抗體的多種方法。例如，人源化抗體可具有一個(gè)或多個(gè)從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱為"輸入，，殘基，它們通常取自"輸入，，可變區(qū)。基本上可遵循Winter及其同事的方法進(jìn)行人源化(Jonesetal.,Nature321:522-525(1986);Riechmannetal"Nature332:323-327(1988);Verhoeyenetal"Science239:1534-1536(1988)),即用非人高變區(qū)序列替代人抗體的對(duì)應(yīng)序列。因此，此類"人源化，，抗體是嵌合抗體(美國專利4,816，567),其中顯著少于完整的人可變區(qū)用非人物種的相應(yīng)序列替代。在實(shí)踐中，人源化抗體通常是如下人抗體，其中有些高變區(qū)殘基和可能的有些FR殘基用嚙齒類抗體類似位點(diǎn)的殘基替代。用于制備人源化抗體的人輕鏈和重鏈可變區(qū)的選擇對(duì)于降低抗原性是非常重要的。依照所謂的"最適(best-fit)"方法，用嚙齒類抗體的可變區(qū)序列對(duì)已知人可變區(qū)序列的整個(gè)文庫進(jìn)行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架(Simsetal"J.Immunol.151:2296(1993);Chothiaetal.,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈亞類(subgroup)的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carteretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992);Prestaetal"J.Immunol.151:2623(1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保留對(duì)抗原的高親和力和其它有利的生物學(xué)特性。為了達(dá)到此目的，依照一種方法，通過使用親本序列和人源化序抗體。通?？色@得免疫球蛋白三維模型，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)程序。通過檢查這些顯示圖像能分析殘基在候選免疫球蛋白序列發(fā)揮功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可以從受體序列和輸入序列中選出FR殘基并組合，從而得到期望的抗體特征，諸如對(duì)靶抗原的親和力升高。一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實(shí)質(zhì)的涉及對(duì)抗原結(jié)合的影響。人抗體本發(fā)明的人抗OX40L抗體可以通過如上所述聯(lián)合選自人衍生噬菌體展示庫的Fv克隆可變域序列與已知的人恒定域序列來構(gòu)建?；蛘?，可以通過雜交瘤方法來生成本發(fā)明的人單克隆抗OX40L抗體。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系已有記載，例如KozborJ.Immunol.,133:3001(1984》Brodeuretal.，MonoclonalAntibodyProductionTechniques'andApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987);及Boerneretal.，J.Immunol"147:86(1991).例如，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)?dǎo)致在抗原攻擊后生成人抗體。參見例如Jakobovitsetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA卯:2551(1993);Jakobovitsetal.,Nature362:255-258(1993);Bruggermannetal"YearinImmunol.7:33(1993)。基因改組也可用于在體外自非人(例如嚙齒類)抗體衍生人抗體，其中人抗體具有與起始非人抗體相似的親和力和特異性。依照此方法，它也稱為"表位印記"(epitopeimprinting),如上所述通過噬菌體展示技術(shù)得到的非人抗體片段的重鏈或輕鏈可變區(qū)用人V結(jié)構(gòu)域基因全集替換，產(chǎn)生非人鏈-人鏈scFv或Fab嵌合物群。用抗原進(jìn)行的選擇導(dǎo)致非人鏈/人鏈嵌合scFv或Fab的分離，其中人鏈在一級(jí)噬菌體展示克隆中消除相應(yīng)的非人鏈后恢復(fù)了抗原結(jié)合位點(diǎn)，即表位決定(印記，imprint)人鏈配偶體的選擇。在重復(fù)該過程以替換剩余非人鏈時(shí)，得到人抗體(參見PCTWO93/06213，公開于1993年4月1日)。與傳統(tǒng)的通過CDR移植進(jìn)行的非人抗體的人源化不同，此技術(shù)提供完全人的抗體，它們不含非人起源的FR架或CDR殘基。還可以由體外激活的B細(xì)胞來生成人抗體(參見美國專利No.5,567,610和5，229,275)。雙特異性抗體雙特異性抗體指對(duì)至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體，優(yōu)選人抗體或人源化抗體。在本案中，結(jié)合特異性之一針對(duì)OX40L，另一結(jié)合特異性針對(duì)任何其它抗原。例示性的雙特異性抗體可結(jié)合OX40L蛋白質(zhì)的兩種不同表位。雙特異性抗體還可用于將細(xì)胞毒劑定位于表達(dá)OX40L的細(xì)胞。這些抗體擁有OX40L結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒劑(例如肥鬼草毒蛋白、抗干擾素-oc、長(zhǎng)春花生物堿類、蓖麻毒蛋白A鏈、曱氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長(zhǎng)抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。在傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于兩對(duì)免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩種重鏈具有不同的特異性(MillsteinandCuello,Atowe305:537(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。類似的規(guī)程披露于WO93/08829，公開于1993年5月13日及TrauneckerWa/.,￡M50J10:3655(簡(jiǎn))。依照一種不同且更優(yōu)選的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變域與免疫球蛋白恒定域序列融合。優(yōu)選的是，與包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定域進(jìn)行融合。優(yōu)選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)(Ch1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時(shí)，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時(shí)提供最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了極大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時(shí)或在該比例沒有特別意義時(shí)，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入一個(gè)表達(dá)載體。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個(gè)雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于WO94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見例如Suresh&a/.，M^/zoA/"五"2^mo/ogy121:210(1986)。依照另一種方法，可改造一對(duì)抗體分子間的界面，以將從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含至少部分抗體恒定域CH3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個(gè)或多個(gè)小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或相似大小的補(bǔ)償性"空腔"。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機(jī)制。雙特異性抗體包括交聯(lián)或"異源偶聯(lián)"抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體已經(jīng)建議用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國專利No.4,676,980)，及用于治療HIV感染(WO91/00360，WO92/00373和EP03089)。可使用任何便利的交聯(lián)方法來制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，連同許多交聯(lián)技術(shù)一起披露于美國專利No.4,676,980。文獻(xiàn)中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brennan"a/.,5We"ce229:81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的規(guī)程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab，片段轉(zhuǎn)變?yōu)槭璐趸綍跛狨?TNB)衍生物。然后將Fab'-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進(jìn)展便于從大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，這些片段可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby"a/.,JMed.175:217-225(1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種Fab'片段，并在體外進(jìn)行定向化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達(dá)HER2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞，以及觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對(duì)人乳瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉《連生成雙特異性抗體。Kostelnyefa/.,/wm柳o/.148(5):1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger&a/"Ato/.t/5L490:6444-6448(1993)記載的"雙抗體"技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機(jī)制。該片^R包含通過接頭相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VJ,所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間不能配對(duì)。因此，迫使一個(gè)片段上的VH和Vj吉構(gòu)域與另一個(gè)片段上的互補(bǔ)VL和VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，由此形成兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。還報(bào)道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Grubera/"http://畫畫/.152:5368(1994)。設(shè)想了具有超過兩個(gè)效價(jià)的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt"a/.，/畫畫/.147:60(1991)。多價(jià)抗體多價(jià)抗體可以比二價(jià)抗體更快的受到表達(dá)該抗體所結(jié)合抗原的細(xì)胞的內(nèi)在化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是可容易地通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達(dá)而生成的、具有三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)(例如四價(jià)抗體)的多價(jià)抗體(IgM類別以外的)。多價(jià)抗體可包含二聚化結(jié)構(gòu)域和三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域包含(或由其組成)Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)。在這種情況中，抗體將包含F(xiàn)c區(qū)及Fc區(qū)氨基末端的三個(gè)或更多抗原結(jié)合位點(diǎn)。本文中優(yōu)選的多價(jià)抗體包含(或由其組成)三個(gè)至約八個(gè)，但優(yōu)選四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。多價(jià)抗體包含至少一條多肽鏈(且優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個(gè)或多個(gè)可變域。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc,其中VD1是第一可變域，VD2是第二可變域，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或l。例如，多肽鏈可包含VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區(qū)鏈。本文中的多價(jià)抗體優(yōu)選進(jìn)一步包含至少兩條(且優(yōu)選四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多價(jià)抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文設(shè)想的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，且任選進(jìn)一步包含CL結(jié)構(gòu)域。抗體變體在有些實(shí)施方案中，設(shè)想了本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進(jìn)抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。抗體的氨基酸序列變體是通過將適宜的核苷酸變化引入抗體核酸或通過肽合成制備的。此類修飾包括例如抗體氨基酸序列內(nèi)的殘基刪除和/或插入和/或替代?？蛇M(jìn)行任何刪除、插入和替代組合以獲得最終的構(gòu)建物，倘若最終的構(gòu)建物具有期望的特征?？稍谥苽湫蛄袝r(shí)將氨基酸改變引入抗體氨基酸序列?？捎糜阼b定抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的方法有"丙氨酸掃描誘變,，，如CunninghamandWells,Science244:1081-1085(1989)中所述。這里，鑒定一個(gè)殘基或一組靶殘基(如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c(diǎn)引入更多或其它變體，推敲對(duì)替代展示出功能敏感性的氨基酸位置。由此，盡管用于引入氨基酸序列變異的位點(diǎn)是預(yù)先決定的，然而突變本身的本質(zhì)不必預(yù)先決定。例如，為了分析指定位點(diǎn)處突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并對(duì)所表達(dá)免疫球蛋白篩選期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長(zhǎng)度范圍由一個(gè)殘基至包含上百或更多殘基的多肽，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N端曱硫氨酰殘基的抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括將抗體的N或C端與酶(如用于ADEPT)或延長(zhǎng)抗體血清半衰期的多肽融合?？贵w的另一類氨基酸變體改變了抗體的原始糖基化樣式。改變包括刪除在抗體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物模塊，和/或添加抗體中不存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。多肽的糖基化典型的或是N-連接的或是O-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。如此，多肽中這些三肽序列任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接的糖基化指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗體中添加糖基化位點(diǎn)可通過改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或多個(gè)上述三肽序列而便利的完成(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。所述改變還可通過向原始抗體的序列中添加或替代一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基來進(jìn)行(用于O-連接的糖基化位點(diǎn))。若抗體包含F(xiàn)c區(qū)，則可改變附著其上的碳水化合物。例如，美國專利申請(qǐng)US2003/0157108(Presta,L.)中記載了有缺乏巖藻糖的成熟碳水化合物結(jié)構(gòu)附著于抗體Fc區(qū)的抗體。還可參見US2004/0093621(KyowaHakkoKogyoCo"Ltd.)。WO2003/011878(Jean誦Mairet等人)和美國專利第6,602,684號(hào)(Umana等人)中提到了在附著于抗體Fc區(qū)的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗體。WO1997/30087(Patel等人)中報(bào)告了在附著于抗體Fc區(qū)的寡糖中有至少一個(gè)半乳糖殘基的抗體。關(guān)于有更改碳水化合物附著于其Fc區(qū)的抗體還可參見WO1998/58964(Raju,S.)和WO1999/22764(Raju，S.)。關(guān)于具有改良糖基化的抗原結(jié)合分子還可參見US2005/0123546(Umanaetal.)。本文中的優(yōu)選糖基化變體包含F(xiàn)c區(qū)，其中附著于Fc區(qū)的碳水化合物結(jié)構(gòu)缺乏巖藻糖。此類變體具有改進(jìn)的ADCC功能。任選的是，F(xiàn)c區(qū)還包含進(jìn)一步改進(jìn)ADCC的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代，例如Fc區(qū)位置298、333和/或334處的替代(Eu殘基編號(hào)方式)。涉及"脫巖藻糖型"或"巖藻糖缺乏型"抗體的出版物的例子包括US2003/0157108;WO2000/61739;WO2001/29246;US2003/0115614;US2002/0164328;US2004/0093621;US2004/0132140;US2004/0110704;US2004/0110282;US2004/0109865;WO2003/085119;WO2003/084570;WO2005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;Okazakietal.J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnukietal.Biotech.Bioeng.87:614(2004)。生成脫巖藻糖化抗體的細(xì)胞系的例子包括蛋白質(zhì)巖藻糖化缺陷的Lecl3CHO細(xì)胞(Ripkaetal.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美國專利申請(qǐng)?zhí)朥S2003/0157108Al,Presta,L;及WO2004/056312Al，Adamsetal.,尤其是實(shí)施例ll)和敲除細(xì)胞系，諸如a-l,6-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因，F(xiàn)UT8,敲除的CHO細(xì)胞(Yamane-Ohnukietal.Biotech.Bioeng.87:614(2004))。另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個(gè)氨基酸殘基用不同殘基替代。最有興趣進(jìn)行替代誘變的位點(diǎn)包括高變區(qū)，但是也設(shè)想了FR改變。表l中"優(yōu)選替代，，欄顯示了保守替代。如果此類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性變化，那么可導(dǎo)入表l中稱為"例示替代"的更實(shí)質(zhì)變化，或如下文參照氨基酸分類進(jìn)一步所述，并篩選產(chǎn)物。表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>對(duì)抗體生物學(xué)特性的實(shí)質(zhì)性修飾可通過選擇對(duì)維持以下方面的效果差異顯著的替代來實(shí)現(xiàn)(a)替代區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如(折疊)片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，天然存在殘基可如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gin;(3)酸性的Asp、Glu;(4)堿性的His、Lys、Arg;(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro;(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代需要用這些類別之一的成員替換另一個(gè)類別的。一類替代變體牽涉替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)的所得變體相對(duì)于產(chǎn)生它們的親本抗體將具有改良的生物學(xué)特性。用于生成此類替代變體的一種便利方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)而言之，將數(shù)個(gè)高變區(qū)位點(diǎn)(例如6-7個(gè)位點(diǎn))突變，在各個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗體展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個(gè)顆粒內(nèi)包裝的Mi3基因m產(chǎn)物的融合物。然后如本文所公開的對(duì)噬菌體展示的變體篩選其生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點(diǎn)，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒定對(duì)抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基?；蛘?另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體和抗原之間的接觸點(diǎn)可能是有益的。所述接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術(shù)進(jìn)行替代的候選位點(diǎn)。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對(duì)該組變體進(jìn)行篩選，可選擇在一種或多種相關(guān)測(cè)定法中具有優(yōu)良特性的抗體用于進(jìn)一步的開發(fā)。編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過本領(lǐng)域知道的多種方法來制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然發(fā)生氨基酸序列變體的情況中)，或者通過對(duì)較早制備的變體或非變異型式的抗體進(jìn)行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點(diǎn))誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備?？赡芟Ｍ诒景l(fā)明免疫球蛋白多肽的Fc區(qū)中引入一處或多處氨基酸修飾，由此生成Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可包括在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置(包括鉸鏈半胱氨酸)包含氨基酸修飾(如替代)的人Fc區(qū)序歹'J(如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))。依照此描述和本領(lǐng)域的教導(dǎo)，設(shè)想了在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所使用的抗體與野生型對(duì)應(yīng)抗體相比可在例如Fc區(qū)中包含一處或多處改變。與它們的野生型對(duì)應(yīng)物相比，這些抗體仍將基本上保留治療功效所需要的相同特性。例如，認(rèn)為可在Fc區(qū)中進(jìn)行將會(huì)導(dǎo)致Clq結(jié)合和/或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)改變(即或是增強(qiáng)或是削弱)的某些改變，例如W099/51642中所述。還可參見關(guān)注Fc區(qū)變體其它實(shí)例的DuncanandWinter,Nature322:738-40(1988);美國專利5，648,260;美國專利5，624,821;及W094/29351。WO00/42072(Presta)和WO2004/056312(Lowman)記載了對(duì)FcR的結(jié)合提高或降低的抗體變體。在此明確收入這些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見Shieldsetal.J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。半衰期延長(zhǎng)且對(duì)新生兒Fc受體(FcRn)(它負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒)(Guyeretal.，J.Immunol.117:587(1976)及Kimetal.,J.Immunol.24:249(1994))的結(jié)合改良的抗體記載于US2005/0014934A1(Hintonetal.)。這些抗體包含具有一處或多處改進(jìn)Fc區(qū)與FcRn結(jié)合的替代的Fc區(qū)。具有改變的Fc區(qū)氨基酸序列且Clq結(jié)合能力升高或降低的多肽變體記載于美國專利No.6，194，551B1,W099/51642。在此明確收入這些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參見Idusogieetal.J，Immunol.164:4178-4184(2000)?？贵w衍生物可進(jìn)一步修飾本發(fā)明的抗體以包含本領(lǐng)域知道的且易于獲得的額外非蛋白質(zhì)性質(zhì)部分。優(yōu)選的是，適于抗體衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實(shí)例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧曱基纖維素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-l,3-二氧戊環(huán)、聚-l,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或隨機(jī)共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的穩(wěn)定性，聚乙二醇丙醛在生產(chǎn)中可能具有優(yōu)勢(shì)。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附著到抗體上的聚合物數(shù)目可以變化，而且如果附著了超過一個(gè)聚合物，那么它們可以是相同或不同的分子。一般而言，可根據(jù)下列考慮來確定用于衍生化的聚合物的數(shù)目和/或類型，包括但不限于待改進(jìn)抗體的具體特性或功能、抗體衍生物是否將用于指定條件下的治療等。謬逸^r摩需'^t資的戎琳本發(fā)明的體可以用本領(lǐng)域已知的各種測(cè)定法對(duì)其物理/化學(xué)性質(zhì)和生物功能進(jìn)行表征。在一些實(shí)施方式中，抗體表征為如下任意一種或者多種特征結(jié)合OX40L，減弱或者阻斷OX40L活化，減弱或者阻斷OX40L下游分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減弱或者阻斷OX40受體活化，減弱或者阻斷OX40受體下游分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減弱或者阻斷OX40結(jié)合OX40L和/或OX40L多聚化，和/或?qū)γ庖卟“Y(例如，哮喘，過敏性鼻炎，特應(yīng)性皮炎，多發(fā)性硬化，GVHF或者系統(tǒng)性紅斑狼齊)的治療和/或預(yù)防；和/或?qū)εcOX40L表達(dá)和/或活性(例如增加的OX40L表達(dá)和/或活性)相關(guān)的病癥的治療和/或預(yù)防。純化的抗體還可以通過一系列測(cè)定法進(jìn)行表征，包括但不限于，N端測(cè)序，氨基酸測(cè)定，非變性大小排阻高壓液相層析(HPLC),質(zhì)譜測(cè)定，離子交換層析和木瓜蛋白酶消化。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，對(duì)此處制備的抗體進(jìn)行它們的生物學(xué)活性測(cè)定。在一些實(shí)施方式中，對(duì)本發(fā)明抗體檢驗(yàn)它們的抗原結(jié)合活性。本領(lǐng)域術(shù)的任意直接或者竟?fàn)幮缘慕Y(jié)合測(cè)定法Western印跡，放射免疫測(cè)定，ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法)，"夾心法"免疫測(cè)定，免測(cè)沉淀測(cè)定，熒光免疫測(cè)定和蛋白A免疫測(cè)定。在下面的實(shí)施例部分提供說明性的抗原結(jié)合測(cè)定法。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供抗OX40L單克隆抗體，所述抗OX40L單克隆抗體與抗體8E12和/或13G5抗體竟?fàn)幗Y(jié)合OX40L。這種竟?fàn)幙贵w包括識(shí)別OX40L表位的抗體，所述OX40L表位與抗體8E12和/或13G5識(shí)別的OX40L表位相同或者重疊。這種竟?fàn)幙贵w可以通過對(duì)抗OX40L雜交瘤上清篩(或者無)抗體的對(duì)照結(jié)合混合物中檢測(cè)到的結(jié)合、標(biāo)記抗體的量相比，包含竟?fàn)幙贵w的雜交瘤上清將降低受試竟?fàn)幗Y(jié)合混合物中結(jié)合、標(biāo)記抗體的量。此處描述的任意竟?fàn)幗Y(jié)合測(cè)定法均適用于上面的步驟。利用任意方便的方法通過篩選具有所需性質(zhì)的抗OX40L雜交瘤克隆可以獲得具有此處所述性質(zhì)的本發(fā)明抗OX40L抗體。例如，如果阻斷或者不阻斷OX40受體與OX40L結(jié)合的抗OX40L單克隆抗體是需要的，那么可以在結(jié)合竟?fàn)帨y(cè)定法中檢測(cè)候選抗體，所述檢測(cè)例如竟?fàn)幮越Y(jié)合ELISA,其中板上的孔用OX40L包被，在包被的板上放置包含過量OX40受體的抗體溶液；所述檢測(cè)例如酶法檢測(cè)結(jié)合的抗體，例如將結(jié)合的抗體與HRP偶聯(lián)抗Ig抗體或者生物素化的抗Ig抗體接觸并進(jìn)行HRP顯色反應(yīng)，例如將板與鏈霉親和素-1^和/或過氧化氫反應(yīng)，利用ELISA板讀數(shù)器在490nm通過分光光度法檢測(cè)HRP顯色反應(yīng)。如果需要抑制OX40L活化的抗OX40L抗體，可以通過檢測(cè)OX40L途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或者OX40途徑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的測(cè)定法檢測(cè)，例如NFkB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定法。這種測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的。確定抗OX40L抗體抑制能力的其它功能試驗(yàn)是本領(lǐng)域已知的，其中一些在此處舉例說明。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明預(yù)期具有一些但不是全部效應(yīng)器功能已有變化的抗體，這使其成為許多應(yīng)用的所需候選物，其中抗體在體內(nèi)的半衰期很重要但某些效應(yīng)器功能(例如補(bǔ)體和ADCC)是無用或者有害的。在某些實(shí)施方式中，測(cè)量制備免疫球蛋白的Fc活性以確保只有所需性質(zhì)被保留?？梢赃M(jìn)行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測(cè)定以證實(shí)CDC和/或ADCC活性的減少/耗竭。例如，可以進(jìn)行Fc受體(FcR)結(jié)合測(cè)定以確?？贵w缺失FcyR結(jié)合(因此可能缺失ADCC活性)，但保留FcRn結(jié)合能力。調(diào)節(jié)介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，它們只表達(dá)FcyRIII，而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、FcyRII和FcyRIII。在RavetchandKinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)第464頁的表3概述了造血細(xì)胞上的FcR^達(dá)。美國專利5,500,362或者5，821,337描述了體外測(cè)定感興趣分子的ADCC活性的實(shí)例。用于這種測(cè)定的有用效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?？蛇x的，或者此外，可以在體內(nèi)測(cè)定感興趣的分子的ADCC活性，例如，在例如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)公開的動(dòng)物模型中。也可以進(jìn)行Clq結(jié)合測(cè)定以證實(shí)抗體不能結(jié)合Clq從而缺失CDC活性。為了檢測(cè)補(bǔ)體激活，可以進(jìn)行CDC測(cè)定，例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202:163(1996)的描述。也可以利用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行FcRn結(jié)合和體內(nèi)清除率/半衰期測(cè)定。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有增強(qiáng)效應(yīng)器功能和/或延長(zhǎng)半衰期的改變的抗體。載體、宿主細(xì)胞和重組方法為了重組生產(chǎn)本發(fā)明的抗體，分離編碼它的核酸，并將其插入可復(fù)制載體，用于進(jìn)一步克隆(DNA擴(kuò)增)或表達(dá)?？墒褂贸Ｒ?guī)流程容易地分離編碼抗體的DNA并測(cè)序(例如使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苦酸探針)。可利用許多載體。載體的選擇部分取決于將要使用的宿主細(xì)胞。通常，優(yōu)選的宿主細(xì)胞是原核或真核(通常是哺乳動(dòng)物)起源的。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會(huì)，任何同種型的恒定區(qū)可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定區(qū)，而且此類恒定區(qū)可以從任何人或動(dòng)物物種獲得。a.使用原核宿主細(xì)胞生成抗體i.載體構(gòu)建可使用標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)來獲得編碼本發(fā)明抗體多肽構(gòu)件的多核苷酸序列?？蓮目贵w生成細(xì)胞諸如雜交瘤細(xì)胞分離期望的多核苷酸序列并測(cè)序?；蛘?，可使用核苷酸合成儀或PCR技術(shù)合成多核苷酸。一旦得到，將編碼多肽的序列插入能夠在原核宿主中復(fù)制并表達(dá)異源多核苷酸的重組載體。為了本發(fā)明，可使用本領(lǐng)域可獲得的且知道的許多載體。適宜載體的選擇將主要取決于將要插入載體的核酸的大小和將要用載體轉(zhuǎn)化的具體宿主細(xì)胞。根據(jù)其功能(擴(kuò)增或表達(dá)異源多核苷酸，或二者兼之)及其與它在其中駐留的具體宿主細(xì)胞的相容性，每種載體含有不同的構(gòu)件。載體構(gòu)件通常包括但不限于復(fù)制起點(diǎn)、選擇標(biāo)志基因、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、信號(hào)序列、異源核酸插入片段、和轉(zhuǎn)錄終止序列。一般而言，與宿主細(xì)胞一起使用的質(zhì)粒載體包含衍生自與這些宿主相容物種的復(fù)制子和控制序列。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)志序列。例如，通常用衍生自大腸桿菌物種的質(zhì)粒pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌。pBR322包含編碼氨千青霉素(Amp)和四環(huán)素(Tet)抗性的基因，由此提供輕松鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物質(zhì)?；蚴删w還可包含或經(jīng)修飾而包含可被微生物生物體用于表達(dá)內(nèi)源蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子。Carter等人，美國專利5,648,237中詳細(xì)記載了用于表達(dá)特定抗體的pBR322衍生物的實(shí)例。另夕卜，可將包含與宿主微生物相容的復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體用作這些宿主的轉(zhuǎn)化載體。例如，可使用噬菌體諸如XGEM.TM.-11來構(gòu)建可用于轉(zhuǎn)化易感宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌LE392的重組載體。本發(fā)明的表達(dá)載體可包含兩種或多種啟動(dòng)子-順反子對(duì)，它們編碼每一種多肽構(gòu)件。啟動(dòng)子是位于順反子上游(5')的非翻譯調(diào)控序列，它調(diào)控順反子的表達(dá)。原核啟動(dòng)子通常分成兩類，誘導(dǎo)型的和組成性的。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子指響應(yīng)培養(yǎng)條件的變化(如營養(yǎng)物的存在與否或溫度變化)而啟動(dòng)受其控制的順反子的升高水平轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。眾所周知受到多種潛在宿主細(xì)胞識(shí)別的大量啟動(dòng)子。通過限制酶消化切下源DNA中的啟動(dòng)子并將分離的啟動(dòng)子序列插入本發(fā)明的載體，由此可將選擇的啟動(dòng)子與編碼輕鏈或重鏈的順反子DNA可操作連接。天然啟動(dòng)子序列和許多異源啟動(dòng)子都可用于指導(dǎo)靶基因的擴(kuò)增和/或表達(dá)。在有些實(shí)施方案中，使用異源啟動(dòng)子，因?yàn)榕c天然靶多肽啟動(dòng)子相比，它們通常容許所表達(dá)靶基因的更高轉(zhuǎn)錄和更高產(chǎn)量。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括PhoA啟動(dòng)子、P-半乳糖苷酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、和雜合啟動(dòng)子諸如tac或trc啟動(dòng)子。然而，在細(xì)菌中有功能的其它啟動(dòng)子(諸如其它已知的細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子)也是合適的。它們的核苷酸序列已經(jīng)發(fā)表，由此熟練工作人員能夠使用提供任何所需限制位點(diǎn)的接頭或銜接頭將它們與編碼靶輕鏈和重鏈的順反子可操作連接(Siebenlistetal"Cell20:269(1980))。在本發(fā)明的一個(gè)方面，重組載體內(nèi)的每個(gè)順反子都包含指導(dǎo)所表達(dá)多肽穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)的分泌信號(hào)序列構(gòu)件。一般而言，信號(hào)序列可以是載體的構(gòu)件，或者它可以是插入栽體的靶多肽DNA的一部分。為了本發(fā)明而選擇的信號(hào)序列應(yīng)當(dāng)是受到宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即被信號(hào)肽酶切除)的信號(hào)序列。對(duì)于不識(shí)別并加工異源多肽的天然信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，將信號(hào)序列用選自例如下組的原核信號(hào)序列替代堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或熱穩(wěn)定的腸毒素II(STII)前導(dǎo)序列、LamB、PhoE、Pe舊、OmpA和MBP。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)的兩個(gè)順反子中都使用的信號(hào)序列是STII信號(hào)序列或其變體。在另一方面，依照本發(fā)明的免疫球蛋白的生成可在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生，因此不需要在每個(gè)順反子內(nèi)存在分泌信號(hào)序列。在那點(diǎn)上，免疫球蛋白輕鏈和重鏈在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)、折疊和裝配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌抹(如大腸桿菌trxB-菌抹)提供有利于二硫鍵形成的細(xì)胞質(zhì)條件，從而容許所表達(dá)蛋白質(zhì)亞基的正確折疊和裝配。ProbaandPluckthun，Gene159:203(1995))。適于表達(dá)本發(fā)明抗體的原核宿主細(xì)胞包括古細(xì)菌(Archaebacteria)和真細(xì)菌(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。有用細(xì)菌的實(shí)例包括埃希氏菌屬(Escherichia)(如大腸埃希氏菌(大腸桿菌，E.coli))、芽孢桿菌屬(Bacillus)(如枯草芽孢桿菌(B.subtilis))、腸桿菌屬(Enterobacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(如銅綠假單胞菌P.aeruginosa)物種、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、志賀氏菌屬(Shigella),根瘤菌屬(Rhizobium)、透明顫菌屬(Vitreoscilla)、或副球菌屬(Paracoccus)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用革蘭氏陰性細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用大腸桿菌細(xì)胞作為本發(fā)明的宿主。大腸桿菌菌抹的實(shí)例包括菌林W3110(Bachmann,CellularandMolecularBiology,第2巻，Washington,D.C.，美國微生物學(xué)學(xué)會(huì)，1987，第1190-1219頁；ATCC保藏號(hào)27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110AfhuA(AtonA)ptr3lacIqlacL8AompTA(nmpc畫fepE)degP41kanR的菌抹33D3(美國專利號(hào)5,639，635)。其它菌抹及其衍生物，諸如大腸桿菌294(ATCC31，446)、大腸桿菌B、大腸桿菌X1776(ATCC31,537)和大腸桿菌RV308(ATCC31,608)也是合適的。這些實(shí)例只是例示而非限制。本領(lǐng)域知道用于構(gòu)建具有指定基因型的任何上述細(xì)菌衍生物的方法，參見例如Bassetal.，Proteins8:309-314(1990)。通常必需考慮復(fù)制子在細(xì)菌細(xì)胞中的可復(fù)制性來選擇適宜的細(xì)菌。例如，在使用眾所周知的質(zhì)粒諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410來提供復(fù)制子時(shí)，大腸桿菌、沙雷氏菌屬、或沙門氏菌屬物種可能適于用作宿主。通常，宿主細(xì)胞應(yīng)當(dāng)分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在細(xì)胞培養(yǎng)中摻入額外的蛋白酶抑制劑。ii.抗體生成用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改動(dòng)的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化即將DNA導(dǎo)入原核宿主，使得DNA能夠進(jìn)行復(fù)制，或是作為染色體外元件或是通過染色體成分。根據(jù)所用宿主細(xì)胞，使用適于這些細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。采用氯化鈣的鈣處理通常用于具有堅(jiān)固細(xì)胞壁屏障的細(xì)菌細(xì)胞。另一種轉(zhuǎn)化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的還有一種技術(shù)是電穿孔。在本領(lǐng)域知道的且適于培養(yǎng)選定宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成本發(fā)明多肽的原核細(xì)胞。合適培養(yǎng)基的實(shí)例包括添加了必需營養(yǎng)補(bǔ)充物的LB培養(yǎng)基(Luriabroth)。在有些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還含有根據(jù)表達(dá)載體的構(gòu)建而選擇的選擇劑，以選擇性容許包含表達(dá)載體的原核細(xì)胞生長(zhǎng)。例如，向用于培養(yǎng)表達(dá)氨千青霉素抗性基因的細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加氨千青霉素。除了碳、氮、和無機(jī)磷酸鹽來源以外，還可含有適當(dāng)濃度的任何必需補(bǔ)充物，或是單獨(dú)加入或是作為與另一種補(bǔ)充物或培養(yǎng)基的混合物，諸如復(fù)合氮源。任選的是，培養(yǎng)基可含有一種或多種選自下組的還原劑谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基乙酸鹽/酯、二疏赤蘚糖醇和二硫蘇糖醇。在合適的溫度培養(yǎng)原核宿主細(xì)胞。例如，對(duì)于培養(yǎng)大腸桿菌，優(yōu)選的溫度范圍是約2(TC至約39'C，更優(yōu)選約25t:至約37。C，甚至更優(yōu)選約3(TC。主要取決于宿主生物體，培養(yǎng)基的pH可以是范圍為約5至約9的任何pH。對(duì)于大腸桿菌，pH優(yōu)選約6.8至約7.4，更優(yōu)選約7.0。如果本發(fā)明的表達(dá)載體中使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，那么在適于激活啟動(dòng)子的條件下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，使用PhoA啟動(dòng)子來控制多肽的轉(zhuǎn)錄。因此，為了誘導(dǎo)，在磷酸鹽限制培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)過轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的是，磷酸鹽限制培養(yǎng)基是CR.A.P培養(yǎng)基(參見例如Simmonsetal.,J.Immunol.Methods263:133-147(2002))。根據(jù)所采用的載體構(gòu)建物，可采用多種其它誘導(dǎo)物，正如本領(lǐng)域所知道的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所表達(dá)的本發(fā)明多肽分泌到宿主細(xì)胞的周質(zhì)中并從中回收。蛋白質(zhì)回收通常牽涉破壞:敞生物，通常通過諸如滲壓震擾(osmoticshock)、超聲處理或裂解等手段。一旦細(xì)胞遭到破壞，可通過離心或過濾清除細(xì)胞碎片或整個(gè)細(xì)胞。可以通過例如親和樹脂層析進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)?；蛘?，蛋白質(zhì)可能轉(zhuǎn)運(yùn)到培養(yǎng)液中并從中分離?？蓮呐囵B(yǎng)液清除細(xì)胞，并將培養(yǎng)物上清液過濾和濃縮，用于進(jìn)一步純化所生成蛋白質(zhì)。可使用普遍知道的方法諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和Western印跡分析進(jìn)一步分離和鑒定所表達(dá)蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過發(fā)酵過程大量進(jìn)行抗體生產(chǎn)。多種大規(guī)模補(bǔ)料-分批發(fā)酵流程可用于生產(chǎn)重組蛋白。大規(guī)模發(fā)酵具有至少1000升的容量，優(yōu)選約1，000至100，000升的容量。這些發(fā)酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧和養(yǎng)分，尤其是葡萄糖(優(yōu)選的碳源/能源)。小規(guī);漠發(fā)酵通常指在體積容量不超過約100升的發(fā)酵罐中進(jìn)行的發(fā)酵，范圍可以是約1升至約100升。在發(fā)酵過程中，通常在將細(xì)胞在合適條件下培養(yǎng)至期望密度(例如OD550約180-220，在此階段細(xì)胞處于早期穩(wěn)定期)后啟動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)的誘導(dǎo)。根據(jù)所采用的載體構(gòu)建物，可使用多種誘導(dǎo)物，正如本領(lǐng)域知道的和上文描述的。可在誘導(dǎo)前將細(xì)胞培養(yǎng)更短的時(shí)間。通常將細(xì)胞誘導(dǎo)約12-50小時(shí)，但是可使用更長(zhǎng)或更短的誘導(dǎo)時(shí)間。為了提高本發(fā)明多肽的產(chǎn)量和質(zhì)量，可修改多項(xiàng)發(fā)酵條件。例如，為了改善所分泌抗體多肽的正確裝配和折疊，可使用過度表達(dá)伴侶蛋白諸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴估活性的一種肽基脯氨酰-順式,反式-異構(gòu)酶)的額外載體來共轉(zhuǎn)化宿主原核細(xì)胞。已經(jīng)證明伴侶蛋白促進(jìn)在細(xì)菌宿主細(xì)胞中生成的異源蛋白質(zhì)的正確折疊和溶解度。Chenetal.，J.Biol.Chem.274:19601-19605(1999);Georgiou等人，美國專利6,083,715;Georgiou等人，美國專利6，027，888;BothmannandPluckthun,J.Biol.Chem.275:17100-17105(2000);RammandPluckthun,J.Biol.Chem.275:17106-17113(2000);Arieetal"Mol.Microbiol.39:199-210(2001))。為了將所表達(dá)異源蛋白質(zhì)(尤其是對(duì)蛋白水解敏感的異源蛋白質(zhì))的蛋白水解降至最低，可將蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌抹用于本發(fā)明。例如，可修飾宿主細(xì)胞菌抹，在編碼已知細(xì)菌蛋白酶的基因中進(jìn)行遺傳突變，諸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合?？梢垣@得有些大腸桿菌蛋白酶缺陷菌抹，參見例如Jolyetal.，(1998)見上文；Georgiou等人，美國專利5,264,365;Georgiou等人，美國專利5,508,192;Haraetal.，MicrobialDrugResistance2:63-72(1996)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)中使用蛋白水解酶缺陷且經(jīng)過過度表達(dá)一種或多種伴侶蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌林作為宿主細(xì)胞。iii.抗體純化可采用本領(lǐng)域知道的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法。下面的流程是合適純化流程的例示免疫親和或離子交換柱上的分餾、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或陽離子交換樹脂諸如DEAE上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀、和使用例如SephadexG-75的凝膠過濾。在一個(gè)方面，將固定在固相上的蛋白A用于本發(fā)明全長(zhǎng)抗體產(chǎn)物的免疫親和純化。蛋白A是來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureas)的41kD纟田胞壁蛋白質(zhì)，它以高親和力結(jié)合抗體Fc區(qū)。Lindmarketal.，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白A固定其上的固相優(yōu)選具有玻璃或石英表面的柱子，更優(yōu)選可控孔徑玻璃柱或硅酸柱。在有些應(yīng)用中，柱子以諸如甘油等試劑包被，試圖防止污染物的非特異粘附。作為純化的第一步，將衍生自如上所述細(xì)胞培養(yǎng)物的制備物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗體特異結(jié)合蛋白A。然后清洗固相以清除與固相非特異結(jié)合的污染物。最后通過洗脫從固相回收目的抗體。b.4吏用真核宿主細(xì)胞生成抗體載體構(gòu)件通常包括但不限于如下一種或多種信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一種或多種標(biāo)志基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。(i)信號(hào)序列構(gòu)件在真核宿主細(xì)胞中使用的載體還可在目的成熟蛋白質(zhì)或多肽的N端包含信號(hào)序列或具有特異切割位點(diǎn)的其它多肽。優(yōu)選受到宿主細(xì)胞識(shí)別并加工(即被信號(hào)肽酶切除)的異源信號(hào)序列。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可利用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)，例如單純皰滲病毒gD信號(hào)。將這些前體區(qū)的DNA連接到編碼抗體的DNA的讀碼框中。(ii)復(fù)制起點(diǎn)通常，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)構(gòu)件。例如，SV40起點(diǎn)通?？赡苤灰虬缙趩?dòng)子才使用。Ciii)選擇基因構(gòu)件表達(dá)和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素的抗性，如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補(bǔ)足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷；或(c)提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)物。選擇方案的一個(gè)實(shí)例利用藥物來阻滯宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。經(jīng)異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞生成賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，因而幸免于選擇方案。此類顯性選擇的實(shí)例使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)志的另一個(gè)實(shí)例是能夠鑒定有能力攝取抗體核酸的細(xì)胞的選擇標(biāo)志，諸如DHFR、胸香激酶、金屬硫蛋白I和II優(yōu)選靈長(zhǎng)類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，首先通過將所有轉(zhuǎn)化子在含有曱氨蝶呤(Mtx，DHFR的一種竟?fàn)幮赞卓箘?的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來鑒定經(jīng)DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在采用野生型DHFR時(shí)，適宜的宿主細(xì)胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系(如ATCCCRL-9096)。或者，可通過在含有針對(duì)選擇標(biāo)志的選擇劑諸如氨基糖苦抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞來選擇經(jīng)編碼抗體、野生型DHFR蛋白、和另一種選擇標(biāo)志諸如氨基糖苦3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA^f列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(特別是包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)。參見美國專利4,965,199。(iv)啟動(dòng)子構(gòu)件表達(dá)和克隆載體通常包含受到宿主生物體識(shí)別的啟動(dòng)子，且與抗體多肽核酸可操作連接。已知真核細(xì)胞的啟動(dòng)子序列。事實(shí)上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)，它位于起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)上游約25至30個(gè)堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游70至80個(gè)堿基處發(fā)現(xiàn)的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信號(hào)。所有這些序列合適的插入真核表達(dá)載體中。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中由載體轉(zhuǎn)錄抗體多肽受到例如從病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如2型腺病毒)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因組獲得的、來自異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子)的、來自熱休克啟動(dòng)子的啟動(dòng)子的控制，倘若這些啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子，該片段還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子。美國專利4,419,446中公開了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國專利4，601,978中記載了該系統(tǒng)的一種修改或者，可使用勞氏肉瘤病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列作為啟動(dòng)子。(v)增強(qiáng)子元件構(gòu)件常常通過在載體中插入增強(qiáng)子序列來提高高等真核細(xì)胞對(duì)編碼本發(fā)明抗體多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。現(xiàn)在知道來自哺乳動(dòng)物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、a-胎蛋白和胰島素)的許多增強(qiáng)子序列。然而，通常使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括SV40復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的增強(qiáng)子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多瘤病毒復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)的增強(qiáng)子、和腺病毒增強(qiáng)子。關(guān)于激活真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件還可參見Yaniv,Nature297:17-18(1982)。增強(qiáng)子可剪接到載體中，位于抗體多肽編碼序列的5'或3'位置，但是優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5'位點(diǎn)。(vi)轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件在真核宿主細(xì)胞中使用的表達(dá)載體通常還包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通常可從真核或病毒DNA或cDNA非翻譯區(qū)的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區(qū)域包含在編碼抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中轉(zhuǎn)錄成聚腺芬酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化區(qū)。參見WO94/11026及其中公開的表達(dá)載體。(vii)宿主細(xì)^^的選4奪和轉(zhuǎn)化適于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞包括本文描述的高等真核細(xì)胞，包括脊推動(dòng)物宿主細(xì)胞。脊推動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)流程。有用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例有經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(C0S-7，ATCCCRL1651)、人胚腎系(293細(xì)胞或?yàn)閼腋∨囵B(yǎng)而亞克隆的293細(xì)胞，Grahametal.,J.Gen.Virol.36:59(1977))、幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK,ATCCCCL10)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞/"DHFR(CHO,Urlaubetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))、小鼠塞托利(Sertoli)細(xì)胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))、猴腎細(xì)胞(CVl，ATCCCCL70)、非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76,ATCCCRL1587)、人宮頸癌細(xì)胞(HELA,ATCCCCL2)、犬腎細(xì)胞(MDCK,ATCCCCL34)、牛鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(BRL3A，ATCCCRL1442)、人肺細(xì)胞(W138，ATCCCCL75)、人肝細(xì)胞(HepG2，HB8065)、小鼠乳瘤(MMT060562,ATCCCCL51)、TRI細(xì)胞(Matheretal.，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))、MRC5細(xì)月包、FS4細(xì)胞和人肝細(xì)胞瘤(hepatoma)系(HepG2)。為了生成抗體，用上文所述表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改動(dòng)的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。(viii)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生成本發(fā)明抗體的宿主細(xì)胞。商品化培養(yǎng)基諸如Ham氏F10(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏修改Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM，Sigma)適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可使用下列文獻(xiàn)中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基Hametal"Meth.Enz.58:44(1979);Barnesetal"Anal.Biochem.102:255(1980);美國專利4,767，704;4，657，866;4,927,762;4,560,655;5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美國專利復(fù)審30，985。任何這些培養(yǎng)基可根據(jù)需要補(bǔ)充激素和/或其它生長(zhǎng)因子(諸如胰島素、運(yùn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核香酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCESFM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機(jī)化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以適宜濃度含有本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其它必需補(bǔ)充物。培養(yǎng)條件諸如溫度、pH等即為表達(dá)而選擇的宿主細(xì)胞先前所用的，這對(duì)于普通技術(shù)人員是顯然的。(ix)抗體的純化在使用重組技術(shù)時(shí)，可在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，那么首先需要通過例如離心或超濾清除微粒碎片，或是宿主細(xì)胞或是裂解片段。如果抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么通常首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器(例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元)濃縮來自這些表達(dá)系統(tǒng)的上清液?？稍谌魏紊鲜霾襟E中包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外來污染物的生長(zhǎng)?？墒褂美缌u磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析(優(yōu)選的純化技術(shù)是親和層析)來純化從細(xì)胞制備的抗體組合物。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可用于純4匕基于人yl、y2、或y4重鏈的^t體(Lindmarketal.，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人y3(Gussetal.,EMBOJ.5:1567-1575(1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可使用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時(shí)間。若抗體包含CH3結(jié)構(gòu)域，則可使用BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)進(jìn)行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)諸如離子交換柱上的分餾、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE和石危酸4妄沉淀。在任何初步純化步驟之后，可將含有目的抗體和污染物的混合物進(jìn)行低pH疏水相互作用層析，使用pH約2.5-4.5的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度(如約0-0.25M鹽)進(jìn)行。免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還提供了包含偶聯(lián)有細(xì)胞毒劑的本文所述任何抗OX40L抗體的免疫偶聯(lián)物(可互換的稱為"抗體-藥物偶聯(lián)物"或"ADC，，)，所述細(xì)胞毒劑諸如化療劑、藥物、生長(zhǎng)抑制劑、毒素(如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)?？贵w-藥物偶聯(lián)物在癌癥治療中用于局部投遞毒害細(xì)胞劑或抑制細(xì)胞試劑(即用于殺死或抑制腫瘤細(xì)胞的藥物)的用途(SyrigosandEpenetos,AnticancerResearch19:605-614(1999);Niculescu-DuvazandSpringer,Adv.Drg.Del.Rev.26:151-172(1997);美國專利4,975，278)能將藥物部分靶向投遞至腫瘤，并在那兒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)積累，而系統(tǒng)施用這些未經(jīng)偶聯(lián)的藥物試劑可能在試圖消除的腫瘤細(xì)胞以外導(dǎo)致不可接受的對(duì)正常細(xì)胞的毒性水平(Baldwinetal.,Lancet603-05(1986年5月15日)；Thorpe,"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",在《MonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications》中，A.Pinchera等人編，第475-506頁，.1985)。由此試圖獲得最大功效及最小毒性。多克隆抗體和單克隆抗體皆有報(bào)道可用于這些策略(Rowlandetal.，CancerImmunol.Immunother.21:183-87(1986))。這些方法中所使用的藥物包括道諾霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin),曱氨蟲萊p令(methotrexate)和長(zhǎng)春地辛(vindesine)(Rowlandetal.，1986,見上文)。抗體-毒素偶聯(lián)物中所使用的毒素包括細(xì)菌毒素諸如白喉毒素、植物毒素諸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素諸如格爾德霉素(geldanamycin)(Mandleretal.，Jour,oftheNat.CancerInst92(19):1573-1581(2000);Mandleretal.,Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028(2000);Mandleretal.,BioconjugateChem.13:786-791(2002))、美登木素生物石咸類(EP1391213;Liuetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996))、和加利車霉素(Lodeetal.，CancerRes.58:2928(1998);Hinmanetal.,CancerRes.53:3336-3342(1993))。毒素可通過包括微管蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合或拓樸異構(gòu)酶抑制在內(nèi)的機(jī)制發(fā)揮其毒害細(xì)胞和抑制細(xì)胞的效果。有些細(xì)胞毒藥物在與大的抗體或蛋白質(zhì)受體配體偶聯(lián)時(shí)趨于失活或活性降低。ZEVALIN(ibritumomabtiuxetan，Biogen/Idec)是由針對(duì)在正常和惡性B淋巴細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)的CD20抗原的鼠IgGlK單克隆抗體與通過疏脲接頭-螯合劑所結(jié)合的111In或90Y放射性同位素構(gòu)成的抗體-放射性同位素偶聯(lián)物(Wisemanetal.,Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77(2000);Wisemanetal"Blood99(12):4336-42(2002);Witzigetal.,J.Clin.Oncol.20(10):2453-63(2002);Witzigetal"J.Clin.Oncol.20(15):3262-69(2002))。盡管ZEVALIN具有針對(duì)B細(xì)胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施藥在大多數(shù)患者中導(dǎo)致嚴(yán)重且長(zhǎng)時(shí)間的血細(xì)胞減少。MYLOTARG(gemtuzumabozogamicin，WyethPharmaceuticals)，即由人CD33抗體與加利車霉素連接而構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，在2000年批準(zhǔn)用于經(jīng)注射治療急性骨髓性白血病(DrugsoftheFuture25(7):686(2000);美國專利4970198;5079233;5585089;5606040;5693762;5739116;5767285;5773001)。Cantuzumabmertansine(ImmunogenInc.)，即由huC242抗體經(jīng)二硫化物接頭SPP與美登木素生物堿藥物部分DMl連接而構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，正在進(jìn)行用于治療表達(dá)CanAg的癌癥諸如結(jié)腸癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期試驗(yàn)。MLN-2704(MillenniumPharm.,BZLBiologies,ImmunogenInc.)，即由抗前列腺特異膜抗原(PSMA)單克隆抗體與美登木素生物堿藥物部分DMl連接而構(gòu)成的抗體-藥物偶聯(lián)物，正在進(jìn)行用于前列腺腫瘤潛在治療的開發(fā)。將多拉司他汀(dolastatin)的合成類似物auristatin肽、auristatinE(AE)和單曱基auristatin(MMAE)與嵌合單克隆抗體cBR96(對(duì)癌上的LewisY特異)和cAC10(對(duì)惡性血液腫瘤上的CD30特異)偶聯(lián)(Doroninaetal.，NatureBiotechnology21(7):778-784(2003)),且正在進(jìn)行治療性開發(fā)。本文(例如上文)描述了可用于生成免疫偶聯(lián)物的化療劑?？墒褂玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自4同纟錄，支單月包菌Pseudomonasaeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮才艮毒蛋白(modeccin)A鏈、a-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白樹毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依i若霉素(enomycin)和單端孑包菌素(trichothecenes)。參見例如1993年10月28日公開的WO93/21232。多種放射性核素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。實(shí)例包括212Bi、1311、131In、90Y和186Re?？贵w和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)-疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯曱?；?己二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l,5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitettaetal.,Science238:1098(1987)中所述制備荒麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的1-異石克氰酸苯曱基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO94/11026。本文還設(shè)想了抗體與一種或多種小分子毒素諸如加利車霉素(calicheamicin)、美登木素生物石咸類(maytansinoids)、多拉司4也汀類(dolostatins)、aurostatins、單端孢霉素(trichothecene)和CC1065及這些毒素具有毒素活性的片段的偶聯(lián)物。i.美登素和美登木素生物堿類在有些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)有一個(gè)或多個(gè)美登木素生物堿分子的本發(fā)明抗體(全長(zhǎng)或片段)。美登木素生物堿類是通過抑制微管蛋白多聚化來發(fā)揮作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(Maytenusserrata)分離得到(美國專利3，896,111)。隨后發(fā)現(xiàn)某些微生物也生成美登木素生物堿類，諸如美登醇和C-3美登醇酯(美國專利4,151,042)。例如下列美國專利公開了合成美登醇及其衍生物和類似物4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371，533。美登木素生物堿類藥物模塊在抗體藥物偶聯(lián)物中是有吸引力的藥物模塊，因?yàn)樗鼈?i)相對(duì)易于通過發(fā)酵或發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)修飾、衍生化來制備；(ii)易于用適于通過非二硫化物接頭的偶聯(lián)的官能基衍生化；(iii)在血漿中穩(wěn)定；且(iv)有效針對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系。治療用途美國專利5,208,020;5，416，064;及歐洲專利EP0425235Bl,明確將其公開內(nèi)容收入本文作為參考。Liuetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)記載了包含與針對(duì)人結(jié)腸直腸癌的單克隆抗體C242連接的稱為DM1的美登木素生物堿的免疫偶聯(lián)物。發(fā)現(xiàn)該偶聯(lián)物具有針對(duì)培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞的高度細(xì)胞毒性，而且在體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)測(cè)定法中顯示抗腫瘤活性。Charietal.,CancerResearch52:127-131(1992)記載了其中美登木素生物堿經(jīng)二硫化物接頭與結(jié)合人結(jié)腸癌細(xì)胞系上抗原的鼠抗體A7或結(jié)合HER-2/neu癌基因的另一種鼠單克隆抗體TA.1偶聯(lián)的免疫偶聯(lián)物。在體外在人乳癌細(xì)胞系SK-BR-3上測(cè)試了TA.1-美登木素生物堿偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性，該細(xì)胞系每個(gè)細(xì)胞表達(dá)3xl()S個(gè)HER-2表面抗原。藥物偶聯(lián)物達(dá)到了與游離美登木素生物堿藥物相似的一定程度的細(xì)胞毒性，這可通過增加每個(gè)抗體分子偶聯(lián)的美登木素生物堿分子數(shù)目來提高。A7-美登木素生物堿偶聯(lián)物在小鼠中顯示低系統(tǒng)性細(xì)胞毒性。連接且不顯著削弱抗體或美登木素生物;咸分子的生物學(xué)活性來制備。參見例如美國專利No.5,208,020,明確將其公開內(nèi)容收入本文作為參考。每個(gè)抗體分子偶聯(lián)平均3-4個(gè)美登木素生物堿分子在增強(qiáng)針對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性中顯示功效，且對(duì)抗體的功能或溶解度沒有負(fù)面影響，盡管預(yù)計(jì)甚至一個(gè)分子的毒素/抗體也將較之棵抗體的使用增強(qiáng)細(xì)胞毒性。美登木素生物堿類在本領(lǐng)域是眾所周知的，而且可通過已知技術(shù)合成或從天然來源分離。例如美國專利生物堿類。優(yōu)選的美登木素生物堿類是美登醇和美登醇分子的芳香環(huán)或其它位置經(jīng)過修飾的美登醇類似物，諸如各種美登醇酯。本領(lǐng)域知道許多連接基團(tuán)可用于制備抗體-美登木素生物堿偶聯(lián)物，包括例如美國專利5,208，020或歐洲專利0425235Bl;Charietal.,CancerResearch52:127-131(1992);2004年10月9日提交的美國專利申請(qǐng)No.10/960,602中所公開的，明確將其公開內(nèi)容收入本文作為參考。包含接頭構(gòu)件SMCC的抗體-美登木素生物堿類偶聯(lián)物可以如2004年10月8日提交的美國專利申請(qǐng)No.10/960,602中所披露的來制備。連接基團(tuán)包括二硫化物基團(tuán)、硫醚基團(tuán)、酸不穩(wěn)定基團(tuán)、光不穩(wěn)定基團(tuán)、肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)、或酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)，正如上文所述專利中所公開的，優(yōu)選二碌"匕物和碌b醚基團(tuán)。本文中描述和例示了別的連接基團(tuán)?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和美登木素生物堿的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞氨基一4-(N-馬來酰亞氨基曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(SMCC)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)-疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯曱?；?-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l，5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlssonetal.,Biochem.J.173:723-737(1978))和N畫琥珀酰亞氨基-4-(2-吡吱基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫鍵連接。根據(jù)連接的類型，可將接頭附著于美登木素生物堿分子的多個(gè)位置。例如，可使用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)通過與羥基的反應(yīng)來形成酯鍵。反應(yīng)可發(fā)生在具有羥基的C-3位置、經(jīng)羥曱基修飾的C-14位置、經(jīng)羥基修飾的C-15位置、和具有羥基的C-20位置。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在美登醇或美登醇類似物的C-3位置形成鍵連接。ii.Auristatin和多拉司他汀在有些實(shí)施方案中，免疫偶聯(lián)物包含與多拉司他汀類(dolastatins)或多拉司他汀肽類似物及衍生物、auristatin類偶聯(lián)的本發(fā)明抗體(美國專利No.5,635,483;5,780,588)。多拉司他汀類和auristatin類已經(jīng)顯示出干擾微管動(dòng)力學(xué)、GTPK解、及核和細(xì)胞分裂(Woykeetal(2001)Antimicrob.AgentsandChemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(US5,663，149)和抗真菌活性(Pettitetal(1998)Antimicrob.AgentsChemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin藥物模塊可經(jīng)由肽藥物模塊的N(氨基)末端或C(羧基)末端附著于抗體(WO02/088172)。例示性的auristatin實(shí)施方案包括N-末端連接的單曱基auristatin藥物模塊DE和DF，披露于"MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands",US流水號(hào)No.10/983,340，2004年11月5日提交，明確將其公開內(nèi)容完整收入本文作為參考。典型的是，基于肽的藥物模塊可通過在兩個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵來制備。此類肽鍵可依照例如肽化學(xué)領(lǐng)域眾所周知的液相合成法來制備(參見E.Schr6derandK.Liibke，ThePeptides,volume1，pp76-136，1965，AcademicPress)。auristatin/多拉司他汀藥物模塊可依照以下文獻(xiàn)中的方法來制備US5,635,483;US5,780,588;Pettitetal(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465;Pettitetal(1998)Anti-CancerDrugDesign13:243-277;Pettit,G.R.，etal.Synthesis,1996，719-725;Pettitetal(1996)J.Chem.Soc.PerkinTrans.15:859-863;及Doronina(2003)NatBiotechnol21(7):778-784;"MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands",美國流水號(hào)No.10/983,340,2004年11月5日提交，將其完整收入本文作為參考(披露了例如制備諸如MMAE和MMAF偶聯(lián)至接頭的單曱基纈氨酸化合物的接頭和方法)。iii.加利車霉素在其它說是反拿中，免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)有一個(gè)或多個(gè)加利車霉素分子的本發(fā)明抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度生成雙鏈DNA斷裂。關(guān)于加利車霉素家族偶聯(lián)物的制備參見美國專利5,712,374;5,714,586;5，739，116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;5，877，296(都授予美國Cyanamid公司)?？捎玫募永嚸顾亟Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于yll、a21、a31、N-乙?；?ylI、PSAG和eil(Hinmanetal.，CancerResearch53:3336-3342(1993);Lodeetal.，CancerResearch58:2925-2928(1998);及上述授予美國Cyanamid公司的美國專利)?？膳c抗體綴合的另一種抗腫瘤藥物是QFA,它是一種抗葉酸藥物。加利車霉素和QFA都具有胞內(nèi)作用位點(diǎn)，且不易穿過質(zhì)膜。因此，這些試劑經(jīng)由抗體介導(dǎo)的內(nèi)在化的細(xì)胞攝取大大增強(qiáng)了它們的細(xì)胞毒效果。iv.其它細(xì)胞毒劑可與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的其它抗腫瘤劑包括BCNU、鏈佐星(streptozoicin)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、5-氟尿。密咬、美國專利5,053,394、5，770，710中記載的統(tǒng)稱為L(zhǎng)L-E33288復(fù)合物的試劑家族、及埃斯波霉素類(esperamicins)(美國專利5,877,296)?？捎玫拿富钚远舅丶捌淦伟ò缀矶舅谹鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A鏈、相思豆毒蛋白(abrin)A鏈、蒴蓮才艮毒蛋白(modeccin)A鏈、a-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP畫S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、月巴皂草(sapaonariaofficinalis)4卬制4勿、白初于毒蛋白(gelonin)、絲4木霉素(mitogellin)、局卩艮曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依i若霉素(enomycin)和單端孢菌素(trichothecenes)。參見例如1993年10月28日公布的WO93/21232。本發(fā)明還設(shè)想了抗體和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶，諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成的免疫偶聯(lián)物。為了選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生成放射偶聯(lián)抗體。實(shí)例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb^和Lu的放射性同位素。在將偶聯(lián)物用于檢測(cè)時(shí)，可包含放射性原子用于閃爍照相研究，例如Tc"m或I123，或是包含自旋標(biāo)記物用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、4L、錳或鐵。可以已知方式將放射性或其它標(biāo)記物摻入偶聯(lián)物。例如，可生物合成肽，或是通過化學(xué)氨基酸合成法合成肽，其中使用牽涉例如氟-19代替氫的合適氨基酸前體?？山?jīng)肽中的半胱氨酸殘基來附著標(biāo)記物，諸如Tc"m或I123、Rel86、Rel88和In111?？梢越?jīng)賴氨酸殘基來附著釔-90。IODOGEN法(Frakeretal.,Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57(1978))可用于4參入石典-123。《MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy》(Chatal，CRCPress,1989)詳細(xì)記載了其它方法?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯(SMCC)、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)-疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯曱?；?-乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如曱苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l，5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitettaetal.，Science238:1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的l-異硫氰酸苯曱基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苦酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒藥物的"可切割接頭"。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩(wěn)定接頭、二曱基接頭、或含二硫化物接頭(Charietal.，CancerResearch52:127-131(1992);美國專利5,208,020)。本發(fā)明的化合物明確涵蓋但不限于用下列交聯(lián)劑制備的ADC:商品化(如購自PierceBiotechnologyInc.,Rockford，IL,U.S.A.)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC掘CC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。見2003-2004年度應(yīng)用手冊(cè)和產(chǎn)品目錄(ApplicationsHandbookandCatalog)第467-498頁。v.抗體-藥物偶聯(lián)物的制備在本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)中，將抗體(Ab)經(jīng)接頭(L)與一個(gè)或多個(gè)藥物部分(D)綴合，例如每個(gè)抗體偶聯(lián)約1個(gè)至約20個(gè)藥物部分。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的有機(jī)化學(xué)反應(yīng)、條件和試劑通過數(shù)種路徑來制備通式I的ADC，包括(1)抗體的親核基團(tuán)經(jīng)共價(jià)4定與二價(jià)接頭試劑反應(yīng)，形成Ab-L，隨后與藥物部分D反應(yīng)；和(2)藥物部分的親核基團(tuán)經(jīng)共價(jià)4建與二價(jià)接頭試劑反應(yīng)，形成D-L，隨后與抗體的親核基團(tuán)反應(yīng)。本文中描述了用于制備ADC的別的方法。Ab-(L-D)pI接頭可以由一種或多種接頭構(gòu)件構(gòu)成。例示性的接頭構(gòu)件包括6-馬來酰亞胺己?；?"MC")、馬來酰亞胺丙酰基("MP")、纈氨酸-瓜氨酸("val-cit")、丙氨酸-苯丙氨酸("ala-phe")、對(duì)氨基千氧羰基("PAB")、4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀酰亞氨基酯("SPP")、4-(N-馬來酰亞胺曱基)環(huán)己烷-l羧酸N-琥珀酰亞氨基酯("SMCC')、和(4-碘-乙?；?氨基苯曱酸N-琥珀酰亞氨基酯("SIAB")。本領(lǐng)域知道別的接頭構(gòu)件，本文也描述了一些。還可參見"MonomethylvalineCompoundsCapableofConjugationtoLigands，，，美國流水號(hào)No.10/983,340，2004年11月5日提交，將其完整內(nèi)容收入本文作為參考。在有些實(shí)施方案中，接頭可包含氨基酸殘基。例示性的氨基酸接頭構(gòu)件包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括纈氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括甘氨酸-纈氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。構(gòu)成氨基酸接頭構(gòu)件的氨基酸殘基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸類似物，諸如瓜氨酸。氨基酸接頭構(gòu)件可以在它們的特定酶(例如腫瘤相關(guān)蛋白酶，組織蛋白酶B、C和D,或纖溶酶蛋白酶)的酶促切割的選^f奪性方面進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化?？贵w的親核基團(tuán)包括但不限于(i)N末端氨基；(ii)側(cè)鏈氨基，如賴氨酸；(iii)側(cè)鏈巰基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗體中糖的羥基或氨基。氨基、疏基、和羥基是親核的，能夠與接頭部分上的親電子基團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、卣代曱酸酉旨、和酸性卣化物；(ii)烷基和苯曱基卣化物，諸如卣代乙酰胺；(iii)醛類、酮類、羧基和馬來酰亞胺基團(tuán)。某些抗體具有可還原的鏈間二硫鍵，即半胱氨酸橋。可通過還原劑諸如DTT(二硫蘇糖醇)處理使抗體具有與接頭試劑綴合的反應(yīng)活性。每個(gè)半胱氨酸橋理論上將形成兩個(gè)反應(yīng)性碌u醇親核體?？山?jīng)由賴氨酸與2-亞氨基疏烷(Traut氏試劑)的反應(yīng)，導(dǎo)致胺轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼?，從而將額外親核基團(tuán)引入抗體?？梢酝ㄟ^導(dǎo)入一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、或更多個(gè)半胱氨酸殘基(例如制備包含一個(gè)或多個(gè)非天然半胱氨酸氨基酸殘基的突變型抗體)而將反應(yīng)性硫醇基導(dǎo)入抗體(或其片段)。還可通過修飾抗體來生成本發(fā)明的抗體-藥物偶聯(lián)物，即引入可與接頭試劑或藥物上的親核取代基反應(yīng)的親電子部分?？捎美绺叩馑猁}氧化劑氧化糖基化抗體的糖，從而形成可與接頭試劑或藥物部分的胺基團(tuán)反應(yīng)的醛或酮基團(tuán)。所得亞胺Schiff堿基可形成穩(wěn)定的鍵，或者可用例如硼氫化物試劑還原而形成穩(wěn)定的胺連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化抗體的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏高碘酸鈉的反應(yīng)可在蛋白質(zhì)中生成羰(醛和酮)基團(tuán)，它可與藥物上的適宜基團(tuán)反應(yīng)(Hermanson,BioconjugateTechniques)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含N末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的蛋白質(zhì)可與偏高石與酸鈉反應(yīng)，導(dǎo)致在第一個(gè)氨基酸處生成醛(Geoghegan&Stroh，BioconjugateChem.3:138-146(1992);US5,362,852)。此類醛可與藥物部分或接頭親核體反應(yīng)。同樣，藥物部分上的親核基團(tuán)包括但不限于胺、硫醇、羥基、酰肼、肟、肼、縮氨基疏脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基團(tuán)，它們能夠與接頭部分上的親電子基團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵，而接頭試劑包括(i)活性酯類，諸如NHS酯、HOBt酯、卣代曱酸酯、和酸性囟化物；(ii)烷基和苯曱基面化物，諸如卣代乙酰胺；(iii)醛類、酮類、羧基、和馬來酰亞胺基團(tuán)?；蛘撸赏ㄟ^例如重組技術(shù)或肽合成來制備包含抗體和細(xì)胞毒劑的融合蛋白。DNA的長(zhǎng)度可包含各自編碼偶聯(lián)物兩個(gè)部分的區(qū)域，或是彼此毗鄰或是由編碼接頭肽的區(qū)域分開，該接頭肽不破壞偶聯(lián)物的期望特性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，可將抗體與"受體"(諸如鏈霉親和素)偶聯(lián)從而用于腫瘤預(yù)先靶向，其中對(duì)患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，接著使用清除劑由循環(huán)中清除未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與細(xì)胞毒劑(如放射性核苷酸)偶聯(lián)的"配體"(如親合素)。藥用配制劑包含本發(fā)明抗體的治療用配制劑可通過將具有期望純度的抗體與任選的生理學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy20thedition(2000))混合，以水溶液、凍干或其它干燥劑型的形式制備供貯存。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受^_無毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二曱基千基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；對(duì)羥基苯曱酸烷基S旨，諸如對(duì)羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。合物，優(yōu)選那些活性互補(bǔ)且彼此沒有不利影響的。合適的是，此類分子以對(duì)于預(yù)定目的有效的量組合存在?；钚猿煞诌€可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)披露于例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy20thedition(2000》用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過濾來實(shí)現(xiàn)。可制備持續(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有本發(fā)明免疫球蛋白的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠嚢。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交S旨(美國專利No.3,773,919)、L-谷氨酸與L-谷氨酸Y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞^=木構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然諸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能夠釋放分子達(dá)100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。當(dāng)封裝的免疫球蛋白在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間維持時(shí)，它們可能由于暴露于37'C的潮濕環(huán)境而變性或聚集，導(dǎo)致生物學(xué)活性損失和免疫原性可能改變?？梢愿鶕?jù)相關(guān)機(jī)制來設(shè)計(jì)合理的穩(wěn)定化策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是經(jīng)由硫-二硫化物互換的分子間S-S鍵形成，那么可通過修飾巰基殘基、由酸性溶液凍干、控制濕度、采用適宜添加劑和開發(fā)特定聚合物基質(zhì)組合物來實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定。用途本發(fā)明的抗體可用于，例如，體夕卜(invitro)、離體(exvivo)和體內(nèi)(invivo)治療方法。一方面，本發(fā)明提供治療或者預(yù)防免疫病癥的方法，該方法包括給需要這種治療的患者施用有效量的抗OX40L抗體。在一些實(shí)施方式中，所述病癥是免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，所述病癥是自身免疫病癥。在一些實(shí)施方式中，所述病癥是哮喘，特應(yīng)性皮炎，過敏性鼻炎，炎癥性腸病，多發(fā)性硬化，GVHD和/或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。在一些實(shí)施方式中，所述病癥是與疾病相關(guān)的病毒、細(xì)菌或者其它感染原所致的病癥。參見US2005/0069548A1。此外，本發(fā)明的至少一些抗體能夠結(jié)合其它種屬的抗原。因此，可使用本發(fā)明的抗體結(jié)合特異抗原的活性，例如，在包含抗原的細(xì)胞培養(yǎng)物中，在具有與本發(fā)明抗體交叉反應(yīng)的抗原的人類受試者或者其它哺乳動(dòng)物中(例如黑猩猩，狒狒，狨，短尾猴和恒河猴，豬或者小鼠)結(jié)合抗原。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體可用于抑制抗原的活性，通過將抗原與抗體接觸以致抗原活性被抑制。優(yōu)選的，所述抗原是人蛋白分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以在結(jié)合患者體內(nèi)抗原的方法中使用本發(fā)明的抗體，包括給受試者施用本發(fā)明的抗體以致受試者體內(nèi)的抗原被結(jié)合，所述受試者患有與增加的抗原表達(dá)和/或活性有關(guān)的病癥。優(yōu)選的，抗原是人蛋白分子，受試者是人受試者。此外，受試者可以是表達(dá)與本發(fā)明的抗體結(jié)合的抗原的哺乳動(dòng)物。此外受試者可以是已經(jīng)導(dǎo)入抗原的哺乳動(dòng)物(例如，通過抗原給藥或者通過抗原轉(zhuǎn)基因表達(dá))。本發(fā)明的抗體可以給藥人類受試者用于治療目的。此外，本發(fā)明的抗體可以給藥非人哺乳動(dòng)物用于獸醫(yī)目的或者作為人類疾病的動(dòng)物模型，所述非人哺乳動(dòng)物(例如，靈長(zhǎng)類動(dòng)物，豬或者小鼠)表達(dá)與免疫球蛋白交叉反應(yīng)的抗原。對(duì)于后者，這種動(dòng)物模型可用于評(píng)價(jià)本發(fā)明抗體的治療效果(例如，劑量和給藥時(shí)程的試驗(yàn))。本發(fā)明的抗體可用于治療、抑制、延緩進(jìn)展、預(yù)防/延緩復(fù)發(fā)、改善或者預(yù)防一種或者多種與抗原分子的表達(dá)和/或活性相關(guān)的疾病、紊亂或者狀態(tài)。在某些實(shí)施方式中，給患者施用免疫偶聯(lián)物，所述免疫偶聯(lián)物包括與一種或者多種細(xì)胞毒性劑偶聯(lián)的抗體。在一些實(shí)施方式中，免疫偶聯(lián)物和/或其結(jié)合的抗原被細(xì)胞內(nèi)化，導(dǎo)致免疫偶聯(lián)物在殺傷其結(jié)合的靶細(xì)胞方向治療效力增強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞毒性劑靶向或者干擾靶細(xì)胞中的核酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞毒性劑靶向或者干擾微管聚合。這種細(xì)胞毒性劑的實(shí)例包括此處記錄的任意一種化療齊'J(例如maytansinoid，auristatin,dolastatin或者calicheamicin)，放射性同位素，或者核糖核酸酶或者DNA核酸內(nèi)切酶。發(fā)明的抗體可以與另外的抗體、類固醇(例如可吸入的、全身性或者皮膚用固醇)、化療劑(包括化療劑的混合物)、其它細(xì)胞毒性劑、抗血管生成劑、細(xì)胞因子和/或生長(zhǎng)抑制劑共同給藥。上面提及的這種組合療法包括組合給藥(其中兩種或更多藥劑被包括在相同或者分離的制劑中)和分別給藥，在這種情況下，本發(fā)明抗體的給藥可以發(fā)生在輔助療法給藥之前和\或之后。與抗EphB4抗體共同給藥的治療劑的有效量取決于醫(yī)師或者獸醫(yī)的判斷。完成劑量給藥和調(diào)整以實(shí)現(xiàn)對(duì)待治療病癥的最大控制。此外劑量取決于使用的治療劑類型和待治療的特定患者狀況。在某些實(shí)施方式中，抑制劑的組合增強(qiáng)單一抑制劑的效果。術(shù)語"增強(qiáng)"是指治療劑在其常用或者批準(zhǔn)劑量時(shí)效果的提高。本發(fā)明抗體(和輔助治療劑)通過任意合適的方法給藥，包括腸胃外的，皮下的，腹膜內(nèi)的，肺內(nèi)的和鼻內(nèi)的，和，如果需要局部療法，局部給藥。腸胃外輸注包括肌內(nèi)的，靜脈內(nèi)的，動(dòng)脈內(nèi)的，腹膜內(nèi)的或者皮下的給藥。此外，通過脈沖輸注適當(dāng)給藥抗體，尤其是逐漸降低劑量的抗體?？梢酝ㄟ^任意合適的途徑給藥，例如通過注射，例如靜脈內(nèi)或者皮下注射，這部分取決于是短暫給藥還是長(zhǎng)期給藥。以符合良好醫(yī)療實(shí)踐的方式配方(formulated)、配制(dosed)和給藥本發(fā)明的抗體組合物。該情況下考慮的因素包括待治療的特定病癥，待治療的特定哺乳動(dòng)物，個(gè)體患者的臨床病癥，病癥起因，藥劑輸送位點(diǎn)，給藥方法，給藥時(shí)間表，和執(zhí)業(yè)醫(yī)生已知的其它因素?？贵w沒有必要，但是可選地與一種或者多種目前用于預(yù)防或者治療所述病癥的藥劑一起配制。這類其它藥劑的有效量取決于制劑中存在的本發(fā)明抗體的量、病癥或者治療的類型和上面討論的其它因素。這些通常使用與上文所用相同的劑量和給藥途經(jīng)，或者大約從1到99%的在此之前使用的劑量。為了疾病的預(yù)防或者治療，本發(fā)明抗體的合適劑量(當(dāng)單獨(dú)使用或者與其它藥劑聯(lián)合使用時(shí))取決于待治療疾病的類型，抗體類型，疾病的嚴(yán)重程度和病程，給藥抗體是用于預(yù)防還是治療目的，先前的療法，患者臨床史和對(duì)抗體的應(yīng)答，和主治醫(yī)師的判斷。將抗體一次性或者在一系列治療中適當(dāng)?shù)亟o藥患者。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度，大約lpg/kg到15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗體是給藥患者的初始候選劑量，例如，通過一次或者多次分別給藥，或者通過連續(xù)的輸注。一種典型的每日劑量可以從大約l嗎/kg到IOOmg/kg或者更多，取決于如上所述的因素。為了在數(shù)天或者更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)重復(fù)給藥，根據(jù)病癥，維持治療直到發(fā)生所期望的癥狀抑制?？贵w的示范性劑量從大約0.05mg/kg到大約10mg/kg。因此，可以給藥患者大約0.5mg/kg,2.0mg/kg,4.0mg/kg或者10mg/kg(或者其任意組合)的一種或者多種劑量。這種劑量可以間歇給藥，例如每隔一周或者每隔三周(例如這樣的話患者收到大約2到大約20,例如大約6個(gè)劑量的抗體)。可以給藥更高的起始負(fù)載劑量(initialloadingdose)，繼之以一種或者多種更低的劑量。示范性的給藥方式包括給藥大約4mg/kg的起始負(fù)載劑量，繼之以大約2mg/kg抗體的周維持劑量。但是，也可以使用其它給藥劑量方案。可以方便的通過常規(guī)技術(shù)和測(cè)定法監(jiān)控這類療法的進(jìn)程。本發(fā)明的抗OX40L抗體可用于特定細(xì)胞或者組織中檢測(cè)OX40L表達(dá)的測(cè)定法(例如診斷或者預(yù)測(cè)測(cè)定法)，其中抗體按如下所述進(jìn)行標(biāo)記和/或固定在不溶基質(zhì)上。另一方面，本發(fā)明提供用于OX40L檢測(cè)的方法，該方法包括檢測(cè)樣品中的OX40L-抗OX40L抗體復(fù)合物。本文使用的術(shù)語"檢測(cè)"包括參考對(duì)照或者不參考對(duì)照的定性和/或定量檢測(cè)(測(cè)量水平)。該方法包括檢測(cè)生物樣品中的OX40L-抗OX40L抗體復(fù)合物，所述生物樣品來自患有或者懷疑患有所述病癥的患者。在一些實(shí)施方式中，OX40L表達(dá)是增加的表達(dá)或者異常(不需要)的表達(dá)。另一方面，本發(fā)明提供任意一種本文描述的抗OX40L抗體，其中抗OX40L抗體包^"可4全測(cè)的標(biāo)記。另一方面，本發(fā)明提供本文描述的任意一種抗OX40L抗體和OX40L的復(fù)合物。在一些實(shí)施方式中，所述復(fù)合物是體內(nèi)或者體外的。在一些實(shí)施方式中，^tt合物包括癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，抗OX40L抗體被可檢測(cè)的標(biāo)記?？筄X40L抗體可用于大量公知檢測(cè)分析法中任意一種的OX40L檢測(cè)。例如，通過從目標(biāo)來源獲得樣品用于對(duì)生物樣品進(jìn)行OX40L的測(cè)定，將樣品與抗OX40L抗體混合以允許抗體與混合物中存在的任意OX40L形成抗體/OX40L復(fù)合物，檢測(cè)混合物中存在的任意抗體/OX40L復(fù)合物。可以通過本領(lǐng)域已知的適于特定樣品的方法制備生物樣品。根據(jù)使用的測(cè)定類型選擇混合樣品與抗體的方法和;f企測(cè)抗體/OX40L復(fù)合物的方法。這類測(cè)定法包括免疫組織化學(xué)，竟?fàn)幮院蛫A心測(cè)定法，和空間位阻測(cè)定法。OX40L分析方法均使用一種或者多種下列試劑標(biāo)記的OX40L類似物，固定的OX40L類似物，標(biāo)記的抗OX40L抗體，固定的抗OX40L抗體和空間偶聯(lián)物。標(biāo)記的試劑還被稱為"顯跡物"。使用的標(biāo)記物是不干擾OX40L和抗OX40L抗體結(jié)合的任意可檢測(cè)官能團(tuán)。已知許多標(biāo)記物可用于免疫測(cè)定法，實(shí)例包括可以直接檢測(cè)的基團(tuán)(moiety)，例如熒光染料、化學(xué)發(fā)光和放射性標(biāo)記物以及基團(tuán)，例如酶，它們必須反應(yīng)或者衍生以便能夠被檢測(cè)。這種標(biāo)記物的實(shí)例包括使用的標(biāo)記物是不干擾OX40L和抗OX40L抗體結(jié)合的任意可檢測(cè)官能團(tuán)。許多標(biāo)記物已知可用于免疫測(cè)定法，實(shí)例包括可以直接檢測(cè)的基團(tuán)，例如熒光染料、化學(xué)發(fā)光和放射性標(biāo)記物以及基團(tuán)，例如酶，它們必須反應(yīng)或者衍生以便能夠被檢測(cè)。這種標(biāo)記物的實(shí)例包括放射性同位素"P，14C,1251，^和1311，熒光團(tuán)例如稀土螯合物或者熒光素和其衍生物，若丹明和其衍生物，丹酰，傘形酮，熒光素酶，例如，焚火蟲焚光素酶和細(xì)菌焚光素酶(美國專利4，737，456)，熒光素，2，3-dihydrophthalazinediones，辣根過氧化物酶(HRP),堿性磷酸酶，|3-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖類氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脫氬酶，雜環(huán)氧化酶例如尿酸酶和黃噤呤氧化酶，偶聯(lián)使用過氧化氫以氧化染料前體(例如HRP)的酶、乳過氧化物酶或者微過氧化物酶、生物素/抗生物素蛋白、自旋標(biāo)記物、噬菌體標(biāo)記物、穩(wěn)定自由基，等等偶聯(lián)。已經(jīng)有將這些標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合到蛋白或者多肽的常規(guī)方法。例如，偶聯(lián)劑例如二醛，碳化二亞胺，雙馬來酰亞胺，雙亞氨酸乙酯，雙偶氮聯(lián)苯胺和類似物可用于標(biāo)記具有上述焚光、化學(xué)發(fā)光和酶標(biāo)記物的抗體。參見，例如，美國專利3,940,475(熒光測(cè)定法)和3,645，090(酶)；Hunter等人，A^wre，144:945(1962);David等人，所oc/^m^^v，13:1014-1021(1974);Pain等人，■//wmwwo/.Mef/20成40:219-230(1981);和Nygren,J.///加c/zem.Q^oc/zew.'30:407-412(1982)。此處優(yōu)選的標(biāo)記物是酶例如辣才艮過氧化物酶和堿性磷酸酶。包括酶的這種標(biāo)記物與抗體的偶聯(lián)對(duì)熟悉免疫測(cè)定技術(shù)的普通技術(shù)人員來說是一種標(biāo)準(zhǔn)操作步驟。參見，例如，O'Sullivan等人，"MethodsforthePreparationofEnzyme-antibodyConjugatesforUseinEnzymeImmunoassay,"inM"/zoA五"z戸o/ogy，ed.J.J.LangoneandH.VanVunakis,Vol.73(AcademicPress,NewYork,NewYork,1981)，147-166頁。某些測(cè)定法需要試劑的固定。固定需要將抗OX40L抗體同仍然在溶液中游離的任意OX40L分離。在測(cè)定步驟前通常伴隨使抗OX40L抗體或者OX40L類似物不溶解，通過吸附到不溶于水的基質(zhì)或者表面(Bennich等人，U.S.3,720,760),通過共價(jià)偶聯(lián)(例如，利用戊二醛交聯(lián))，或者之后通過使OX40L抗體或者OX40類似物不溶解(例如，通過免測(cè)沉淀法)?？梢岳妹庖呓M織化學(xué)和染色實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)樣品中蛋白的表達(dá)。組織切片的免疫組織化學(xué)染色已被證明是一種測(cè)定或者4企測(cè)樣品中蛋白存在的可靠方法。免疫組織化學(xué)("IHC")技術(shù)利用抗體探測(cè)并在原位觀察細(xì)胞抗原，這通常通過生色或者焚光方法進(jìn)行。對(duì)于樣品制備，可以使用來自哺乳動(dòng)物(通常是人類患者)的組織或者細(xì)胞樣品。可以通過本領(lǐng)域已知的各種步驟獲得樣品，包括但不限于手術(shù)切割、抽吸或者活組織切片。組織可以是新鮮或者冷凍的。在一個(gè)實(shí)施方式中，樣品被固定和埋入石蠟或者類似物中?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法固定(即保存)組織樣品。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員清楚固定劑的選擇由樣品是用于組織染色還是其它分析的目的來決定。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還清楚固定時(shí)長(zhǎng)取決于組織樣品的大小和使用的固定劑。IHC可以與其它技術(shù)例如形態(tài)學(xué)染色和/或焚光原位雜交一起進(jìn)行?，F(xiàn)有兩種常用的IHC方法；直接和間接測(cè)定法。根據(jù)第一種測(cè)定法，直接檢測(cè)抗體與靶抗原(例如，OX40L)的結(jié)合。這種直接測(cè)定法使用標(biāo)記的試劑，例如熒光標(biāo)簽或者酶標(biāo)記的第一抗體，其不需要進(jìn)一步的抗體相互作用就能觀察。在典型的間接測(cè)定法中，未偶聯(lián)的第一抗體結(jié)合抗原，然后標(biāo)記的第二抗體結(jié)合第一抗體。當(dāng)?shù)诙贵w與酶標(biāo)記物偶聯(lián)時(shí)，添加生色或者熒光底物以觀察抗原。因?yàn)槿舾煞N第二抗體可以與第一抗體上的不同表位反應(yīng)而發(fā)生信號(hào)放大。用于免疫組織化學(xué)的第一和/或第二抗體通常用可檢測(cè)的基團(tuán)標(biāo)記?，F(xiàn)有的許多標(biāo)記物通常可以分成下列類型.除了上述討論到的樣品制備步驟外，可能還需要在IHC之前、期間或者之后對(duì)組織切片進(jìn)行處理，例如，表位恢復(fù)方法，例如在檸檬酸緩沖液中對(duì)纟且織才羊品進(jìn)4亍力口熱(參見，，H口，Leong等人jp;/./mmwwo/^toc/zem.4(3):201(1996))。在任選封閉步驟后，組織切片在合適條件下接觸第一抗體足夠時(shí)間段以便第一抗體與組織樣品中的靶蛋白抗原結(jié)合。實(shí)現(xiàn)這些的合適條件可以通過常規(guī)試驗(yàn)方法確定?？贵w與樣品的結(jié)合程度通過使用上述討論到的任意一種可檢測(cè)標(biāo)記物來確定。優(yōu)選的，標(biāo)記物是酶標(biāo)記物(例如HRPO)，其催化生色底物例如3,3'-二氨基聯(lián)苯胺色原體的化學(xué)變化。優(yōu)選的酶標(biāo)記物被偶聯(lián)到特異結(jié)合第一抗體的抗體(例如第一抗體是兔多克隆抗體，第二抗體是山羊抗兔抗體)。如此制備的標(biāo)本被固定和蓋片。然后進(jìn)行載玻片鑒定，例如利用顯微鏡，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)使用的染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)。其它測(cè)定法，稱為竟?fàn)幮曰蛘邐A心測(cè)定法，已經(jīng)被明確建立并被廣泛用于商業(yè)i貪斷工業(yè)。竟?fàn)幏治龇ㄒ蕾囉陲@跡物OX40L類似物與待測(cè)樣品OX40L竟?fàn)幱邢蘖康目筄X40L抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的能力。竟?fàn)幥昂罂筄X40L抗體通常是不溶解分離。通過輕輕倒出(其中結(jié)合伴侶是預(yù)先不溶解的)或者通過離心(其中結(jié)合伴侶在竟?fàn)幏磻?yīng)后沉淀)實(shí)現(xiàn)這種分離。待測(cè)樣品OX40L的量與結(jié)合的顯跡物的量成反比，所述結(jié)合顯跡物的量通過標(biāo)記物質(zhì)的量測(cè)定。繪制OX40L已知量的劑量反應(yīng)曲線，與試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較以定量確定待測(cè)樣品中存在的OX40L的量。當(dāng)使用酶作為可4全測(cè)標(biāo)記物時(shí)，這些測(cè)定法凈皮稱為ELISA系統(tǒng)。另一種竟?fàn)幏治龇?，稱為"均相"測(cè)定法，不需要相分離。此處，制備并使用酶與OX40L的偶聯(lián)物，這樣的話當(dāng)抗OX40L抗體結(jié)合OX40L時(shí)，抗OX40L抗體的存在改變酶活性。在這種情況下，OX40L或者其免疫活性片段與雙功能有機(jī)橋偶聯(lián)到酶例如過氧化物酶上。選擇偶聯(lián)物以與抗OX40L抗體一起使用以便抗OX40L抗體的結(jié)合抑制或者增強(qiáng)標(biāo)記物的酶活性。該方法本身被廣泛使用，稱作EMIT?？臻g偶聯(lián)物用于均相測(cè)定法的位阻方法。通過將低分子量半抗原共價(jià)連接到小OX40L片段合成這些偶聯(lián)物，以便針對(duì)半抗原的抗體基本上不會(huì)與抗OX40L抗體同時(shí)結(jié)合偶聯(lián)物。在此測(cè)定步驟下待測(cè)樣品中存在的OX40L將結(jié)合抗OX40L抗體，從而允許抗-半抗原結(jié)合所述偶聯(lián)物，導(dǎo)致偶聯(lián)物的半抗原特性的變化，例如，當(dāng)半抗原是熒光基團(tuán)時(shí)熒光的變化。夾心測(cè)定法尤其可用于OX40L或者抗OX40L抗體的測(cè)定。在順次夾心測(cè)定法(sequentialsandwichassays)中固定的抗OX40L抗體用于吸附待測(cè)樣品OX40L,通過洗滌去除待測(cè)樣品，結(jié)合的OX40L用于吸附標(biāo)記的第二抗OX40L抗體，然后從殘余顯跡物中分離結(jié)合的材料。結(jié)合顯跡物的量與待測(cè)樣品OX40L成正比。"平行，，夾心測(cè)定法中在添加標(biāo)記的抗OX40L前不分離待測(cè)樣品。使用抗OX40L單克隆抗體作為一種抗體和多克隆抗OX40L抗體作為另一種抗體的順次夾心測(cè)定法可用于檢測(cè)樣品的OX40L。上文僅僅是OX40L的示范性檢測(cè)分析法?，F(xiàn)在或者此后發(fā)展的使用抗OX40L抗體測(cè)定OX40L的其它方法均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，包括此處描述的生物測(cè)定法。制品在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了包含可用于治療、預(yù)防和/或診斷上文所述紊亂病癥的物質(zhì)的制品。該制品包括容器和貼在所述容器上或與其相連的標(biāo)簽或包裝插頁。合適的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各種材料制成，諸如玻璃或塑料。容器中裝有其自身或在聯(lián)合其它組合物時(shí)有效治療、預(yù)防和/或診斷疾患的組合物，而且可具有無菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射針頭可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小管)。組合物中的至少一種活性劑是本發(fā)明的抗體。標(biāo)簽或包裝插頁指示該組合物用于治療選擇的疾患，諸如哮喘。此外，制品可包括(a)其中裝有組合物的第一容器，其中所述組合物包含本發(fā)明的抗體；和(b)其中裝有組合物的第二容器。本發(fā)明此實(shí)施方案中的制品還可包括指示第一和第二抗體組合物可用于治療特定疾患例如哮喘的包裝插頁?；蛘?另外，制品還可包括第二(或第三)容器，其中裝有制藥學(xué)可接受的緩沖劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它還可包括商業(yè)和用戶立場(chǎng)上所需的其它物質(zhì)，包括其它緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。下面是本發(fā)明方法和組合物的實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)上文提供的一般描述，可實(shí)施各種其它實(shí)施方案。實(shí)施例實(shí)施例1:抗OX40L'j、鼠單克隆抗體8E12和13G5的制備按如下所述制備針對(duì)人OX40L胞外序列的抗體。5只Balb/c小鼠(CharlesRiverLaboratories,Wilmington,DE)用溶于Ribi佐劑(RibiImmunochemResearch,Inc.,Hamilton,MO)的重組人OX40L-標(biāo)記多肽(融合到標(biāo)記肽的人OX40配體胞外結(jié)構(gòu)域，由CHO細(xì)胞表達(dá)，Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco，CA)進(jìn)行超免疫(hyperimmunize)。來自顯示高抗OX40L抗體滴度的小鼠的B細(xì)月包與小鼠骨髓瘤細(xì)月包(pul.Anan,22.4，Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,CA)融合。數(shù)天后，收集上清，通過直接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)對(duì)抗體產(chǎn)生進(jìn)行篩選。利用ProteinA親和層析(Pharmacia快速蛋白液相層析,Pharmacia,Uppsala,Sweden)純化來自陽性克隆生長(zhǎng)-條件培養(yǎng)基的IgG。純化的抗體制品進(jìn)行無菌過濾(0.2卞m孔徑大??；Nalgene，RochesterNY)，4'C保存于磷酸鹽緩沖液(PBS)中。利用ELISA陽性克隆的生長(zhǎng)-條件培養(yǎng)基進(jìn)行基于流式細(xì)胞術(shù)的測(cè)定法，篩選與重組OX40R-Fc(與CHO細(xì)胞表達(dá)的IgGlFc片段融合的人OX40受體，Genentech,Inc.)竟?fàn)幗Y(jié)合CHO細(xì)胞上表達(dá)的人OX40L的單克隆抗體。CHO-OX40L細(xì)胞與OX40R-Fc預(yù)孵育，然后添加生長(zhǎng)-條件培養(yǎng)基。孵育后，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗滌，然后用藻紅蛋白偶聯(lián)的抗小鼠IgG染色以檢測(cè)結(jié)合的小鼠抗人OX40L單克隆抗體的量。測(cè)定平均焚光指數(shù)(MFI)。在這些測(cè)定中稱為8E12和13G5的單克隆抗體(Mabs)表現(xiàn)良好。利用標(biāo)準(zhǔn)方法從產(chǎn)生8E12和13G5抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA。使用下列重鏈和輕鏈的簡(jiǎn)并引物通過RT-PCR擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)。正向引物對(duì)VL和VH區(qū)的N端氨基酸序列特異。將LC和HC反向引物分別設(shè)計(jì)成分別與輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域1(CH1)退火，它們?cè)诜N屬間是高度保守的。擴(kuò)增的VL和VH區(qū)被克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，利用常規(guī)測(cè)序方法測(cè)定插入的多核苷酸序列。圖1顯示8E12VL和VH氨基酸序列。圖3顯示13G5VL和VH氨基酸序列。實(shí)施例2:Mab8E12和13G5結(jié)合OX40L蛋白的ELISA分析如下所述進(jìn)行竟?fàn)幮訣LISA分析以檢測(cè)溶液中抗OX40LMabs8E12和13G5與OX40L的結(jié)合，并檢測(cè)與細(xì)胞表面表達(dá)的OX40L結(jié)合。在一些實(shí)驗(yàn)中，在4。CmaxiSorp96孔微孔板(Nunc,Roskilde，Denmark)用溶于50mM碳酸鹽緩沖液，pH9.6的2(ig/ml抗FlagM2抗體(Sigma)包被過夜。所述的板用包含0.05。/。聚山梨酸酯20的PBS洗滌，用溶于PBS的0.5。/。牛血清白蛋白、10ppmProclin300(Supelco,Bellefonte，PA)在室溫下封閉1小時(shí)。洗滌板，并添加0.5pg/ml人OX40LECD-Flag多肽。孵育l小時(shí)后，洗涂板。添加人OX40-IgG-bio和用PBS系列稀釋的抗體的混合物，所述PBS包含0.5。/。牛血清白蛋白，0.05%聚山梨酸酯20，10ppmProclin300。將該板在室溫下孵育2小時(shí)，并洗滌。通過添加鏈霉親和素-HRP(Amdex，Copenhagen,Denmark)繼之以3，3',5，5'-四曱基聯(lián)苯胺(Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburgg,MD)作為底物以檢測(cè)結(jié)合的人OX40-IgG-bio。使該板顯色，通過添加lM正磷酸終止反應(yīng)。利用Titertekstacker^數(shù)器(ICN，CostaMesa,CA)在450nm讀取吸光度。利用4參數(shù)回歸曲線擬合程序(KaleidaGraph,Synergysoftware,Reading,PA)擬合滴定曲線?？筄X40LMabs8E12和13G5與人OX40L結(jié)合的近似EC50分別為1.4nM和1.1nM。在一些實(shí)驗(yàn)中，與上述類似進(jìn)行測(cè)定，除了ELISA板用0.5ng/ml人OX40-IgG包被，人OX40-標(biāo)記(OX40-FIag)和系列稀釋的抗體的混合物在板上孵育，使用抗-Flag-bio抗體繼之以鏈霉親和素-HRP來檢測(cè)結(jié)合的人OX40-標(biāo)記?？筄X40LMabs8E12和13G5與人OX40L結(jié)合的近似EC50分別為1.9nM和0.46nM。在其它實(shí)驗(yàn)中，37。C潮濕的5。/。0)2條件下在50:50F12/DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)全長(zhǎng)人OX40L的CHO細(xì)胞，所述培養(yǎng)基添加了2mML-谷氨酰胺，100單位/ml青霉素，100|ng/ml鏈霉素(補(bǔ)給性培養(yǎng)基)，和5%FBS(GibcoBRLLifeTechnologies,Gaithersburg,MD)(生長(zhǎng)培養(yǎng)基)。利用Accutase(ICN)從培養(yǎng)板分離細(xì)胞，添加到96孔微孔板，300，000個(gè)細(xì)胞/孔。向板中添加溶于生長(zhǎng)培養(yǎng)基的人OX40-IgG和系列稀釋的抗體的混合物。在冰上孵育1小時(shí)后，通過離心板洗滌細(xì)胞，去除上清。利用抗-Fc-HRP檢測(cè)結(jié)合的人OX40-IgG。對(duì)于8E12和13G5計(jì)算的EC50分別是20和130nM。在一些實(shí)驗(yàn)中，使用人OX40-IgG-bio替代人OX40-IgG。利用鏈霉親和素-HRP檢測(cè)結(jié)合的人OX40-IgG-bio。按如上所述進(jìn)行板的顯色和讀數(shù)。Mab8E12和13G5與人OX40L結(jié)合的近似EC50分別為大約11nM和60nM。這些分析證明Mab8E12和13G5結(jié)合溶液中的人OX40L和CHO細(xì)胞上表達(dá)的人OX40L。為了確定Mab8E12和13G5是否結(jié)合小鼠OX40L，ELISA板用小鼠OX40L包被。添加系列稀釋的8E12或者13G5(0.004-4pg/ml)。使用山羊抗小鼠Fc-HRP進(jìn)行檢測(cè)。未觀察到結(jié)合。在不同的模式中，ELISA板用8E12或者13G5包被。添加系列稀釋的小鼠OX40L-標(biāo)記。使用生物素化的抗-標(biāo)記(anti-Flag)繼之以鏈霉親和素-HRP進(jìn)行檢測(cè)。未觀察到結(jié)合。實(shí)施例3:利用表面等離子體共振對(duì)Mab8E12和13G5的分析在室溫下利用PharmaciaBIAcore3000(BIAcoreAB，Uppsala,Sweden)通過表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance)測(cè)定小鼠抗OX40L抗體與人OX40L的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(Karlsson等人，1994;Morton&Myszka，1998)。通過伯胺基團(tuán)將抗-標(biāo)記抗體(抗-FlagM2，Sigma,St.Louis,MO)固定到傳感器芯片(CM5)。使用高流速以最小化大規(guī)模傳送的影響。以5ial/分鐘注射20ial0.025MN-羥基琥珀酰亞胺和O.1MN-乙基-N'(二曱基氨基丙基)碳化二亞胺的混合物對(duì)羧曱基化的傳感器芯片表面基質(zhì)進(jìn)行活化。溶于10mM醋酸鈉，pH4.5的7pl50pg/ml抗-標(biāo)記以5pl/分鐘注入兩次。偶聯(lián)后，通過注入20pllM乙醇胺，pH8.5封閉芯片上未占據(jù)的位點(diǎn)。運(yùn)行緩沖液是包含0.05%聚山梨酸上的抗-Flag結(jié)合。對(duì)于動(dòng)力學(xué)測(cè)定，用運(yùn)行緩沖液兩倍連續(xù)稀釋的小鼠抗人OX40抗體8E12(PUR9333)和13G5(PUR9306)(6.2-50nM)在30pl/分鐘流速下注入流式細(xì)胞2分鐘，允許結(jié)合的抗OX40L抗體解離20分鐘。通過注入30jal10mM甘氨酸'HC1(pH1.5)再生結(jié)合表面。具有固定的抗-Flag抗體但沒有OX40L-Flag的流式細(xì)胞被用作參照細(xì)胞。利用總體擬合通過l:1結(jié)合模型分析數(shù)據(jù)。同時(shí)擬合結(jié)合和解離速率常數(shù)(BIAevaluation軟件)。對(duì)于8E12和13G5IgG抗體，表觀結(jié)合速率常數(shù)(apparenton-rateconstant)分別是2,6xl(^和4.8xl()S(l/Ms)。由于非常緩慢的解離速率(off-rate)動(dòng)力學(xué)，無法確定解離速率常數(shù)(〈5xl0Vs)。對(duì)于8E12和13G5IgG抗體，計(jì)算的表觀Kd值分別為O.019nM和O.010nM。實(shí)施例4:抗OX40L抗體8E12和13G5識(shí)別OX40L上不同的結(jié)合決定簇進(jìn)行Scatchard結(jié)合實(shí)驗(yàn)以確定抗OX40LmAb8E12和13G5是否互相竟?fàn)幗Y(jié)合表達(dá)人OX40L的CHO細(xì)胞上的相似或者重疊表位，并測(cè)定所述抗體的結(jié)合親和力。利用標(biāo)準(zhǔn)乳過氧化物酶(lactoperoxidase)方法進(jìn)行碘化50嗎抗OX40L小鼠單克隆抗體8E12和13G5?？贵w8E12和13G5用培養(yǎng)基緩沖液(DubeccosF12:DMEM，1%牛血清白蛋白，0,05%疊氮鈉和25mMHepes緩沖液pH7.2)進(jìn)行1:4連續(xù)稀釋，起始的初濃度是200nM。在96微孔板中一式兩份進(jìn)行兩組系列稀釋(50)。各組稀釋的每孔添加50pL碘化的8E12或者13G5(終濃度0.25nM)。將板進(jìn)行混合，然后將整個(gè)混合物轉(zhuǎn)移到96孔組織培養(yǎng)板，所述組織培養(yǎng)板每孔包含30，000個(gè)表達(dá)OX40L的CHO細(xì)胞，所述CHO細(xì)胞已在前一天接種。覆蓋板并在4。C孵育過夜。次日對(duì)孔(包含細(xì)胞)進(jìn)行抽吸，用培養(yǎng)基緩沖液洗滌兩次。每孔添加200nLlNNaOH裂解細(xì)胞，振搖10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到96孔微型管。在Wallacgamma閃爍計(jì)數(shù)器中對(duì)每管進(jìn)行計(jì)數(shù)。與抗體濃度結(jié)合的計(jì)數(shù)被輸入Scatchard分析程序NewLigand以繪制結(jié)合相對(duì)結(jié)合/游離(plotboundversusbound/free)圖，并確定結(jié)合親和力和受體濃度。對(duì)于竟?fàn)幮詫?shí)驗(yàn)，收集數(shù)據(jù)利用Kaleidagraph繪圖。利用4參數(shù)擬合繪制曲線。Mab8E12與人OX40L結(jié)合的Kd為0.92nM。Mab13G5與人OX40L結(jié)合的Kd為1.09nM。8E12和13G5沒有互相竟?fàn)幗Y(jié)合CHO細(xì)胞上表達(dá)的OX40L，表明抗OX40L單克隆抗體8E12和13G5識(shí)別不同的人OX40L結(jié)合決定蔟。實(shí)施例5:抗OX40L抗體抑制人OX40L和人OX40的相互作用進(jìn)行竟?fàn)幮越Y(jié)合實(shí)驗(yàn)以確定抗OX40LMab8E12和13G5是否與碘化的OX40-Fc(與Fc結(jié)構(gòu)域融合的OX40受體胞外結(jié)構(gòu)域)竟?fàn)幗Y(jié)合CHO細(xì)胞上表達(dá)的OX40L。利用標(biāo)準(zhǔn)乳過氧化物酶方法碘化50iagOX40L-Fc配體?？贵w8E12和13G5用培養(yǎng)基緩沖液(DubeccosF12:DMEM，1%牛血清白蛋白，0.05%疊氮鈉和25mMHepes緩沖液pH7.2)進(jìn)行1:4連續(xù)稀釋，起始于初濃度200nM。在96微孔板中一式兩份進(jìn)行稀釋(50pL)。每孔添加50pL碘化的OX40L-Fc(終濃度0.25nM)，混合，然后將整個(gè)混合物轉(zhuǎn)移到96孔組織培養(yǎng)板，所述組織培養(yǎng)板每孔包含30，000個(gè)表達(dá)OX40L的CHO細(xì)胞，所述CHO細(xì)胞前一天已經(jīng)接種。覆蓋板并在4。C孵育過夜。次日對(duì)孔(包含細(xì)胞)進(jìn)行抽吸，用培養(yǎng)基緩沖液洗滌兩次。每孔添加200pLlNNaOH裂解細(xì)胞，振搖10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到96孔微型管。在Wallacgamma閃爍計(jì)數(shù)器中對(duì)每管進(jìn)行計(jì)數(shù)。收集數(shù)據(jù)，利用Kaleidagraph繪圖。利用4參數(shù)擬合繪制曲線。圖3顯示該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。Mab8E12(空心三角形)和13G5(實(shí)心正方形)與OX40受體竟?fàn)幗Y(jié)合CHO細(xì)胞上表達(dá)的OX40L,表明上述抗體抑制人OX40受體與人OX40L的結(jié)合。實(shí)施例6:在基于細(xì)胞的測(cè)定法中抗OX40L抗體處理抑制T細(xì)胞增殖進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測(cè)定以確定抗OX40L單克隆抗體對(duì)OX40L-OX40相互作用的阻斷是否抑制T細(xì)胞增殖。這種基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗OX40L抗體抑制OX40L信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。簡(jiǎn)單來說，根據(jù)制造商的說明狀細(xì)胞(pDC)。細(xì)胞以1x106個(gè)細(xì)胞/ml在包含RPMI/10。/。胎牛血清/2mML-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用2.5(ig/ml可溶性人CD40L蛋白(R&DSystems)和10ng/ml人IL-3蛋白(R&DSystems)刺激3天以便活化pDC?；罨?pDC)然后用磷酸鹽緩沖液/3%胎牛血清洗滌三次，然后與CD45RA+初始T細(xì)胞(naiveTcell)共培養(yǎng)，所述CD45RA+初始T細(xì)胞是根據(jù)制造商的說明書(MiltenyiBiotec)利用MACS珠子從人血液分離的。在指定試劑存在條件下，共培養(yǎng)物以l:200的pDC:T細(xì)胞比例，在U型底96孔板中以每孑Ux105T細(xì)胞濃度培養(yǎng)l周。在最后6小時(shí)培養(yǎng)期間細(xì)胞接受每孔luCi曱基-氣化胸腺嘧啶的脈沖，收集到濾板上并計(jì)數(shù)。圖4顯示兩組實(shí)-瞼的結(jié)果，稱為"dnrl"和"dnr2"。利用抗OX40L單克隆抗體8E12(空心正方形)和單克隆抗體13G5(空心圓)的處理均顯著抑制T細(xì)胞的增殖，表明這兩種抗體抑制OX40L信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。相反，對(duì)照小鼠IgGl(X's)不抑制T細(xì)胞增殖。空心菱形顯示T細(xì)胞增殖的對(duì)照水平，實(shí)心正方形顯示與活化pDC共培養(yǎng)的T細(xì)胞的水平。不同供體間抗OX40L單克隆抗體抑制T細(xì)胞增殖的IC50不同，范圍從0.5到10nM。實(shí)施例7:抗OX40L抗體處理抑制T記憶細(xì)胞的IL-2產(chǎn)生測(cè)定T記憶細(xì)胞的IL-2產(chǎn)生以確定抗OX40L單克隆抗體對(duì)OX40L-OX40相互作用的阻斷是否抑制IL-2產(chǎn)生。該實(shí)-險(xiǎn);險(xiǎn)測(cè)抗OX40L抗體抑制OX40L信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。簡(jiǎn)單來說，根據(jù)制造商的說明書(MiltenyiBiotec)利用MACS珠子從人血液分離CD45RO+記憶T細(xì)胞。細(xì)胞以lx106個(gè)細(xì)胞/ml濃度在包含RPMI/10。/。胎牛血清/2mML-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用lng/ml抗-CD3抗體(BDPharmingen)和10nM可溶性人OX40L蛋白(R&DSystems)刺激16小時(shí)。添加指定濃度的抗OX40L抗體或者對(duì)照mlgGl抗體。按照制造商的說明書(11&DSystems)利用ELISA試劑盒測(cè)量上清中IL-2的水平。圖5顯示兩組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，稱為"dnr5"和"dnr6"。利用單克隆抗體8E12(空心正方形)和單克隆抗體13G5(空心圓)的處理均顯著抑制T記憶細(xì)胞的IL-2產(chǎn)生。相反，對(duì)照小鼠IgGl(X's)的添加不抑制IL-2產(chǎn)生。帶陰影的正方形顯示用抗CD3抗體單獨(dú)處理時(shí)記憶T細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的水平，實(shí)心正方形顯示用抗CD3抗體和人OX40L單獨(dú)處理時(shí)產(chǎn)生的IL-2的水平，或者空心菱形顯示單獨(dú)的T記憶細(xì)胞。實(shí)施例8:抗OX40L抗體處理抑制活化T細(xì)胞的存活測(cè)定活化T細(xì)胞的存活以確定抗OX40L單克隆抗體對(duì)OX40L-OX40相互作用的阻斷是否抑制存活。這種基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗OX40L抗體抑制OX40L信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。簡(jiǎn)單來說，根據(jù)制造商的說明書(MiltenyiBiotec)利用BDCA-4MACS珠子從人血液中分離漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)。細(xì)胞以lxl(^個(gè)細(xì)胞/ml濃度在包含RPMI/10。/。胎牛血清/2mML-谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng),用2.5嗎/ml可溶性人CD40L蛋白(R&DSystems)和lOng/ml人IL-3蛋白(R&DSystems)刺激3天。然后對(duì)CD123+BDCA2活化的pDC進(jìn)行FACS分類，并與活化的T細(xì)胞共培養(yǎng)。根據(jù)制造商的說明書(MiltenyiBiotec)利用MACS珠子通過陰性選擇從人血液分離T細(xì)胞，用O.llag/ml抗-CD3/1pg/ml抗-CD28(BDPharmingen)活化3天。在指定試劑(1nM或者10nM濃度)存在條件下，以l:50的pDC:T細(xì)胞比例，在6孔板中以每ml1《106個(gè)丁細(xì)胞的濃度進(jìn)行共培養(yǎng)。通過臺(tái)盼藍(lán)拒染法按時(shí)間測(cè)定細(xì)胞數(shù)目。圖6顯示實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。利用抗OX40Lmab8E12(空心正方形)和mab13G5(空心圓)的處理均顯著抑制活化T細(xì)胞的存活。相反，對(duì)照小鼠IgGl("mlgGl";X's)的添加不抑制活化T細(xì)胞的存活。空心菱形顯示單獨(dú)T細(xì)胞的對(duì)照("未刺激(unstim)")，實(shí)心正方形顯示與活化的pDC("ac.pDC")共培養(yǎng)的T細(xì)胞的對(duì)照。細(xì)描述，但說明書和實(shí)施例不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求1.一種抗OX40L抗體，包括:選自由以下序列組成的組中的至少1種、2種、3種、4種、5種和/或6種高變區(qū)(HVR)序列:(a)包括序列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQIDNO:1)或者RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQIDNO:2)的HVR-L1；(b)包括序列RVSNRFS(SEQIDNO:3)或者KVSNRFS(SEQIDNO:4)的HVR-L2；(c)包括序列FQGSHVPYT(SEQIDNO:5)或者SQSTHIPWT(SEQIDNO:6)的HVR-L3；(d)包括序列SYWLN(SEQIDNO:7)或者SYWMH(SEQIDNO:8)的HVR-H1；(e)包括序列MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQIDNO:9)或者EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQIDNO:10)的HVR-H2；和(f)包括序列GRGNFYGGSHAMEY(SEQIDNO:11)或者ERSPRYFDV(SEQIDNO:12)的HVR-H3，其中該抗OX40L抗體結(jié)合OX40L。2.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括選自由以下序列組成的組中的至少l種、2種、3種、4種、5種和/或6種超變區(qū)(HVR)序列(a)包括序列RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQIDNO:l)的HVR-Ll;(b)包括序列RVSNRFS(SEQIDNO:3)的HVR-L2;(c)包括序列FQGSHVPYT(SEQIDNO:5)的HVR-L3;(d)包括序列SYWLN(SEQIDNO:7)的HVR-Hl;(e)包括序列MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQIDNO:9)的HVR-H2;和(f)包括序列GRGNFYGGSHAMEY(SEQIDNO:11)的HVR-H3。3.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括選自由以下序列組成的組中的至少l種、2種、3種、4種、5種和/或6種超變區(qū)(HVR)序列(a)包括序列RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQIDNO:2)的HVR-Ll;(b)包括序列KVSNRFS(SEQIDNO:4)的HVR-L2;(c)包括序列SQSTHIPWT(SEQIDNO:6)的HVR-L3;(d)包括序列SYWMH(SEQIDNO:8)的HVR-Hl;(e)包括序列EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQIDNO:10)的HVR-H2;和(f)包括序列ERSPRYFDV(SEQIDNO:12)的HVR-H3。4.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括輕鏈，該輕鏈包括選自由RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQIDNO:l)，RVSNRFS(SEQIDNO:3)和FQGSHVPYT(SEQIDNO:5)組成的組中的至少l種、至少2種或者所有3種HVR序列。5.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括重鏈，該重鏈包括選自由SYWLN(SEQIDNO:7)，MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQID種或者所有3種HVIUf列。6.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括(a)輕鏈，該輕鏈包括選自由RSSQSIVHGNGNTYLE(SEQIDNO:l)，RVSNRFS(SEQIDNO:3)和FQGSHVPYT(SEQIDNO:5)組成的組中的至少l種、至少2種或者所有3種HVR序列，和(b)重鏈，該重鏈包括選自由SYWLN(SEQIDNO:7)，MIDPSDSETHYNQVFKD(SEQIDNO:9)和GRGNFYGGSHAMEY(SEQIDNO:11)組成的組中的至少1種、至少2種或者所有3種HVR序列。7.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括輕鏈，該輕鏈包括選自由RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQIDNO:2)，KVSNRFS(SEQIDNO:4)和SQSTHIPWT(SEQIDNO:6)組成的組中的至少l種、至少2種或者所有3種HVR序列。8.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括重鏈，該重鏈包括選自由SYWMH(SEQIDNO:8),EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQIDNO:IO)和ERSPRYFDV(SEQIDNO:12)組成的組中的至少l種、至少2種或者所有3種HVR序列。9.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括(a)輕鏈，該輕鏈包括選自由RSSQSPVHSNGNTYLH(SEQIDNO:2)，種、至少2種或者所有3種HVR序列；和(b)重鏈，該重鏈包括選自由SYWMH(SEQIDNO:8),EIDPSNGRTNYNEKFKS(SEQIDNO:IO)和ERSPRYFDV(SEQIDNO:12)組成的組中的至少l種、至少2種或者所有3種HVR序列。10.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括具有以下序列的輕鏈可變域FGGGTKVEIKR(SEQIDNO:13)。11.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括具有以下序列的重鏈可變域RGNFYGGSHAMEYWGQGTLLTVSS(SEQIDNO:15)。12.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括:(a)具有以下序列的輕鏈可變域FGGGTKVEIKR(SEQIDNO:13);和(b)具有以下序列的重鏈可變域:RGNFYGGSHAMEYWGQGTLLTVSS(SEQIDNO:15)。13.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括具有以下序列的輕鏈可變域WTFGGGTKVEIKR(SEQIDNO:14)。14.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括具有以下序列的重鏈可變域SPRYFDVWGAGTTLTVSS(SEQIDNO:16)。15.如權(quán)利要求1所述的抗OX40L抗體，其中所述抗體包括(a)具有以下序列的輕鏈可變域KLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPWTFGGGTKVEIKR(SEQIDNO:14);和(b)具有以下序列的重鏈可變域SPRYFDVWGAGTTLTVSS(SEQIDNO:16)。16.—種分離的抗體，該抗體和權(quán)利要求12所述抗體與人OX40L上相同的表位結(jié)合。17.—種分離的抗體，該抗體和權(quán)利要求15所述抗體與人OX40L上相同的表位結(jié)合。18.—種分離的抗體，該抗體與權(quán)利要求12所述的抗體竟?fàn)帯?9.一種分離的抗體，該抗體與權(quán)利要求15所述的抗體竟?fàn)帯?0.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。21.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體選自由下列抗體組成的組嵌合抗體，人源化抗體，親和力成熟的抗體，人抗體和雙特異抗體。22.權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體是抗體片段。23.—種編碼權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述抗體的多核苷酸。24.—種包括權(quán)利要求23所述多核苦酸的載體。25.權(quán)利要求24所述的載體，其中所述載體是表達(dá)載體。26.—種包括權(quán)利要求24或者25所述載體的宿主細(xì)胞。27.權(quán)利要求26所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。28.權(quán)利要求26所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是真核的細(xì)胞。29.權(quán)利要求26所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。30.—種制備抗OX40L抗體的方法，所述方法包括(a)在合適的宿主細(xì)月包中表達(dá)權(quán)利要求25所述的載體，和(b)回收該抗體。31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。32.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。33.—種治療或者預(yù)防免疫病癥的方法，所述方法包括給需要這種治療的患者施用有效量的權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述的抗OX40L抗體。34.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述免疫病癥是自身免疫病癥。35.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述免疫病癥是哮喘，特應(yīng)性皮炎，過敏性鼻炎，炎癥性腸病，移植物抗宿主疾病，多發(fā)性硬化或者系統(tǒng)性紅斑狼瘡。36.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述免疫病癥是哮喘，特應(yīng)性皮炎或者過敏性鼻炎。37.—種包括權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)所述抗OX40L抗體的組合物。38.—種包括如權(quán)利要求22所述多核芬酸的組合物。39.權(quán)利要求37或者38所述的組合物，其特征在于該組合物還包括載體。全文摘要本發(fā)明提供抗OX40L抗體、包括這些抗體的組合物以及使用這些抗體的方法。文檔編號(hào)C07K16/28GK101374865SQ200680052972公開日2009年2月25日申請(qǐng)日期2006年12月15日優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日發(fā)明者弗萊維厄斯·馬丁申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司